SECUENCIACIN

DE ADN
Trozo de
ADN
Aminocidos
de una
protena.
Secuencia
designa la
composicin de
nucletidos
Tipo
Orden de sus
nucletidos.
Secuenciar
determinar la
estructura de
una secuencia
de ADN
Cmo se secuencia el ADN?
Histricamente hay
dos mtodos de
secuenciacin del
ADN
Maxam & Gilbert, o
secuenciacin
qumica
Sanger, que usa
dideoxynucleotidos
Maxam & Gilbert, o secuenciacin
qumica
1977
Secuenciacin de ADN mediante
degradacin qumica.

Basado en la modificacin qumica y
posterior rotura del ADN

Permita utilizar un ADN purificado sin
necesidad de clonarlo.
(A)marcaje radiactivo en uno de los extremos y
la purificacin de fragmento de ADN. El
tratamiento qumico genera rupturas en una
pequea proporcin de uno o dos de los cuatro
nucletidos en cada una de las cuatro
reacciones (G, A+G, C, C+T). Luego, se realiza el
tratamiento con piperidina a 90C para clivar el
enlace azcar-fosfato en los sitios
correspondientes. De ese modo se genera una
serie de fragmentos a partir del extremo
marcado radiactivamente hasta el primer lugar
de corte en cada molcula.
Maxam & Gilbert, o secuenciacin
qumica
Maxam & Gilbert, o secuenciacin
qumica
(B) Los fragmentos se separan por tamao
mediante electroforesis en gel, separando los
productos de las cuatro reacciones en cuatro
calles del gel distintas.
Para visualizar los fragmentos generados se hace
una autoradiografa, lo que provee una imagen de
una serie de bandas oscuras correspondientes a los
fragmentos marcados con el radioistopo. A partir
de la lectura de estos fragmentos, desde abajo
(fragmentos ms pequeos) hacia arriba
(fragmentos ms grades), se puede inferir la
secuencia de ADN de inters.
Mtodo de terminacin de la
cadena de Sanger
1977
Se utilizan pocos reactivos txicos y
cantidades menores de radiactividad.
Uso de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs)
como terminadores de la cadena de ADN.

Los ddNTPs son desoxinucletidos de las 4 nucletidos diferentes (dATP,dTTP, dCTP y dGTP) que
carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de estos nucletidos se
incorpora a una cadena de ADN en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongndose ya
que la enzima ADN polimerasa necesita un extremo 3 OH para aadir el siguiente nucletido, y el
ddNTP incorporado carece de este grupo hidroxilo.
Mtodo de terminacin de la cadena
de Sanger
Fragmentos de ADN de longitud
variable, son desnaturalizados por calor
y separados por tamao mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida -
urea.
Cada una de las 4 reacciones de
sntesis se corre en calles individuales (A,
T, G y C) y se visualizan las bandas de
ADN mediante autoradiografa o luz
ultravioleta. Las bandas obtenidas en el
gel corresponden a los fragmentos de
ADN de diferentes longitudes.
Las posiciones relativas entre las cuatro
calles se utilizan entonces para leer (de
abajo a arriba) la secuencia de ADN.
Los secuenciadores automticos
Variaciones del mtodo de Sanger.
Secuenciacin por terminador
fluorescente, en la cual se marca
cada uno de los cuatro ddNTPs que
terminan la cadena con un
colorante fluorescente diferente, los
cuales fluorescen a diferentes
longitudes de onda.
Despus, los productos se mezclan y se someten a electroforesis en gel. Mientras que los fragmentos
de ADN se desplazan a travs del gel, pasan por un rayo lser que excita al compuesto fluorescente.
La luz emitida es detectada por un fotomultiplicador, que est conectado con una computadora
que colecta y analiza los datos
La secuenciacin de genomas a gran
escala
Conocer la secuencia de fragmentos muy grandes de ADN.
Esto es necesario en cualquier proyecto genoma en donde el ADN puede estar
formado por miles de nucletidos (genomas bacterianos) a 200 millones de
bases (Cromosoma 1 humano).

