Sunteți pe pagina 1din 40

Metode Cromatografice

Dr. Brndua-Alina Petre


Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Metode cromatografice: notiuni generale
Cromatografia o tehnica de separare a amestecurilor, in componentele sale cu scopul de a le
analiza, identifica, purifica si /sau cuantifica. Cromatografia se bazeaza pe interactiunea
diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti) cu ajutorul a doua faze
cromatografice: faza mobila si faza stationara.
Principalele avanteje pe care le prezinta cromatografia ca metoda de separare sunt:
- Permite separarea, identificarea si dozarea cantitativa a componentelor unui amestec.
- Se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practic orice compus organic/ bio-organic
poate fi separat printr-o metoda cromatografica
- Sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicata. n acelasi timp nsa se pot
aplica si la scara preparativa.
- Durata analizei este redusa, comparativ cu alte metode de analiza ale amestecurilor complexe.

Separare
Analiza
Identificare
Purificare
Cuantificare
Componente Amestec
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Metode cromatografice: scurt istoric
1901 - botanistul rus Tswet, care a separat niste pigmenti vegetali pe o coloana umpluta cu
carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol.

Denumirea provine de la cuvintele gecesti chromos = culoare si graphos = scriere.

1941 - A. Martin si R. Synge au initiat cromatografia lichida de repartitie pe coloana, pentru care
au primit ulterior Premiul Nobel n 1952. Ei au separat aminoacizi acilati pe o coloana ce
continea silicagel, iar drept faza mobila au utilizat n-butanol saturat cu apa.

1943 - tot ei s-au pus bazele cromatografiei pe hrtie, prima forma de cromatografie planara.

1947 - s-au pus bazele cromatografia de schimb ionic.

1950 - A. Martin, care mpreuna cu A.T. James a separat acizi organici volatili pe o coloana de
sticla umpluta cu Celite acoperita cu ulei siliconic, utiliznd ca faza mobila azotul.

1959 - Cromatografia pe coloane cu gel a fost initiata n de Porath si Flodin.
Cromatografia de lichide moderna pe coloana, numita de nalta performanta sau de
nalta presiune (HPLC) poate fi datata la nceputul anilor 1960 si se bazeaza pe lucrarile
lui Csaba Horvth, efectuate la Univesitatea Yale.

1967 Cromatografia de bioafinitate.
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Clasificarea metodelor cromatografice
1. Clasificarea n functie de mecanismul separarii
1.1. Cromatografie de adsorbtie
1.2. Cromatografie de repartitie
1.3. Cromatografie de schimb ionic
1.4. Cromatografie de excluziune
1.5. Cromatografie de afinitate

2. Clasificarea n functie de natura fazelor cromatografice
2.1. Cromatografie de gaze
2.1. Gaz-lichid (GLC)
2.2. Gaz-solid (GSC)
2.2. Cromatografie de lichide
2.1. Lichid-lichid (LLC)
2.2. Lichid-solid (LSC)
2.3. Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

3. Clasificarea n functie de configuratia sistemului cromatografic
3.1. Cromatografie pe coloana
3.1.1 Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)
3.1.2 Cromatografie pe coloane capilare
3.2. Cromatografie planara
3.2.1 Cromatografie n strat subtire
3.2.2 Cromatografie pe hrtie
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Gaz cromatografia (GC)
Analizeaza compusi organici volatili. Faza mobila este un gaz iar faza stationara este de
obicei un lichid pe un suport solid sau un solid absorbant.

Lichid cromatorafia (LC)
Se foloseste pentru separarea analitilor in solutie. Faza mobila este un solvent iar faza
stationara este un lichid pe un suport solid (ex. rasina ion-exchange).
High-performance liquid chromatography (HPLC)
O varianta a cromatografiei de lichide care utilizeaza presiune inalta pentru a creste
eficienta separarii.


Size-exclusion chromatography (SEC)
Numita si gel-permeation chromatography (GPC), faza mobila este un solvent si faza
stationara este un material poros.
Thin-layer chromatography (TLC) - cromatografia in strat subtire
O metoda simpla si rapida de a monitoriza produsii unei reactii sau de a verifica puritatea
unor compusi organici. Faza mobila este un solvent si faza stationara este un solid adsorbit
pe un suport solid.
Tipuri de metode cromatografice
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Diferite tipuri de interactiuni in cromatografie
Cromatografie de adsorptie
pentru GC & LC
Cromatografie de partitie - pentru GC
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
resin-SO
3
-
gel filtration by size
resin-N(CH
3
)
3
+

Diferite tipuri de interactiuni in cromatografie
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Depinde de pH si taria ionica

