TP Microbiologie

Etat frais - Milieu solide : une goutte deau + une colonie

- Milieu liquide : une goutte du milieu
Entre lame et lamelle observ au microscope lobjectif 40.
! Ensemencements
Milieu liquide : 5 0 gouttes de suspension dun milieu li!uide
" partir dun milieu solide on prpare un tube
#mol$se avec de leau p#$siologi!ue soit on dpose
!uel!ues colonies avec lose.
Milieu solide :
%ubes : pi!ure centrale ou glose inclin
&oites : - talement en surface 'r(teau) 0)ml*
-+nondation puis on enl,ve le-c,s
-+ncorporation 'en masse* m.
-+solement en surface '/t#odes des stries ou par puisement* 0)
ml
0nombrement : voir %12
3 '4567ml* 8 3ombre de colonie '456* 7 5acteur de dilution '0
-n
* - 9olume dpos
'ml*
! Coloration de Gram
:aliser un frottis : goutte deau) colonie avec l ose) sc#er

er
colorant : 9iolet de gentiane 'min* puis rincer et sc#er
;-ateur : le lugol 'min*) rincer et sc#er
le di<rentiateur : alcool =5> '5-0s*) rincer et sc#er
2
,me
colorant : fus#ine ou safranine 'min*) rincer et sc#er
observation objectif ? 00 avec une goutte d#uile sur la lame :
9iolet 8 gram +) rose 8 gram
@
noter la forme) le gram et larrangement des cellules.
Aram +) co!ues ' staphylococcaceae + Streptocaccaceae)
:ec#erc#e de la catalase
1rsence catalase 'enB$me catal$sant destruction des C
2
D
2
*
%est : Dn place !uel!ue goutte d C
2
D
2
sur un prl,vement de culture solide avec
pipette pasteur.
:sultat : 6atalase + dgagement gaBeu- avec mousse ou bulles 'Staphylococcus*
6atalase - : Streptococcus
%$pe respiratoire 'tude avec D
2
de lair*
%est : Dn utilise une glose VF li!uide : on ensemence en spiral avec une pipette
pasteur et on refroidit leau froide 'puis incuber EF>6 24#*
:sultats :
" : aro-anarobie facultative
& : arobie strict
6 : micro-arop#iles
0 : anarobie strict
/tabolisme o-$datif ou fermentatif
%est : Dn utilise le milieu de Hugh et Leifson pralablement fondu au bain marie puis
refroidie 45>6.
Dn ajoute 0)5 ml de glucose 'concentration ;nale G* puis on ensemence !
tubes par pi"#re centrale) dont sera ferm 5 car il sera recouvert d#uile de
paraHne.
$!ydati%e: si D vert7orang et 5 vert) elle utilise D2 et un peu acide.
Fermentati%e & si D et 5 jaune) pas utilisation D2 et tr,s dacide.
'nacti%e & si 5 et D vert) inactive pour le glucose et pas dacide produit.
si D et 5 vert-bleu) elle est alcalinisant et on a un produit alcalin 'basi!ue*.
5ermentation du mannitol) mobilit rduites des nitrates
%est : Dn utilise un milieu MM( ensemenc par pi!Ire centrale.
:sultats :
/annitol : /annitol + : /ilieu devient jaune) fermentation du mannitol.
/obilit : /obilit - : &actries le long de la strie.
/obilit + : partout.
3itrate : Dn ajoute le ractif de Ariess :
Raction positive : coloration rouge) la bactrie rduit les nitrates
en nitrites.
Raction ngative : pas de coloration) rvler les nitrates par
ajout de poudre de Binc :
- Ji coloration rouge la bactrie ne rduit pas les nitrates 'prsence de
nitrites*.
- Ji pas coloration) pas de nitrate) pas de nitrites car dj rduit en 32.
streptococcus
1rsence dune #mol$sine 'l$se #maties*
%est : Dn utilise une glose au sang) on ralise une strie longitudinale.
