Progresele nregistrate n genetica clasic au ridicat, ulterior, numeroase probleme
legate de natura biochimic a materialului genetic, respectiv a genelor. Identificarea i studierea aprofundat a materialului genetic ridicau numeroase probleme, de aceea nu au putut fi rezolvate dect prin cercetri interdisciplinare de genetic, biochimie, medicin, fiziologie, fizic, matematic i altele. Aceste cercetri constituie realizrile cele mai importante ale tiinei contemporane i au pus bazele geneticii moleculare, care studiaz ereditatea i variabilitatea organismelor la nivel molecular. Complexitatea structurilor macromoleculare, interaciunile de ordin informaional dintre acizii nucleici i proteine, multitudinea tipurilor de proteine ce alctuiesc organismele, au generat structuri supramoleculare care asigur existena, variabilitatea i continuitatea materiei vii. n urm cu trei decenii nimeni nu i-ar fi nchipuit c oamenii vor cunoate structura genelor i modul lor de exprimare ntr-un sistem celular. ntr-o perioad scurt de timp s-a demonstrat c moleculele de acid dezoxiribonucleic i acid ribonucleic, att la organismele inferioare ct i la cele superioare, conin n mod codificat informaia genetic pentru sinteza proteinelor. S-au descifrat mecanismele intime care stau la baza complicatelor reacii prin care se sintetizeaz o protein n organism, fenomene ce au fost reproduse apoi i n laborator, aa cum se va vedea ntr-un alt capitol referitor la ingineria genetic.
PROTEINE I ACIZI NUCLEICI
Studiile de biochimie privind substratul material al ereditii pretind o cunoatere temeinic a componentelor chimice din celul, precum i a proceselor de transformare a acestora. Din multitudinea de componente chimice ce intr n alctuirea celulei, principalul substrat al materiei vii l constituie proteinele i acizii nucleici. Proteinele sunt grupate n holoproteine, constituite numai din aminoacizi i heteroproteine care, pe lng aminoacizi, mai posed o grup prostetic. Din grupul heteroproteinelor fac parte: fosfoproteinele, glicoproteinele, cromoproteinele, lipoproteinele i nucleoproteinele. Nucleoproteinele sunt formate dintr-o protein i o grupare prostetic reprezentat de nuclein. Se cunosc mai multe tipuri de holoproteine, unele aparinnd grupului de polipeptide cu greutate molecular mic, denumite protamine, care conin pn la 90% arginin i sunt lipsite de aminoacizi aromatici i cu sulf. Alte tipuri de proteine cum ar fi histonele, conin lizin i arginin, aminoacizi aromatici i cu sulf, leucin, alanin, glicin i acid glutamic. Ambele tipuri de proteine au caracter bazic i formeaz sruri cu acizii nucleici, de tipul nucleoproteinelor. Un alt tip de protein care conine i triptofan, l constituie proteina fibrilar care intr n constituia fibrelor celulare. Proteinele sunt formate din aminoacizi care sunt legai prin legturi peptidice, alctuind lanuri polipeptidice, avnd o structur macromolecular. Datorit faptului c proteinele conin n molecula lor lanuri i catene mari, cu structuri interne diferite, pot aprea n spaiu diferite configuraii, grupate n mai multe niveluri de organizare: structura primar, secundar, teriar i cuaternar. Structura primar a proteinelor se refer la constituia chimic a fiecrui lan polipeptidic ce intr n alctuirea lor. Specificitatea unei proteine este dat de numrul lanurilor polipeptidice, iar specificitatea unui lan polipeptidic este dat de numrul, felul i ordinea aminoacizilor ce l constituie. n lanurile polipeptidice, particip mai frecvent 20 de tipuri de aminoacizi, dei numrul aminoacizilor cunoscui se ridic la aproximativ 100. Faptul c fiecare protein se caracterizeaz printr-o anumit secven de aminoacizi, orice schimbare a acestei secvene va atrage modificri ale proteinei i ca atare i a fenotipului organismelor vii. Structura secundar se refer la orientarea spaial a aminoacizilor, unii fa de alii n cadrul lanului polipeptidic. Datorit unor fore de atracie necovalente sau covalente chiar, anumite poriuni din lanul polipeptidic se atrag, rezultnd o serie de torsionri i orientri n diferite direcii a lanului polipeptidic, dndu-i o anumit configuraie spaial. Structura teriar se formeaz cnd ntre aminoacizi ndeprtai ai aceluiai lan polipeptidic se formeaz legturi chimice, dnd moleculei proteice o configuraie spaial foarte neregulat. Structura cuaternar se ntlnete la proteinele formate din mai multe lanuri polipeptidice, ce pot fi identice sau diferite ca structur. Din cercetrile efectuate de biochimiti se desprinde unul din cele mai importante principii ale biologiei moleculare: structura secundar, teriar i cuaternar a unei proteine este determinat de structura primar a lanului polipeptidic. Acest principiu a fcut posibil cunoaterea modului cum se realizeaz n celule sinteza enzimelor i a proteinelor.
