Tehnici de Laborator in Micologia Medicala

Sub red
Dr. M
SeI de l
Departa
Univers
Laborat
Public
Univers
'Ion Ion
Editura
Iasi, Ro

Teh
n m
dactia:
Mihai Mare
lucrri
amentul de M
sitatea 'Petre
torul de Mico
, Facultatea d
sitatea de Stiin
nescu de la Br

a PIM
omnia

hnici de
icologia
es
icrobiologie,
Andrei, Iasi
logie Micot
de Medicin V
nte Agricole s
rad, Iasi
200
laborat
a medic
Facultatea de
toxicologie, D
Veterinar,
si Medicin V
7
tor
cal
Medicin De
Departamentul
Veterinar
entar,
l de Sntate

C
S
sa
S
ad

E
So
w
Ia
Copyright 20
ocietatea Rom

Nici o p
au diIuzat n
.R.M.M.M. T
dresate n scri
Societa
OP 6, C
Iasi R

Editor v
ing. Ion

Comenz
Societa
OP 6, C
Iasi R
e-mail:
www.Iu

ditura PIM
os. SteIan cel
www.pimcopy
asi Romnia

Descr
Tehni

I. Mar

543.0
582.2
007
mn de Mic
parte a acestei
orice Iorm s
Toate cererile d
is pe adresa:
atea Romn d
CP 1356
Romnia
volum si desig
nu Ailinci
zi la:
atea Romn d
CP 1356
Romnia
comenziIu
ungi.ro
Mare nr. 11
.ro
rierea CIP a B
ici de laborat
Mihai Mare
Bibliogr.
Index.
ISBN 978-9
res, Mihai (ed
6
8

II
cologie Medic
i publicatii nu
sau prin orice
de reproducer
de Micologie M
gn copert:
de Micologie M
ngi.ro

Bibliotecii Na
tor n micolo
es. Iasi : PIM
973-716-677-
d.)
cal i Micoto
u poate Ii repro
mijloace, Ir
re a materialel
Medical si M
Medical si M
aionale a Ro
ogia medical
M, 2007
7
oxicologie
odus, transm
acordul scris
lor publicate v
Micotoxicolog
Micotoxicolog
omniei
/ sub red.:
mis, stocat
s al
vor Ii
gie
gie

III
Autori

Ingrid Cezara Apetrei
Doctor medic veterinar, doctorand
Laboratorul de Microbiologie Imunologie
Departamentul de Sntate Public
Facultatea de Medicin Veterinar
Universitatea de Stiinte Agricole si Medicin Veterinar
'Ion Ionescu de la Brad, Iasi

Olimpia Bazgan
Doctor medic veterinar, doctor n Medicin Veterinar
ProIesor universitar
Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie

Petru Cazacu
Laboratorul de Histologie
Departamentul de Stiinte Fundamentale

Maria Dan
Doctor medic, doctor n Medicin
Laboratorul de Microbiologie
Institutul de Boli Cardiovasculare 'G. Georgescu Iasi

Bogdan Doroftei
Doctor medic, doctor n Medicin
Preparator universitar
Clinica II Obstetric - Ginecologie
Facultatea de Medicin
Universitatea de Medicin si Farmacie 'Gr. T. Popa Iasi

IV

Luminia - Iuliana Malic
Laboratorul de Micologie - Micotoxicologie

Magdalena Mare
Medic dentist, doctorand
Preparator universitar
Departamentul de Protetic
Facultatea de Medicin Dentar
Universitatea 'Petre Andrei, Iasi
SC Dentomedica SRL

Mihai Mare
Medic dentist, doctor medic veterinar, doctor n Medicin
SeI de lucrri
Departamentul de Microbiologie
Facultatea de Medicin Dentar
Universitatea 'Petre Andrei, Iasi
Laboratorul de Micologie Micotoxicologie

V

Volum editat cu sprijinul BRD-GSG

VI
Cuprins

Cap. 1 Tehnici de recoltare, transport i procesare primar
a prelevatelor clinice ............................................................................................... 1
1.1. Sngele ..................................................................................................... 2
1.1.1. Recoltarea sngelui pentru hemocultur ................................... 3
1.1.2. Numrul de hemoculturi si momentul prelevrii ...................... 4
1.1.3. Volumul de snge ce urmeaz a Ii nsmntat .......................... 4
1.1.4. Medii de cultur ........................................................................ 4
1.1.5. Durata incubrii si prelucrarea hemoculturilor ......................... 7
1.1.6. SemniIicatia hemoculturilor pozitive cu Iungi saprobioti ........ 8
1.2. Mduva osoas hematogen ..................................................................... 8
1.3. Lichidul ceIalo-rahidian ........................................................................... 8
1.4. Raclatul cornean ....................................................................................... 9
1.5. Prelevatul otic .......................................................................................... 9
1.6. Fluidele intraoculare ................................................................................ 9
1.7. Firele de pr ............................................................................................. 9
1.8. Fragmentele unghiale si scuamele cutanate ............................................. 9
1.9. Secretiile respiratorii joase ..................................................................... 10
1.10. Aspiratul pulmonar ................................................................................ 11
1.11. Biopsia pulmonar ................................................................................. 11
1.12. Alte Iluide organice normal sterile ......................................................... 11
1.13. Secretiile purulente din abcese subcutanate sau din plgi deschise ....... 12
1.14. Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale................................. 12
1.15. Urina ...................................................................................................... 12
1.16. Secretiile vaginale .................................................................................. 14
1.17. Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin ................... 15
1.18. Fragmentele tisulare biopsice ................................................................. 15
1.19. Tehnica aspiratiei cu ac Iin .................................................................... 15
BibliograIie selectiv ............................................................................. 18

Cap. 2 Tehnici de microscopie direct ................................................................. 21
2.1. Coloratia negativ cu tus de India .......................................................... 22
2.2. Coloratia negativ cu mercurochrom 2 si tus de India ....................... 23
2.3. Coloratia cu lactoIenol si albastru de anilin ......................................... 24
2.4. Coloratia cu hidroxid de potasiu si cerneal Parker ............................... 25
2.5. ClariIicarea cu hidroxid de potasiu si dimetil sulIoxid .......................... 25
2.6. Coloratia cu calcoIluor alb si KOH 10 ............................................... 26
2.7. Coloratia Gram ....................................................................................... 28
2.8. Coloratia Gram - calcoIluor alb ............................................................. 30
2.9. Coloratia Giemsa.................................................................................... 31
2.10. Coloratia May-Grunwald-Giemsa .......................................................... 32
2.11. Coloratia Wright .................................................................................... 34
2.12. Coloratia cu mucicarmin Southgat ......................................................... 35
2.13. Coloratia Musto ..................................................................................... 36

VII

Cap. 3 Medii de cultivare ...................................................................................... 41
3.1. Generalitti ............................................................................................. 41
3.2. Compozitia mediilor de cultur .............................................................. 42
3.3. Prepararea si sterilizarea mediilor .......................................................... 43
3.4. Controlul de calitate si pstrarea mediilor ............................................. 44
Medii de cultivare .................................................................................. 46

Cap. 4 Tehnici de nsmnare i transplantare ............................................... 101
4.1. Tehnici uzuale ...................................................................................... 101
4.2. Tehnici speciale.................................................................................... 103
4.2.1. Tehnica de puriIicare a izolatelor levurice .............................. 103
4.2.2. Tehnica nsmntrii levurilor pe Agarul cu Iin
de porumb si tween 80 ......................................................... 105
4.2.3. Tehnica de cultivare pe suporturi transparente ...................... 105
4.2.4. Tehnica de cultivare n ,pictur suspendat ....................... 106
4.2.5. Tehnica de cultivare pe bloc de geloz ................................. 106
4.3. Tehnici de transplantare ....................................................................... 107
BibliograIie selectiv ........................................................................... 108

Cap. 5 Tehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi ................. 109
5.1. Preparatul extemporaneu cu lactoIenol si albastru de anilin
(levuri) .............................................................................................. 109
5.2. Preparatul extemporaneu cu lactoIenol si albastru de anilin
(Iungi Iilamentosi) ............................................................................ 110
5.3. Preparatul extemporaneu cu band adeziv ......................................... 110
5.4. Lutarea preparatelor extemporanee ...................................................... 111

Cap. 6 Tehnici de histopatologie ........................................................................ 113
6.1. Obtinerea probelor ............................................................................... 113
6.2. Examenul macroscopic ........................................................................ 113
6.3. Fixarea .............................................................................................. 113
6.3.1. Formol solutie 10 tamponat pH 6,8 ................................ 115
6.3.2. Fixatorul Bouin ..................................................................... 116
6.3.3. Fixatorul Hollande ................................................................ 116
6.4. Procesarea tesuturilor ........................................................................... 117
6.4.1. Deshidratarea ........................................................................ 118
6.4.2. ClariIicarea ........................................................................... 119
6.4.3. Impregnarea cu paraIin ....................................................... 119
6.4.4. Includerea ............................................................................. 120
6.4.5. Sectionarea............................................................................ 120
6.4.6. Etalarea sectiunilor ............................................................... 121
6.4.7. Colorarea .............................................................................. 123
6.5. Montarea .............................................................................................. 148
Index

VIII
6.6. Etichetarea si arhivarea ........................................................................ 150
Cap. 7 Tehnici de seromicologie ......................................................................... 153
7.1 Fungitell ........................................................................................... 153
7.1.1. Principiul testului .................................................................. 153
7.1.2. Materiale Iurnizate mpreun cu testul Fungitell .................. 154
7.1.3. Materiale necesare dar neIurnizate mpreun cu kitul .......... 154
7.1.4. Atentionri si precautii ......................................................... 155
7.1.5. Pstrarea reactivilor .............................................................. 155
7.1.6. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor ............................ 155
7.1.7. Tehnic de lucru ................................................................... 155
7.1.8. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 157
7.1.9. Controlul calittii .................................................................. 158
7.1.10. Limite ................................................................................... 158
7.1.11. InterIerarea cu alte substante ................................................ 159
7.1.12. Valori asteptate ..................................................................... 159
7.2. Platelia

Aspergillus ............................................................................ 160
7.2.2. Materiale Iurnizate odat cu kitul ......................................... 160
7.2.3. Materiale necesare, dar neIurnizate odat cu kitul ............... 161
7.2.4. Conservarea reactivilor desigilati
si a celor reconstituiti ............................................................ 161
7.2.5. Tehnica de lucru ................................................................... 162
7.3. Platelia
Candida Ac ............................................................................ 165

7.3.1. Introducere ............................................................................ 165
7.3.3. Materiale Iurnizate mpreun cu kitul ................................... 165
7.3.4. Materiale necesare dar neIurnizate impreun cu kitul .......... 166
7.3.5. Tehnica de lucru ................................................................... 166
7.4. Platelia
Candida Ag ........................................................................... 169

7.4.1. Introducere ............................................................................ 169
7.4.3. Materiale Iurnizate odat cu kitul ......................................... 169
7.4.4. Materiale necesare dar neIurnizate odat cu kitul ................ 169
7.4.5. Tehnica de lucru ................................................................... 170
7.4.6. Maniera de calcul si interpretarea rezultatelor ...................... 171
7.5. IdentiIicarea speciei Candida dubliniensis
prin latex-aglutinare .............................................................. 172

Cap. 8 Teste biochimice i fiziologice ................................................................. 179
8.1. Fermentarea zaharurilor ...................................................................... 179
8.2. Capacitatea de asimilare a surselor de carbon ..................................... 180
8.3. Capacitatea de asimilare a surselor de azot ......................................... 180

IX
8.4. Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la levuri ................ 180
8.5. Testul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la dermatoIiti ........ 181
8.6. Testarea rezistentei la cicloheximid ................................................... 181
8.7. Producerea de Ienol-oxidaz ................................................................ 182
8.8. Testarea producerii altor enzime .......................................................... 182
8.9. Testul de depistare a necesittilor nutritive speciale ............................ 182
8.10. Testul de cultivare pe Agar BCP-lapte-glucoz. .................................. 183
8.11. Testul de perIorare a Iirului de pr in vitro. ......................................... 184
8.12. Testul de cultivare pe boabe de orez .................................................... 185
8.13. Testul de Iilamentare (testul de blastez sau germ-tube test) ............... 185
8.14. Testul de termotolerant / termostimulare ........................................... 186

Cap. 9 Tehnici de micologie molecular ............................................................ 191
9.1. Extractia ADN-ului pentru PCR .......................................................... 191
9.2. Extractia ADN-ului cu ajutorul kit-ului
High Pure Template Preparation Kit (levuri) .................................... 191
9.3. Extractia ADN-ului prin crioprecipitare (Iungi Iilamentosi) ............... 192
9.4. Controlul calittii acizilor nucleici extrasi ........................................... 193
9.5. IdentiIicarea speciei Candida dubliniensis prin PCR duplex ............... 194
9.6. IdentiIicarea molecular a levurilor prin PCR si
secventializarea regiunilor ITS ......................................................... 196
9.7. Reactivi utilizati n tehnicile de biologie molecular ........................... 200

Cap. 10 Tehnici de evaluare a sensibilitii la antifungice ............................... 203
10.1. Tehnica de lucru pentru levuri ............................................................. 203
10.2. Tehnica de lucru pentru Iungi Iilamentosi ........................................... 206
10.3. Testarea sensibilittii la antiIungice prin metoda
diIuzimetric Kirby-Bauer ................................................................ 208

Cap. 11 Tehnici de aeromicologie ...................................................................... 211
11.1. Caseta AIR-O-CELL ........................................................................ 212
11.2. Caseta MICRO-5.................................................................................. 214
11.3. Caseta CYCLEX-D .............................................................................. 215
11.4. Caseta BIOCELL ................................................................................. 215
11.5. Caseta LARO 100 ................................................................................ 216
11.6. Impactorul ZeIon Z-A6 ........................................................................ 217
11.7. Dispozitivul CIP 10M .......................................................................... 219
11.8. Aprecierea ncrcturii Iungice aeropurtate ......................................... 224
11.9. Tehnici de recoltare/examinare direct a probelor ............................... 225
11.9.1. Banda adeziv BIO TAPETM (ZeIon International) ............ 225
11.9.2. Recoltarea Iragmentelor inerte .............................................. 226
11.9.3. Recoltarea cu ajutorul tamponului tip exsudat ...................... 226
Index

X

Cap. 12 Norme generale de biosecuritate n
laboratoarele de micologie medical ................................................ 229
12.1. ClasiIicarea Iungilor n Iunctie de clasele de risc biologic .................. 229
12.2. Norme generale de biosecuritate .......................................................... 230
12.2.1. Tehnici de laborator Iolosite n zona de lucru ....................... 232
12.3. Metode de protectie primar ................................................................ 232
12.3.1. Hote de protectie biologic ................................................... 232
12.4. Substante decontaminante Iolosite n
laboratoarele de micologie medical ................................................. 233
12.5. Msuri de protectie mpotriva substantelor chimice ........................... 235

Anex .................................................................................................................... 237

Index ..................................................................................................................... 245

XI
Prefa

Fungii microorganisme Iamiliare tuturor prin omniprezenta si diversitatea
lor, au Iost considerati mult timp inoIensivi pentru om, singurele maniIestri induse de
acestia candidozele superIiciale si dermatoIitozele avnd un prognostic vital
Iavorabil. Odat cu individualizarea micologiei medicale ca stiint de sine stttoare n
cadrul microbiologiei, n prima jumtate a secolului trecut, si intensiIicrii
investigatiilor n acest domeniu, au aprut date din ce n ce mai certe privind
implicarea Iungilor ntr-o serie de entitti nosologice care pot Ii grupate n micoze
(superIiciale, proIunde, sistemice), micotoxicoze si alergoze.
n conditiile actuale, cnd organismele umane sunt supuse interventiei a
numerosi Iactori agresivi care le destabilizeaz homeostazia si le induc modiIicri
reactive detrimentale, reIerindu-ne la posibilitatea implicrii unei specii Iungice sau a
alteia n determinarea unor entitti morbide, asertiunea c 'practic, putem intalni orice,
oriunde este ct se poate de veridic. Limita dintre patogen si nepatogen, dintre
colonizare si oportunism, este extrem de labil, neexistnd practic o delimitare strict.
Fungi considerati cu cca. 1 2 decenii n urm ca nepatogeni, existnd n mediul
ambiant doar ca banali contaminanti, sunt astzi recunoscuti ca agenti patogeni
redutabili n cazul gazdelor imunocompromise. Fungii patogeni reprezint astzi o
provocare pentru lumea medical, att din punct de vedere epidemiologic
(augmentarea incidentei micozelor invazive), ct si diagnostic sau terapeutic. Se
consider c aproximativ 5 dintre decesele intraspitalicesti se datoreaz unei cauze
sau complicatii Iungice. Micoze precum aspergiloza invaziv, zygomicozele sau
scedosporiozele sunt responsabile de un numr crescnd de decese prin diagnosticarea
adeseori diIicil si terapia extrem de costisitoare si de multe ori ineIicace.
Scopul prezentului volum este de a pune la dispozitia medicului de laborator si
clinicianului o suit de tehnici utile n diagnosticarea si managementul ulterior al
micozelor. Am ncercat prezentarea acestora n succesiunea lor logic, ntr-o manier
ct mai comprehensibil, urmrind toate etapele demersului diagnostic, de la
prelevarea probelor pn la testele de sensibilitate la antiIungice. De asemenea, am
imprimat lucrrii un caracter de ghid practic, reducnd la maxim consideratiile
teoretice. Inevitabil, unele tehnici sau proceduri au Iost omise, Iie pentru a nu
suprancrca textul cu inIormatie redundant, Iie din cauza perIormantelor reduse ale
acestora. Binenteles, varianta propus este perIectibil, iar sugestiile cititorilor avizati
vor sta la baza unei eventuale noi editii.
Speranta noastr, a autorilor, este ca acest ghid s aduc o viziune unitar n
micologia clinic din Romnia si s contribuie la ameliorarea capacittii de diagnostic
si control a micozelor, att a celor superIiciale, dar mai ales a celor invazive, cu
prognostic inIaust. Salvarea si ameliorarea calittii vietii pacientilor critici, printr-un
diagnostic etiologic corect si o monitorizare riguroas a terapiei antiIungice, au
reprezentat argumentele primordiale ale acestui demers publicistic.

Autorii

Iai, iulie 2007

Maria Dan, Bogdan DoroItei, Petru Cazacu, Magdalena Mares, Mihai Mares

1
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)


ecoltarea sau prelevarea probelor este o actiune deosebit de important
pentru diagnosticul diverselor micoze interne sau superIiciale, ea Iiind o
etap critic a acestui demers. Modul de prelevare a probelor si operatiunile ulterioare
la care acestea vor Ii supuse sunt speciIice Iiecrui situs de recoltare si pot reprezenta
tot attia Iactori limitativi pentru un diagnostic eIicient n cazul executrii lor incorecte.
Se recomand ca prelevarea probelor s Iie realizat de personalul laboratorului de
micologie, special instruit n acest scop. Cantitatea / volumul prelevatului trebuie s Iie
suIicient de mare pentru a permite eIectuarea examenului microscopic direct,
cultivarea si eventual examenul histopatologic pe biopsie. Procesarea probelor va
ncepe ct mai curnd posibil dup recoltare, Ir a depsi timpul maxim de asteptare.

Formularul de cerere pentru analize microbiologice

Probele prelevate vor Ii nsotite obligatoriu de un Iormular de cerere pentru
analize microbiologice care va cuprinde datele de identiIicare ale pacientului, tipul
prelevatului, ora recoltrii si examenele de laborator necesare. Unele date anamnetice
(proIesie, cltorii n zone endemice etc.) ca si unele inIormatii clinice relevante sunt
importante pentru medicul de laborator n procesarea optim a probelor si vor Ii
Iurnizate de ctre clinician n acelasi Iormular. Formularul de cerere va contine si
numele medicului, numrul de teleIon, clar indicate, pentru a Ii contactat n cazul unor
rezultatele critice sau urgente.
Tratamentele recente cu antiIungice trebuie imperios speciIicate pentru a ajuta
microbiologul la interpretarea rezultatelor testelor si la eIectuarea antiIungigramei.
Rezultatele serologice si culturale anterioare trebuie de asemenea speciIicate dac au
Iost eIectuate.

Precauii

1. Se urmeaz precautiile standard pentru recoltarea si manipularea produselor
biologice. Se trateaz toate probele ca Iiind potential periculoase.
2. Dup recoltare n recipiente adecvate, probele se introduc n pungi din plastic tip
ziplock, cu buzunar lateral (pentru Iormularul de cerere).
R
1
Tehnici de recoltare, transport si
procesare primar a prelevatelor clinice
Tehnici de recoltare, transport si procesare primar a prelevatelor clinice

2

Recoltarea

1. Cnd este posibil, probele se recolteaz naintea administrrii agentilor
antimicrobieni.
2. Se identiIic sursa probei si se speciIic corect zona, astIel nct n cursul
procesrii n laborator s Iie selectat mediul de cultur adecvat.
3. Se indic cnd un microorganism particular este cutat n mod special n prob.
4. Dac o prob este recoltat prin traversul pielii intacte, aceasta se va dezinIecta
cu alcool etilic 70, urmat de o solutie pe baz de iod (1-2 tinctur de iod
sau 10 solutie de povidon-iod). Excesul de tinctur de iod se ndeprteaz
cu ajutorul unui tampon mbibat n alcool, pentru a preveni eventualele iritatii.
5. Pentru recoltarea din situsuri normal sterile se utilizeaz echipament sterilizat si
tehnic aseptic pentru a preveni contaminarea cu microorganisme n timpul
procedurilor invazive.
6. Colectarea probelor se va Iace n recipiente ermetice, sterile si rezistente, cu
capac Iiletat, care nu permit crearea de aerosoli n momentul deschiderii.
7. Se eticheteaz clar recipientul de transport cu numele pacientului, numrul de
identiIicare, data si ora de colectare.
8. Probele obtinute prin aspiratie cu ac Iin trebuie transIerate ntr-un tub steril sau
Ilacon de transport nainte de a Ii trimise la laborator.
9. Dac din probele Iluide s-au executat Irotiuri imediat dup recoltare, acestea vor
Ii individualizate corespunztor prin notare pe captul mat al lamei. Se
recomand trimiterea a 1-5 Irotiuri pentru evaluare citologic. Acestea se vor
Iixa imediat prin pulverizarea Irotiului cu un Iixator citologic sau se introduc n
etanol 95 pentru 20 minute.

