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OBJETIVOS
• Determinar la variación de la concentración, en el tiempo, de glucógeno y
glucosa en cortes de hígado de rata en solución de Krebs, para confirmar
así el rol de éste en la regulación de la glicemia sanguínea, a través de
procesos como la glucogenolisis.
• Perfeccionar la realización de la técnica de GOD-PAP para la determinación
de glucosa.
• Aprehender a determinar cuantitativamente la concentración de glucógeno
hepático.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material
es
Tubos de ensayo Reactivos
Gradilla para tubos de ensayo
Pipetas de 2 mL
Pipetas de 5 mL
Propipeta verde Solución de Krebs (isotónica con
Propipeta azul el plasma)
Micropipeta 200 – 1000µ L Ácido Tricloroacético 5%
Puntas para micropipeta Reactivo de Lugol
Recipiente para puntas usadas Kit para determinación
Papel filtro enzimática de glucosa (GOD-
Marcador PAP) (tampón fosfato, pH 7.3,
Vórtex 100mmol; fenol 16mmol/L; 4-
Baño termorregulado para la Incubación aminoantipirina 0.25mmol/L;
Tubos Khan
glucosa oxidasa ≥ 20000U/L;
Espectrofotómetro
Cubetas para espectrofotómetro peroxidasa ≥ 1000U/L).
Gradillas para Cubetas Solución estándar de glucógeno
Mortero 0.05 g%
Embudo Solución estándar 20 mg%
Balanza
Cronómetro
1
Por lo demás, bien alimentadas y en situación de stress controlado, para que no secreten
adrenalina y no liberen el glucógeno de su hígado.
2
Tarada previamente con el respectivo tubo de ensayo para cada muestra del tejido
sobrenadante líquido en otra serie de tubos, con el cual se determinará la
glucosa liberada, utilizando el método enzimático GOD-PAP.
• Los trozos de tejidos que quedaron en los tubos incubados servirán para
determinar el glucógeno.
3
Cuidadosamente, no bruscamente como dice la guía, pues sino, salta fuera del mortero.
4
Aunque no lo hicimos en el práctico, antes del filtrado se puede centrifugar (para mejores
resultados)
Estándar
0’ (S1) 10’ (S2) 30’ (S3) Blanco
(x2)
Sobrenadante 100 100 100 - -
Estándar 20mg%
- - - 100 -
(µ L)
Reactivo
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Enzimático (µ L)
RESULTADOS
Realizamos una regla de 3 simple pues tenemos la concentración y
absorbancia del estándar de glucosa y glucógeno, lo cual nos permite
calcular la concentración de las otras muestras.
Para glucógeno:
0.25 mg/ml --------> 0.316 X = 0.69 mg/ml
X mg/ml --------> 0.869
Para glucosa:
0.2 mg/ml --------> 0.387 X = 0.18 mg/ml
X mg/ml --------> 0.340
* Para el cálculo de las concentraciones se utilizó el promedio de los estándares para glucosa y
glucógeno.
CONCLUSIÓN
Desarrollado ya el práctico, por los resultados obtenidos, hemos podido
cumplir el objetivo del estudio de glucógeno en tejido hepático junto con
observar la relación entre la cantidad de glucógeno presente y la cantidad
de glucosa que se obtenía de la misma muestra al pasar el tiempo. La
relación que se obtuvo era la esperada en donde la cantidad de glucógeno
disminuía conforme pasaba el tiempo debido al proceso de glucogenolisis el
cual aumentaba la cantidad de glucosa en la muestra. Sucede con el corte
de tejido hepático al ser sometido a un medio similar al plasma sanguíneo
carente de glucosa. Tal como indica la teoría, se ve favorecida la
glucogenólisis para liberar glucosa a la sangre, o, si fuera el caso de un
paciente humano, para contrarrestar la hipoglicemia.