Natura i structura proteinelor determin specificitatea biologic a organismelor, a fiecrei specii n parte, a organelor i esuturilor. Numrul mare de izomeri, succesiunea diferit a aminoacizilor din macromoleculele proteice asigur tocmai individualitatea biochimic i genetic a organismelor. Acizii nucleici i nucleoproteinele sunt componenii cei mai importani ai celulelor vegetale i animale. Ei particip la procesele de diviziune celular, de cretere i difereniere celular i determin specificitatea materiei vii. Acizii nucleici au fost descoperii n anul 1871 cnd F. Miescher identific n spermatozoizii petelui somon (Salmo salar) o substan denumit nuclein, format dintr-o protein i un acid organic ce conine fosfor. Acest acid organic a fost identificat pentru prima dat de ctre R. Altmann n anul 1899 i l-a denumit acid nucleic. Biochimistul Kossel a demonstrat c nucleina este format din doi acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) i acidul ribonucleic (ARN). Acidul dezoxiribonucleic se gsete n cea mai mare parte n nucleul celulelor vegetale i animale, iar acidul ribonucleic se gsete att n nucleu, ct i n citoplasm. Acizii nucleici, respectiv nucleoproteinele, constituie, alturi de alte proteine, substanele de baz din care este alctuit cromozomul. Organismele cele mai simple, cum ar fi virusurile, sunt alctuite aproape numai din nucleoproteine.
DOVEZI PRIVIND ROLUL GENETIC AL ADN
Descoperirile care au avut loc la nivelul celulei au permis o grupare a structurilor care dein funcii ereditare. Ne referim la acele structuri care dein o informaie ereditar i care au continuitate i stabilitate celular. Teoria cromozomic a ereditii a atribuit cromozomilor i genelor rolul principal n ereditate, dei nu se cunoteau nc prea multe despre structura chimic a materialului genetic. Identificarea materialului genetic constituie imperativul geneticii n perioada de la mijlocul secolului nostru. Pentru aceasta trebuiau descoperite i dovedite structurile chimice care dein caracteristicile de baz ale materialului genetic: de a stoca i transmite informaia ereditar i de a-i menine stabilitatea cantitativ i calitativ pe parcursul diviziunii celulare. Cercetrile care s-au fcut la nceputul secolului XX privind proteinele i enzimele, au demonstrat marea diversitate i complexitate a acestora, considerndu-se c i genele ar fi tot de natur proteic. Problema care se pune n aceast etap era dac genele, care ar avea o natur proteic, pot s determine sinteza altor proteine i respectiv enzime. Cercetrile au demonstrat c din punct de vedere chimic, un lan polipeptidic nu poate servi pentru propria sintez, n primul rnd datorit faptului c aminoacizii nu manifest atracie chimic pentru aminoacizi identici. Prima ipotez a legturii dintre o gen i sinteza unei enzime a fost elaborat n anul 1908 de ctre medicul englez Garrod care a studiat maladiile ereditare umane ce afecteaz metabolismul intermediar al fenilalaninei. Identificarea materialului genetic a fost posibil datorit descoperirii unor fenomene ereditare de maxim importan: - transformarea bacterian prin intermediul ADN; - transformarea la eucariote prin intermediul ADN; - recombinarea genetic n cursul reproducerii sexuate la bacterii; - transducia bacterian cu ajutorul virusurilor; - transmiterea informaiei ereditare de ctre ARN viral.
