Sunteți pe pagina 1din 44

SELECIA ASISTAT DE MARKERI

MOLECULARI


CURS NR.10 11.06.2013
METODE MODERNE DE AMELIORARE

DISCIPLINA AMELIORAREA PLANTELOR I PRODUCERE DE SMN
AN III, SEM. II
PLANUL CURSULUI
METODE MODERNE DE
AMELIORARE
Selecia asistat de markeri moleculari
(marker-assisted selection MAS)
Plante modificate genetic (PMG)

CLASIFICAREA
METODELOR DE AMELIORARE
I. METODE CLASICE (CONVENIONALE) DE
AMELIORARE
1. Metode de inducere a variabilitii genetice;
a) Hibridarea (inducerea variabilitii prin recombinaii)
b) Mutageneza (inducerea variabilitii prin mutaii)
2. Metode de izolare a genotipurilor valoroase
a) Selecia n condiii de autofecundare;
b) Selecia n condiii de fecundare strin
3. Alte metode de ameliorare
a) Consangvinizarea i Heterozisul;
b) Androsterilitatea
c) Poliploidia
II. METODE MODERNE (NECONVENIONALE) DE
AMELIORARE


1. Selecia asistat de markeri moleculari;
Analiza QTL (quantitative trait loci);
2. Tehnici de cultur in vitro: tehnologia
microsporilor, embriogeneza somatic, variabilitatea
somaclonal;
3. Metode i tehnici de inginerie genetic:
transformarea genetic prin utilizarea tehnologiei
ADN recombinant i obinerea de PMG.
DEFINIIE
MAS - este un proces de selecie indirect unde caracterul
de interes este selectat nu pe baza aspectului exterior al
caracterului n sine (pe baza fenotpipului), ci cu ajutorul unui
marker genetic din apropierea caracterului (genei) de pe
ADN.
ncruciri n ser Backross-uri n cmp
F
2

P
2

F
1

P
1

x
Populaii largi alctuite din mii
de plante
SELECTIA FENOTIPIC
Experiene n cmp
Experiene n ser
Donor
Recurent
Ameliorarea convenional
F
2

P
2

F
1

P
1
x
Rezistent Sensibil
Selecia asistat de markeri (MAS)
Ameliorarea asistat de markeri
Metoda n care selecia se bazeaz pe markeri ADN
Populaii largi alctuite din mii de
plante
Avantajele MAS
1. Pot fi identificate genotipuri cu performane superioare n
generaii timpurii;
2. Prezint capacitatea de selecie pentru alele recesive sau
trsturi mascate;
3. Pot fi nlocuite metodele costisitoare de screening;
4. Este rapid.


Metoda indirect de selecie cu ajutorul markerilor
moleculari este preferabil seleciei directe n unele situaii,
cum ar fi:
identificarea indivizilor n stadii timpurii de cretere i
dezvoltare, pentru backcross sau pentru programele de
ameliorare a unor populaii;
n cazul unor caractere ereditare care implic mai muli
loci (QTL);
selecia pentru mai multe caractere
(1) Prelevare de probe
frunze de la plante
tinere
(2) Extracia de ADN
(3) PCR
(4) Gel de electroforez
(5) Analiza markerilor
Etapele
analizelor
moleculare
CE ESTE MARKERUL GENETIC?