1.1. Sngele

Hemocultura este o important metod de diagnostic care poate orienta sau
reorienta terapia antimicrobian n cazul bolilor inIectioase grave. Obiectivul major al
tuturor metodelor de hemocultur este reprezentat de depistarea unui numr mic de
microorganisme n snge, de aceea metodele de hemocultur variaz si sunt aproape
proprii Iiecrui laborator. IndiIerent de metoda aleas, este esential prelevarea
sngelui n conditii strict aseptice, nsmntarea acestuia pe un mediu lichid, Iolosirea
unor metode pentru depistarea cresterii microorganismelor n mediu lichid si o Iaz
Iinal de subcultivare pe un mediu solid pentru identiIicarea si testarea sesibilittii la
antiIungice.
Printre Iactorii cheie pe care seIul de laborator trebuie s-i stabileasc se
numr si metoda de hemocultur, cantitatea si compozitia mediului de cultur,
numrul si momentul prelevrii hemoculturilor, volumul de snge care urmeaz a Ii
nsmntat, Irecventa subcultivrilor si interpretarea rezultatelor.
Prelevarea se Iace direct n Ilacoanele de hemocultur de tipul Hemoline
Performance Duo, BacT/ALERT
FA (bioMerieux) sau, mai recomandat, BD

BACTEC
TM
- Mvcosis IC/F Medium (BD Diagnostics). n cazul suspectrii unor
inIectii Iungice cu localizare intracelular a microorganismului (e.g. Histoplasma

3
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

capsulatum), tehnica de liz-centriIugare si utilizarea Ilacoanelor BD BACTEC
TM

Mvco/F Lvtic Medium (BD Diagnostics) cresc esential sansa de izolare a agentului
patogen.

1.1.1. Recoltarea sngelui pentru hemocultur

Sngele pentru hemoculturi trebuie recoltat prin puncie venoas periferic, astIel:
1. Se dezinIecteaz Ilaconul de hemocultur cu alcool izopropilic 70, se asteapt
1 minut;
2. Se palpeaz vena;
3. Se antiseptizeaz tegumentul cu alcool 70, apoi cu tinctur de iod 1-2 (sau
iodoIori 10), concentric, ncepnd din centru;
4. Se asteapt s se usuce si nu se mai palpeaz vena;
5. Se recolteaz sngele, iar dup punctie se nltur iodul de pe tegument cu
alcool (acest pas nu mai este necesar dac se utilizeaz iodoIori).

Recoltarea sangelui prin dispo:itive intravasculare, arteriale sau venoase, este o
problem controversat. Unele studii comparative arat c nu exist diIerente
semniIicative ntre sensibilitatea si speciIicitatea hemoculturilor prelevate de pe cateter
si prin punctie venoas periIeric. Factorii care inIluenteaz acest rezultat Iavorabil
sunt durata scurt a mentinerii cateterului si tehnicile stricte de asepsie. Alte studii
arat c, atunci cnd rezultatele ntre cele dou prelevri sunt discordante,
hemoculturile prelevate prin punctie periIeric sunt mai Iidele n evidentierea
bacteriemiilor / Iungemiilor adevrate Iat de cele prelevate pe cateter. Cu toate
acestea, exist un consens asupra Iaptului c orice hemocultur pozitiv necesit si
interpretarea clinicianului, iar acesta trebuie avertizat cu privire la particularittile
hemoculturilor pozitive prelevate pe cateter. Multe dispute a ridicat si problema
inlocuirii sau nu a acului dup flebotomie pentru inocularea sngelui n Ilaconul de
hemocultur. Majoritatea studiilor arat c nu exist nici o diIerent semniIicativ
statistic ntre cele dou metode, astIel c schimbarea acului nu ar Ii necesar, reducnd
astIel si riscul accidentelor prin ntepare. O antiseptizare atent a tegumentului este mai
important dect schimbarea acului. O meta-analiz a studiilor care au comparat rata
contaminrii hemoculturilor cu si Ir schimbarea acului nainte de inoculare a artat
c aceast rat este de 2,0 cnd se schimb acul, Iat de 3,7 cnd nu se realizeaz
schimbarea acului. Pe de alt parte, reducerea contaminrii hemoculturilor prin
schimbarea acului ar determina o economie de aproximativ 85000 $ pentru Iiecare
1000 de hemoculturi. La modul ideal, pentru recoltarea hemoculturilor, ar trebui s se
apleze la personal special caliIicat (Ilebotomisti).


4
1.1.2. Aumrul de hemoculturi i momentul prelevrii

Majoritatea cercettorilor sunt de acord c peste trei hemoculturi n 24 ore nu
determin o crestere semniIicativ a rezultatelor pozitive. Trei prelevri intermitente n
24 ore, din zone de punctie diIerite, cresc sensibilitatea izolrii aproape de 100.
Hemoculturile trebuie prelevate pe ct posibil naintea instituirii antibioticoterapiei
(dac au Iost administrate antibiotice, aceast inIormatie trebuie luat n consideratie la
interpretarea rezultatelor) si conIorm evolutiei predictive a curbei Iebrile sau / si n
momentul cnd bolnavul semnaleaz aparitia Irisoanelor.

1.1.3. Jolumul de snge ce urmeaz a fi nsmnat

Majoritatea autorilor recomand s se recolteze la adulti 10-30 ml de snge
pentru Iiecare set de hemoculturi. nsmntarea a 20, respectiv 30 ml snge, creste
sensibilitatea cu 38 si 68 Iat de nsmntarea a 10 ml de snge. Recoltarea a peste
30 ml de snge per set de hemocultur mbuntteste Ioarte putin sensibilitatea
hemoculturii si contribuie la instalarea anemiei iatrogene. La copii este necesar un
volum mai mic de snge datorit bacteriemiilor cu un numr mai mare de UFC/ml Iat
de adulti. Se recomand 1-2 ml de snge per set la nou-nscuti, 2-3 ml la sugari si 3-5
ml la copii.
O raie optim de diluie a sangelui in bulion nu a Iost nc stabilit.
Majoritatea autorilor recomand ca aceast dilutie s Iie ntre 1:5 si 1:10, iar unii au
artat c un raport de dilutie de 1:10 este superior celui de 1:5 n ceea ce priveste
rapiditatea si sensibilitatea izolrii. Majoritatea sistemelor de hemocultur contin
polianetol sulIonat de sodiu, care pe lng eIectul anticoagulant inactiveaz si anumiti
agenti antimicrobieni (e.g., aminoglicozidele, polimixinele).

1.1.4. Medii de cultur

Mediile pentru hemocultur prezint variatii n compozitie si de aceea studiile
comparative realizate sunt greu de interpretat.

Sistemele de hemocultur automate i semiautomate computerizate pentru
detectia rapid a microorganismelor n hemoculturi sunt utilizate n multe laboratoare.
Sistemul BACTEC (Becton Dickinson Intruments Systems, Sparks, MD, SUA)
se bazeaz pe detectia direct a producerii de CO
2
prin prelevare seriat de esantioane
de gaz din Ilaconul de cultur, iar n camera de citire prezenta CO
2
este depistat cu
ajutorul luminii inIrarosii, ultraviolete sau radiometric. Cteva studii comparative au
artat c sistemul BACTEC identiIic o gam larg de microorganisme, n special
levuri si Iungi dimorIici, n timp scurt. n comparatie cu sistemul Isolator, mediile
BACTEC pentru Iungi (BACTEC MYCO/F Lvtic bottle si BACTEC high-blood-volume
fungal medium) au avantajul monitorizrii automate continue, dar timpii de izolare sunt
echivalenti, cu exceptia tulpinilor de Histoplasma capsulatum care au Iost izolate doar
n sistemul Isolator.
n sistemul BacT/Alert (Organon Teknika Corp., Durham, NC) cresterea este
semnalizat tot prin detectia CO
2
, dar cu ajutorul unui detector colorimetric. BACTEC

5
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

si BacT/Alert, similare n compozitia bulionului pe baz de tripticaz-soia si cazein,
diIer n suplimentele nutritive si n concentratia de polianetol sulIonat de sodiu.
Studiile comparative ale celor dou sisteme au artat c sistemul BacT/Alert este
superior n izolarea microorganismelor, n special a staIilococilor si levurilor.
BACTEC este superior bulionului cu supliment de pepton si sistemului JITAL
n depistarea bacteriemiilor si Iungemiilor, iar aceast superioritate nu se datoreaz
metodei de detectie.
Flacoanele speciale pentru Iungi ar trebui luate n considerare n anumite
situatii particulare (pacienti HIV inIectati), deoarece Iungii Iilamentosi si dimorIici
necesit o atentie special. Studii recente arat c Ilacoanele pentru izolarea bacteriilor
sunt Ioarte potrivite pentru cultivarea levurilor genului Candida.

Sistemul Oxoid Signal (Oxoid USA, Inc., Columbia, MD) este Iormat dintr-un
singur Ilacon de cultur, n care presiunea CO
2
degajat de cresterea microorganismelor,
Iorteaz Iluidul de cultur s treac ntr-un compartiment semnal, de unde poate Ii
examinat microscopic si subcultivat. Desi evalurile initiale au Iost Iavorabile, studiile
ulterioare au artat c Iurnizeaz un numr crescut de rezultate Ials pozitive si are
diIicultti n semnalizarea cresterii bacteriilor anaerobe, a majorittii levurilor, a
Hemophillus influen:ae, bacililor gram-negativi nonIermentativi, Neisseria
meningitidis, Nocardia spp., si Corvnebacterium feikeium. Noile modele care au
mbunttit compartimentul de semnalizare (cresterea volumului) si beneIiciaz de
agitare, au dovedit proprietti superioare n izolarea microorganismelor.

Mediile difazice (Septi-Chek. Roche Diagnostic Systems, Nutely, NJ,
Hemoline Performance Duo. BioMerieux, Jacutainer agar slant: Becton Dickinson)
sunt de asemenea larg utilizate. Au calitti superioare bulionului suplimentat cu
pepton, sunt avantajoase pentru izolarea micobacteriilor si brucelelor. nsmntarea
Irecvent a pantei poate s Iurnizeze cultur suIicient pentru testarea sensibilittii si
identiIicare, astIel nct timpul de depistare a microorganismelor poate Ii comparabil
cu al sistemelor automate. Folosite n asociatie cu sistemul BACTEC s-a observat o
crestere cu 25 a depistrii episoadelor bacteriemice, Iat de Iolosirea izolat a
sistemului BACTEC.

Metoda lizei cu centrifugare ( denumit anterior DuPont Isolator tube, n
prezent este comercializat de Wampole Laboratories, Cranbury, NJ) izoleaz
majoritatea microorganismelor, dar este indicat n special pentru depistarea
Iungemiilor, (mai ales cu Iungi dimorIici, Iungi Iilamentosi, Malasse:ia furfur), a
inIectiilor cu micobacterii la pacientii cu SIDA si a oportunistilor (Bartonella
henselae). Sngele, prelevat n tuburi cu ,liquoid (polietilenglicol si saponin) este
lizat, apoi centriIugat, iar sedimentul este nsmntat pe medii solide adecvate. Metoda
este echivalent sistemului diIazic n izolarea Iungilor (chiar superioar n izolarea
Histoplasma capsulatum ), de asemenea si n izolarea bacteriilor (metoda lizei cu
centriIugare Iiind mai rapid). Unii autori nu recomand aceast metod n investigatia
de rutin a episoadelor Iebrile la pacientii neutropenici, datorit ratei crescute de
rezultate Ials pozitive.

6
Hemoculturile anaerobe. Setul standard de hemoculturi contine un Ilacon
aerob si unul cu incubare anaerob. Deoarece exist o sans mic de a izola Iungi sau
bacterii strict aerobe n Ilaconul anaerob, Iolosirea de rutin a Ilaconului cu incubare
anaerob poate determina scderea sensibilittii hemoculturii. Cteva studii au artat c
n ultimii 20 de ani s-a produs o scdere a incidentei inIectiilor sistemice determinate
de bacteriile anaerobe; pe de alt parte, tot n aceast perioad s-a produs o crestere a
incidentei Iungemiilor. Aceste schimbri n etiologia inIectiilor sistemice au nceput s
pun sub semnul ntrebrii utilitatea Iolosirii de rutin a Ilaconului anaerob.
Unii autori au artat c Iolosirea a dou Ilacoane aerobe si doar n cazuri
selectionate a Ilaconului anaerob, a dus la cresterea cu 6 a izolrii microorganismelor
cu semniIicatie clinic, n comparatie cu practica standard (un Ilacon aerob si unul
anaerob). Date asemntoare au Iost gsite la copii si avnd n vedere cantitatea mic
de snge care se poate recolta de obicei de la acesti pacienti, este indicat ca ntreaga
cantitate s se nsmnteze n Ilacoane aerobe si doar n cazurile cu risc crescut s se
utilizeze Ilaconul anaerob.
Pe de alt parte, utilizarea Ilacoanelor anaerobe determin o crestere
semniIicativ a izolrii bacteriilor strict anaerobe. n concluzie, la ora actual este
indicat Iolosirea a dou Ilacoane aerobe per set si n circumstante bine selectionate
(e.g., aIectiuni intraabdominale, inIectii orale, neutropenii, celulite, musctur de om)
si pe cea a Ilaconului anaerob.

Neutralizarea i inactivarea substanelor antimicrobiene. Datorit
Irecventei recoltri a sngelui pentru hemoculturi de la pacienti aIlati sub terapie
antimicrobian, pe piat au aprut produse care ncearc s nlture posibilele eIecte
inhibitorii ale cresterii. Sistemul BacT/Alert are variante FAN pentru Ilacoanele aerobe
si anaerobe. Utilizarea acestora a demonstrat mbunttirea izolrii microorganismelor
n comparatie cu mediile standard, iar noua Iormul a mediului a optimizat si
microscopia direct din hemocultur. Studiile comparative ale sistemelor BacT/Alert
FAN si BACTEC cu rezin au artat c perIormantele celor dou medii sunt
echivalente.

Mediile hipertone cu 10 sucroz sunt utilizate pentru a crea un mediu
osmotic protector, mbunttind astIel izolarea bacteriilor si Iungilor cu perete deIectiv
din sngele pacientilor care au primit antibioticoterapie. n general, aceste medii au Iost
evitate n laboratoarele care utilizeaz citirea vizual a cresterii datorit rezultatelor Ials
pozitive date de eIectul hemolitic, dar pe de alt parte producerea unor mari cantitti de
gaz de ctre anumite bacterii, poate Ii util n evidentierea cresterii. Valoarea acestor
medii n depistarea bacteriemiilor si Iungemiilor este controversat. Unele studii arat
o mbunttire a izolrii staIilococilor, bacililor gram-negativi (Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa) si Iungilor, dar o reducere si o ntrziere n izolarea
bacteriilor anaerobe si a Neisseria gonorrhoeae.

Noile metode rapide de identificare i testare a sensibilitii la antibiotice
(Jitek - bioMerieux Vitek, Hazelwood, MO, USA, autoSCAN-W/A - W/A; Dade
Behring Microscan Inc., West Sacramento, CaliI.; BD PHOENIX Automated
Microbiologv Svstem; PCR) a microorganismelor direct din hemoculturile pozitive,

7
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

Iurnizeaz rezultate corecte n aproximativ 2-6 ore si pot determina initierea
antibioticoterapiei, schimbarea terapiei de primointentie cu o terapie mai eIicient sau
mai putin costisitoare. Unii autori au estimat o economie de aproximativ 158 $ per
pacient, apreciat la pacientii la care s-a administrat un antibiotic mai ieItin sau la care
a Iost ntrerupt antibioticoterapia, prin primirea rezultatelor cu 24-48 de ore mai
devreme.
Metodele moleculare au o sensibilitate si o speciIicitate de aproximativ 100
n identiIicarea bacteriilor si levurilor din hemoculturile monomicrobiene si Iurnizeaz
rezultatele n aproximativ 2 ore.

1.1.5. Durata incubrii i prelucrarea hemoculturilor

Majoritatea laboratoarelor care utilizeaz sisteme automate, incubeaz
hemoculturile 5-7 zile. Laboratoarele care deservesc spitale n care Iungii,
Pseudomonas aeruginosa si grupul HACEK sunt izolati Irecvent din sngele
pacientilor, ar trebui s evalueze cu atentie necesitatea subcultivrilor terminale, iar
hemoculturile ar trebui incubate peste 7 zile.
Dac apare semnalizarea cresterii n timpul incubrii, proba este examinat
microscopic (Irotiu colorat Gram) si subcultivat pe medii solide n Iunctie de
categoria microscopic observat. n cazul observrii Iungilor este indicat
subcultivarea pe Agar Sabouraud cu incubare la 30 sau 37C. n situatia n care nu
sunt depistate microorganisme pe Irotiu, trebuie realizate subcultivri oarbe, iar
Ilaconul reintrodus la incubat.
Pentru sistemele manuale de depistare a cresterii, n cazul suspiciunii
Iungemiilor, ar trebui realizate subcultivri ,oarbe la 48 ore si apoi sptmnal, pn
la 30 de zile, pe Agar Sabouraud, cu incubare la 30C.
Examinarea microscopic de rutin, cu ajutorul coloratiei Gram, a
hemoculturilor negative macroscopic dup 24-48 ore de incubare este controversat si
putin indicat, datorit numrului mic de microorganisme care pot Ii detectate utiliznd
Irotiul colorat Gram (aproximativ 10
5
UFC/ml). Coloratia cu acridin orange este mai
sensibil, detectnd ntre 10
3
si 10
4
UFC/ml. Unii autori au comunicat o crestere de
16,8 n depistarea rapid a septicemiilor prin examinarea cu acridin orange a
hemoculturilor negative macroscopic.
Pentru metoda lizei-centriIugare, sngele (7,5-10 ml) este recoltat n tuburi cu
saponin (lizeaz hematiile si globulele albe). Dup recoltare, tuburile se agit de
cteva ori pentru liza complet, iar apoi se centriIugheaz 15 minute la 3000 rpm
pentru concentrarea microorganismelor. Sedimentul este aspirat si nsmntat astIel: o
plac cu Agar snge-ciocolat si o plac cu Agar tripticaz-soia, se incubeaz 3 zile la
37C, apoi 18 zile la 30C; o plac cu Agar Sabouraud si una cu Agar inIuzie cord-
creier, 4 sptmni la 30C. Rata contaminrilor accidentale poate Ii controlat printr-o
bun tehnic aseptic n incinta hotei de sigurant microbiologic de clas II.


8
1.1.. Semnificaia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioi

Aspergillus spp. reprezint cea mai Irecvent cauz a inIectiilor Iungice
invazive, dar este rar izolat din snge. Pe de alt parte, Fusarium spp. este izolat n 60-
70 din hemoculturile pacientilor cu Iusarioz diseminat. Printre Iungii emergenti
implicati tot mai des n inIectii invazive, inclusiv n Iungemii, se numr Scedosporium
spp., Alternaria spp.si Paecilomvces spp.
Cu exceptia Iungemiilor asociate cu prezenta cateterelor venoase centrale,
determinarea semniIicatiei clinice a hemoculturilor pozitive cu Iungi, chiar si la
pacientii cu hemopatii maligne reprezint o provocare. Cele mai Irecvente cauze de
Iungemii adevrate sunt determinate de Scedosporium spp., iar prezenta leucemiei sau
transplantului medular reprezint un Iactor de risc important.
SemniIicatia hemoculturilor pozitive cu Aspergillus spp. este nc neclar. n
literatur sunt doar putine cazuri documentate din punct de vedere clinic, histologic si
microbiologic pentru evidentierea aspergilozei invazive cu hemocultur pozitiv cert.
O singur hemocultur pozitiv, n sistemul lizei cu centriIugare, reprezint n mod
obisnuit un indicator al pseudoaspergilemiei, iar n Iata unei asemenea situatii trebuie
cutate argumentele clinice si radiologice pentru stabilirea semniIicatiei clinice a
izolatului. Totusi, se consider c hemoculturile pozitive pentru Aspergillus, cu real
semniIicatie clinic, sunt Ioarte rare.
Candida spp (n particular Candida albicans) este Irecvent izolat n
hemoculturi, reprezentnd pn la 10 dintre inIectiile sistemice nosocomiale; cu toate
acestea aproximativ 50 din hemoculturi rmn negative la pacientii cu candidemie.
n cazul hemoculturilor pozitive cu Candida spp, trebuie depistat posibila surs a
inIectiei, iar cateterele intravasculare nlocuite. Candiduria poate apare secundar
candidemiei.