Transformarea la procariote
n anul 1928, bacteriologul englez F. Griffith a efectuat mai multe experiene cu pneumococi (Diplococcus pneumoniae), o bacterie care produce la mamifere boala numit pneumonie. Virulena ei este determinat de existena unei capsule format din polizaharide care mpiedic fenomenul de fagocitoz. Coloniile acestor bacterii sunt netede i vscoase, motiv pentru care s-au notat cu S (engl. smooth = neted). Dup reacia imunologic, determinat de tipul de polizaharide ce alctuiesc capsula, exist mai multe tipuri de pneumococi S: SI, SII, SIII etc. Tipul S poate da natere prin mutaii spontane la forme lipsite de capsul, a cror colonii au suprafaa rugoas, notat cu R (engl. rough = aspru, rugos), care sunt nevirulente. Pneumococii de tip R pot fi: RI, RII, RIII, n funcie de tipul S din care provin. F. Griffith a injectat la oareci pneumococi neviruleni de tip RII mpreun cu pneumococi viruleni de tip SIII, ns acetia din urm fuseser omori prin cldur. Surprinztor a fost faptul c oarecii au murit de pneumonie, iar din acetia s-a separat att pneumococi de tip RII ct i pneumococi de tip SIII. Concluzia care s-a desprins a fost c pneumococii de tip RII s-au transformat n pneumococi de tip SIII. Mutaia este exclus n acest caz deoarece tipul RII ar fi trebuit s muteze n tipul SII. Cauza transformrii pneumococilor necapsulai i neviruleni n pneumococi capsulai i viruleni a rmas necunoscut pn n anul 1944, cnd un grup de cercettori americani, O. T. Avery, C. M. Mac Leod i M. Mc. Carty, au reluat experienele fcute de Griffith cu scopul de a identifica substana chimic ce induce transformarea. Ei au extras ADN de la pneumococii de tip SIII i l-au introdus n mediul de cultur al pneumococilor de tip RII. n cultur, pe lng pneumococii de tip RII au aprut i un numr mic de pneumococi de tip SIII, dovedindu-se c agentul transformator este ADN de la tipul donor. Aceast experien poate fi redat sintetic astfel: SIII RII ore 24 in vitro SIII la de ADN RII + + nsuirea de virulen sau nevirulen este legat de prezena sau absena capsulei polizaharidice ce nconjoar pneumococul. ADN transformator a indus pneumococilor neviruleni, acapsulai, nsuirea de virulen, de formare a acestei capsule. Cu ajutorul ADN s-au realizat transformri genetice i pentru alte nsuiri la bacterii. Pneumococii sensibili la streptomicin (St s ) au fost transformai n pneumococi rezisteni la streptomicin (St r ) sub influena ADN extras de la pneumococii rezisteni la acest antibiotic. Fenomenul de transformare genetic s-a realizat i la alte specii de bacterii: Bacillus subtilis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli etc. Transformarea genetic este posibil numai dac bacteriile receptoare prezint o stare de competen, care le permite interaciunea cu un fragment de ADN exogen, asigurnd nglobarea ireversibil a acestuia. Competena este o stare fiziologic tranzitorie care variaz mult n cursul diferitelor faze ale ciclului de multiplicare celular. Celulele bacteriene rmn incompetente dac sunt