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LABORATORIO Nº 10
Medicina Sección I
Integrantes:
Franca González Beltrán
Juan González Oyarzún
Loreto Hernández
Max Hetz Navarrete
Docentes:
Dr. Reginald del Pozo Ph.D
BQ. Mirna Muñoz M.Sc
INTRODUCCIÓN
El absorbente que usaremos en este práctico es el gel de sílice que es débilmente ácido
(pH=4-5 aprox.), el tamaño del poro suele ser de 20 a 150 A. Por lo general lleva un agente
aglomerante que le proporciona firmeza al absorbente. Este absorbente es de características
polares, el cual puede ser tratado por hidrocarburos para neutralizar los –OH, de este modo queda
apto para la separación de componentes lipídicos, con los cuales trabajamos.
En esta técnica debemos sembrar nuestras muestras y una muestra estándar (con sus
componentes previamente conocidos), y luego iniciar la corrida cromatográfica de las muestras por
la fase estacionaria, las cuales posteriormente deben ser reveladas. Para el proceso de revelado
existen métodos físicos y químicos. En este caso se hará reaccionar la sustancia reveladora con los
componentes separados, ocuparemos como agente revelador al Yodo, el cual genera productos
coloreados. Otro agente revelador usado también es el ácido sulfúrico.
MATERIALES
- Cubetas o Cubetas de vidrio con tapa.
- Cromatofolios de sílica gel 60 F254, 20 x 20 cm(MERK)
- Jeringas Hamilton.
- Regla.
- Lápiz grafito.
- Clip.
- Toalla Nova.
- Pipeta Pasteur.
- Tubos eppendorf.
- Cámara cromatográfica.
- Tubos de ensayos.
- Centrífuga.
- Vórtex.
- Guantes.
- Vasos PP.
- Micropipetas.
Reactivos
2
c) Corrida de TLC:
Datos anexos
(Indicados con cuadrados y dentro los números)
1. En este caso la fase lipídica debe sacarse sin pasar a llevar la fase proteica con la pipeta
Pasteur para no proveer de malos resultados ni contaminación.
2. Cada línea debe marcarse con regla, previamente traída por cada grupo. Cabe señalar que
la línea de siembra de cada muestra debe marcarse con lápiz mina, de esta manera no se
quedarán atrapados en la brecha cada estándar que desee correrse.
RESULTADOS
Imagen 1.- corresponde al
cromatofolio, donde se realizó por
técnica de TLC, la corrida de
muestras lipídicas señaladas en la
tabla 1.
Carril Muestra
1 Estándar Colesterol Ester
2 Estándar TAG
3 Estándar Ácidos Grasos
4 Estándar Colesterol
5 Estándar Fosfatidilcolina
6 Mezcla
7 Suero
8 Muestra Margarina
Tabla 1.- corresponde a las muestras
analizadas por cada carril del
cromatofolio.
Banda\Carril 1 2 3 4 5 6 7 8
A (cm) 10.2 5 3.7 1.8 0 0 0 0
B (cm) 1.8 0.7 0.2
C (cm) 3.5 4.7 1.6
D (cm) 5 8.9 2.9
E (cm) 12.3 12.3 6.2
Tabla 2.- corresponde a la movilidad en centímetros de cada banda,
donde cada banda es tabulada con letras en orden alfabético, conforme
aumenta la movilidad de la banda.
Banda\Carri 1 2 3 4 5 6 7 8
l
A (cm) 0.708 0.347 0.257 0.125 0.000 0.000 0.000 0.000
B (cm) 0.125 0.049 0.014
C (cm) 0.243 0.326 0.111
D (cm) 0.347 0.618 0.201
E (cm) 0.854 0.854 0.431
Tabla 3.- corresponde a la movilidad relativa (Rf) de cada banda correspondiente a
cada carril, donde cada banda es tabulada con letras en orden alfabético, conforme
aumenta la movilidad de la banda.
Mi 10.2
Rf = ! = 0.708 " Rf = 0.708
Mc 14.4
Sea,
Rf = Movilidad Relativa
Mi = Movilidad individual de la banda (cm)
Mc = Movilidad posible en el cromatofolio (cm)
Rf Muestra Carril
0 Fosfatidilcolina 5
0,125 Colesterol 4
0,257 Ácidos Grasos 3
0,347 TAG 2
0,708 Colesterol Ester 1
Tabla 3.- corresponde a la organización de los
.
estándares conforme a sus Rf, para analizar más
organizadamente las muestras de los demás
carriles.