Selectivitate mare !
Diferite tipuri de interactiuni in cromatografie
Amino Acids
Proteins
Specific Metal Binding Metal Chelate
Interaction (MCIC)
Proteins and Enzymes Biospecific (very strong) Affinity (AF)
Proteins, Peptides
Amino Acids
Nucleic Acids
Dispersive Interactions
Aqueous/organic
Reversed Phase (RPC)
Proteins
Polysaccharides
Dispersive Interactions
Salt Gradients
Hydrophobic
Interaction (HIC)
Proteins and Peptides
Nucleic Acids
Polysaccharides

Electrostatic Interactions


Ion Exchange (IEC)

Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Chromatographic methods used in Biomolecule Separation
Cromatografia de lichide de inalta
performanta (HPLC)



Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Adsorptia/ Desorptia in HPLC
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Principiul de separare a doua componente
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Solvent
B
Solvent
A
Programmer
Flow
controller
High preassure
pumps
High preassure
mixing chamber
Injection unit
Column Detector
Data
Processing
Computer
Schema unui sistem HPLC
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Injection unit- 6 port valve
Traseul fazei mobile printr-un injector / loop

Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Instrumente HPLC
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Principalele caracteristici ale unei cromatograme
Cromatogram: diagrama semnal obtinuta in funcie de timp elutie al analitului:
forma peack-lui, pozitia si rezolutia.
Peak individual (semnal individual)
a) Timpul de retentie(t
r
) :
timpul necesar analitului de a ajunge la detector dupa introducerea lui in
sistemul cromatografic.
b) Un peak cromatografic ideal
forma Gaussian (w

= 2.35 , w = 4 )
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Peak-uri multiple - Elicienta separarii : doi factori contribuie la cat de bine sunt separare
componentele unui amestec:
- latimea peak-lui (latime mare separare insuficienta)
- spatiile de timp (spacing in time) (distanta mare separare buna)


Principalele caracteristici ale unei cromatograme
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Rezolutia
( )
( )
Rs 2 s.p. the of length 2
1.5 Rs analysis, ve quantitati For
L
w w 2 1
t t
w
t
Rs
2 1
r r
av
r 1 2
|
>

= =
Principalele caracteristici ale unei cromatogrameC
Deviatii de la cromatograma ideala
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Calitativ:
Cromatografie
Spectrometrie de masa
Spectrometrie IR
Cantitativ:
Aria peak-lui
Standard intern


Determinarea calitativa & cantitativa prin metode cromatografice
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Separarea depinde de:
- Faza stationara ( tipul de coloana)

- Faza mobila (solvent si gradient)
Scaling up
1. Coloane analitice - scala mica: separare, identificare, sau masurare.
2. Coloane preparative scala mare: purificare
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Scaling up : coloane cromatografice
Analitic
Preparativ




Faza stationara:
Matrice suport:
- polimeri naturali(celuloza, dextran, agaroza)
- polimeri sintetici( alcoli polivinilici)
- materiale anorganice (silica, alumina, zirconia)

bonded phase (faza functionala) :
-non-polara (C4, C8, C18)
-Polar (-NH
2
, -CN)
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Coloane cromatografice LC/ HPLC
Faza mobila pre-conditii:

miscibla cu apa
viscositate mica
detectie UV mica
solubilitate buna
ne-reactiva d.p.d.v. chimic
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Separare liniara depinde de marimea moleculelor se
separat si de dimensiune porilor in faza stationara
Timp
Covex
Liniar


in trepte
Concav


Izocratic
5
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Elution procedure
Reducand polaritatea fazei mobile permite desprinderea (elutia) moleculelor hydrophobic
legate de faza stationara. Aceasta se face prin aducerea in sistem a unui solvent organic
precum AcCN, metanol sau isopropanol.
TFA ion pairing agent
Faza mobila: Eluent A: 0.1% TFA in MilliQ
Eluent B: 80% AcCN, 0.1% TFA in MilliQ


Elutia cromatografica tipuri de gradiente
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Elutie izocratica cu diferite procente de solvent organic
Influenta gradientului asupra separarii
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Gradient A pentru peptida X.
Time(min) %A %B Flow (ml)
0 95 5 1
5 95 5 1
60 40 60 1
65 0 100 1


peptida X a eluat la un Rt =32 min
Gradient B pentru peptida X.
Time %A %B Flow (ml)
0 75 25 1
5 75 25 1
25 55 45 1
30 0 100 1
35 0 100 1
38 80 20 1

peptida X elueaza la un Rt =17 min

Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Stabilirea unui gradient pentru separarea cromatografica
Teoria talerelor
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Se consider c o coloan este structurat ntr-un numr de celule sau talere, numite n
cazul procesului cromatografic talere teoretice. Fiecare taler are o lungime finit, n care
analitul se gsete (staioneaz) un anumit interval de timp.
Se considera un echilibrul de repartiie cromatografic a unui analit X, ntre o faz mobil
(notat cu indicele m) i o faz staionar (s)
Numarul de talere teoretice a unei coloane cromatografice a fost identificat cu eficienta ei.
Referinta : http://cachescan.bcub.ro/2008_05_28/cap_9_1_pagini_133_147.pdf
Teoria talerelor i propune s stabileasc o relaie ntre concentraia analitului X n
faza mobil dup parcurgerea a n talere din coloana cromatografic.
Teoria talerelor
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Reprezentarea a trei talere teoretice
succesive dintr-o coloana.
In conditii de echilibru
dm - variatia de mas de analit din talerul p.