:sultat : Kone verd(tre autour de la strie : Cmol$se L
"urole claire autour de strie : Cmol$se
"ucune raction : pas #mol$se
6roissance sur milieu- #ostiles
%est : -Dn ensemence une culture en milieu glos dans une solution de
(aCl )*+,-
- Dn ensemence une culture en milieu en solution pH .*)-
:sultat : Dn apprcie la croissance 'apr,s incubation 5j EF>6*.
Mpossibilit dvaluer la croissance di<rente %> 'E0min N0>6*.
/ilieu slectif :
/01 2bile3 esculine3a4ide5 & rec#erc#e de lesculinase 'bile et aBide :
in#ibiteur*
%est : isolement sur &1 &E" partir de la culture en glose 'incuber EF>6*
:sultat : esculine + : petites colonies translucide entour dun #alo noir
'raction avec les ion 5e*
Esculine - : aucun c#angement
Milieu de slanet4 et batley &
%est : isolement sur &1 J& partir de la culture en glose 'incuber EF>6*
:sultat : si les colonies sont rose7rouge fonc se sont des streptoco!ues fcau-
stap#$lococcus
1rsence dune #mol$sine 'l$se #maties*
%est : Dn utilise une glose au sang) on ralise une strie longitudinale.
:sultat : Kone verd(tre autour de la strie : Cmol$se L
"urole claire autour de strie : Cmol$se
"ucune raction : pas #mol$se
1rsence de la t#ermonuclase
%est : Dn utilise une glose 6 17( dans une glose E puits !ue lon ensemence
'tmoin) froid et c#aud*
:sultat : 1uits c#aud et froid di<rents : 03ase non t#ermostable
1uits c#aud et froid identi!ue : 03"se t#ermostable 'Staphylococcus
aureus*
1rsence de la coagulase libre
%est : 0)5ml de culture 24# EF>6 sur bouillon cOur7cervelle 0)5 ml de plasma de
lapin
"giter et incuber 24# EF>6.
:sultat : 6oagulase + : coagulation du contenu du tube. 'Staphylococcus aureus*
/ilieu- slectifs
Milieu de Chapman : Jtap#$lococcus 'Aram +*
%est : faire un talement par puisement par strie partir dune culture de 24#
sur le milieu 'contenant 3a6l !ui permet la slection de bactries #alop#ile et
in#ibe les autre*.
:ouge de p#nol dans le milieu permet de distingu les esp,ces. 'incuber 24#
EF>6*
:sultat : /annitol + : grosses colonies entoures dune aurole jaune
'fermentation mannitol* : staphylococcus aureus
/annitol - : pas petites colonies entour de rouge
Milieu /aird par8er & pour coagulase positive) il met en vidence la
lcit#inase et la lipoprotinase
%est : partir dune culture de 24# ensemenc les &1 par strie 'incuber 24#
EF>6*
:sultat : -colonie noire : rduction du tllurite en tllure.
- #alo claire : prsence de protol$se
-prcipit blanc : #$drol$se des lcit#ines par lcit#inase
.es stap#$loco!ues coagulase + sont lcit#inase + et protol$se+
0vellopement de colonie
et puits 2 et E rose P
t#ermonuclase t#ermostable
Aram +) bacilles ' Lactobacillaceae)
%$pe de mtabolisme '#omofermentaire ou #trofermentaire*
%est : Dn ensemence un milieu li"uide M9S '/an) :ogosa) J#arpe* + cloc#e
de 0ur#am
:sultat : Ctrofermentaire : production de 6D
2
: prsence de gaB sous la
cloc#e.
%emprature de croissance
%est : Dn ensemence E milieu- /:J !uon incube di<rentes tempratures.
:ec#erc#e de larginine di#$drolase : "0C pour bactries en anarobiose
%est : Dn ensemence un milieu li"uide de M:ller 6 l;arginine !ui sera
recouvert de parra;ne.
:sultat : Positif : croissance et coloration pourpre 'enB$me dgrade arginine*