CARRIL 1
CARRIL 2
CARRIL 3
CARRIL 4
CARRIL 5
CARRIL 6
CARRIL 7
CARRIL 8
DISCUSIÓN
Composición 100 g
Proteínas (g) 0
Grasa total (g) 50
Ácidos grasos saturados (g) 22
Ácidos grasos monoinsaturados (g) 8
Ácidos grasos poliinsaturados (g) 20
Ácidos grasos trans (g) 0.9
Colesterol (mg) 0
Hidratos de carbono (g) 0
Tabla 4.- Información nutricional de la margarina Banda Azul ®.
A pesar de ser un análisis cualitativo, puede hacerse una estimación de la cantidad de
lípido dependiendo del tamaño de la banda, se puede decir que en la margarina se encuentra
mayor cantidad de TAG que de otro lípido.
Cabe destacar que seguir la metodología del proceso es fundamental, ya que cualquier
descuido puede interferir en la corrida. Por ejemplo, se observa contaminación del carril 8 en
el carril 7, esto pudo ocurrir por sembrar más cantidad de muestra que la indicada. Otro
ejemplo es la aparición de una segunda banda justo por sobre la banda correspondiente a los
fosfolípidos del carril 8, esto pudo ocurrir por un mal sembrado (fuera de la línea de
siembra) o por sembrar un exceso de muestra, la que puede difundir si no es secada a
tiempo. También, en el mismo carril 8, se observa que las bandas corrieron de forma
desequilibrada, avanzando más del lado derecho que del izquierdo, esto también pudo ser
causado por un error de sembrado, esto puede significar que se sembró más muestra del lado
izquierdo que del derecho. Otro aspecto importante del trabajo, era tomar cuidadosamente la
placa de sílice, evitando tocarla directamente con los dedos descubiertos, ya que esto puede
contaminar la placa con lípidos de la piel y afectar en la visibilidad de las muestras.
CONCLUSIÓN
La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica que permite separar una mezcla
de dos o más compuestos en base a su solubilidad en la fase móvil. En este caso se
separaron mezclas de lípidos, que tienen carácter apolar, por lo que se usó como fase móvil
un solvente orgánico; por consiguiente, el compuesto más apolar tendrá una Rf mayor por
ser más soluble en la fase móvil que otro polar o menos apolar.
El compuesto que presentó mayor Rf fue el colesterol éster (Rf = 10.2), lo que
demuestra su gran apolaridad (es el más hidrofóbico). Por el contrario, los fosfolípidos no
migraron (Rf = 0), ya que son antipáticos, poseen un carácter polar. Por lo tanto, según el
Rf se puede determinar la polaridad del lípidos analizados (a mayor Rf, mayor apolaridad y
viceversa), obteniéndose, de más apolar a menor apolar: colesterol éster, triglicéridos, ácidos
grasos, colesterol libre y fosfolípidos.
La TLC permite hacer un análisis cualitativo de los componentes lipídicos se
distintas muestras, es decir, qué lípidos componen dicha muestra. Se puede realizar una
estimación a simple vista de la cantidad de lípido que posee cada banda, ya que una banda de
mayor tamaño supone mayor cantidad de lípido.
Para separar lípidos de distintas muestras, primero deben extraerse. Por ejemplo, en
el caso de los lípidos plasmáticos, estos deben ser extraídos del suero sanguíneo para evitar
que los componentes proteicos interfieran con la corrida.
La técnica utilizada para el revelado de las bandas fue la exposición de la placa a
vapores de yodo. El yodo se une a los dobles enlaces de las moléculas, dando a las bandas
un color amarillo. Se trata de una técnica rápida y sencilla, sólo debe tenerse la consideración
de actuar con rapidez para delinear las bandas, ya que el yodo es muy volátil.
Por último, es importante seguir al pie de la letra la metodología del trabajo y así
evitar cualquier error en la corrida.
BIBLIOGRAFÍA
• Del Pozo R., Muñoz Mirna, Grandón Javier; "Guía de trabajos prácticos
bioquímica"(2009), Universidad Católica de la Santísima Concepción.
• “Lehninger, Principios de Bioquímica”; David Nelson; Michael Cox, Editorial
Omega, Tercera edición, 2001.
• http://depa.pquim.unam.mx/~fercor/dqo/manuales/1311/p7.pdf