1.2. Mduva osoas hematogen

Se recolteaz prin aspiratie cu sering heparinizat, calea de acces Iiind creat
prin punctie sternal sau punctia crestei iliace. Punctia se realizeaz respectnd cele
mai severe msuri de asepsie. Aspiratul medular, n volum de minim 0,5-1 ml, se
transIer ntr-un tub steril cu dop de cauciuc si se expediaz la laborator n maxim 2
ore.Pe parcursul acestui interval de timp, prelevatul se mentine la temperatura camerei.

1.3. Lichidul cefalo-rahidian

Lichidul ceIalo-rahidian (Iluidul cerebro-spinal sau LCR) se recolteaz prin
punctie rahidian n spatiile intervertebrale L3-L4, L4-L5 sau L5-S1. Punctia se
realizeaz respectnd cele mai severe msuri de asepsie si decontaminarea zonei cu
povidon-iod 2. Dup pozitionarea n spatiul subarahnoidian a cateterului de punctie,
LCR se colecteaz prin curgere liber, n tuburi sterile, n volum de 3-5 ml. nainte de
examinare, proba se concentreaz prin centriIugare la 1500 rpm timp de 10 minute.
Supernatantul se pstreaz pentru testarea antigenic, iar sedimentul pentru cultur si
microscopie direct. Timp de asteptare n vederea procesrii: maxim 15 minute. Nu se
reIrigereaz!

9
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

1.4. Raclatul cornean

Se instileaz 1-2 picturi de anestezic topic, apoi cu ajutorul unei
microchiurete oItalmologice / spatule Kimura sterile, printr-o miscare scurt, se
racleaz zone multiple din segmentul ulcerat. Prelevatul se nsmnteaz direct pe
medii de cultur cu ajutorul instrumentului de recoltare, prin ntepare; totodat, se
pregtesc Irotiuri pentru examenul microscopic direct. Timp maxim de asteptare: 15
minute la temperatura camerei.

1.5. Prelevatul otic

Din conductul auditiv extern se pot preleva probe cu ajutorul tampoanelor
sterile (secretiile) sau prin raclare cu o chiuret (scuamele). Timp maxim de asteptare:
2 ore la temperatura camerei sau 24 ore la 4C.

1.. Fluidele intraoculare

Se recolteaz prin aspiratie cu un ac Iin steril sau prin vitrotomie, apoi se
transIer la laborator n maxim 15 minute pentru procesare. Volumul recomandat este
de cca. 0,5 ml.

1.7. Firele de pr

Se recolteaz cu ajutorul unei pense, de preIerat sub lumin UV, n camer
obscur. Se expediaz la laborator n plicuri de hrtie. Timp maxim de asteptare: 72 ore
la temperatura camerei.

1.8. Fragmentele unghiale i scuamele cutanate

Fragmentele unghiale se recolteaz de la nivelul jonctiunii tesutului sntos cu
cel aIectat, prin raclare cu o chiuret steril sau prin cupare cu ajutorul unui IoarIece,
dup toaletarea zonei cu ap si spun. Nu se recomand decontaminarea cu alcool
deoarece diminueaz sansa de izolare a dermatoIitilor prin cultivare. Raclarea se
realizeaz de obicei pe partea inIerioar a tablei unghiale, distal sau lateral, la
jonctiunea zonei normale cu cea modiIicat. n cazul leziunilor de leuconichie
superIicial, raclarea va interesa supraIata superioar a unghiei. Materialul recoltat se
expediaz la laborator n plicuri de hrtie. Timp maxim de asteptare: 72 ore la
temperatura camerei.
La pacientii suspectati de tinea sau impetigo, unguentele sau alte preparate
aplicate n prealabil trebuie ndeprtate prin stergere cu alcool. Pentru recoltare, se va
utiliza un bisturiu neascutit, o pens, o chiuret Vidal sau un careu rectangular de
mochet. Dac leziunile sunt multiple, se va alege pentru prelevarea de probe cea mai
recent, deoarece raclarea scuamelor vechi, n curs de detasare este adesea
nesatisIctoare pentru diagnostic. Scuamele tegumentare se recolteaz prin raclarea
zonei active a leziunii (de obicei cea periIeric) cu ajutorul unei chiurete sterile sau
prin stergere apsat si repetat cu un tampon steril preumezit n ser Iiziologic steril.

10
Recoltarea cu tamponul este recomandat n cazul leziunilor de epidermoIitie circinat
si presupune nsmntarea imediat a prelevatului pe medii de izolare. Recoltarea cu
ajutorul mochetei este mai eIicient deoarece asigur concomitent abrazarea leziunii si
retinerea sporilor, crescnd astIel sansele de izolare n cultur. Careurile de mochet se
aplic direct pe supraIata mediului de cultivare, se las n contact cu acesta cca. 5-10
minute, dup care se ndeprteaz .
Cnd leziunile sunt localizate la nivelul unor pliuri (axilar, Iesier, mamar,
crural etc.) si sunt umede / inIlamate, recoltarea se va Iace cu ajutorul unui tampon
pentru exsudate umectat n prealabil cu ser Iiziologic, recoltarea Iiind indolor.
La pacientii cu Pitvriasis versicolor, scuamele se recolteaz cel mai bine
utiliznd un Iragment de band adeziv transparent (tip scotch) cu care se
amprenteaz leziunea si care apoi se etaleaz pe o lam de microscopie; n laborator,
pentru eIectuarea examenului microscopic direct, se va aduga ntre lam si banda
adeziv o pictur de colorant, de obicei lactoIenol cu albastru de anilin.

1.9. Secreiile respiratorii joase

Sputa poate Ii prelevat prin expectoratie spontan (neprovocat) si prin
expectoratie indus (provocat).
a) n cazul expectoratiei spontane, pacientul va Ii sItuit s-si clteasc cavitatea
bucal cu ap distilat steril sau cu o solutie slab antiseptic (ap de gur)
anterior colectrii sputei. De asemenea, pacientul va Ii instruit s nu
expectoreze saliva. Colectarea probelor se va realiza prin tuse proIund urmat
de expectorarea secretiei ntr-un recipient steril, cu capac etans. Volumul
minim recoltat va Ii de 2 ml. Proba se trimite la laborator n maxim 2 ore (dac
se mentine la temperatura camerei) sau n 24 ore (dac este pastrat la
temperatura de reIrigerare);
b) n cazul expectoratiei induse, pacientul va Ii ndrumat s-si perieze dintii,
mucoasa lingual si gingiile, apoi s se clteasc riguros cu ap. Pentru
inducerea expectoratiei, pacientul va inhala aproximativ 30-50 ml de solutie
cloruro-sodic 3-10, aerosolizat prin intermediul unui nebulizator
ultrasonic. Sputa obtinut prin expectoratia astIel indus se colecteaz ntr-un
recipient steril, cu capac Iiletat;
c) Aspiratul traheostomic
Canula de traheostomie este colonizat ntr-un interval de cca. 24 ore dup
insertie. Aspirarea probelor se realizeaz cu catetere de suctiune, iar sputa
astIel obtinut se colecteaz n recipienti sterili. Rezultatele trebuie corelate cu
datele clinice si imagistice;
d) Aspiratul endotraheal
Pentru recoltare, se utilizeaz un cateter de suctiune nou, iar secretia aspirat se
stocheaz ntr-un captator de sput steril. Tubul endotraheal este Irecvent
colonizat cu bacterii si levuri, de aceea rezultatele trebuie s Iie corelate cu
constatrile clinice si cu datele imagistice. Extremittile inIerioare ale tuburilor
endotraheale nu reprezint probe acceptabile;
e) Prelevatele bronhoscopice

11
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

Acestea includ lavajul bronhoalveolar (LBA), spltura bronsic, periajul
bronsic si probele biopsice transbronhiale;
Principalele etape ale bronhoscopiei:
- Bronhoscopul se introduce transnazal sau transoral la pacientii neintubati sau prin
sonda endotraheal la pacientii intubati. Se nainteaz cu bronhoscopul pn la
nivelul unei bronhii segmentare (pentru spltura bronsic) sau a unei bronhii
subsegmentare (pentru LBA);
- Se instileaz Iractionat solutie de NaCl 0,85 steril, de obicei n volum total de
pn la 150 ml, cu o sering prin canalul bronhoscopului. Se aspir usor solutia
salin ntr-un recipient steril naintea administrrii urmtoarei Iractii. Se
consider c lavajul obtinut reprezint secretiile de la nivelul a cca. un milion
de alveole si bronhiolele aIerente si contine aproximativ 1 ml secretie;
- Probele recoltate n Ilacoane sterile, n volume suIiciente, se trateaz cu substante
mucolitice de tipul N-acetil-cisteinei si se centriIugheaz timp de 20 minute la
1500 rpm. Timp maxim de asteptare: 2 ore la temperatura camerei sau 24 ore
la 4C.

1.1. Aspiratul pulmonar

Se recolteaz prin inserarea transtoracic a unui ac n inIiltratul pulmonar, sub
ghidaj radiologic sau computer-tomograIic. Se aspir materialul din leziune. Dac
leziunea este de dimensiuni mari sau dac leziunile sunt multiple, se vor colecta mai
multe probe din zonele reprezentative. Aspiratul se transIer ntr-un recipient steril si
se expediaz imediat la laborator.

1.11. Biopsia pulmonar

Se eIectueaz n serviciile de chirurgie toracic si vizeaz obtinerea unei piese
de 1-3 cm
3
tesut. Dac leziunea este de dimensiuni mai mari sau dac se deceleaz
leziuni multiple, se recomand recoltarea mai multor probe din zonele reprezentative.
Probele se trimit la laborator n recipienti sterili, Ir Iormol, protejate ntr-o compres
umectat cu ser Iiziologic steril. Timp de asteptare: 15 minute la temperatura camerei.

1.12. Alte fluide organice normal sterile
(pericardic, peritoneal, pleural, sinovial)

Se recolteaz prin punctie, n volume de minim 5-10 ml, stocndu-se n
Ilacoane sterile. Probele se concentreaz prin centriIugare, sedimentul nsmntndu-se
pe medii solide de izolare sau se transIer ca atare n Ilacoane continnd medii pentru
hemocultur. Timp maxim de asteptare: 15 minute la temperatura camerei sau 24 ore la
4C.


12
1.13. Secreiile purulente din abcese subcutanate sau din plgi deschise

Se preleveaz Iie prin aspiratie, Iie prin tamponament proIund. Se recomand
Iolosirea sistemelor de transport pentru tampoane, n vederea prevenirii desicrii
materialului patogen. De la pacientii cu suspiciune de micetom, se recolteaz puroi din
leziuni pentru studierea culorii granulelor, examenul microscopic direct si cultur. De
la pacientii suspecti de cromomicoz se recolteaz exsudat sau cruste din leziuni pentru
eIectuarea de Irotiuri sau preparate extemporanee n vederea decelrii corpilor
Iumagoizi prin examen microscopic direct. De la pacientii cu sporothricoz se
recolteaz probe prin amprentarea leziunilor cu ajutorul unei lame de microscopie,
Irotiul obtinut colorndu-se Gram, Musto sau cu calcoIluor alb. n cazul criptococozei
diseminate sau a celei cutanate, se recomand recoltarea de probe biopsice sau raclate
din leziunile cutanate n vederea eIecturii de Irotiuri pentru examenul microscopic
direct. n cazul ulcerelor si nodulilor se urmeaz pasii: se decontamineaz supraIata cu
solutie de povidon-iod, se ndeprteaz detritusurile suprapuse si se chiureteaz baza
ulcerelor sau a nodulilor. Dac exsudatul este prezent, acesta se colecteaz cu o sering
sau cu un tampon steril.
Timp maxim de asteptare: 2 ore la temperatura camerei.

1.14. Produsele patologice de la nivelul mucoasei orale

Se recolteaz cu ajutorul unui tampon steril, preumezit n ser Iiziologic, prin
trecerea repetat a acestuia, de minim 10 ori, peste zonele cu leziuni. Alternativ, n
cazul leziunilor pseudo-membranoase sau ulcerate, se poate recurge la raclarea usoar
a acestora cu ajutorul unei chiurete sterile. n cazul aparatelor protetice amovibile,
prelevarea probelor se realizeaz de pe Iata mucozal a acestora zona predilect de
aparitie a bioIilmelor levurice. Din pungile parodontale prelevarea probelor se
eIectueaz cu sonda parodontal, n zonele vestibular, oral, vestibulo-distal,
vestibulo-mezial, oro-distal si oro-mezial. n endodontite, probele se preleveaz cu
ajutorul conurilor de hrtie sterile, de diIerite diametre, Iunctie de dimensiunea
canalelor radiculare. Timp maxim de asteptare: 2 ore la temperatura camerei.

1.15. Urina

Tehnici de recoltare (Iractiunea mijlocie n timpul mictiunii spontane):
a) la Iemei:
- Persoana care recolteaz proba trebuie s-si igienizeze minile n
prealabil, prin splare cu ap si spun. nainte de recoltare, pacientul
va Ii instruit n detaliu asupra manoperelor ce vor urma;
- Se ndeprteaz lenjeria intim, se toaleteaz zona vulvo-vaginal si
deschiderea uretrei cu ap si spun lichid, Iolosind un tampon de tiIon,
din Iat ctre spate;
- Se clteste zona cu ap sau se sterge cu un tiIon umed, cu aceleasi
miscri din Iat ctre spate. Fiecare tampon se utilizeaz o singur
dat;
- n timpul mictiunii, labiile se ndeprteaz;

13
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

- Se elimin un volum de aproximativ 40-50 ml urin, Ir ca pacienta s-
si ntrerup apoi mictiunea;
- Se recolteaz apoi urina din jetul urinar mijlociu, ntr-un recipient steril,
avnd grij ca deschiderea acestuia s nu vin n contact cu supraIete
posibil contaminate;
b) la brbati:
- Persoana care va recolta proba trebuie s Iie corect igienizat prin
splarea minilor cu ap si spun. Dac pacientul este cel ce colecteaz
urina, el trebuie s primeasc n prealabil instructiuni detaliate;
- Se toaleteaz glandul penisului si meatul urinar prin retractarea
preputului (dac nu este circumcis) si splare cu ap si spun lichid;
- Mentinndu-se preputul retractat, se ncepe mictiunea, lsnd s curg
primii mililitri de urin. Pacientul nu-si va ntrerupe emisia de urin;
- Se colecteaz apoi urina din jetul urinar mijlociu, ntr-un recipient steril.
c) Recoltarea prin cateterizare vezical
Inserarea cateterului pentru colectarea unei probe de urin este n general
descurajat. Se poate totusi utiliza cnd urina se nu se poate obtine altIel sau
cnd pacientul se aIl n stare critic.
- Se toaleteaz deschiderea uretrei pacientului si a zonei adiacente, cu ap
si spun lichid, apoi se clteste ct mai riguros;
- Se introduce cateterul pn n vezic prin tehnica recomandat, Iunctie de
sexul pacientului;
- Se ndeprteaz Iractiunea initial, de 30-50 ml urin;
- Se colecteaz urina din Iractiunea mijlocie sau terminal, ntr-un
recipient steril.
d) Recoltarea pe cateter preexistent
Trebuie de obicei evitat datorit colonizrii uneori masive cu microorganisme
a cateterelor.
- Se dezinIecteaz peretele cateterului cu alcool 70;
- Se punctioneaz cateterul, n conditii de asepsie, cu ajutorul unui ac
atasat la o sering. Niciodat se va recolta urina din punga de
colectare '
- Se aspir urina si apoi se descarc seringa ntr-un recipient steril.
e) Recoltarea prin punctie suprapubian
Aspiratia suprapubian se practic pentru diagnosticarea inIectiilor urinare la
adulti, n cazul n care se suspecteaz o inIectie si rezultatele procedurilor de
rutin au Iost nerelevante. Aspiratia suprapubian este de asemenea utilizat la
pacientii pediatrici, atunci cnd probele de urin sunt diIicil de obtinut.
- Se rade pilozitatea din zona suprapubian (dac este necesar) si se
dezinIecteaz tegumentul cu solutie de povidon-iod;
- Se punctioneaz vezica, pe linia median, n dreptul simIizei pubiene
superioare;
- Se aspir prin acul de punctie cca. 50-100 ml urin si se descarc seringa
ntr-un recipient steril.
Timp maxim de asteptare: 2 ore la temperatura camerei.


14
1.1. Secreiile vaginale

Se recolteaz cu ocazia examinrii peretilor vaginali si a portiunii vaginale a
colului uterin. Se va eIectua ntotdeauna naintea tuseului vaginal pentru a evita
modiIicarea secretiilor cervicale sau vaginale prin contaminare sau manevre septice. Se
eIectueaz cu pacienta pe masa ginecologic, n pozitie ginecologic (decubit dorsal,
coapsele n abductie, Ilexate pe abdomen, gambele Ilexate pe coapse si sprijinite n
suporturi). Valvele se aleg n Iunctie de mrimea vaginului pacientei. Ele sunt inegale -
una mai mare si alta mai mic. Introducerea valvelor n vagin trebuie s Iie indolor.
Nu se Ioloseste lubriIiant dac se recolteaz probe pentru Irotiu citobacteriologic sau
cultur. Folosirea serului Iiziologic steril ca lubriIiant poate Ii util n cazul examinrii
unor paciente cu vagin atroIic, deoarece Iaciliteaz introducerea valvelor si nu
modiIic rezultatele testelor de laborator.
Se ndeprteaz cu policele si indexul minii stngi labile mici si se introduce
mai nti valva posterioar cu lama situat vertical, apoi printr-o miscare de rotatie si
naintare se aduce lama orizontal, mentinndu-se tractiunea asupra valvei. Valva
anterioar se introduce direct cu lama situat orizontal pn n Iundul de sac vaginal
anterior. Se exercit o tractiune divergent asupra valvelor pentru a mpiedica
prinderea peretelui vaginal ntre valve si pentru a evidentia colul si Iundurile de sac
vaginale. Extragerea valvelor se Iace n ordine invers introducerii lor, extrgndu-se
initial valva anterioar si ulterior valva posterioar.
Vizualizarea peretilor vaginali se poate obtine si prin Iolosirea unui speculum -
instrument ginecologic care poate Ii conIectionat din plastic sau din metal si este
alctuit din dou valve care sunt articulate printr-un surub sau ecartor. Sunt de mai
multe tipuri, mari, mici, cu lame egale, cu lame inegale, cu diverse denumiri (Cusco,
Graves, Pederson, Collin). Introducerea speculumului se Iace Iie cu lamele situate
orizontal (mai usor la multipare), Iie cu lamele vertical, imprimndu-se ulterior
introducerii o miscare de rotatie si mpingere. Dup introducerea speculumului, se
ndeprteaz lamelele cu ajutorul ecartorului si se examineaz Iundurile de sac
vaginale si colul. Extragerea speculumului se Iace apropiind lamele si eIectund
miscarea n sens invers introducerii.
Dup introducerea valvelor sau a speculumului se observ si se notez starea
mucoasei vaginale si a colului. Normal, mucoasa vaginal este de culoare roz-
trandaIirie, uniIorm. Poate deveni violacee n sarcin sau palid, atroIiat dup
menopauz. Se mai are n vedere troIicitatea mucoasei vaginale, eventuale cicatrici,
chisturi, noduli endometriozici, ulceratii, vegetatii, malIormatii si nu n ultimul rnd
secretiile patologice. Acestea diIer n Iunctie de agentul patogen; n candidoze,
secretia este alb, grunjoas, n inIectiile cu Trichomonas este spumoas, aerat,
abundent, iar gonococul produce o secretie galben-verzuie, Ietid.
Examenul colului va obiectiva situarea, orientarea, Iorma, mrimea, aspectul
exocolului, prezenta unor secretii patologice, prezenta unor leziuni. Normal, colul este
de culoare roz, dup menopauz este palid, iar n sarcin este de culoare violacee
(semnul Jaquemier). n caz de inIlamatii, mucoasa este hiperemiat. Pe supraIata
colului se mai pot observa chisti Naboth, Iocare endometriozice sau noduli Iibromatosi.
Pentru a Ii ct mai concludent, prelevarea trebuie s respecte anumite conditii:
- prelevarea se Iace naintea instituirii tratamentului antimicrobian sau antiIungic;

15
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

- nu se Iolosesc creme vaginale sau ovule cu cel putin 2 zile nainte;
- nu se Iolosesc irigatii vaginale cu cel putin 24 de ore nainte;
- prelevarea nu se realizeaz n prezenta sngelui n vagin;
- se Iolosesc recipiente sterile, pentru a preveni contaminarea probelor;
- evitarea contactului cu substante antimicrobiene a produsului patologic;
- n unele cazuri trebuie Iolosite medii de transport sau lichide conservante;
-recipientele de transport se nchid ermetic pentru a preveni contaminarea mediului
si a personalului care manipuleaz produsul biologic;
- produsul va Ii nsoit de un bilet de trimitere completat corect;
- probele vor Ii etichetate si transportate la laborator n cel mai scurt timp posibil.
Secretia se recolteaz cu ajutorul valvelor sau a speculumului, nelubriIiate,
Iolosind mici tampoane de vat montate pe pense port-tampon sau pipete absorbante.
Instrumentarul trebuie s Iie steril. Tampoanele de vat pot Ii initial umezite n ser
Iiziologic. Prima recoltare se Iace din Iundul de sac posterior. Produsul recoltat se
etaleaz pe o lam n strat subtire, se aplic o pictur de ser Iiziologic, eventual o
pictur de albastru de metilen si apoi o lamel. A doua prelevare se realizeaz n
acelasi mod, iar dup etalarea pe lam se aplic o pictur de KOH 10, apoi lamela.
A treia recoltare se realizeaz cu o baghet steril sau cu un tampon pentru exsudate si
presupune stergerea Iundului de sac posterior cu vrIul acestora.
Probele se expediaz la laborator n maxim 2 ore (stocare la temperatura
camerei).