Un marker genetic poate fi orice regiune din genom n
care exist o variaie detectat care poate face diferena ntre
indivizii unei populaii.
Diferena care apare rar este numit mutaie, iar o
diferen care apare frecvent este numit polimorfism .
Sistemele de markeri sunt analizate pe baza a dou criterii:
a) coninutul de informaii;
b) proporia de multiplex.
Informativitatea unei clase de markeri este reprezentat de
uurina markerilor de a detecta polimorfismul ntre doi indivizi.
Heterozigoia este un bun indicator al ncrcturii de informaii. Ea
este definit ca probabilitatea ca cele dou alele luate la ntmplare
dintr-o populaie s poata fi distinse, utiliznd un marker molecular.
Proporia de multiplex este definit ca fiind numrul de loci (benzi)
analizai simultan per experiment (pe gel).
Proporia de multiplex i heterozigoia reprezint indicele de
marker (MI)
Utilizarea markerilor se bazeaz pe polimorfismul existent n
Utilizarea markerilor se bazeaz pe polimorfismul existent n
populaiile naturale, care poate fi clasificat n trei categorii:
- de secven
- de inserie / deleie
- de numr al unitilor care se repet n regiunile cu ADN
repetitiv.
Din punct de vedere genetic, se poate considera c exist markeri
cu specificitate de locus i codominani i markeri fr specificitate de
locus i dominani.
Un locus reprezint poziia ocupat de o gen sau un segment de
ADN la nivelul unui cromozom, iar o alel reprezint una dintre
variantele unei gene care se gsesc la acelai locus, afecteaz acelai
caracter fenotipic i care se deosebesc ntre ele prin polimorfismul
secvenei de nucleotide.
Markerii dominani pot fi utilizai pentru studiul diversitii
speciilor, pentru clonarea poziional i pentru alctuirea rapid a
hrilor genetice, mai ales la speciile mai puin studiate.
Markerii codominani se folosesc pentru realizarea hrilor
genetice, pentru cartografierea comparat, pentru cartografierea
genelor cu efecte cantitative (QTL).
n funcie de tehnica utilizat, markerii ADN pot fi clasificai n
dou categorii:
- markeri pe baz de hibridizare
- markeri pe baz de PCR.
Un marker molecular (ADN) ideal ar trebui s
ndeplineasc urmtoarele proprieti:
- polimorfism nativ ridicat;
- codominant pentru a putea determina statutul de
homozigot sau heterozigot al organismelor
diploide;
- apariia frecvent n genom;
- comportarea selectiv neutr la condiiile de mediu
i la cele impuse de analizele genetice;
- disponibil;
- testarea uoar i rapid;
- posibilitatea mare de reproducere a determinrilor.
Un marker ADN care s ndeplinesc toate aceste condiii
este dificil de gsit, dar n funcie de tipul de studiu care
urmeaz s se fac, se alege un marker adecvat.
Markerii trebuie s fie
la o distan foarte mic de locii int!
Markerii ideali ar trebui s fie la o distan de sub 5 cM
fa de gena sau genele (QTL) int
Utiliznd o pereche de markeri ce flancheaz gena de
interes poate crete eficiena seleciei, dar cresc i
costurile i timpul
Marker A
QTL
5 cM

95%
Marker A
QTL
Marker B
5 cM
5 cM
~99.5%
Markerii trebuie s fie polimorfici
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
RM84 RM296
P
1
P
2
P
1
P
2
Not polymorphic Polymorphic!
ADN - extracie
Prelevare probe - frunze
Plci de porelan
Mojar cu pistil
Markeri ADN bazai pe PCR
Tehnic simpl i costuri reduse
GEL de electroforez
(agaroz ori poliacrilamid)
PCR
PCR Buffer +
MgCl
2

+

dNTPS +
EnzimaTaq +
Primeri +
Matria de ADN
Termocycler
Agaroz - gel electroforetic
Lamp UV
UV transilluminator
UV light
UV transilluminator
Acrilamid gel electroforetic 1
Acrilamid gel electroforetic 2
I. MARKERI PE BAZ DE PCR
In 1983, cercettorul Kary Mullis descoper o ingenioas tehnic
de amplificare a ADN in vitro numit reacia de polimerizare n lan
(Polymerase Chain Reaction PCR).
CE ESTE REACIA PCR?
Este un procedeu rapid de amplificare enzimatic in vitro a
unui segment specific de ADN.


CARE SUNT COMPONENTELE REACIEI PCR?

1. Matria de ADN un segment dublu catenar de ADN ce
urmeaz a fi amplificat
2. Primeri secvene scurte monocatenare de ARN
3. Enzima ADN polimeraza (component proteic)
4. 4 dezoxinucleotide trifosforice dTTP, dGTP, dATP, dCTP
5. Un tampon de reacie cu sruri (MgCl2,KCl, Tris HCL pH8,4
6. Ulei mineral steril
CARE SUNT ETAPELE REACIEI PCR?

ntr-o reacie PCR exist o alternan de 3 temperaturi controlate,
care sunt repetate n 25 50 cicluri:

1. DENATURAREA
60 secunde - 94 grade C
1. Renaturarea (prinderea primerilor)
60 secunde - 60 grade C
Primer sens (forward primer) ce se prinde de secvena complementar, n
sensul regiunii ce va fi amplificat.
Primer antisens (reverse primer), ce se leag n josul regiunii.
3. Extensia
2 minute - 72 grade C

Aceast temperatur este optim pentru activitatea ADN polimerazei
(copiaza catena- matrita de ADN, adauga dNTP)
Amplificarea exponenial a ADN-lui
RAPD (Random amplified polymorphic DNA = polimorfismul ADN
amplificat cu primeri randomici)