Ngatif : coloration jaune
:ec#erc#e de lesculinase
%est : Dn ensemence pour pi!ure centrale une glose lesculine.
:sultat : Positif : milieu noir 'la bactrie poss,de lenB$me esculinase*
Ngatif : milieu reste gris
5ermentation des glucides
%est : 0ans un milieu %iande le%ure) on ajoute m. de solution de glucide
puis on ensemence avec la culture 24# et incubation E0>c 5j*.
:sultat : fermentation + si virage de lindicateur de pC.
Aram Q) bacilles (pseudomonadaceae + Enterobacteria)
:ec#erc#e de lo-$dase
%est : Dn dpose un dis"ue o!ydase sur une lame sur la!uelle on ajoute la colonie
'sans pince et ose*
:sultat : !ydase + : violet 2Pseudomonas5
!ydase - : pas de raction 20nterobacteriaceae5
%$pe respiratoire 'tude avec D
2
de lair*
%est : Dn utilise une glose VF li!uide : on ensemence en spiral avec une pipette
pasteur et on refroidit leau froide 'puis incuber EF>6 24#*
:sultats :
" : aro-anarobie facultative
& : arobie strict
6 : micro-arop#iles
0 : anarobie strict
/tabolisme o-$datif ou fermentatif
%est : Dn utilise le milieu de Hugh et Leifson pralablement fondu au bain marie puis
refroidie 45>6.
Dn ajoute 0)5 ml de glucose 'concentration ;nale G* puis on ensemence !
tubes par pi"#re centrale) dont sera ferm 5 car il sera recouvert d#uile de
paraHne.
$!ydati%e: si D vert7orang et 5 vert) elle utilise D2 et un peu acide.
Fermentati%e & si D et 5 jaune) pas utilisation D2 et tr,s dacide.
'nacti%e & si 5 et D vert) inactive pour le glucose et pas dacide produit.
si D et 5 vert-bleu) elle est alcalinisant et on a un produit alcalin 'basi!ue*.
5ermentation du mannitol) mobilit rduites des nitrates
%est : Dn utilise un milieu MM( ensemenc par pi!Ire centrale.
:sultats :
/annitol : /annitol + : /ilieu devient jaune) fermentation du mannitol.
/obilit : /obilit - : &actries le long de la strie.
/obilit + : partout.
3itrate : Dn ajoute le ractif de Ariess :
Raction positive : coloration rouge) la bactrie rduit les nitrates
en nitrites.
Raction ngative : pas de coloration) rvler les nitrates par
ajout de poudre de Binc :
- Ji coloration rouge la bactrie ne rduit pas les nitrates 'prsence de
nitrites*.
- Ji pas coloration) pas de nitrate) pas de nitrites car dj rduit en 32.
1seudomonas
4tilisation du citrate
%est : Dn ensemence la pente dun tube de citrate de Simmons par strie centrale et
longitudinale.
:sultat : Positif : alcalinisation du milieu '!ui devient bleu cause du bleu de
bromot#$mol* car colonie utilise le citrate en augmentant le pC et dveloppement des
bactries.
Ngatif : pas dalcalinisation donc pas de virement de couleur.
Mincubation <=>C
:ec#erc#e de la Alatinase
%est : Dn ensemence par pi!ure centrale le culot dun milieu 6 la glatine) apr,s
refroidissement.
'+ncuber 4R# semaine %> ambiante*.
:sultat : positif sil $ a li!ufaction de la glatine.
1igmentation : milieu Sing " et Sing & :
%est :
:sultat :
/ilieu slectif p$oc$anosel glose :
%est : raliser un isolement 'par strie* sur milieu p$oc$anosel
:sultat : si croissance : pseudomonas 'car ctrimide in#ibe toutes colonies
sauf pseudomonas*
/ilieu bleu7vert : production de p$ocianine
/ilieu vert Tuorescent : production de
p$overdine+p$ocianine