1.17. Produse patologice de la nivelul tractului genital masculin

n aceast grup includem prelevatele balano-preputiale (pseudo-membranele
candidozice), secretia prostatic, aspiratul prostatic si biopsia testicular. n cazul
leziunilor balano-preputiale, recoltarea probelor se realizeaz Iacil prin stergere
repetat cu un tampon steril de vat, umectat n prealabil cu ser Iiziologic.
Secretia prostatic se obtine prin eIectuarea unui masaj digital transrectal.
Colectarea probelor se realizeaz n tuburi sterile sau cu ajutorul unui tampon steril si
va Ii precedat obligatoriu de toaletarea penian. Detectarea ecograIic a abceselor
prostatice permite recoltarea de probe prin aspiratie cu ac Iin. Aspiratul de prostat se
trimite n recipienti sterili.
Biopsia testicular se eIectueaz n servicii chirurgicale, n conditii de asepsie
si antisepsie depline, iar probele se trimit la laborator n recipiente sterile (cele pentru
cultur) sau continnd Iixator Bouin (cele pentru diagnostic histopatologic).

1.18. Fragmentele tisulare biopsice

Se recolteaz n timpul interventiilor chirurgicale si se transport nvelite n
tiIon steril umectat cu ser Iiziologic, n containere sterile. Timp maxim de asteptare: 15
minute la temperatura camerei. Fragmentele de tesut suspectate a proveni dintr-un
Iocar de zygomicoz nu se mojareaz, nu se tritureaz, deoarece se distruge miceliul si
creste enorm riscul de a obtine culturi negative.


16
1.19. 1ehnica aspiraiei cu ac fin

Aspiratia cu ac Iin (AAF) este util pentru diagnosticul leziunilor care sunt
usor palpabile, cum ar Ii excrescentele pielii, leziunile deIormante ale tesutului
subcutanat, tiroid, limIonoduri, glande salivare si sni. Aspiratia ghidat prin tehnici
imagistice cum ar Ii computer-tomograIia sau ultrasonograIia permite obtinerea de
probe si n cazul leziunilor organelor interne ca pulmonul, organele abdominale si
retroperitoneale, prostata etc. Riscul sczut al complicatiilor permite executarea ei n
ambulatoriu. AAF este indicat si la pacientii debilitati, cu leziuni multiple, Iiind o
tehnic minim invaziv.
Acele pentru puncie vor avea un calibru standard de 22-24 G si lungime de
2,5-4 cm. Lungimea si calibrul acului trebuie s Iie adecvate mrimii, proIunzimii,
zonei si consistentei ,tintei. Pentru leziunile subcutanate mici, acele de calibru 23G si
lungime de 2,5 cm sunt ideale, desi n leziunile proIunde sunt necesare ace mai lungi si
cu diametru mai mare. Acele Iine sunt de asemenea recomandate pentru copii, si pentru
organele vascularizate, cum ar Ii tiroida.
Seringile recomandate n aceast tehnic sunt cele single-use, cu volum util de
10 ml. Seringile trebuie s Iie de calitate, capabile s produc o presiune negativ
adecvat aspirrii. Seringile cu capacitate de 5 ml pot Ii utilizate pentru organele
vascularizate precum tiroida. Un Iactor important este adaptarea etans a acului la
captul seringii. O potrivire neglijent a acestuia poate compromite procedura.
Manipularea pistonului seringii se realizeaz cu o mn, iar cu cealalt se Iixeaz
leziunea.

1ehnica aspiraiei

naintea executrii aspiratiei trebuie urmate etapele:
1. EIectuarea unei anamneze riguroase si a unui examen clinic detaliat, cu
revederea rezultatelor radiologice si stabilirea diagnosticul prezumtiv. Trasarea
cu ajutorul unui marker a zonei corporale n care se va executa aspiratia;
2. Leziunea ce urmeaz s Iie aspirat este palpat si Iixat pentru a aprecia
punctul optim de abordare. Se va alege n consecint acul cel mai adecvat;
3. Procedura trebuie s Iie clar explicat pacientului si consimtit de acesta.
Pacientul poate prezenta o stare de anxietate, Iiind necesar o premedicatie cu
tranchilizante. Pielea se dezinIecteaz Ierm cu un tampon de vat mbibat n
solutie iodat. Anestezia local este uneori necesar;
4. nainte de nceperea procedurii, ne vom asigura c tot echipamentul necesar,
instrumentarul si accesoriile sunt disponibile;
5. Pozitionarea pacientului: orice pozitie poate Ii aleas, tinndu-se binenteles cont
de conIortul pacientului si asigurarea cii de abord. AAF este de obicei
executat cu pacientul asezat n decubit dorsal pe un pat de examinare;
6. Imobilizarea leziunii: leziunea este Iixat ntre policele si indexul minii stngi,
cu pielea usor tensionat. Se ncearc evitarea interpunerii maselor musculare
importante;
7. Penetrarea leziunii: se punctioneaz leziunea printr-o miscare atent si rapid,
unghiul si proIunzimea penetrrii variind dup caz. Pentru Iormatiunile mici,

17
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

este indicat aspiratia din zona central . Pentru Iormatiunile mai mari, care pot
avea necroze, modiIicri chistice sau hemoragice centrale, aspiratia poate Ii
executat si de la periIerie. Dac se aspir numai puroi sau material necrotic
din leziunile mari, AAF poate Ii repetat imediat, de la periIerie. Dac acul se
plaseaz tangential n cazul unei Iormatiuni mici sau dac penetreaz dincolo
de Iormatiune, materialul nu va putea Ii recoltat.
Aot. Dac suprafaa :onei de execuie a AAF este locali:at lang cutia toracic
(formaiuni nodulare axilare sau supraclaviculare), aspiraia se va executa intr-un
plan paralel fa de cutia toracic pentru a evita penumotoraxul. In AAF la nivelul
tiroidei, pacientul trebuie instruit s nu inghit sau s vorbeasc cand acul este plasat
in interiorul formaiunii.
8. Crearea vacuumului si obtinerea materialului biologic: aspiratia este executat
dup ptrunderea n leziune si se mentine n timp ce acul este actionat viguros
prin multiple miscri de ,,du-te - vino, n cteva directii diIerite dar
convergente. ntreaga procedur trebuie s dureze maxim 6-8 secunde. Nu se
roteste acul si nici nu se Iac miscri de pompare a pistonului seringii (nuntru-
naIar). Rezultatul aspiratiei este extragerea de Iragmente de tesut si celule
dislocate de bizoul acului.
9. Eliberarea vacuumului si retragerea acului: cnd materialul biologic este
observat la baza acului, procedura se ntrerupe. naintea retragerii acului, se
elibereaz din tensiune pistonul seringii, apoi acul se scoate din Iormatiune,
drept, Ir al nclina. Pistonul revine singur, ncet (Ir a Ii mpins). O eliberare
insuIicient a presiunii negative n interiorul Iormatiunii va cauza aspirarea
materialului biologic la intrarea n sering, ceea ce-l va Iace diIicil de
recuperat. n situatii exceptionale, seringa si acul pot Ii cltite cu ser Iiziologic
sau Iixator care apoi se va centriIuga pentru a prepara un Irotiu. Imediat dup
retragerea acului, pe zona punctionat se aplic un tampon mbibat cu
dezinIectant si se preseaz cteva minute, de preIerat de ctre un asistent.
Aceasta se realizeaz cu scopul de a preveni Iormarea unui hematom n zonele
intens vascularizate.


18
Bibliografie selectiv

1. Artal M E (2004) - Diagnostico histopatologico de las micosis; Rev
Iberoam Micol; 21:1-9.
2. Bates D W, Cook E F, Goldman L, et al. (1990) - Predicting bacteremia in
hospitalized patients: a prospectively validated model; Ann Intern Med;
113:495-500.
3. Brouqui P, Raoult D (2001) - Endocarditis Due to Rare and Fastidious
Bacteria; Clin Microbiol Rev; 24(1): 177-207.
4. Buiuc D, Negut M (1999) - 1ratat de microbiologie clinic; Ed. Medical;
Bucuresti.
5. Cicalese L (1999) - Bacterial translocation in intestinal transplant
recipients; 1ransplantation; 67(9): S589.
6. Darby J M, Linden P, Pasculle W, et al. (1997) - Utilization and diagnostic
yield oI blood cultures in a surgical intensive care unit; Crit Care Med;
25:989-994.
7. Debelian G J (1998) - Anaerobic bacteremia and Iungemia in patients
undergoing endodontic therapy: an overview; Ann Periodontol; 3(1):281-
287.
8. Doern G V (1994) - Manual blood culture systems and the antimicrobial
removal device; Clin Lab Med; 14:133-147.
9. Edgeworth J D, Treacher D F, Eykyn S J (1999) - A 25-year study oI
nosocomial bacteremia in an adult intensive care unit; Crit Care Med;
27:1421-1428.
10. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed.
Viata Medical Romneasc; Bucuresti.
11. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines - dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
12. Hampton J R, Harrison M J G (1964) - Sterile blood cultures in bacterial
endocarditis; Q1 Med; 36:167-174.
13. Harlod C N (1986) - Cost EIIective Blood Cultures - Is It Possible or
Impossible to ModiIy Behavior? Infection Control; 7(1):32-33.
14. Hoog G S de, Guarro J, Gene J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
edition; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat
Rovira i Virgili.
15. Jaimes F, Arango C, Ruiz G et al (2004) - Predicting Bacteremia at the
Bedside; Clinical Infectious Diseases; 38:357-362.
16. Lichtman Steven M (2001) - Baterial Translocation in Humans; 1ournal
of Pediatric Castroenterology & Autrition; 33(1):1-10.
17. Lionaskis M S (2004) - The signiIicance oI blood cultures positive Ior
emerging saprophytic moulds in cancer pacients; Clin Microb Infect; 10
(10):922-926.
18. Maoxin W, David E B (2004) - Fine Needle Aspiration, Cancer
Investigation; 22(4).
19. Peteanu V, Peteanu V, Balt M (1997) - Examene i investigaii n
ginecologie i obstetric; Ed. Ex Ponto, Bucuresti.

19
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)

20. Richardson M D, Warnock D W (2003) - Fungal infection - Diagnosis
and Management; Blackwell Publishing.
21. Ronveaux O, Jans B, Suetens C, Carasauw H (1998) - Epidemiology oI
Bloodstream inIections in Belgium 1992-1996; Eur 1 Clin Infect Dis; 17:
695-700.
22. Sutton D A (2003) - Specimen collection, transport, and processing:
Mycology; In Murray P R et al. (eds.); Manual of clinical microbiology;
8
th
edition; ASM Press; Washington D C; 2:1659-1667.
23. Varghese C, Venkataraman K, Bhagwat S et al. (2005) - Manual for
Cytology; Directorate General oI Health Services Ministry oI Health and
Family WelIare, India.
24. Warran D, Zack J, Elward A, Cox M, Fraser V (2001) - Nosocomial
primary bloodstream inIections in intensive care unit patients in a
nonteaching community medical center: a 21-month prospective study;
Clin Infect Dis; 33:1329-1335.
25. Wingard J R (1999) - Fungal inIections aIter bone marrow transplant; Biol
Blood Marrow 1ransplant; 5(2):55-68.

Mihai Mares, Bogdan DoroItei, Petru Cazacu, Maria Dan

21
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*


xamenul microscopic direct al produselor patologice recent recoltate poate
orienta diagnosticul ctre o inIectie Iungic si uneori poate chiar oIeri
indicii importante privind etiologia acesteia prin evidentierea unor Iormatiuni sau
elemente caracteristice. El este obligatoriu pentru orice tip de prelevat cu exceptia
sngelui si are valoare diagnostic intrinsec deoarece permite conIirmarea rapid a
suspiciunii de inIectie micotic si inIormarea timpurie a clinicianului, cu mult timp
nainte de pozitivarea culturii. Se eIectueaz pe prelevate n stare proaspt, cu sau Ir
colorare prealabil (calcoIluor, Giemsa etc.): lavaj bronhoalveolar (dup centriIugare),
biopsii (Irotiuri prin amprent), sput (dup tratare cu N-acetil-cistein), hemoculturi,
prelevate superIiciale cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale, auriculare.

Produsele patologice pentru care exist suspiciunea c ar contine Iungi se pot
examina microscopic prin una dintre urmtoarele Iorme:
- preparat extemporaneu ntre lam si lamel, cu solutie 20 KOH (scuame,
Iragmente unghiale, secretii linguale, vaginale); sensibilitatea metodei este
relativ sczut, depinznd de abilitatea si experienta anterioar a
examinatorului. n acest scop, se omogenizeaz pe o lam de microscopie
volume egale din materialul patologic si solutia clariIicant, dup care se
acoper cu o lamel, astIel nct s se evite Iormarea bulelor de aer. Decelarea
Iormatiunilor Iungice n prelevate este mult ameliorat dac la solutia
clariIicant se adaug un colorant negru clorazol, cerneal Parker sau o
substant Iluorescent cu aIinitate pentru glicanul din peretele Iungilor
(Blankophor, CalcoIluor n proportie de 0,1). Utilizarea substantelor
Iluorescente incumb examinarea preparatului la un microscop cu Iluorescent.
- preparat extemporaneu cu solutie 20 KOH substant Iluorescent sau Irotiu
colorat cu aceeasi substant Iluorescent (CalcoIluor, Blankophor etc.); este
metoda optim de detectie a Iungilor n prelevate datorit unei sensibilitti si
speciIicitti excelente, dar necesit microscopie n lumin ultraviolet (Iig. nr.
2-1 ve:i Anexa). Cteva Iragmente din prelevatul recoltat de la pacient se
depun pe o lam de sticl, ntr-o pictur de lichid clariIicant (solutie 10-20
KOH cu adaos de calcoIluor 0,1) care prin ,digerarea keratinei si a celulelor
somatice va permite observarea la microscop a diverselor Iormatiuni
E
2
Tehnici de microscopie direct

22
caracteristice Iungilor. Dup un contact de cca. 10-15 minute (eventual mai
ndelungat n cazul Iragmentelor unghiale), lama se acoper cu o lamel si se
examineaz la microscop, cu obiectivele 10, 20 si 40, dup caz. Actiunea
lichidului clariIicant poate Ii intensiIicat prin nclzirea lamei la Ilacra unui
bec de gaz, Ir ns a-l aduce la Iierbere. n general, lama se poate examina
cnd opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil.
- Irotiu colorat Gram: pune cu usurint n evident Iilamentele, pseudohiIele,
artrosporii si blastosporii de dimensiuni mari, ns este inadecvat pentru
detectia celulelor levurice de dimensiuni mici de exemplu, Candida glabrata
(Iig. nr. 2-2 ve:i Anexa)
- Irotiu pregtit pentru imunoIluorescent prin tratare cu anticorpi monoclonali
cuplati cu markeri Iluorescenti (n special pentru detectia Pneumocvstis
firoveci n prelevatele respiratorii)
- preparat extemporaneu colorat cu tus de India: pune n evident levurile capsulate
din genul Crvptococcus, n sedimentul LCR, urinar, etc. (Iig. nr. 2-3 ve:i
Anexa)
- Irotiu colorat May-Grunwald-Giemsa: metod de rutin pentru depistarea
levurilor intracelulare de tip Histoplasma, dar poate Ii utilizat si pentru
detectarea levurilor prin microscopie direct (Iig. nr. 2-4 ve:i Anexa)
- Irotiu necolorat sau colorat cu albastru de metilen 3: metoda se poate Iolosi
pentru detectarea levurilor din hemoculturi, ns alte tehnici cu speciIicitate
mai ridicat sunt recomandate (Iig. nr. 2-5 ve:i Anexa)
- preparat extemporaneu cu band adeziv, colorat cu albastru de metilen n
lactoIenol: metod expeditiv de diagnostic tip ,one-step a leziunilor de
Pitvria:is versicolor (Iig. nr. 2-6 ve:i Anexa)
- Irotiuri obtinute prin etalare sau amprent (pornind de la prelevate ca aspiratul
bronsic, LBA sau biopsiile) care apoi se coloreaz Musto sau cu calcoIluor si
se examineaz n vederea decelrii aspectelor particulare care ar pleda pentru o
zygomicoz, aspergiloz etc.

Elementele morIologice identiIicabile prin examen microscopic direct sunt
levurile (burjeonate sau nu, intra- sau extracelulare, cu sau Ir capsul), Iragmentele
hiIale, septate sau nu, uneori ramiIicate, celulele Iumagoide - celule cu aspect
muriIorm, melanizate, de 4-12 m diametru, septate longitudinal si transversal,
granulele (numite si scleroti - elemente sIerice, dure, de cca. 1 mm diametru, Iormate la
nivelul micetoamelor prin ntreteserea dens a hiIelor), rar structurile de IructiIicare ale
unor Iungi Iilamentosi.

2.1. Coloraia negativ cu tu de India

Scop
Se recomand pentru decelarea levurilor apartinnd speciei C. neoformans n
sedimentul unor Iluide biologice (LCR, urin, etc.).

Echipamente
Lame si lamele de microscopie, mnusi de unic Iolosint, pipete

23
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

Reactivi
Tus de India sau tip Parker

Mod de lucru
1. Pe o lam de sticl degresat se depun si se amestec o pictur din sedimentul
probei de analizat si o pictur tus de India;
2. Se acoper cu o lamel de sticl evitnd Iormarea bulelor de aer;
3. Preparatul extemporaneu astIel obtinut se examineaz la microscop
(x100, x400).

Rezultatul colorrii
Crvptococcus neoformans se prezint sub Iorm de celule levurice rotunde,
nmugurite sau nu, nconjurate de un halou clar, necolorat, Iacil de vizualizat pe Iondul
maron-negru al preparatului. Datorit necolorrii capsulei polizaharidice, metoda mai
poart denumirea de 'coloratia negativ cu tus de India.

2.2. Coloraia negativ cu mercurochrom 2" i tu de India

Scop
Reprezint o variant mbunttit a metodei anterioare, permitnd
vizualizarea a trei zone n componenta capsulei si a unor corpusculi n interiorul
celulelor levurice la C. neoformans, ceea ce creste considerabil speciIicitatea
examenului microscopic direct.

Echipamente
Lame si lamele de microscopie, mnusi de unic Iolosint, pipete

Reactivi
Solutie 2 mercurochrom (C
20
H
8
Br
2
HgNa
2
O
6
sarea disodic a 2,7-dibrom-4-
(hidroxomercurio)-Iluoresceinei)
Tus India (sau tus negru tip Parker)

Mod de lucru
1. Pe o lam de sticl degresat se depun succesiv si se omogenizeaz o pictur
din sedimentul probei de analizat, o pictur sol. 2 mercurochrom si o
pictur tus de India;
2. Se acoper cu o lamel;
3. Se examineaz la microscop (x100, x400, x1000).

Rezultatul colorrii
Crvptococcus neoformans se prezint sub Iorm de celule levurice rotunde,
nmugurite sau nu, nconjurate de o capsul clar, Iormat din 3 zone concentrice; n
interiorul celulelor levurice sunt adesea observabili corpusculi de Iorm rotund.


24
2.3. Coloraia cu lactofenol i albastru de anilin (Lactophenol Cotton Blue)

Scop
Metod destinat colorrii si evidentierii prin microscopie a Iungilor din unele
prelevate clinice si culturi.

Echipamente
Lame si lamele de microscopie, curate si degresate, ans de nsmntare,
mnusi de protectie, pahar Berzelius, plnie, hrtie de Iiltru, agitator magnetic.

Reactivi

LactoIenol cu albastru de anilin

Albastru de anilin ......................................... 0,05 g
Fenol, cristale .............................................. 20,00 g
Glicerol ...................................................... 40,00 ml
Acid lactic .................................................. 20,00 ml
Ap distilat ............................................... 20,00 ml

Prepararea acestei solutii dureaz cca. dou zile:
1. n prima zi, se dizolv albastrul de anilin n apa distilat. Se las peste noapte
pentru decantarea colorantului insolubil;
2. AIIa zi, purtnd mnusi de protectie, se adaug cristalele de Ienol n acidul
lactic, ntr-un pahar Berzelius. Se omogenizeaz apoi Iolosind un agitator
magnetic pn la dizolvarea complet a Ienolului;
3. Se adaug glicerolul;
4. Se Iiltreaz solutia de albastrul de anilin si se adaug n solutia de Ienol /
glicerol / acid lactic. Se amestec si se pstreaz la temperatura camerei n
Ilacoane cu dop picurtor.

Mod de lucru
1. Se etaleaz pe o lam o cantitate suIicient de prob;
2. Se adaug 1-2 picturi solutie de lactoIenol si albastru de anilin;
3. Se omogenizeaz usor;
4. Se acoper cu o lamel si se examineaz la microscop.