Vt - volumul talerului
V - volumul coloanei
- numarul de talere

viteza de modificare a conc. unui analit in faza mobila din talerul
notat cu p la trecerea fazei mobile prin el. Solutia acestei ec. reda
conc. analitului X in faza mobila din talerul notat cu p pentru un
numar de talere teoretice din coloana cromatografica notata cu .
In practica este mult mai mare decat 100 iar ecuatia finala devine
una de tip Gauss in acord cu forma experimentala a picurilor
cromatografice.

*
-conc. initiala a
analitului X
*
H- inaltimea unui taler
N- nr. de talere teoretice
L- lungimea coloanei
Teoria talerelor exprima calitatea unei coloane prin nr. de talere teoretice atribuite procesului
cromatografic pentru un anumit analit injectat in coloana, dar nu reda si o explicatie a
mecanismului ce sta la baza echilibrelor de distribuie ale analiilor ntre faza mobil i faza
staionar.







Teoria dispersiei de pinde de:
- viteza transferului de mas ntre cele dou faze participante la procesul cromatografic
- viteza de difuziune a moleculelor de analit (solut) de-a lungul coloanei i
- hidrodinamica fazei mobile.
Teoria dispersiei frontului de analit n coloana cromatografic
ecuatia van Deemter
H- inaltimea talerului teoretic
A - constanta de difuziune turbulent
B- constanta difuziei longitudinale
C- constanta transferului de mas al analitului n faza staionar
- viteza fazei mobile

Reprezentarea grafic a ecuaiei van Deemter.
Reversed Phase Chromatographie (RP-HPLC): separa moleculele pe baza
diferentelor in hidrofobicitate. In RP-HPLC polaritatea fazei stationare este mai
mica decat cea a fazei mobile.
- bonded phase este extrem de hidrofobica sau ne-polara.
- faza mobila este polara, in mod uzual apa.
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Faza normala si faza inversata in cromatografie
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Cromatografia Reversed Phase - principiu
THF- tetrahidrofuran
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Optimizarea solubilitatii probelor (pentru proteine si peptide)
Detectori : detectia probelor introduse in sistemul cromatografic
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Detector Senzitivitate
Absorptie UV/VIS 100 pg 1 ng
Fluorescenta 1 10 pg
Spectrometrie de masa 100 pg 1 ng
Electrochimic 10 pg 1 ng
Index de refractie 100 ng 1g
Peptide / proteine detectie UV la 220 nm
Proteinele in soluie absorb lumina ultravioleta cu o absorbana maxim la 200 nm si 280 nm.
Aminoacizii cu inele au o absorbana maxima la 280 nm.
Legaturile peptidice dau o absorbanta maxima la 220 nm.
Structura secundar, teriara, cuaternara, precum si factori, cum ar fi pH-ul, tria ionic, etc
pot modifica spectrul de absorbana.
Tipical cromatogram in LC/MS
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
i
n
t
e
n
s
i
t
a
t
e

time


Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)
Viteza (timp mai scurt), sensitivitate si rezolutie mai mare
UPLC- foarte importanta in industria farmaceutica si identificarea proteinelor target.

Prin folosirea unor particule mai mici (1,7 m, 2 m), viteza i capacitatea de
separare (numrul de peak-uri soluionate pe unitatea de timp) pot fi extinse la noi
limite. Pentru a preveni back pressure UPLC foleseste pompe ce permit o presiune
de 1000 bari.

Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
UPLC - cromatograme
Concentratia
Cofeinei (g/l)
Aria Peak-lui
(mVmin 10
7
)
0.25 2.2665
0.5 3.5074
0.75 5.5779
1 6.7391
1.25 8.1167
1.50 9.5658
2 12.5890
X1=
X2=
Vydac C
18
column
: 274 nm

Coffein Structure
Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Determinarea cantitativa a cofeinei prin RP-HPLC
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0,5 1 1,5 2 2,5
concentration g/l
p
e
a
k

a
r
e
a

m
V


m
i
n


1
0

7

Proteomica curs nr. 5 - Metode cromatografice
Curba de calibrare standard a cofeinei