Principales formas
de secuenciar a
gran escala el
genoma
Secuenciacin
jerrquica
Secuenciacin de
genomas
completos
Secuenciacin jerrquica
(hierarchical shotgun
sequencing):
El primer paso consiste en construir una genoteca
por fragmentacin del ADN e introduccin del mismo
en vectores que aceptan grandes insertos, en este
caso de BACs. Los fragmentos de ADN representados
en la genoteca son organizados en un mapa fsico y
los clones individuales son seleccionados y
secuenciados para lo cual se hace una nueva
genoteca de trozos ms pequeos (shotgun library).
La secuencia de los clones se ensambla finalmente
para reconstruir la secuencia del genoma.
Secuenciacin de genomas
completos (whole genome
shotgun sequencing):
En este mtodo el genoma completo es cortado en
pequeos fragmentos de ADN. A diferencia del
mtodo anterior no se utilizan mapas fsicos como
referencia para ordenar los fragmentos. As, cada
fragmento es secuenciado primero y las secuencias
solapantes se ubican juntas para crear un contiguo.
Para lograr el solapamiento, los fragmentos de ADN
deben ser secuenciados varias veces.
Nuevos mtodos de secuenciacin:
secuenciacin de alto rendimiento
Secuenciacin ms barata y eficiente, a pesar de
obtener fragmentos de menor tamao.
Secuencias obtenidas requieren el empleo de
potentes herramientas informticas para su
ensamblaje.
Actualmente, los sistemas de nueva generacin
disponibles en el mercado son el mtodo 454 de
Roche, Solexa de Illumina y SOLiD de Applied
Biosystems.
La mayora de los mtodos utilizan un paso con
clonacin in vitro para generar muchas copias de
cada molcula individual, ya que los mtodos de
deteccin molecular frecuentemente no son lo
suficientemente sensibles para la secuenciacin de
una sola molcula.
Genotecas y secuencias de
aislamiento
L
a

c
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l
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c
a

Aislar el genoma completo de la clula (obtencin de
DNA genmico)
Fraccionar el genoma en fragmentos de un tamao
apropiado
Clonar cada fragmento en un vector (ligar cada
fragmento a un vector)
Introducir cada molcula recombinante, fragmento-
vector en una clula husped
En muchos
programas
biotecnolgicos de
nueva generacin
se pretende aislar
algn gen que
determine una
protena de inters.
En muchos casos,
para lograr esto se
suele recurrir a la
creacin de una
genoteca para
rastrear luego en
ella buscar dicho
gen.

T
i
p
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d
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g
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n
o
t
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c
a
s

Genoteca genmica: contiene el genoma de un organismo
Genoteca de ADN copia: contiene los genes que se expresan
en las condiciones en las que se encontraba la clula en el
momento de obtener la muestra de ARN a partir de la cual se
sintetiza el ADN copia
Mini genotecas o genotecas parciales: contienen slo una
fraccin del genoma o del ADN copia
O
b
j
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v
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s
t
r
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c
c
i

n

El aislamiento de secuencias y genes: punto de
partida para el estudio molecular
La conservacin del genoma: la excepcionalidad de
una muestra biolgica aconseja conservar su material
gentico (restos arqueolgicos, especies en extincin,
individuos con patologas nicas)
Estudio de la secuencia genmica: conocer la
secuencia completa de un genoma implica su
clonacin previa
M

t
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g
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n
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t
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c
a

Hibridacin de ADN usando alguna sonda marcada
Rastreo inmunolgico (uso de anticuerpos frente al
producto de inters)
Rastreo o seleccin de la actividad biolgica de la
protena
MANIPULACIN
GENTICA DE
ANIMALES
TRANSGNESIS Y CLONACIN

Diseo y construccin de los
primeros animales transgnicos.

Auge de la transgnesis
experimental.