cultivate la pH mai mic de 7,4, n prezena unor enzime proteolitice sau la densiti celulare mici, condiii n care proteina activator, ce induce competena nu este sintetizat sau este inactivat. Proteina activator este un polipeptid endogen cu greutate molecular mic, cationic, bogat n aminoacizi bazici i hidrofobi, sensibil la enzimele proteolitice i extrem de aderent la toate suprafeele. Starea de competen presupune o serie de modificri ale peretelui celular bacterian. Proteina activator determin o serie de alterri de suprafa prin aciunea murein-hidrolazei, peretele celular devenind mai poros i cu o suprafa intens electropozitiv, ceea ce favorizeaz legarea fragmentelor de ADN exogen, ncrcate electronegativ (Zarnea G., 1986). n ceea ce privete mecanismul de transformare genetic se afirm c ADN exogen ptrunde n celula bacterian printr-o regiune denumit mezozom. Cromozomul bacterian este ataat de membrana celular tot n zona mezozomului. Ptruns n celula bacteriei acceptor, ADN exogen realizeaz o sinaps, cu o zon cu nucleotide complementare din cromozomul acesteia. n final, ADN exogen, se integreaz n cromozomul bacteriei receptoare. ADN exogen este o secven de 900 de nucleotide, n medie, reprezentnd, frecvent, o singur gen, mai rar dou, trei gene. Integrarea ADN exogen n cromozomul bacterian, formeaz un ADN heteroduplex, deoarece nu se realizeaz o complementaritate perfect a nucleotidelor. n replicarea ulterioar a acestui ADN, vor rezulta dou molecule, una de tipul ADN receptor i cealalt de tip ADN transformat. (Raicu P., 1997).
Transfecia la procariote
Rolul genetic al ADN a fost pus n eviden i printr-o serie de experiene cu bacteriofagi (virusuri ce atac i distrug bacteriile). Importante n acest sens sunt experienele efectuate de A. Hershey i M. Chase (1952) privind infecia viral, constituind i primele experiene de transfecie, care const n introducerea de ADN exogen n celule receptor. Ei au folosit bacteriofagii din seria T i n special bacteriofagul T 2 , unul din cei mai mari bacteriofagi (2400-2500 ). Bacteriofagul este constituit din cap i coad. Capul conine n interior ADN iar nveliul (capsida) i coada sunt constituite din proteine (figura 3.1). Fagii se reproduc numai n celulele bacteriene cu ajutorul aparatului enzimatic al acestora. Infecia viral are loc astfel: fagul se prinde cu filamentele codale de membrana bacteriei. Enzimele fagului dizolv n acest punct membrana bacteriei, iar ADN fagic este introdus prin coada acestuia n celula bacterian. ntr-un interval de timp destul de scurt, n interiorul bacteriei se formeaz cteva sute de bacteriofagi, bacteria fiind distrus (liza bacteriei) i fagii sunt eliberai putnd infecta alte celule. Faptul c bacteriofagii se reproduc n interiorul bacteriei, denot c ADN fagic are capacitatea de a se autoreproduce (funcia autocatalitic) i n acelai timp deine informaia genetic necesar sintezei proteinelor proprii necesare constituirii capsidei pe baza aminoacizilor liberi din celula bacterian (funcia heterocatalitic).