Para la cuantificación de glucógeno y glucosa se detuvieron las reacciones
con la aplicación de ATC al 5% el cual mantuvo constantes las cantidades
de glucógeno mientras se procedía con la muestra de tejido hepático.
Para esto se tomó el sobrenadante una vez incubada la muestra de tejido
hepático a 37°C por distintos valores de tiempo, el que se procedió a
estudiar por el método GOD-PAP para determinar la concentración de
glucosa, el cual, como se trató en el práctico anterior, se fundamenta en la
generación de un compuesto coloreado que es proporcional a la cantidad
de glucosa en la muestra y que es sometido a estudio espectrofotométrico.
Los resultados como ya hemos mencionado fueron los esperados ya que
conforme las muestras tenían un mayor tiempo de incubación se observaba
un aumento en la cantidad de glucosa, esto debido a que el medio era el
apropiado y, al no contener sustratos, predominaba el proceso de
formación de glucosa.
Para la cuantificación de glucógeno también se procedió con técnicas
espectrofotométricas debido a la propiedad de este de dar coloración caoba
con el yodo. Una vez detenida la reacción se procedió a sacar el glucógeno
de las células con métodos mecánicos triturando el trozo de hígado. Luego
se tomo un poco de la solución resultante y se le aplicó reactivo de lugol
para dejar reposar por 5 minutos y llevar a espectrofotómetro. La tendencia
de los resultados fue la esperable, donde la cantidad de glucógeno había
disminuido mientras más tiempo de incubación había tenido la muestra,
pues éste se había degradado a glucosa por el proceso de glucogenolisis.
Situación que se observa en las personas cuando es necesario aumentar el
nivel de glucosa en la sangre debido a un ayuno o ejercicio intenso, el
hígado recurre a sus reservas de glucógeno el cual es degradado a glucosa
y liberada a la sangre, para así mantener una glicemia constante, ya que el
hígado cumple un importante rol en la regulación de ésta.
Podemos concluir además, que la degradación de glucógeno es un proceso
relativamente rápido; en un intervalo de aproximadamente 30 minutos la
concentración de las reservas de glucógeno en el hígado ya había
disminuido considerablemente, según los datos obtenidos mediante
espectrofotometría, y, por el contrario, la concentración de glucosa liberada
había aumentado
DISCUSIÓN
Una vez mas fue utilizado el método GOD-PAP del cual se conoce su
aplicación en la determinación de presencia de glucosa en la orina, tema
tratado en el práctico anterior. Al igual que con la glucosa, una vez más
debimos recurrir a técnicas espectrofotométricas para el estudio de
glucógeno, de las cuales ya se conocen las ventajas y dificultades que
presenta en su procedimiento, asociadas principalmente a la correcta
preparación de la muestra a estudiar. Durante el práctico, no presentamos
dificultad alguna en el procedimiento pues se tuvo cuidado en las etapas
mas sensibles y también se estuvo muy atento al tiempo entre cada
muestra para que los resultados obtenidos fueran lo mas certeros posibles.
Es importante destacar que el aumento de glucosa en la solución, y la
disminución de ésta en los hepatocitos no es exactamente proporcional, ya
que durante el procedimiento puede ocurrir pérdida de ésta, como
consecuencia del manejo de los instrumentos.
BIBLIOGRAFÍA
• Dr. Reginald Del Pozo; Mg. Mirna Muñoz. “Guía de Trabajos Prácticos
Bioquímica”; U.C.S.C., Fac. Medicina, 2003.
• Lehninger, Albert; Nelson, David; Cox, Michael. “Principios de
Bioquímica”; Editorial Omega, segunda edición, 1995.
• Stryer, Lubert. “Bioquímica” Vol. 2; Editorial Reverté, S.A.; cuarta
edición, 1995.
• http://www.scielo.cl/pdf/rcp/v56n6/art01.pdf
• http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2004/miranda_s/sources/miranda_s.
pdf
• http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1994.pdf