Aceast tehnic presupune utilizarea unor primeri arbitrari (cu
lungimea de 10 nucleotide) pentru amplificarea unor fragmente de
ADN fa de care manifest complementaritate.
Produii de amplificare sunt analizai prin separarea
electroforetica n sistem orizontal n gel de agaroz i se coloreaz cu
bromur de etidium.
Markerii RAPD pot fi utilizati i n determinarea distanei
genetice dintre indivizii nrudii.
Metoda RAPD constituie un instrument valoros n analizele
biologiei moleculare, mai ales pentru cartarea i amprentarea genetic.
AVANTAJE
- detecia neradioactiv;
- nu necesit informaii n prealabil despre secvena de ADN
din genom;
- sunt utilizai ca markeri universali pentru orice genom;
- utilizeaz o cantitate mic de ADN genomic;
- detectarea multipl a polimorfismului;
- simplitate experimental;
- nu necesit echipamente scumpe.
DAF (DNA amplification fingerprinting = amprente genetice ale
produilor amplificrii)

Utilizeaz primeri arbitrari foarte scuri cu lungimea de 5-8
nucleotide pentru amplificarea AND.
Produii de amplificare sunt separai pe gel de poliacrilamid i
vizualizai prin colorare cu argint.
Tehnica DAF necesit o optimizare cu grij a parametrilor, dar cu
toate acestea este foarte potrivit pentru automatizare i pentru
marcarea cu fluorescen a primerilor.
Aceast tehnic este foarte folosit n cartarea genetic.
II. MARKERI PE BAZ DE HIBRIDIZARE
Markerii RFLP (Restriction fragments lenghth polymorphism =
Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie)
implica :
** taierea AND ului genomic cu enzime de restrictie;
** separarea electroforetica a fragmentelor rezultate;
** transferul pe o membrana speciala libera de ADN
(procedeul Southern blotting);
** detectarea polimorfismelor modelelor de benzi prin
hibridare cu o secventa complementara de ADN
marcata, denumita sonda moleculara.
***Aceasta tehnica necesita o prealabila cunoastere a
secventei de ADN (sonde clonale caracterizate).
Markerii RFLP se transmit codominant cu raportul de segregare
n F2 de 1:2:1. La un individ heterozigot sunt vizibile ambele benzi alele,
ceea ce face posibil diferenierea lui de ambii prini homozigoi.
Tehnica RFLP furnizeaz markeri codominani i cu specificitate
de locus, evideniind polimorfismul la nivelul anumitor secvene.
PLANTE MODIFICATE GENETIC
(PLANTE TRANSGENICE)
Ce este Organismul Modificat Genetic
(OMG) ?

Orice organism (cu excepia celui uman) al crui
materialul genetic a fost schimbat altfel dect prin
ncruciare i / sau recombinare natural.
Plant MG





Bumbac netratat Bumbac MG - cu
toleran la erbicide
Plante transgenice cu toleran la erbicide
Plante modificate genetic, rezistente la atacul
unor insecte

Specia Denumirea
O.M.G.-lui
Caracterul
modificat
Trans
gena
Originea
transgenei
Firma
care a
brevetat
O.M.G
Porumb Pyrausta Rezisten la
Ostrinia
nubilalis
Cry 1
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
kurstaki
Mycogen
Seeds
Porumb YieldGard Rezisten la
Ostrinia
nubilalis
Cry 1
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
kurstaki
Monsanto
Porumb Furio CB Rezisten la
Ostrinia
nubilalis
Cry 1
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
kurstaki
Novartis
Porumb MaisGard Rezisten la
Ostrinia
nubilalis
Cry 1
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
kurstaki
Pioneer
Porumb StarLink Rezisten la
Ostrinia
nubilalis
Cry 1
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
kurstaki
AgrEvo
(Aventis)
Cartof NewleafPotato Rezisten la
Leptinotarsa
decemlineata
Cry 3
A
Bacillus
thuringiensis
(Bt) ssp.
tenebrionis
Monsanto


Porumb Bt
Bacteria insecticid
(Bacillus thuringiensis - Bt)
Cristale de toxina Bt
Plante de porumb Bt
Izolarea genei toxinei Bt
& introducerea n planta
de porumb
Plante de porumb (PMG)
Frunzele conin toxina Bt
Omizile au fost omorate
S-au redus tratamentele chimice