Se pune ntrebarea dac, pe lng ADN fagic, n interiorul bacteriei nu ptrund i proteinele virale. Pentru a clarifica acest aspect A. Hershey i M. Chase au folosit izotopii radioactivi P 32 i S 35 . Fosforul radioactiv marcheaz molecula de ADN iar sulful radioactiv marcheaz proteinele. S-au cultivat bacterii E. coli pe un mediu la care s-a adugat fosfor radioactiv (P 32 ). Dac se infecteaz cultura cu bacteriofagi T 2 , vor rezulta bacteriofagi marcai radioactiv, deoarece ADN fagic incorporeaz izotopul P 35 . Cu aceti bacteriofagi marcai s-au infectat alte bacterii neradioactive. Fig. 3.1. Structura fagilor de tip T
ADN fagic radioactiv a ptruns n interiorul bacteriilor, n timp ce capsida fagilor, nemarcat, a rmas la nivelul peretelui celular bacterian. Dac bacteriile au fost infectate cu bacteriofagi marcai cu S 35 , bacteriile nu devin radioactive pentru c n acest caz izotopul S 35 s-a localizat numai la nivelul proteinei din capsid. i ntr-un caz i n altul capsidele au rmas aderente de suprafaa bacteriei, putnd fi izolate prin agitare. n interiorul bacteriei ptrunde numai ADN fagic, care realizeaz procesul de transfecie. La eucariote, transfecia s-a realizat prin mai multe metode: adiia de cromozomi metafazici la suspensii celulare, cu ADN exogen purificat sau prin folosirea unui vector retroviral care poart o anumit gen. Introducerea ADN exogen realizeaz modificri ale genomului receptor, n urma crora se realizeaz organisme modificate genetic, respectiv plante i animale transgenice sau nlocuirea unor gene defective cu gene normale, ceea ce reprezint terapia genic.
Transformarea la eucariote
Transformarea genetic la organismele superioare a evideniat rolul genetic al ADN. Primele experiene de transformare genetic la eucariote au fost realizate n anul 1959 de J. Benoit, P. Leroy, R. i C. Vendrely. S-a extras ADN din spermatozoizii i eritrocitele masculilor din rasa de rae Khaki Campbell i s-a introdus intraperitoneal la bobocii de rae din rasa Pekin. Adulii din rasa Pekin, rezultai din bobocii tratai au prezentat o serie de modificri morfologice privind culoarea penajului, a ciocului i picioarelor, a taliei, realizndu-se o nou ras denumit Blanche-neige. n anul 1971, C. R. Merril i colab. au transferat gene de la Escherichia coli n celulele umane. Astfel, gena ce metabolizeaz galactoza la E. coli a fost preluat de fagul lambda i apoi transferat de acesta n celulele fibroblastice umane ce proveneau de la un bolnav de galactosemie (nu putea metaboliza galactoza). Fenomenul de transformare a fost realizat i la alte organisme superioare: Drosophila melanogaster, Bombyx mori, Petunia hybrida, Hordeum vulgare .a. La noi n ar, P. Raicu i colab. (1963), au introdus prin vacuum infiltraie ADN de la Triticum durum n boabe de gru de la specia Triticum aestivum. Plantele rezultate din boabele tratate cu ADN exogen prezentau modificri privind culoarea i ritmul de cretere.
Materialul genetic al ribovirusurilor
Astzi se consider c virusurile constituie sisteme complexe alctuite din dou componente: nveliul proteic care nu are rol genetic i ADN sau ARN ce dein mesajul genetic. nveliul proteic denumit i capsid conine uniti mai simple denumite capsomere. Exist dou categorii de virusuri, unele au ca material genetic ADN i sunt denumite dezoxiribovirusuri, iar altele conin ARN i sunt denumite ribovirusuri. Ribovirusurile cele mai cunoscute sunt: virusul mozaicului tutunului (VMT), virusul poliomielitei, al encefalitei, bacteriofagul F2, virusul gripal, virusul sarcomului Rous (RSV), multe virusuri tumorale etc. Rolul genetic al ARN a fost pus n eviden la virusul mozaicului tutunului de H. F. Conrat i R. Williams (SUA, 1955) i A. Gierer i G. Schramm (Germania, 1956). Virusul mozaicului tutunului conine aproximativ 6% ARN v i 94% proteine. Ei au izolat ARN v de proteina viral i au fcut infecii cu ambele componente pe frunze sntoase de tutun. S-a constatat c boala denumit mozaicul sau arsura frunzelor de tutun s-a manifestat numai la frunzele infectate cu ARN v . Se poate afirma c la ribovirusuri, ARN v stocheaz informaia genetic necesar sintezei proteinelor virale care vor constitui capsida viral.