Rezultatul colorrii
Fungii albastru-nchis

Aot:
Soluia de lactofenol i albastru de anilin este disponibil comercial. Merck, Remel,
Becton-Dickinson (Lactophenol blue solution)


25
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

2.4. Coloraia cu hidroxid de potasiu i cerneal Parker

Scop
Evidentierea elementelor Iungice n raclatele tegumentare, pr si Iragmente
unghiale, prin examen microscopic direct.

Echipamente
Lame si lamele de microscopie, curate si degresate, ans de nsmntare, pens

Reactivi

Hidroxid de potasiu .......................................... 10 g
Glicerol ........................................................... 10 ml
Cerneal Parker Quink Permanent Blue ......... 10 ml
Ap distilat .................................................... 80 ml

Se dizolv KOH n ap, apoi se adaug glicerol si cerneala Parker. Glicerolul
previne cristalizarea reactivului si deshidratarea probei.

Mod de lucru
1. Se utilizeaz o ans de nsmntare sau pens pentru ndeprtarea unei mici
portiuni din proba de tesut, n special din zonele necrotice sau purulente.
Aceasta se etaleaz ntr-o pictur de colorant, pe o lam de microscopie;
2. Se acoper cu o lamel si apoi se comprim preparatul cu ajutorul captului unei
anse de nsmntare pentru ndeprtarea excesului de Iluid. Se nclzeste usor
preparatul prin trecerea acestuia de 2-3 ori prin Ilacr, evitndu-se Iierberea;
3. Dup clariIicarea preparatelor (15-20 minute pentru raclatele pielii si cteva ore
pentru raclatele unghiale), acestea se vor examina la microscop (x10, x20, x40)
pentru punerea n evident a elementelor Iungice.

Rezultatul colorrii
Elementele Iungice apar colorate n albastru pal.

Aot:
1. Aceast tehnic este frecvent utili:at, dar timpul necesar pentru clarificarea i colorarea
complet poate fi mai indelungat. Preparatele se pot pstra pan cand re:ultatele culturii
sunt cunoscute.
2. Probele negative la prima citire trebuie pstrate i reexaminate in :iua urmtoare pentru a
evita raportarea unor re:ultate fals negative, datorit intar:ierii clarificrii i colorrii
probei.

2.5. Clarificarea cu hidroxid de potasiu i dimetil sulfoxid

Scop
Evidentierea elementelor Iungice prin examenul microscopic direct al
raclatelor tegumentare, pr si unghii (n special detectia dermatoIitozelor).


26
Echipamente
Lame si lamele de microscopie, curate si degresate, ans de nsmntare, pens

Reactivi

Dimetil sulIoxid (DMSO) ............................... 40 ml
Ap distilat .................................................... 60 ml

Se adaug dimetil sulIoxidul n apa distilat si apoi se dizolv KOH n solutia
respectiv.

Mod de lucru
1. Se utilizeaz o ans de nsmntare sau o pens pentru recoltarea unei mici
portiuni din prelevat. Aceasta se etaleaz apoi ntr-o pictur de KOH-DMSO
pe o lam de microscopie;
2. Se acoper cu o lamel, se comprim usor preparatul cu ajutorul captului unei
anse de nsmntare si apoi se ndeprteaz excesul de Iluid. Preparatul nu se
nclzeste;
3. Se examineaz la microscop, cu diaIragma semideschis pentu a surprinde mai
usor elementele Iungice reIringente, necolorate.

Aote:
1. DMSO permite o macerare i o clarificare mult mai rapide decat hidroxidul de potasiu
singur.
2. Preparatele nu se vor pstra dup examinare.

2.. Coloraia cu calcofluor alb i KOH 1"

Scop
Evidentierea elementelor Iungice din diverse prelevate, prin microscopie cu
Iluorescent.

Echipamente
pens.


27
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

Reactivi

Solutia A

Glicerol ........................................................... 10 ml
Ap distilat .................................................... 90 ml

Se dizolv KOH n ap si apoi se adaug glicerolul.

Solutie B

CalcoIluor alb .................................................. 0,1 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Se dizolv calcoIluorul alb pulbere n apa distilat usor nclzit.

Mod de lucru
1. Se amestec o pictur din Iiecare solutie (A si B) n centrul unei lame de
microscopie;
2. Se etaleaz proba de tesut n solutie si apoi se acoper cu o lamel, comprimnd
preparatul cu captul unei anse de nsmntare. Excesul de lichid se elimin;
3. Alternativ, n Iunctie de natura prelevatului se pot obtine si Irotiuri prin
amprent sau stergere, care se trateaz apoi cu solutiile reunite mentionate;
4. Se nclzeste usor lama si se examineaz la microscopul cu Iluorescent echipat
cu Iiltre adecvate.

Rezultatul colorrii
Elementele Iungice prezente n preparat vor apare colorate n albastru
Iluorescent sau verde-deschis, n Iunctie de Iiltrele utilizate.

Aote:
1. Este o metod expeditiv i sensibil, totui este necesar ca microscopul cu fluorescena s
fie dotat cu filtre care s determine o sensibili:are la lumina ultraviolet, cu o lungime de
und foas, de cca. 400 nm.
2. Calcofluorul alb (M2R pulbere - Polvsciences sau Blankophor BA - Baver) este utili:at ca
agent de albire in industria hartiei, legandu-se selectiv de celulo: i chitin. Este un
colorant fluorescent pentru fungi.


28
2.7. Coloraia Cram

Scop
IdentiIicarea Iungilor prin examenul microscopic al Irotiurilor executate din
diverse lichide biologice.

Fixator
Metanol absolut

Echipamente
Lame de sticl pentru microscopie (25/75 mm) cu un capt mat, pipete Pasteur,
anse de nsmtare microbiologic, ace de inoculare, recipiente pentru depozitarea de
deseuri biologice
Materiale optionale, depinznd de sursa probelor si de protocolul laboratorului:
a) plit nclzitoare, 60C;
b) centriIug;
c) agitator tip Vortex;
d) tuburi sterile cu dop Iiletat;
e) IoarIece sterile, bisturie, pense.

Reactivi

Solutia de cristal violet

Cristal violet ....................................................... 2 g
Etanol 95 ..................................................... 20 ml
Oxalat de amoniu ............................................. 0,8 g
Ap distilat .................................................... 80 ml

Se dizolv cristalul violet n etanol si oxalatul de amoniu n ap. Se las solutia
de oxalat de amoniu peste noapte pentru solubilizare complet sau se nclzeste usor
pn la dizolvare. Se amestec cele dou solutii si apoi se Iiltreaz.

Solutia iod-iodurat Gram (solutia Lugol)

Iod ....................................................................... 1 g
Iodur de potasiu ................................................ 2 g
Ap distilat .................................................. 275 ml

Se adaug iodul peste iodura de potasiu, n aproximativ 25 ml ap distilat.
Cnd solubilizarea este complet se adaug restul de ap.
Atenie' Iodul este coro:iv. Se evit inhalarea, ingestia sau contactul cu pielea.

*
ve:i coloraia Gram-calcofluor alb

29
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

Solutia de alcool-aceton

Etanol 95 ................................................... 100 ml
Aceton ......................................................... 100 ml

Se omogenizeaz si se pstreaz ntr-un recipient brun, etichetat cu data
preparrii, la temperatura camerei. Solutia este stabil 1 an.
Atenie' Etanolul i acetona sunt inflamabile.
SaIranin O 0,4

SaIranin O ......................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 250 ml

Mod de lucru
1. Frotiurile pot Ii Iixate prin nclzire sau cu metanol;
2. Frotiurile se pot usca n aer sau se mentin pe o platin nclzitoare electric, la
60C, pn la uscare:
3. Dac Irotiurile sunt uscate n aer se vor trece de dou sau trei ori printr-o Ilacr.
Pentru a evita denaturarea Irotiului, acesta nu se supranclzeste.
4. Se las lama s se rcesc nainte de colorare;
5. Fixarea cu metanol previne liza eritrocitelor. De asemenea, Iixarea cu metanol
este recomandat pentru toate prelevatele clinice lichide, n special pentru
urin, deoarece previne splarea probelor n timpul colorrii. Metanolul se
stocheaz n sticle brune cu dop etans. O cantitate de lucru poate Ii pstrat n
recipienti de plastic, dac aceasta se nlocuieste la Iiecare 2 sptmni. Pentru
Iixare, se adaug cteva picturi de metanol pe lam, se las n contact timp de
1 minut, apoi se vars si se las lama s se usuce la aer;
6. Se inund Irotiul astIel Iixat, cu solutie de cristal violet. Se las n contact 60
secunde;
7. Se vars solutia de cristal violet si se clteste lama usor cu ap de robinet.
Atenie' Cltirea excesiv poate determina ndeprtarea cristalului violet din
celulele gram-pozitive. Apa se vars pe unul din capetele lamei, oblic, pentru a
asigura o curgere lent peste Irotiu.
8. Se clteste apoi cu solutie Lugol, timp de 3 secunde;
9. Se inund Irotiul cu solutie Lugol si se las n contact 30 secunde;
10. Se spal cu ap de robinet;
11. Se toarn solutie alcool-aceton peste Irotiu, ntr-un capt al lamei, oblic, pn
cnd solutia care se scurge la capatul opus devine clar. Timpul de decolorare
variaz n Iunctie de grosimea Irotiului (n general 8-10 secunde);
13. Se inund lama cu solutie de saIranin 0,4 , timp de 30 secunde;
14. Se ndeprteaz colorantul (saIranin 0,4) cu un jet de ap de robinet ;
15. Se usuc lama n aer, n pozitie vertical, iar apoi se sterge reversul acesteia cu
un servetel mbibat n alcool sau aceton.


30
Rezultatul colorrii
Fungii sunt Gram-pozitivi, deci se vor colora n violet.

Aote:
1.Dac soluia de cristal violet pre:int precipitat sau sediment, se refiltrea: inainte de
utili:are. Unii colorani, in special safranina, se pot contamina. Cand se suspectea:
acest lucru, se inlocuiesc.
2. Evaporarea poate altera eficacitatea reactivilor, soluiile de lucru trebuie schimbate
regulat.
3. Zilnic sau cand se folosete un nou lot de reactivi se reali:ea: controlul de calitate prin
executarea unui frotiu din Escherichia coli (ATCC 25922) i Staphvlococcus
epidermidis (ATCC 12228) sau Staphvlococcus aureus (ATCC 25923). Acesta se
fixea: i se colorea: dup tehnica descris mai sus. Re:ultatele colorrii frotiului de
control.
a) coco-bacili Gram-negativi. ro:,
b) coci Gram-po:itivi. violet intens.
4. Cateva dintre cau:ele cele mai frecvente care duc la obinerea unor re:ultate
nesatisfctoare ale coloraiei Gram.
a) utili:area unor lame de microscopie insuficient degresate. Pentru acest lucru, se
pstrea: lamele intr-un pahar cu etanol 95. Excesul de alcool se
indeprtea: prin tergerea sau flambarea lamelor inainte de utili:are,
b) executarea unor frotiuri prea groase,
c) supraincl:irea frotiului cand acesta este fixat prin cldur,
d) splarea excesiv pe durata procedurii de colorare.

2.8. Coloraia Cram - calcofluor alb

Scop
Uneori, Iungii nu se pot distinge cu acuratete n Irotiurile colorate Gram sau
pot rmne mascati de alte materiale din prob. n aceast situatie, calcoIluorul alb
poate Ii utilizat pentru supracolorarea Irotiurilor colorate Gram n vederea unei mai
bune evidentieri a elementelor Iungice.

Echipamente
Lame si lamele pentru microscopie, hrtie de Iiltru, betisoare din lemn,
microscop cu Iluorescent, sticlrie de laborator

Reactivi

Xilen
Metanol absolut
Solutie de hidroxid de potasiu 10 sau 20
CalcoIluor alb

Mod de lucru
1. Se coloreaz Irotiul prin tehnica de colorare Gram;
2. Se aplic peste Irotiul colorat Gram un Iragment de hrtie absorbant, pentru a-l
usca;

31
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

3. Se inund lama cu xilen pentru 1-2 ore, n Iunctie de grosimea Irotiului;
4. Se cltesc lamele n metanol absolut pentru a ndeprta resturile tisulare;
5. Se inund lama cu solutie KOH 10-20 pentru 1-2 ore, n Iunctie de grosimea
Irotiului;
6. Se ndeprteaz KOH, se adaug o pictur de calcoIluor alb 0,1 si se
omogenizeaz usor cu un betisor de lemn;
7. Se aplic apoi o lamel prin presare usoar. Preparatul se examineaz la
microscopul cu Iluorescent Iolosind Iiltre speciale (490-520 nm);
8. Elementele Iungice care n prealabil nu sunt vizibile sau sunt neidentiIicabile n
Irotiurile colorate Gram, pot Ii distinse mai Iacil ca structuri Iluorescente.

Aot:
Multe din prelevatele clinice trimise laboratoarelor de microbiologie pentru
examinare pot conine i elemente fungice, care de multe ori sunt nedetectate sau confundate.
De aceea este imperios necesar o instruire a personalului in vederea creterii performanelor
examenului microscopic direct i in ceea ce privete detectarea elementelor fungice pe frotiuri
colorate Gram.

2.9. Coloraia Ciemsa

Scop
Evidentierea troIozoitilor si a corpilor intrachistici (nu si a chistilor) la
Pneumocvstis carinii, prin examenul microscopic al Irotiurilor executate din prelevate
respiratorii joase.

Fixator
Metanol absolut

Echipamente
Lame si lamele pentru microscopie, curate si degresate, sticlrie de laborator,
hrtie de Iiltru

Reactivi

Solutia Giemsa stoc

Colorant Giemsa, pulbere ................................ 0,8 g
Glicerol ........................................................ 50,0 ml
Metanol absolut ........................................... 50,0 ml

Se dizolv pulberea de colorant Giemsa n glicerol, apoi se nclzeste solutia
pe baie de ap pn la 56-60C, timp de 90-120 minute. Se adaug metanolul, se
omogenizeaz si se Iiltreaz. Solutia stoc se va pstra la temperatura camerei ntr-un
recipient nchis.

Solutie Giemsa de lucru
Solutia stoc se dilueaz n proportie de 1:50 cu solutie de IosIat Sorensen.

32

Solutie IosIat Sorensen pH 6,4

FosIat de potasiu monobazic ......................... 6,63 g
FosIat de potasiu dibazic anhidru .................. 2,56 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml

Mod de lucru
1. Se usuc Irotiul n aer;
2. Se Iixeaz cel putin 30 secunde (uzual 3-4 minute) n metanol absolut;
3. Se ndeprteaz metanolul prin nclinarea lamei sau prin scoaterea acesteia din
paharul cu Iixator, apoi se usuc n aer;
4. Se introduc lamele complet uscate ntr-un pahar Berzelius sau se aseaz
orizontal n suportul unei baterii de colorare care contine solutie Giemsa de
lucru, pentru 20-30 minute;
5. Se spal lama cu ap distilat;
6. Se sterge pe verso, apoi se usuc n aer;
7. Se monteaz sau nu, apoi se examineaz la microscop. nainte de montare,
lamela se introduce n xilen pentru a evita aparitia bulelor.

Rezultatul colorrii
TroIozoitii apar de obicei n plaje, aglomerati, cu nucleul colorat n rosu-
violet si citoplasma n gri.

Aote:
1. Prelungirea imersiei in soluia Giemsa diluat poate face ca materialul biologic de pe
lam s se desprind.
2. Colorantul Giemsa este disponibil comercial.

2.1. Coloraia May-Crunwald-Ciemsa (MCC)

Scop
Este o coloratie de electie pentru depistarea intramacroIagic a Iormei levurice
apartinnd speciei Histoplasma capsulatum var. capsulatum.

Fixator
Metanol absolut

Echipamente
hrtie de Iiltru


33
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

Reactivi

Solutia de colorare I (May- Grnwald)

May-Grnwald pulbere ................................... 0,3 g
Metanol absolut ......................................... 100,0 ml

Dup preparare se pstreaz ntr-un recipient etans, la temperatura camerei
timp de 24 ore. Se Iiltreaz nainte de utilizare.

Solutia de colorare II (Giemsa)

Colorant Giemsa pulbere .................................... 1 g
Glicerol ........................................................... 66 ml
Metanol absolut .............................................. 66 ml

Colorantul Giemsa se dizolv n glicerol si apoi se nclzeste la 56C timp de
90-120 minute. Se adaug metanolul agitnd pentru omogenizare. Solutia Iinal se
pstreaz la temperatura camerei ntr-un recipient nchis. Se Iiltreaz nainte de
utilizare.

Solutia tampon Srensen pH 6,8

FosIat de sodiu dibazic .................................... 0,3 g
FosIat de sodiu monobazic .............................. 0,7 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Dup preparare, solutia se pstreaz la Irigider; este stabil timp de 1 an.

Mod de lucru
1. Se Iixeaz Irotiurile n metanol absolut, timp de 30 secunde;
2. Se ndeprteaz metanolul;
3. Se aplic solutia de colorare I proaspt diluat 1:1 cu solutie tampon, timp de 5
minute (lama va Ii pozitionat orizontal sau introdus ntr-un pahar);
4. Se transIer lamele Ir splare prealabil n solutia de colorare II diluat recent
cu 9 prti de solutie tampon, pentru 10-15 minute;
5. Se imerseaz lamele n solutie tampon pentru ndeprtarea colorantului;
6. Se spal lamele cu ap de robinet din abundent;
7. Se transIer ntr-un pahar cu ap pentru 2-5 minute;
8. Se usuc apoi ntr-o pozitie oblic. Nu se usuc prin stergere;
9. Se poate monta o lamel, ns nu este neaprat necesar.

Rezultatul colorrii
Fungii nuante de roz, albastru, violet


34
Aote:
1. Este important ca lamele s nu se usuce in timpul colorrii, pentru a preveni apariia
artefactelor sau formarea de precipitate.
2.Soluia stoc Mav-Grunwald i colorantul Giemsa sunt disponibile comercial

2.11. Coloraia Wright

Scop
Evidentierea Iormelor levurice la Histoplasma capsulatum var. capsulatum
prin examen microscopic al Irotiurilor executate din snge si mduv osoas
hematogen

Fixator
Metanol absolut

Echipamente
hrtie de Iiltru

Reactivi

Solutie de colorare (care poate Ii achizitionat ca solutie gata preparat sau ca pulbere
din diverse surse comerciale)

Colorant Wright pulbere .................................. 0,3 g
Metanol absolut ......................................... 100,0 ml

Dup preparare, solutia se mentine ntr-un recipient etans la temperatura
camerei timp de 24 ore si se Iiltreaz nainte de utilizare.

Solutie tampon Sorensen pH 6,4

KH
2
PO
4
anhidru ............................................ 6,63 g
Na
2
HPO
4
anhidru ........................................... 2,56 g
Ap distilat .......................................... ad 1000 ml.

Mod de lucru
1. Se usuc Irotiul si se Iixeaz apoi cel putin 30 secunde n metanol absolut;
2. Se ndeprteaz metanolul prin nclinarea lamei;
3. Se aplic solutia de colorare, timp de 2 minute, peste lama pozitionat orizontal,
numrnd picturile;
4. Se adaug peste colorant aceeasi cantitate din solutia tampon. Se omogenizeaz
atent colorantul si solutia tampon Ir a atinge supraIata Iilmului de lichid (va
apare o strlucire metalic la supraIata amestecului);
5. Se las amestecul n contact cu Irotiul timp de 3 minute;
6. Se clteste lama cu ap distilat timp de 30 secunde;

35
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

7. Lamele se usuc n pozitie vertical. Nu se vor sterge;
8. Dac se doreste, Irotiul se poate monta prin acoperire cu o lamel.

Rezultatul colorrii
Fungii culoare violet

2.12. Coloraia cu mucicarmin Southgat

Scop
Coloratia se utilizeaz pentru detectarea materialului capsular la Crvptococcus
neoformans

Echipamente
pahare Berzelius, plnie de Iiltrare, hrtie de Iiltru, baie de ap

Reactivi

Rosu Carmin .................................................... 1,0 g
Hidroxid de aluminiu pulbere .......................... 1,0 g
Etanol 50 ................................................ 100,0 ml

Dup omogenizarea acestor substante, n solutie se adaug:

Clorur de aluminiu anhidr ............................ 0,5 g

Se Iierbe pe baia de ap pentru 2-3 minute, apoi se las s se rceasc. Se
completeaz pn la volumul initial cu etanol 50 si apoi se Iiltreaz. Solutia stoc este
stabil cteva luni.

Hematoxilina Ehrlich
Vezi coloratia hemalaun-eozin

Alcool acid 0,5
Vezi coloratia hemalaun-eozin

Mod de lucru
1. Se hidrateaz sectiunile sau se execut un Irotiu (dup caz);
2. Se coloreaz cu hematoxilin timp de 15 minute;
3. Se diIerentiaz cu alcool-acid si apoi se cltesc cu ap de robinet;
4. Se coloreaz pentru 30 minute n solutia rosu carmin;
5. Cltire n ap distilat, deshidratare, clariIicare si montare.


36
Rezultatul colorrii
Mucicarminul coloreaz mucinele acide n roz (capsula va deveni astIel
colorat)

2.13. Coloraia Musto

Scop
Punerea n evident a elementelor Iungice prin examenul microscopic al
Irotiurilor

Echipamente
plit electric, vase din sticl Pyrex

Reactivi

Metenamin - solutie stoc

Metenamin 3 ........................................... 100 ml
Azotat de argint 0,15 .................................... 5 ml

n momentul adaugrii solutiei de metenamin peste solutia de azotat de argint,
se va Iorma un precipitat alb, care va dispare prin agitarea paharului. Solutia Iinal este
stabil 3 luni si se pstreaz la 4C.
Atenie' Coro:iv, posibil carcinogen.