enterobacterie
/tabolisme des glucides
%est : Dn ensemence la pente du milieu ?liger Ha@na en strie et son culot par
pi!ure.
3e pas visser totalement le bouc#on pour arer le milieu 'incubation24#
EF>6*.
:sultats : Pente : Lactose + : jaune
Lactose - : rouge

Culot : "lucose + : jaune
"lucose - : rouge
.e glucose est toujours utilis en premier
0!emple &
1roduction de gaB : dcollement de la glose et7ou bulles
&actries C
2
J
+
: 1rsence de sulfure d#$drog,ne : prcipit noir
C
2
J
-
: 1as de prcipit
.06+ : 1rsence de l$sine dcarbo-$lase car l$sine transform en
cadaverine : coloration violette
.06- : incolore
%est D31A :
%est : prlever un peu de culture dans la pente du tube et mettre en suspension
dans 0)5 ml deau distill et mettre un dis!ue D31A puis incuber EF>6
observ toutes les 5min pendant #.
:sultat : test positif si couleur jaune
%est de la p#n$lalanine :
%est : ensemencer le milieu "11 'glose p#n$lalanine* avec le germe 'incuber
24# EF>6*
:sultat : recouvrir la culture de 0)2 ml dune solution 5e6lE
Ji coloration verte rsultat +) la p#n$lalanine est transform en acide
p#n$lp$ruvi!ue
%est tr$ptop#ane : rec#erc#e urase) tr$ptop#ane dsaminase)
tr$ptop#anase
%est : Ensemencer !uel!ues gouttes de suspension bactrienne 'ou colonie* en
milieu ure indole 'incuber 24# EF>6*
:sultat : urase : si le rouge de p#nol vire au rouge prsence durase
'alcalinisation*.
%r$ptop#anase : spar le contenu du tube dans 2 tubes #mol$se
-ajouter E gouttes de perchlorure de fer si coloration
rouge7brun T71A
- ajouter E gouttes de ractif de ?o%ac) si apparition dun
anneau rouge) tryptophanase A 'production dindole*.

/ilieu slectif : 0r$galsUi pour &actries Aram Q
%est : avec culture 24# ensemenc &1 par mt#ode des stries 'incuber 24#
4R# EF>6*
:sultat : .actose + : colonie jaune 'fermentation lactose*
.actose - : colonie bleu-vert
/ilieu slectif : E/&
%est : Ensemencer le milieu par stries dpuisement 'incuber 24#
EF>6*
:sultat : -colonies plates) violette fonce mtalli!ue : E.coli
-grosses colonies : enterobacter
-petites colonies grise : almonella
-colonies violet p(le) reTet mtalli!ue : citrobacter
Aalerie "1+ : on compte !ue les c#i<re test + et on rel,ve le numro 'NEFE*
TP fromage A yaourt-
7ilution &
Milieu et temps d;incubation & voir tableau %1 fromage
3 '4567g* 8 3ombre de colonie '456* 7 5acteur de dilution '0
-n
* - !uantit
dpos 'g*
Le yaourt & lait ferment par 2 bactries t#ermop#iles : !actobacillus
bulgaricus

treptococcus thermophilus "salivarius#
5ermentation !ui conduit la prise en masse du lait 'coagulum ferme) sans
lactoserum*
.e tube contient ml de solution
bactrienne et =ml de li!uide p#$siologi!ue
'dilution 0V-*
Dn prl,ve ml du tube !uon met dans
=ml de li!uide p#$sio dans le tube 2
'dilution 0V-2*WW
ml
9olume total de c#a!ue tube
0ml
TP antibioti"ues
/an!ue de temps donc regarder votre %1
Croissance microbienne
Je reporter au cour de microbiologie 'bouc#er* + %1E
3ombre de bactries par unit de volume
0ensit opti!ue
1oids sec