Metenamin - solutie de lucru

Borax 5 .......................................................... 2 ml
Ap distilat .................................................... 25 ml
Metenamin solutie stoc ................................. 25 ml

Se adaug solutia de borax n ap distilat, apoi se omogenizeaz cu solutia
stoc de metenamin. Se prepar extemporaneu.

Acid cromic 5

Trioxid de crom .................................................. 5 g
Ap distilat .................................................. 100 ml

Solutia se poate pstra 6 luni.
Atenie' Acidul este coro:iv, posibil carcinogen. Se vor evita contactul i
inhalarea.


37
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*

Borax 5

Borat de sodiu .................................................. 5,0 g
Ap distilat .......................................... ad 100,0 ml

Solutia este stabil 3 luni.

BisulIit de sodiu 1

BisulIit de sodiu .................................................. 2 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml

Se pstreaz la 4C.

Clorur de aur 0,2

Clorur de aur .................................................. 0,2 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Se pstreaz la Irigider n recipiente etanse, riguros igienizate n prealabil.
Solutia este stabil 1 an.
Atenie' Se evit contactul i inhalarea.

TiosulIat de sodiu 2

TiosulIat de sodiu ............................................... 4 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml

Se pstreaz la 4C.

Verde luminos 1

Verde luminos SF yellow ................................... 1 g
Ap distilat ............................................. ad 100 ml
Acid acetic glacial .................................... 5 picturi

Dup preparare se pstreaz la Irigider.

Mod de lucru
1. Fixarea: se nclzeste acidul cromic 5 pn la 65C pe o plit electric si apoi
se imerseaz imediat lamele timp de 1 minut;
2. Cltire de dou ori n ap distilat ;
3. Se introduc preparatele n bisulIitul de sodiu, timp de 1 minut;
4. Se cltesc lamele n ap distilat

38
5. Impregnarea argentic: solutia de lucru se transIer ntr-un vas de sticl Pyrex si
apoi se imerseaz lamele. Se nclzeste rapid la 90-95C timp de 2-3 minute:
solutia si schimb culoarea de la cenusiu la negru, iar lamele devin maro;
6. Cltire de trei ori n ap distilat;
7. Lamele se introduc n clorur de aur 0,2 timp de 1 minut;
8. Cltire cu ap distilat;
9. Imersare n tiosulIat de sodiu, timp de 1 minut;
11. Contra-colorarea cu verde luminos, timp de 1 minut;
12. Cltire cu ap de robinet, timp de 2 minute;
13. Deshidratare n etanol 95 cteva secunde, apoi n alcool absolut, de dou ori
timp de cteva secunde;
14. Se introduc lamele n xilen sau metil-ciclohexan cteva secunde, pentru
clariIicare;
15. Se monteaz lamele n Eurik.

Rezultatul colorrii
Fungii culoare brun-negricios
Fondul verde

Aot:
1. Coloraia Musto este versiunea rapid a metodei Gomori-Grocott, utili:and tot
principiul impregnrii argentice.
2. Soluiile din bateria de colorare se reinnoiesc dup 4 etape sau din 2 in 2 sptmani.
3. Aceast metod comport in principal trei fa:e.
fixarea cu acid cromic
colorarea cu nitrat de argint - metenamin
contra-colorare cu verde luminos
4. Oxidarea gruprii hidroxil a poli:aharidelor fungice parietale i complexarea lor cu
reactivul argentic, determin coloraia brun-negricioas a fungilor pe un fond verde
al preparatului.
5. Aceast tehnic pre:int mai multe avantafe.
reproductibilitate excelent i rapiditate (aproximativ 20 minute)
costuri moderate
posibilitatea de aplicare pentru o varietate larg de probe biologice, inclusiv
pentru prelevatele bronho-alveolare in investigarea pentru pneumocisto:
simplitatea tehnicii i uurina cu care se detectea: elementele fungice, chiar
dac acestea sunt foarte rare
6. Pentru reuita coloraiei trebuie respectate trei condiii eseniale.
indicaiile tehnice
folosirea unei lame-martor la fiecare serie de colorare
reinnoirea regulat a reactivilor
7. Frotiurile sero-fibrinoase (lichid pleural, articular etc.) pre:int uneori inconvenientul
c se desprind de pe lam in cursul colorrii. Acest inconvenient nu poate fi remediat,
dar dac frotiul nu s-a desprins in totalitate se poate recurge la o metod de
examinare microscopic direct intre lam i lamel.


39
!
"
#
$
%
&
'
(
'

*


1. Bridgman C P (1992) - Micoscopic Anatomy Laboratory Manual;
Washington University School oI Medicine, St. Louis, Missouri.
Bucuresti.
3. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed. Viata
Medical Romneasc; Bucuresti.
4. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines - dmarche diagnostique; Ed.
Elsevier; Paris.
5. Hoog G S de, Guarro J, Gene J, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi;
2
nd
ed; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.
6. Houwen B (2000) - Blood Film Preparation and Staining Procedures;
Laboratory Hematology; Carden Jennings Publishing Co Ltd.
7. Richardson M D, Warnock D W (2003) - Fungal infection - Diagnosis and
Management; Blackwell Publishing.
8. Zerba R, HuiHuicho L, Guillen A (1996) - ModiIied India ink preparation Ior
C.neoformans in cerebrospinal Iluid specimens; 1 Clin Microbiol; 34(9):2290-
2291.

Luminita Malic, Olimpia Bazgan, Mihai Mares

41
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+


3.1. Ceneraliti

eIinirea mediilor de cultur ntr-o manier complet si complex, n
contextul variettii covrsitoare a entittilor taxonomice microbiene si a
exigentelor nutritive extrem de diverse pe care acestea le reclam n dezvoltarea lor,
este o ncercare destul de diIicil pentru microbiologul practician. Acest demers
rmne n domeniul speculativ, deoarece orice ncercare n acest sens va tinde s
satisIac mai curnd legile semanticii dect rigorile practicii medicale.
Totusi, putem deIini mediile de cultur ca un complex de substante chimice
pure sau dimpotriv, de substraturi organice si minerale cu un grad mai redus de
puritate, care s oIere microorganismelor posibilitatea dezvoltrii si multiplicrii,
imitnd pe ct posibil conditiile troIico-habituale din organismele gazd sau din
biotopurile naturale speciIice.
Izolarea n conditii de laborator a Iungilor din prelevatele patologice, indiIerent
de natura lor, este o necesitate indiscutabil pentru ntelegerea procesului morbid
inIectios si pentru initierea terapiei etiotrope.
Diversitatea Iungilor, ca bioentitti cu potential patogen, justiIic includerea n
mediile de cultur a unei game largi si variate de nutrienti care s asigure izolarea
si/sau identiIicarea lor n conditii optime. Au Iost Iormulate astIel o multitudine de
medii de cultivare incluznd ingrediente cu grade diIerite de speciIicitate, care s
corespund dezideratelor de eIicient, precizie si expeditivitate din micologia clinic.
Investigarea particularittilor biochimice ale Iungilor, n special a proIilului lor
enzimatic, a Icut posibil n ultimul timp Iormularea unor medii de cultur mai
complexe, care permit identiIicarea mai Iacil a acestor microorganisme din
prelevatele patologice. Astzi, o adevrat industrie, sustinut de o intens activitate de
cercetare, produce o gam extrem de diversiIicat de substraturi nutritive si medii de
cultivare, care oIer generoase posibilitti de Iolosire n demersul diagnostic al bolilor
inIectioase induse de Iungi.

D
3
Medii de cultivare
Medii de cultivare

42
3.2. Compoziia mediilor de cultur

Particularittile metabolice si numrul apreciabil al Iungilor incumb Iolosirea
unor substraturi nutritive variate, Icnd practic imposibil obtinerea unui mediu
standard pentru toate speciile de interes medical. Unele Iormule (Sabouraud, Czapek,
PDA) permit totusi dezvoltarea unui numr mare de entitti taxonomice apartinnd mai
multor genuri.
n general, principalele componente ale mediilor de cultur sunt reprezentate
de substantele nutritive, agentii revelatori, Iactorii inhibitori, apa si agentii de
solidiIicare (n cazul mediilor solide).
Substantele nutritive sau nutrientii sunt reprezentate de o grupare pletoric de
substante chimice care sunt incluse n medii pentru a oIeri Iungilor: o surs de carbon,
o surs de azot si promotori de crestere (substante minerale, vitamine, acizi grasi etc.).
Din punct de vedere al structurii chimice, nutrientii pot Ii:
n cazul surselor de carbon:
1. monozaharide (glucoza sau dextroza, Iructoza, manoza, galactoza, xiloza,
ramnoza, arabinoza)
2. di- si oligozaharide (zaharoza sau sucroza, lactoza, maltoza, celobioza,
trehaloza, raIinoza)
3. polizaharide (amidon, glicogen, celuloz, chitin etc.)
4. acizi organici (tartric, citric, oxalic, malonic etc.)
5. lipide
n cazul surselor de azot:
1. substante anorganice azotate (nitrati, nitriti, sruri de amoniu)
2. peptide si proteine (pepton, hidrolizat de cazein, gelatin, cazein,
keratin, ovalbumin)
3. aminoacizi (glicin, triptoIan, glutamin, histidin s.a.)
4. uree
n cazul promotorilor de crestere:
1. substante minerale (sub Iorm de sruri care s contin Na, K, Mg, Ca,
Fe, Cu, Zn, Co, P, S s.a.)
2. vitamine (tiamin, acid nicotinic, inozitol etc.)
3. acizi grasi cu lant lung de atomi de carbon (C
12
-C
24
), necesari pentru
dezvoltarea levurilor lipodependente ale genului Malasse:ia.
Se recomand ca n mediile de cultur solide destinate izolrii Iungilor,
raportul C:N s Iie de 9-12:1. Factorii inhibitori sunt reprezentati de substante ce pot
supresa dezvoltarea unor categorii de microorganisme, mai ales a celor contaminante,
indezirabile n manoperele de izolare si identiIicare a Iungilor cu semniIicatie clinic.
Este vorba, n principal, de bacterii si Iungi saprobioti, ubicuitari, care alturi de Iungii
patogeni sau conditionat patogeni, compun n mod obisnuit microIlora diverselor
prelevate recoltate din situsuri normal nesterile. Pentru anihilarea dezvoltrii
bacteriilor, se recomand nglobarea n mediile de cultur destinate izolrii Iungilor, a
unor substante din grupa antibioticelor (penicilin, streptomicin, cloramIenicol,
gentamicin, ciproIloxacin, tobramicin) sau a colorantilor (cristal violet, Rose
Bengal).

43
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Izolarea Iungilor patogeni este Iavorizat de nsmntarea prelevatelor pe
medii solide ce contin cicloheximid, substant capabil s inhibe partial sau total
dezvoltarea Iungilor contaminanti.
Formularea unor medii diIerentiale, care s asigure o bun discriminare ntre
diIeritele specii de Iungi potential prezente n diverse prelevate, a presupus includerea
unor agenti revelatori n compozitia mediilor de cultur; n marea lor majoritate,
acestia sunt substraturi ale diverselor enzime produse n special de micromicetii
levuriIormi, prin a cror scindare se Iormeaz compusi Iluorescenti (identiIicabili n
lumina ultraviolet) sau compusi caracterizati printr-o culoare speciIic.
Primele medii diIerentiale cromogene, utilizate pentru identiIicarea prezumtiv
a diverselor specii de Candida, au Iost mediul Nickerson si mediul Pagano-Levin,
agentii revelatori Iolositi Iiind reprezentati de sulIitul de bismut, respectiv srurile de
triIenil-tetrazoliu. ns numrul redus de specii identiIicabile a determinat n timp
renuntarea la aceste medii si nlocuirea lor cu altele mai perIormante, att ca spectru de
microorganisme identiIicabile, ct si ca grade de speciIicitate si sensibilitate ale
metodei.
Paleta acestor medii diIerentiale este destul de larg, doar n cazul speciei
Candida albicans si a altor ctorva levuri, Iiind disponibile comercial nu mai putin de
6 astIel de medii (tabelul 1-1). Ele contin substratul Iluorogen sau cromogen pentru
una sau dou enzime (-D-galactozaminidaz si/sau L-prolin-aminopeptidaz),
permitnd chiar izolarea si identiIicarea simultan, ntr-o singur etap, a levurilor din
diverse prelevate, Ir a Ii necesar utilizarea suplimentar a altor medii.

3.3. Prepararea i sterilizarea mediilor

Prepararea mediilor este o etap extrem de important, care conditioneaz
hotrtor dezvoltarea, replicarea si exprimarea Ienotipic plenar a tuturor caracterelor
culturale ale Iungilor. Calitatea ingredientelor, modul de solubilizare a acestora,
succesiunea adugrii lor, ajustarea pH-ului si repartizarea mediilor n vederea
sterilizrii pot reprezenta tot attia Iactori limitativi ai demersului diagnostic, dac nu li
se acord importanta cuvenit.
n prezent, n laboratoarele de diagnostic microbiologic este cvasigeneralizat
prepararea mediilor de cultur prin hidratarea asocierilor complete de ingrediente
standardizate, conditionate sub Iorm de pulbere, comercializate de diIerite Iirme. Prin
utilizarea unor astIel de medii standardizate sunt eliminate inconvenientele legate de
procurarea unor ingrediente de calitate, iar rezultatele obtinute prin cultivarea Iungilor
sunt reproductibile.
n general, mediile deshidratate sunt reconstituite prin solubilizarea unor
cantitti precise de pulbere n ap distilat sau ap de robinet, de preIerat nclzit la
70-80C, urmat apoi de Iierberea amestecului pn la dizolvarea complet a tuturor
ingredientelor. n cazul mediilor ce contin ingrediente care nu suport nclzire la
temperaturi crescute, se va renunta la etapa de Iierbere.
n general, la prepararea mediilor de cultivare comercializate se vor respecta
riguros instructiunile Iirmei productoare.
Dup preparare, mediile repartizate n Ilacoane sau tuburi se vor steriliza prin
autoclavare, timp de 15-20 minute la 121C (sau respectnd parametrii recomandati de
Medii de cultivare

44
productor). Componentele ce nu pot Ii autoclavate datorit termolabilittii lor, se vor
prepara separat si se vor aduga la mediul de baz dup sterilizarea acestuia.
n vederea autoclavrii eIiciente se recomand repartizarea mediilor n
Ilacoane cu o capacitate care s nu depseasc 400-500 ml. Cele mai indicate sunt cele
conIectionate din sticl Pirex, gradate, cu capac Iiletabil, tip Deltalab - Spania.

3.4. Controlul de calitate i pstrarea mediilor

Fiecare nou lot de medii de cultur, indiIerent de provenienta sa (medii gata de
Iolosire, repartizate n plci sau tuburi 'single-use livrate de diverse Iirme sau medii
preparate n laborator) va Ii supus unui control de rutin care vizeaz analiza unor
nsusiri esentiale cum ar Ii aspectul, pH-ul, sterilitatea si perIormantele mediului.
Aspectul (culoare, transparent, consistent) si pH-ul trebuie s corespund
parametrilor standard speciIici pentru respectivul mediu de cultivare. Starea de
sterilitate a mediilor se veriIic prin incubarea ctorva recipiente la temperaturile de
30C, respectiv 37C, timp de 24-48 ore. Absenta dezvoltrii unor colonii bacteriene
sau Iungice indic o corect sterilizare a mediului. PerIormantele de crestere se veriIic
utiliznd tulpini tip din colectia laboratorului, alese n Iunctie de tipul de mediu si de
recomandrile privind aplicabilitatea acestuia n diagnostic:
- Mediile de izolare neselective se veriIic prin evaluarea capacittii lor de a
asigura dezvoltarea optim a tulpinilor nsmntate;
- Mediile selective se veriIic prin nsmntarea unor tulpini tip rezistente si a
unora sensibile la agentii inhibitori existenti n mediu;
- Calitatea mediilor diIerentiale se evalueaz prin modul de reactie al acestora n
urma nsmntrii cu tulpini productoare de reactii pozitive si negative.
Conservarea mediilor de cultur preparate n laborator si a celor reconstituite
prin rehidratare se Iace de preIerint la temperaturi de reIrigerare (2-8C), plcile Petri
plasndu-se n pungi de polietilen sau cutii nchise ermetic, iar tuburile vor Ii
etanseizate cu dopuri conIectionate din material neporos pentru a preveni desicarea. n
aceste conditii, mediile conditionate n plci Petri se pot pstra pn la 3 luni, iar cele
n tuburi cu dop etans pn la 6 luni. Exceptie Iac unele medii ce contin ingrediente
perisabile, degradabile, a cror stocare n timp este limitat.


45
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Tabelul 3-1
Utilitatea diagnostic a unor medii cromogene
Denumirea mediului i
firma productoare
Specii identificate Aspectul coloniilor
CandiSelect 4
(Bio-Rad)
Candida albicans
Culoare roz-violet, contur
regulat
C. tropicalis
Culoare turcoaz intens,
bombate, contur regulat,
de tip S.
C. glabrata
Culoare turcoaz mai
estompat, strlucitoare,
plate, contur regulat, de
tip S.
C.krusei
Culoare verde-turcoaz,
mate, contur neregulat, de
tip R.
Chromogenic Candida
Agar (Oxoid)
C. albicans
Culoare verde
C. tropicalis
Culoare albastru-nchis
C. krusei
Culoare roz-nchis, mate,
contur neregulat
C. glabrata
Culoare galben-bej
C. parapsilosis
Culoare brun
CHROMagar Candida
(BD Sciences)
C. albicans
Culoare verde-smarald
C. glabrata
Culoare violet-deschis
(lila), mate
C. krusei
Culoare roz-pal,
albicioase la periIerie, de
tip R
C. tropicalis
Culoare albastr-verzuie
pn la albastru-metalizat
Candida ID2
(bioMrieux)
C. albicans
Culoare albastr
C. tropicalis
C. lusitaniae
C. kefvr

Culoare roz
Candichrom II
(Elitech, Frana)
C.albicans

Alte levuri
Culoare alb -crem,
colonii lucioase,
albastre verzui

Culoare alb
Agar cu extract de
semine de Niger
(Birdseed Agar)
Crvptococcus
neoformans
Culoare brun
Alte levuri Culoare alb crem
Medii de cultivare

46
Medii de cultivare

M1 Agar acetat Fowell

Compoziie
Acetat de sodiu x 3H
2
O
Agar
Ap purificat
5 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: se dizolv acetatul de sodiu trihidrat n ap, dup care se
ajusteaz pH-ul ntre 6,5-7 nainte de a aduga agarul. Se
nclzeste amestecul pn la completa solubilizare a agarului.
Se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz translucid
pH final la 25C : 6,5-7
Controlul calitii: Saccharomvces cerevisiae ATCC 9763 dezvoltare cu
producere de ascospori
Utilizare: stimularea producerii Iormelor sexuate la levuri
Stocare: n eprubete, 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: nu se comercializeaz.

M2 Agar acetat McClary

Compoziie
Acetat de potasiu
Gluco:
Clorur de sodiu
Sulfat de magne:iu
heptahidrat
Extract de drofdie
Agar
Ap purificat
9,8 g
1 g
1,2 g
,7 g
2,5 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: se dizolv ingredientele n apa prenclzit, nainte de a aduga
agarul. Se nclzeste amestecul pn la completa solubilizare a
agarului. Se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15
minute.
Aspect: geloz glbuie, translucid
pH final la 25C : 6,0 0,2
Controlul calitii: Saccharomvces cerevisiae ATCC 9763 dezvoltare cu
producere de ascospori
Utilizare: stimularea producerii Iormelor sexuate la levuri
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C


47
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M3 Agar BCC Candida

Compoziie
Pepton
Extract de drofdie
Dextro:
Agar
Jerde de bromcre:ol
Ap distilat
1, g
1, g
4, g
15, g
,2 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat si se Iierb un minut
pn la completa dizolvare. Se autoclaveaz la 121
0
C timp de
15 minute. Se adaug neomicin 500 mg/l, dup rcirea
mediului la o temperatur de 50-55
0
C.
Aspect: geloz albastru-verzuie, usor opalescent
pH final la 25
0
C: 6,1 0,1
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231: virarea culorii mediului spre
galben.
Candida tropicalis ATCC 9968: virarea culorii mediului spre
galben.
Escherichia coli ATCC 25922: virarea culorii mediului spre
verde.
Utilizare: mediu diIerential si selectiv Iolosit pentru izolarea primar si
detectia speciilor genului Candida din prelevatele clinice.
Plcile Petri nsmntate se incubeaz 72 ore la o temperatur
de 30 2
0
C.
Stocare: 28 C
Disponibil comercial: DiIco (SUA)

M4 Agar BICCY (Agar bismut - sulfit - glucoz - glicin - drojdie)
Agar Aickerson

Compoziie
Citrat amoniacal de
bismut
Sulfat de sodiu
Dextro:
Glicin
Extract de drofdie
Agar
Ap distilat
5, g
3, g
1, g
1, g
1, g
1, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, sub agitare
continu. Mediul se rceste la 45 - 50
C, dup care se
Medii de cultivare

48
repartizeaz n plci Petri. Nu se autoclaveaz. nainte de
utilizare se recomand veriIicarea sterilittii si a pH-ului.
Aspect: mediu omogen, opalescent, alb-glbui
pH final la 25
0
C: 6,8 0,2
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231
Candida kefvr ATCC 8553
Candida tropicalis ATCC 1369
Utilizare: mediu recomandat pentru izolarea si identiIicarea speciilor
apartinnd genului Candida. Inocularea se realizeaz din
culturi proaspete, iar incubarea are loc la o temperatur de 25
2C, 18-24 ore (3-5 zile dac este necesar)
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Becton Dickenson (SUA)

M5 Agar Blasto "D"

Compoziie
Gluco:
Tween 80
Sulfat de potasiu
Citrat de magne:iu
Fosfat dipotasic
Asparagin
Aminoaci:i de tipul
"Casamino"
Clorur de sodiu
Agar
Ap deioni:at
7 g
,2 ml
,5 g
1,5 g
5 g
5 g
3 g
,85 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se adaug n apa puriIicat prenclzit si se Iierb
apoi sub agitare pn la completa lor dizolvare. Se sterilizeaz
prin autoclavare la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz clar, transparent
pH final la 25
0
C: 6,6 0,2
Utilizare: transIormarea Iormei Iilamentoase n Iorm levuric la specia
Blastomvces dermatitidis, prin incubare la 37
0
C.


49
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M Agar Bromcrezol purpur - cazein - glucoz
(Bromcresol purple casein glucose Agar )

Compoziie soluie A
Lapte ecremat
Soluie etanolic de
Bromcre:ol purpur 1,6
Ap distilat
8 g

2 ml
ad 1 ml

Compoziie soluie B
Gluco:
Agar
Ap distilat
4 g
3 g
ad 1 ml

Preparare: dup solubilizarea ingredientelor n apa distilat prenclzit,
cele dou solutii se sterilizeaz separat astIel: sol. A - 8 minute
la 115C, sol. B - 15 minute la 121C. Dup rcire la 45-
50C, cele dou solutii se amestec, se omogenizeaz, se
ajusteaz pH-ul la valoarea 6,6 si apoi se repartizeaz n tuburi
sterile, n pant.
Aspect: geloz n pant, bleu pal, opac
Controlul calitii: Trichophvton rubrum ATCC 28188: dezvoltare Ir alcali-
nizare (mediul nu si modiIic nuanta);
Trichophvton mentagrophvtes ATCC 9533: dezvoltare cu alca-
linizare (virarea culorii n violet-purpuriu);
Utilizare: test de identiIicare a speciilor de dermatoIiti
Stocare: o lun la temperatura de reIrigerare

M7 Agar Ciocolat (Agar Chocolate)

Compoziie
Tripton
Pepton din soia
Clorur de sodiu
Agar
Ap distilat
Sange defibrinat ovin
15, g
5, g
5, g
15, g
ad 1 ml
5-1 "

Preparare: se dizolv ingredientele n apa distilat prenclzit si se Iierb
un minut. Mediul se repartizeaz (cte 90 ml) n Ilacoane si se
sterilizeaz prin autoclavare la 121C timp de 15 minute. Dup
sterilizare, mediul se rceste la 75-80C, moment n care se
Medii de cultivare

50
adaug cte 10 ml de snge deIibrinat ovin n Iiecare Ilacon. Se
agit sub protectia unei hote bacteriologice de clas II, pn la
aparitia culorii brun-ciocolatii.
Aspect: geloz brun-roscat, opac
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 (colonii gri, de consistent
cremoas, cu Iilamentare evident la periIerie - aspect stelat)
Candida parapsilosis ATCC 22019 (colonii netede, Ir
Iilametare periIeric)
Utilizare: identiIicarea tulpinilor de Candida albicans prin incubare la
37C, n atmosIer cu 6 CO
2
, timp de 48 ore
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: mediul baz - Becton Dickenson (SUA), Remel (SUA),
Biokar Diagnostics (Franta)

M8 Agar Christensen

Compoziie soluia A
Pepton
Gluco:
Fosfat monopotasic
Clorur de sodiu
Uree
Rou fenol
Ap distilat
1 g
1 g
2 g
5 g
2 g
,12 g
1 ml

Compoziie soluia B
Agar
Ap distilat
15 g
9 ml

Preparare: se pregteste solutia A si se sterilizeaz prin Iiltrare, apoi se
Iierbe agarul cu apa distilat pn la dizolvare. Solutia B se
sterilizeaz prin autoclavare la 121C timp de 15 min, iar dup
rcire la 50C se adaug solutia A prenclzit. Mediul astIel
obtinut se repartizeaz n tuburi si se las s se solidiIice n
pozitie nclinat. Solutia A se poate steriliza si prin
autoclavare, n acest caz ureea adugndu-se sub Iorm de
solutie steril, dup rcirea amestecului la 50C.
Aspect: geloz galben-orange, transparent
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 dezvoltare Ir modiIicarea
culorii mediului;
Crvptococcus albidus ATCC 66030 dezvoltare cu virarea
culorii mediului spre roz-rosu;

51
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Utilizare: identiIicarea speciilor Iungice ureazo-pozitive (Crvptococcus
spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp. si unii dermatoIiti)
Stocare: 2 luni la temperatura de reIrigerare
Disponibil comercial: un mediu-baz care se aditiveaz dup autoclavare cu solutie
steril de uree Merck (Germania), Remel (SUA).

M9 Agar cu acid cafeic i citrat feric

Compoziie
Sulfat acid de sodiu
Gluco:
Extract levuric
Fosfat dipotasic
Sulfat de magne:iu
hidratat
Acid cafeic
Cloramfenicol
Citrat feric
Agar
Ap distilat
5 g
5 g
2 g
,8 g
,7 g
,18 g
,5 g
,2 g
15 g
ad 1 ml

prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz maron deschis, translucid
pH final la 25
0
C: nu se determin
Controlul calitii: Crvptococcus neoformans ATCC 14116: colonii brune cu
aspect mucoid;
Utilizare: mediu pentru izolarea si identiIicarea speciei Crvptococcus
neoformans;

Medii de cultivare

52
M1 Agar cu extract de cartof i glucoz (PDA)

Compoziie
Gluco: (dextro:)
Infu:ie de cartofi pulbere
Agar
Ap purificat
2 g
4 g
2 g
ad 1 ml

prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute
Aspect: geloz alb-glbuie, translucid
Controlul calitii: Aspergillus niger ATCC 16404
Candida albicans ATCC 10231
Saccharomvces cerevisiae ATCC 9763
Trichophvton mentagrophvtes ATCC 9533
Utilizare: mediu Iolosit pentru cultivarea si identiIicarea levurilor si
Iungilor Iilamentosi
Disponibil comercial: Merck (Germania), Remel (SUA), Biokar Diagnostics
(Franta).

M11 Agar cu extract de drojdie i cloramfenicol
(Yeast Extract Clucose Chloramphenicol Agar)

Compoziie
Extract de drofdie
Gluco:
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
5, g
2, g
,1 g
13, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, dup care
se Iierb un minut. Se autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz galben pal, translucid
pH final la 25C: 6,6 0,2
Escherichia coli ATCC 25922 -
Utilizare: cultivarea si identiIicarea Iungilor levuriIormi si Iilamentosi
Disponibil comercial: DiIco (SUA).


53
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M12 Agar cu extract de drojdie i fiton
(Phytone Yeast Extract Agar)

Compoziie
Pepton din soia
Extract de drofdie
Dextro:
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
1, g
5, g
4, g
,5 g
17, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit,
amestecnd continuu, cu mentinerea temperaturii de Iierbere
timp de un minut. Autoclavarea are loc la o temperatur de
121
o
C timp de 15 minute.
Penicillium roqueforti ATCC 9295
Trichophvton verrucosum ATCC 38485
Utilizare: mediu pentru izolarea si identiIicarea Iungilor din prelevatele
clinice, n special a dermatoIitilor din specia Trichophvton
verrucosum

M13 Agar cu extract de orez

Compoziie
Extract de ore:
Agar
Ap distilat
5, g
2, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit,
amestecnd continuu, cu mentinerea temperaturii de Iierbere
timp de un minut. Autoclavarea are loc la o temperatur de
121
o
C timp de 15 minute.
Aspect: geloz de culoare galben-pal, translucid
Utilizare: Iormarea clamidosporilor la speciile de Candida
Medii de cultivare

54
Disponibil comercial: Becton Dickinson (SUA).

M14 Agar cu extract de paprika
(Cround red hot pepper agar)

Compoziie
Paprika
Gluco:
Agar
Ap distilat
4, g
4, g
15, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se adaug n apa distilat si se aduc la punctul de
Iierbere, apoi se sterilizeaz prin autoclavare la 116C timp de
30 minute.
Aspect: geloz opac, de culoare brun-roscat, cu miros de paprika
pH final la 25C: 4,9
Controlul calitii: Crvptococcus neoformans var. neoformans colonii alb-
cremoase dup 48 ore de incubare la 30C, care se
pigmenteaz n brun dup aceast perioad
Utilizare: izolarea si identiIicarea prezumtiv a tulpinilor de
Crvptococcus neoformans
Stocarea: 2- 8C

M15 Agar cu extract de sol

Prepararea
extractului de sol: 1 kg sol de grdin se amestec cu 1000 ml ap de robinet, se
nclzeste 30 de minute, se decanteaz, se Iiltreaz si se
completeaz la 1000 ml cu ap distilat. La 1000 ml extract de
sol se adaug 2 g glucoz, 1 g extract de drojdie, 15 g agar si
6,6 g de pr uman tocat si sterilizat. Mediul este recomandat
pentru obtinerea de cleistoteci la specii de Arthroderma
(Iormele teleomorIe ale dermatoIitilor).
Disponibil comercial: nu este disponibil comercial.


55
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M1 Agar cu extract de tutun (1obacco Agar)

Compoziie
Extract din frun:e de
tutun
Agar
1 ml
2 g

Preparare: 50 grame Irunze de tutun se Iierb timp de 30 minute ntr-un
litru de ap distilat. Extractul obtinut se Iiltreaz; se ajusteaz
pH-ul la valoarea 6 si se readuce volumul la 1000 ml cu ap
distilat. Dup adugarea agarului, amestecul se nclzeste
pn la dizolvarea complet a acestuia. Mediul se sterilizeaz
prin autoclavare la 121C timp de 15 minute. Dup sterilizare,
mediul se repartizeaz n plci Petri sterile ( 90 mm), cte 25
ml/plac.
Aspect: geloz translucid, de culoare galben-maronie
Controlul calitii: Candida dubliniensis CBS 7987 (Iormare de clamidospori n
urma nsmntrii prin tehnica Dalmeau si incubare la 30C)
Utilizare: mediu destinat identiIicrii tulpinilor de Candida albicans si
Candida dubliniensis pe baza stimulrii producerii de
clamidospori (C. albicans 96 dintre tulpini, C.dubliniensis
100 dintre tuplini)
Stocare: 2-8C

M17 Agar cu fin de porumb (Cornmeal agar)

Compoziie
Fin de porumb
Gluco:
Agar
Ap distilat
4 g
1 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: se amestec Iina de porumb cu apa distilat si se nclzeste
amestecul la 52C timp de o or sau la 121C timp de 10
minute. Dup tratamentul termic, amestecul se Iiltreaz prin
tiIon si vat, apoi prin hrtie de Iiltru. n Iiltratul obtinut se
introduc agarul si glucoza, Iierbndu-se pn la topirea
acestora. Se readuce volumul la 1000 ml, apoi se sterilizeaz la
121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz albicioas, translucid
Medii de cultivare

56
Controlul calitii. Trichophvton rubrum ATCC 28188: pigment rosu n mediul
subiacent
Trichophvton mentagrophvtes ATCC 9533: pigment brun sub
colonie
Utilizare: stimuleaz pigmentogeneza la susele de T. rubrum si le
diIerentiaz de tulpinile apartinnd speciei T. mentagrophvtes.
Disponibil comercial: Remel (SUA).

M18 Agar cu fin de porumb i 1ween 8 (Cornmeal Agar 1ween 8)

Compoziie
Fin de porumb
Tween 80
Agar
Ap distilat
4 g
1 ml
2 g
ad 1 ml

Preparare: Iina de porumb se adaug n 500 ml ap distilat si se
macereaz timp de o or la 65C; dup Iiltrare si reajustarea
volumului la 500 ml, solutia astIel obtinut se amestec cu
agarul n prealabil solubilizat n 500 ml ap distilat si cu 10
ml Tween 80. Se ajusteaz pH-ul la 6,6 - 6,8 si apoi se
sterilizeaz prin autoclavare la 121C timp de 20 minute.
Aspect: geloz albicioas, translucid
Candida albicans ATCC 60193 (cu aparitia clamidosporilor
prin cultivare submers)
Utilizare: identiIicarea diIeritelor specii ale genului Candida prin
studierea caracterelor morIologice microscopice etalate de
acestea n urma cultivrii submerse, la 30C timp de 48 ore
Disponibil comercial: Becton Dickenson (SUA), Remel (SUA)

M19 Agar cu frunze de garoaf

Preparare: Irunzele de garoaI sunt tiate n bucti, uscate si sterilizate
prin expunerea la radiatii gamma sau oxid de etilen. Cteva
bucti sterile sunt introduse n 1,5 agar nesolidiIicat. n locul
Irunzelor de garoaI se pot Iolosi de asemenea si bucti de
hrtie de Iiltru sterile. Acest mediu este recomandat pentru
cultivarea si identiIicarea speciilor apartinnd genului
Fusarium.


57
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M2 Agar cu L-canavanin - glicin - albastru de bromtimol (CCB Agar)

Compoziie soluia A
Glicin
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Tiamin HCl
L-canavanin sulfat
Ap distilat
1 g
1 g
1 g
1 mg
3 mg
ad 1 ml

Dup solubilizarea complet a ingredientelor enumerate, se
ajusteaz pH-ul la 5,6 si amestecul se sterilizeaz prin Iiltrare
utiliznd Iiltre cu porozitate de 0,22 m. Solutia astIel obtinut
se pstreaz la Irigider (4C).

Compoziie soluia B
Albastru de bromtimol
Hidroxid de sodiu 0,01 N
Ap distilat
,4 g
4 ml
3 ml

Albastrul de bromtimol se dizolv n solutia de hidroxid de
sodiu, apoi se adaug apa distilat.
Preparare: pentru obtinerea unui litru de mediu, se amestec 880 ml ap
distilat cu 20 ml solutie B si 20 g pulbere de agar. Sterilizarea
se realizeaz prin autoclavare la 121C, timp de 15 minute.
Dup rcirea mediului la 48C, se adaug 100 ml solutie A si
se omogenizeaz, apoi se repartizeaz n plci Petri.
Aspect: geloz translucid de culoare galben-verzuie
Controlul calitii : Crvptococcus neoformans var. neoformans dezvoltare
disgonic, Ir modiIicarea culorii mediului;
Crvptococcus neoformans var. gattii - dezvoltare eugonic, cu
virarea culorii mediului de la galben-verzui la albastru-cobalt;
Utilizare: mediul este recomandat pentru diIerentierea celor dou
varietti ale speciei Crvptococcus neoformans (var.
neoformans i var. gattii). Dup nsmntarea tulpinilor de
testat, incubarea se realizeaz la 25C timp de 5 zile. Doar var.
gattii are capacitatea de a cultiva n prezenta L-canavaninei si
de a Iolosi glicina ca unic surs de carbon. Aceste
particularitti metabolice determin pozitivarea testului pe
Agar CGB, adic schimbarea de pH (de la 5,8 la aproximativ
7,0) si modiIicarea culorii mediului (de la galben-verzui la
albastru-cobalt).
Stocare: n plci o lun la 2-8C
Medii de cultivare

58

M21 Agar cu sucroz i creatin

Compoziie
Creatin
Sucro:
KCl
MgSO
4
FeSO
4

K
2
HPO
4

Bromcre:ol purpur
Agar
Ap distilat
3 g
3 g
.5 g
.5 g
.1 g
1.3 g
.5 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se introduc n apa distilat prenclzit si se
omogenizeaz pn la completa dizolvare. Se autoclaveaz la
121C timp de 15 minute. Se ajusteaz pH-ul la valoarea 6,0
0,2.
Aspect: geloz opalescent, de culoare roz
pH final la 25 C: 6,0 0,2
Utilizare: mediu destinat izolrii si identiIicrii Iungilor Iilamentosi
Stocare: 2-8C


59
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M22 Agar cu sucroz, creatin i dicloran
(Creatine Sucrose Dichloran Agar)

Compoziie
Creatin
Sucro:
KCl
KH
2
PO
4

MgSO
4

FeSO
4
K
2
HPO
4

Cloramfenicol
Dicloran
Bromcre:ol purpur
ZnSO
4

CuSO
4

Agar
Ap distilat
3 g
3 g
.5 g
1 g
.5 g
.1 g
,5 g
,5 g
,2 g
,5 g
,1 g
,5 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, se
sterilizeaz prin autoclavare la temperatura de 121C timp de
15 minute. Se adaug 0,05 g clortetraciclin si se ajusteaz
pH-ul la valoarea 4,8.
Aspect: geloz de culoare roz, usor opalescent
pH final la 25 C: 4,8
Stocare: 2-8C

M23 Agar - acid acetic - dicloran - extract de drojdie
(Acetic Acid Dichloran Yeast Extract Agar)

Compoziie
Extract de drofdie
Sucro:
MgSO
4
x 7 H
2
O
Dicloran
Agar
Ap distilat
2 g
15 g
.5 g
.2g
2 g
ad 1 ml

autoclaveaz la 121 C timp de 15 minute, dup care se adaug
0,5 acid acetic glacial.
Aspect: geloz translucid, de culoare glbuie
Medii de cultivare

60
Stocare: 2-8C

M24 Agar - dicloran - extract de drojdie - 18 " glicerol
(Dichloran Yeast Extract 18" Clycerol Agar)

Compoziie
Extract de drofdie
Sucro:
K
2
HPO
4
MgSO
4

Cloramfenicol
Dicloran (0,2 in etanol)
ZnSO
4

CuSO
4

Agar
Glicerol
Ap distilat
2 g
15 g
1 g
,5 g
,5 g
1 ml
,1 g
,5 g
2 g
22 g
ad 1 ml

sterilizeaz prin autoclavare la temperatura de 121C timp de
15 minute. Se adaug 0,05 g clortetraciclin.
Aspect: geloz de culoare glbuie, usor opalescent
pH final la 25 C: nu se determin
Stocare: 2-8C

M25 Agar difereniere Aspergillus

Compoziie
Mediu deshidratat Becton
Dickenson

Preparare: conIorm recomandrilor Iirmei productoare
pH final la 25
0
C: 7,0 0,5
Controlul calitii: tulpinile de A. flavus produc virarea culorii mediului n galben
-portocaliu. Alte specii de Aspergillus (A.parasiticus, A.
sclerotiorum, A. thomii) produc de asemenea modiIicri ale
culorii mediului de cultivare, dar acestea sunt distincte Iat de
cele produse de A. flavus.

61
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Utilizare: acest mediu de cultur contine cazein, aminoacizi, extract de
drojdie mbogtit cu complex vitaminic B. Citratul Ieric este
esential pentru producerea pigmentului galben care ajut la
diIerentierea speciei A. flavus de alte specii cu semniIicatie
clinic ale aceluiasi gen. Cu ajutorul unei anse sterile, se
etaleaz pe supraIata mediului cteva colonii dup care se
incubeaz la 25C timp de 10 zile, pentru a permite virarea
culorii spre diIerite nuante de galben.
Stocare: 2-8C

M2 Agar Dixon

Compoziie
Agar cu extract de mal
Bil de bou deshidratat
Tween 40
Glicerol mono-oleat
Ap distilat
g
2 g
1 ml
2,5 ml
ad 1 ml

Preparare: glicerolul mono-oleat se emulsioneaz cu Tween 40 apoi se
adaug treptat, sub agitare continu, mediul preparat prin
amestecarea celorlalte ingrediente. Se sterilizeaz prin
autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz nchis la culoare, translucid
Controlul calitii: Malasse:ia furfur ATCC 12078
Utilizare: izolarea levurilor lipoIile apartinnd genului Malasse:ia

Medii de cultivare

62
M27 Agar Dixon modificat

Compoziie
Extract de mal
Tween 40
Pepton
Glicerol
Acid oleic
Agar
Ap distilat
3 g
2 g
1 ml
g
2 ml
2 ml
15 g
ad 1 ml

Preparare: glicerolul si acidul oleic se emulsioneaz cu Tween 40, apoi se
adaug treptat, sub agitare continu, mediul preparat prin
amestecarea celorlalte ingrediente. Se sterilizeaz prin
autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz nchis la culoare
Controlul calitii: Malasse:ia furfur ATCC 12078
Utilizare: izolarea levurilor lipoIile din prelevate patologice

M28 Agar glucoz - pepton - drojdie
(Clucose Peptone Yeast Extract Agar)

Compoziie
Gluco:
Pepton
Agar
Extract de drofdie
Ap distilat
2 g
5 g
2 g
5 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se solubilizeaz n apa prenclzit. Se
Aspect: geloz glbuie, usor opalescent
pH final la 25C : nu se determin
Utilizare: cultivarea levurilor n vederea conservrii


63
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M29 Agar infuzie cord - creier (Brain Heart Agar BHI )

Compoziie
Infu:ie de cord
Infu:ie de creier
Pepton
Gluco:
Clorur de sodiu
Fosfat disodic
Agar
Ap distilat
25 ml
2 ml
1 g
2 g
5 g
2,5 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se adaug n apa distilat prenclzit, apoi
amestecul se Iierbe sub agitare pn la completa dizolvare a
acestora. Mediul astIel obtinut se repartizeaz n eprubete sau
Ilacoane si se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de
15 minute. Reteta se poate modiIica prin mbunttirea cu 5-
10 snge deIibrinat de berbec sau prin adaos de
cloramIenicol si/sau gentamicin (500 mg/l).
Aspect: geloz transparent, de culoare galben-pal; geloz opac de
culoare rosie (varianta aditivat cu snge)
Streptococcus pvogenes ATCC 19615 ( - n cazul variantei
aditivate cu antibiotice)
Utilizare: izolarea unei game largi de microorganisme cu exigente
nutritive particulare, cum ar Ii Iungii dimorIici
Stocare: eprubete 4 luni la 2-8 C, n plci o lun la 2-8C
Disponibil comercial: Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Franta), Becton
Dickinson (SUA), bioMerieux (Franta).

M3 Agar izolare Candida

Compoziie
Extract de drofdie
Extract de mal
Pepton
Dextro:
Agar
Albastru de anilin
Ap distilat
3, g
3, g
5, g
1, g
2, g
,1 g
ad 1 ml

Medii de cultivare

64
Preparare: ingredientele se adaug n apa distilat si se Iierb un minut
pn la completa solubilizare. Se autoclaveaz la 121
0
C timp
de 15 minute.
Aspect: geloz de culoare albastr, opalescent
pH final la 25
0
C: 6,2 0,2
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231: produce Iluorescent bleu
verzuie la 354 nm;
Bacillus subtilis ATCC 6633: nu produce Iluorescent;
Escherichia coli ATCC 25922 : nu produce Iluorescent;
Utilizare: izolarea si identiIicarea speciei Candida albicans din prelevate
clinice. Plcile Petri nsmntate se incubeaz 72 ore la o
temperatur de 30 2
0
C.
Stocare: 28C
Disponibil comercial: Becton Dikinson (SUA).

M31 Agar Lactrimel (Borelli)

Compoziie
Fin de grau
Lapte praf ecremat
Miere
Agar
Cloramfenicol
Cicloheximid
Ap distilat
14 g
14 g
7 g
2 g
,5 g
,5 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se amestec cu apa distilat prenclzit, sub
agitare continu, pn la completa lor solubilizare. Se
sterilizeaz prin autoclavare la 105C timp de 10 minute. Dup
autoclavare se repartizeaz n plci Petri.
Aspect: Geloz opac, de culoare alb
Controlul calitii: Microsporum canis ATCC 1162: dezvoltare cu sporulare
intens si pigmentogenez
Utilizare: Iavorizeaz sporularea marii majoritti a dermatoIitilor si
stimuleaz producerea pigmentului speciIic n cazul M.
audouinii, M. canis si T. rubrum
Stocare: o lun, n plci Petri la 2-8C


65
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M32 Agar Leeming

Compoziie
Pepton
Gluco:
Tween 60
Glicerol
Glicerol mono-stearat
Lapte integral
Extract de drofdie
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
1 g
5 g
4 g
,5 ml
1 ml
,5 g
1 ml
,1 g
,5 g
12 g
ad 1 ml

Preparare: glicerolul si glicerolul mono-stearat se emulsioneaz cu Tween
60, apoi se adaug treptat, sub agitare continu, mediul
preparat prin amestecarea celorlalte ingrediente. Se sterilizeaz
prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz nchis la culoare
pH final la 25C : 6 0,2
Controlul calitii: Malasse:ia furfur ATTC 12078
Utilizare: izolarea levurilor lipoIile din prelevate patologice

M33 Agar Littman (Littman Oxgall Agar)

Compoziie
Pepton
Dextro:
Agar
Cristal violet
Streptomicin
Ap distilat
1, g
1, g
15, g
2, g
,1 g
3, mg
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat, amestecnd continuu,
cu mentinerea temperaturii de Iierbere timp de un minut.
Autoclavarea are loc la o temperatur de 121
o
C timp de 15
minute, cu rcire la 47C pentru adugarea antibioticului;
streptomicina se poate nlocui cu cloramIenicol, acesta
putndu-se aduga chiar naintea autoclavrii.
Aspect: geloz de culoare bleu-cenusie, usor opalescent
Medii de cultivare

66
Escherichia coli ATCC 25922
Utilizare: mediu pentru cultivarea si identiIicarea Iungilor, n special a
celor dermatoIiti
Disponibil comercial: Remel (SUA), DiIco (SUA).

M34 Agar Mueller - Hinton - glucoz 2"

Compoziie
Extract de carne pulbere
Ca:ein
Amidon
Agar
Gluco:
Albastru de metilen
Ap distilat
2 g
17,5 g
1,5 g
15 g
2 g
,5 mg
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se solubilizeaz n apa distilat prenclzit, sub
agitare continu. Se repartizeaz n tuburi sau Ilacoane si se
sterilizeaz prin autoclavare la 110C, timp de 20 minute.
Aspect: geloz opalescent
pH final la 25
0
C: 6,9 - 7,1
Utilizare: mediul se Ioloseste pentru testarea susceptibilittii la
antiIungice (voriconazol si Iluconazol) prin metoda CLSI
M44-A (metod diIuzimetric cu discuri). Se recomand ca
grosimea stratului de mediu s Iie de 4 0,5 mm (cca. 25 ml/
plac Petri cu 90mm sau cca. 60 ml / plac Petri cu 150
mm).
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: mediul baz (Ir glucoz) este comercializat de Remel (SUA),
Biokar Diagnostics (Franta), Becton Dickinson (SUA),
bioMerieux (Franta).

M35 Agar cu fin de ovz (Oatmeal Agar)

Compoziie
Fin de ov:
Agar
Ap distilat
, g
18, g
ad 1 ml


67
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

o
C timp de 15
minute.
Aspect: geloz albicioas, usor opalescent
Utilizare: mediu pentru cultivarea si studierea caracterelor morIologice
ale Iungilor Iilamentosi; stimuleaz sporularea

M3 Agar Pal

Compoziie
Gluco:
Fosfat monopotasic
Creatinin
Agar
Extract apos din semine
integrale de floarea-
soarelui
1 g
1 g
1 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: se mruntesc 50 g seminte de Iloarea-soarelui nedecorticate,
nesrate, cu ajutorul unui blender si se Iierb timp de 30 minute
ntr-un litru de ap distilat. Se Iiltreaz, se adaug restul
ingredientelor, se ajusteaz pH-ul la 5,5 si se sterilizeaz apoi
prin autoclavare la 110C timp de 20 minute.
Candida dubliniensis CBS 7987
Utilizare: diIerentierea speciilor C. albicans si C. dubliniensis pe baza
morIologiei coloniilor si producerii de clamidospori; C.
dubliniensis produce clamidospori si colonii cu Iilamentare
periIeric evident, prin incubare la 30C timp de 48-72 ore, n
timp ce C. albicans nu.
Stocare: 2-8C

Medii de cultivare

68
M37 Agar pentru studierea morfologiei levurilor
(Yeast Morphology Agar)

Compoziie
Sulfat de amoniu
Asparagin
Dextro:
L-histidin HCl
LD-metionin
LD-triptofan
Biotin
Calciu pantotenat
Acid folic
Ini:itol
Niacin
Acid p-aminoben:oic
Piridoxin HCl
Riboflavin
Tiamin HCl
Acid boric
Sulfat de cupru
Iodur de potasiu
Clorur feric
Sulfat de magne:iu
Molibdat de sodiu
Sulfat de :inc
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Clorur de sodiu
Clorur de calciu
Agar
Ap distilat
3,5 g
1,5 g
1, g
1, mg
2, mg
2, mg
2, ug
4, ug
2, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
5, ug
4, ug
1, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
1, g
,5 g
,1 g
,1 g
18, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, dup care
se Iierb un minut. Se autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz galben-pal, opalescent
Controlul calitii: Kloeckera apiculata ATCC 9774
Utilizare: cultivarea si identiIicarea levurilor pe baza caracterelor
culturale si a celor morIologice


69
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M38 Agar pepton - glucoz - fluconazol

Compoziie
Pepton
Gluco:
Agar
Cloramfenicol
Gentamicin
Flucona:ol
Ap distilat
1 g
2 g
2 g
4 mg
25 mg
5 mg
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se solubilizeaz n apa distilat prenclzit. Se
ajusteaz valoarea pH-ului la 7,0. Se autoclaveaz la 121C
timp de 15 minute.
pH final la 25
0
C: 6,8-7,0
Controlul calitii: Aspergillus flavus ATCC 10124
Candida albincans ATCC 66027
Utilizare: mediu destinat izolrii precoce a Iungilor Iilamentosi din
prelevate contaminate cu levuri (ex. sput)

Medii de cultivare

70
M39 Mediul RPMI 14
(cu glutamin, glucoz ,2", rou fenol, fr bicarbonat)

Compoziie
L-arginin
L-asparagin anhidr
Acid L-aspartic
L-cistin hidrocloric
Acid L-glutamic
L-glutamin
Glicin
L-histidin
L- hidroxiprolin
L-i:oleucin
L- li:in hidrocloric
L- metionin
L- fenilalanin
L-prolin
L-serin
L-treonin
L-triptofan
L-tiro:in disodic
L-valin
Biotin
Acid D-pantotenic
Colin HCl
Acid folic
Mio-ino:idol
Niacinamid
PABA
Piridoxin HCl
Riboflavin
Tiamin HCl
Jitamina B
12

Nitrat de calciu
monohidrat
Clorur de potasiu
Sulfat de magne:iu
Clorur de sodiu
Fosfat disodic anhidru
D-gluco:
Glutation redus
Rou fenol
Ap distilat
2 mg
5 mg
2 mg
5,2 mg
2 mg
3 mg
1 mg
15 mg
2 mg
5 mg
4 mg
15 mg
15 mg
2 mg
3 mg
2 mg
5 mg
28,83 mg
2 mg
,2 mg
,25 mg
3 mg
1 mg
35 mg
1 mg
1 mg
1 mg
,2 mg
1 mg
,5 mg
1 mg
4 mg
48,84 mg
mg
8 mg
2 mg
1 mg
5,3 mg
ad 1 ml


71
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Preparare : mediul se gseste sub Iorm ,ready Ior use (Sigma Aldrich),
ct si sub Iorm de pulbere pentru prepararea n laborator.
Pulberea se dizolv n ap bidistilat n cantitate de 10,4 g
pentru mediul uzual si 20,8 g pentru mediul dublu concentrat.
Aspect: bulion transparent de culoare rosiatic
Utilizare: pentru utilizare, mediul se tamponeaz cu MOPS 3-(N-
morpholino) propanesulIonic acid, concentratia Iinal a
acestuia Iiind 0,165 mol/litru. Se obtine astIel un pH cu
valoarea 7,0 convenabil dezvoltrii microorganismelor ce vor
Ii testate.
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Sigma Aldrich (Germania).

M4 Agar SABHI

Este un mediu de cultivare disponibil comercial n multiple
variante (cu si Ir CloramIenicol, Gentamicin sau
Cicloheximid) obtinut prin amestecul unor cantitti
echivalente de Agar Sabouraud si Agar inIuzie cord - creier. Se
recomand pentru cultivarea si izolarea selectiv a Iungilor
patogeni.
Disponibil comercial: Remel (SUA), Becton Dickinson (SUA).

M41 Agar Sabouraud cicloheximid

Compoziie
Pepton
Dextro:
Agar
Cicloheximid
Cloramfenicol
Ap distilat
1, g
1, g
15,5 g
,4 g
,5 g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute.
Aspect: geloz de culoarea chihlimbarului, transparent
Aureobasidium pullulans ATCC 9348
Blastomvces dermatitidis ATCC 56218
Microsporum audouinii ATCC 9079
Medii de cultivare

72
Penicillium roquefortii ATCC 9295
Phialophora verrucosa ATCC 10223
Staphvlococcus aureus ATCC 25923
Streptomvces rimosus ATCC 10970
Utilizare: mediu pentru izolarea selectiv a Iungilor rezistenti la
cicloheximid, n special a dermatoIitilor
Disponibil comercial: Becton Dickinson (SUA), Merck (Germania), Remel (SUA),
Biokar Diagnostics (Franta).

M42 Agar Sabouraud cloramfenicol

Compoziie
Pepton
Gluco:
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
1 g
4 g
,5 g
15 g
ad 1 ml

acestora; mediul astIel obtinut se repartizeaz n eprubete sau
Ilacoane si se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de
15 minute.
Aspergillus niger ATCC 16404
Trichophvton rubrum ATCC 28188
Proteus vulgaris ATCC 13315
Utilizare: izolarea unei game largi de Iungi patogeni si oportunisti din
prelevatele patologice
Disponibil comercial: Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Franta), Becton Dickinson
(SUA), bioMerieux (Franta).

M43 Agar Sabouraud Emmons

Compoziie
Pepton
Gluco:
Agar
Ap distilat
1 g
2 g
15 g
ad 1 ml

73
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

acestora. Se ajusteaz pH-ul la valoarea 7,0. Mediul astIel
obtinut se repartizeaz n eprubete sau Ilacoane si se
sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15 minute.
Trichophvton rubrum ATCC 28188
Proteus vulgaris ATCC 13315
Utilizare: izolarea unei game largi de Iungi patogeni si oportunisti din
prelevatele patologice (variantele aditivate)
Disponibil comercial: exist numeroase variante mbunttite cu CloramIenicol,
Gentamicin, Cicloheximid.

M44 Agar snge - glucoz - cistein

Compoziie
Tripton agar ba:
L-cistein
Sange de berbec
defibrinat
Cloramfenicol
Ap deioni:at
33 g
1 g
5 ml
,5 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele (cu exceptia sngelui) se solubilizeaz n apa
prenclzit, apoi se autoclaveaz timp de 15 minute la 121C.
Dup autoclavare, mediul se rceste lent la 45-50C, moment
n care se adaug sngele si se omogenizeaz.
Aspect: geloz de culoare rosie-vie, opac
pH final la 25
0
C: 7,2 0,2
Controlul calitii: Escherichia coli ATCC 25922 -
Utilizare: mediu de conversie (Iolosit pentru transIormarea Iormei
Iilamentoase n cea levuric) pentru identiIicarea tulpinilor de
Histoplasma capsulatum, Blastomvces dermatitidis,
Paracoccidioides brasiliensis si Sporothrix schenckii.

Medii de cultivare

74
M45 Agar selectiv cu triptofan

Este un mediu solid cu o compozitie simpl, incluznd ca
ingrediente principale doar L-triptoIan (0,01) si o surs
lipidic. La pH 5 si 37
o
C, permite dezvoltarea selectiv a
speciei Malasse:ia furfur, cu producerea unui pigment brun ce
diIuzeaz n substratul nutritiv subiacent.

M4 Agar Staib (Agar cu infuzie de Aiger) Bird seed Agar

Compoziie
Extract apos din semine
de Niger
Gluco:
Fosfat monopotasic
Creatinin
Agar
1 ml
1 g
1 g
1 g
15 g

Preparare: 50 g seminte de Niger (Gui:otia abvssinica) se autoclaveaz
ntr-un litru de ap timp de 10 minute la 115C, apoi se
Iiltreaz. n acest extract apos se adaug restul ingredientelor si
se nclzeste pn la completa dizolvare a acestora. Se readuce
volumul la 1000 ml si se autoclaveaz la 121C timp de 15
minute. Mediul se poate aditiva cu cloramIenicol (500 mg/l).
Aspect: geloz de culoare bej, opalescent
pH final la 25C : 5,5- 6,0
Controlul calitii: Crvptococcus neoformans ATCC 14116: colonii brune, cu
aspect mucoid;
Candida albicans ATCC 10231 : colonii netede, lucioase;
Utilizare: mediu diIerential pentru Filobasidiella (Crvptococcus)
neoformans, mediul este util si pentru diIerentierea speciilor
Candida albicans (colonii de tip S, lucioase, similare celor de
pe mediile uzuale de cultivare) si Candida dubliniensis
(colonii de tip R, majoritatea cu marginile Iranjurate).
Disponibil comercial: Becton - Dickinson (USA)


75
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M47 Agar 1akaschio (Agar Sabouraud diluat)

Compoziie
Gluco:
Neopepton
Sulfat de magne:iu
Fosfat monopotasic
Agar
Ap distilat
2 g
1 g
1 g
1 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se amestec cu apa distilat prenclzit, sub
agitare continu, pn la completa lor solubilizare. Se
Aspect: geloz translucid, de culoare glbuie
Controlul calitii: Microsporum canis ATCC 11621 - dezvoltare cu sporulare
intens
Uitlizare: Iavorizeaz sporularea tulpinilor de dermatoIiti

M48 Agar 1ween 8 (destinat testului de opacifiere)

Compoziie
Bacto pepton
Clorur de sodiu
Clorur de calciu
Tween 80
Agar
Ap distilat
1 g
5 g
,1 g
5 ml
15 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele (cu exceptia Tween-ului) se dizolv n apa
distilat prenclzit si se Iierb un minut. Se sterilizeaz prin
autoclavare la 121C timp de 15 minute. Se rceste la 50C,
moment n care se adaug Tween-ul. Mediul se repartizeaz n
plci Petri sterile ( 90 mm), cte 25 ml/plac.
Aspect: geloz transparent, de culoare galben pai
Controlul calitii: permite dezvoltarea diIeritelor specii ale genului Candida, cu
aparitia unui halo opac n jurul coloniilor de levuri secretoare
de esteraz (Candida albicans, Candida guilliermondii,
Candida rugosa, Candida tropicalis).
Utilizare: mediul este recomandat pentru diIerentierea tulpinilor de C.
albicans si C. dubliniensis. Tulpinile de testat se inoculeaz n
Medii de cultivare

76
puncte separate, iar incubarea se realizeaz la 30C timp de 10
zile. Tulpinile de C. albicans si C. tropicalis determin aparitia
unui halo opac n jurul coloniilor, la 2-3 zile post-inoculare, n
timp ce tulpinile de C. dubliniensis nu pozitiveaz testul nici n
10 zile post-inoculare. Tulpinile cu actiune lipolitic secret o
esteraz capabil s scindeze Tween-ul si s elibereze acizii
grasi care se vor cupla cu ionii de Ca
2
Iormnd sruri vizibile
sub Iorma unei zone de opaciIiere n jurul coloniilor. C.
dubliniensis este lipsit de actiune lipolitic, comportament util
n diIerentierea de C. albicans.
Stocare: 2-8C

M49 Agar cu amidon

Compoziie
Amidon solubil
Extract de drofdie
Agar
Ap distilat
4 g
5 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: substantele se introduc n ap si se dizolv pe baie de ap. Nu
este necesar ajustarea pH-ului care, dup sterilizare, are
valoarea 6,5-7.
pH final la 25C: 6,5-7
Controlul calitii: Fusarium solani ATCC 22278 - dezvoltare cu sporulare
intens;
Utilizare: mediu destinat stimulrii sporulrii la Iungii Iilamentosi

M5 Agar - ap de robinet

Compoziie
Agar
Ap de robinet
15-25 g
ad 1 ml

Preparare: agarul se dizolv n apa prenclzit si apoi se sterilizeaz 20
minute la 121C. Se pot aduga paie de gru sau boabe de orez
sterilizate.
pH final la 25C: nu se determin

77
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Utilizare: multi Iungi sensibili sporuleaz bine pe acest mediu. Este
utilizat att pentru izolarea genului Pvthium, ct si pentru
izolarea si stimularea sporulrii la speciile de Fusarium. De
asemenea, transIerul pe acest mediu a culturilor pleomorIe ale
dermatoIitilor induce sporularea si chiar revenirea la tipul
,wild a speciilor dezvoltate n prealabil pe mediul Sabouraud.

M51 Bulion cu uree ( test rapid pentru identificarea levurilor )
(Rapid Urea Broth 1est for Yeasts)

Compoziie
Pepton
NaCl
Fosfat monopotasic
Rou fenol
Gluco:
Uree
Ap distilat
1 g
5 g
2 g
,12 g
1 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele (cu exceptia ureei) se solubilizeaz n 500 ml ap
distilat prenclzit si apoi se sterilizeaz prin autoclavare la
121C timp de 15 minute. Ureea se solubilizeaz n apa
distilat rmas si se sterilizeaz prin Iiltrare, utiliznd
membrane cu porozitate de 0,22 m. Cele dou solutii astIel
obtinute se rcesc la temperatura camerei si se amestec sub
protectia unei hote microbiologice de clas II; bulionul obtinut
se repartizeaz n tuburi (cte 3 ml).
Aspect: bulion transparent, de culoare glbuie
Controlul calitii : Crvptococcus neoformans ATCC 66031 - ureazo pozitiv (rosu)
Candida albicans ATCC 1023 - ureazo negativ (galben)
Utilizare: diIerentierea tulpinilor levurice ureazo-pozitive de cele ureazo-
negative si identiIicarea prezumtiv a unor genuri
(Crvptococcus, Rhodotorula i Trichosporon )
Stocare: - 20C timp de 2 luni
Disponibil comercial: Remel (SUA).

Medii de cultivare

78
M52 Bulion Sabouraud

Compoziie
Pepton
Gluco:
Ap distilat
1 g
2 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se solubilizeaz n apa distilat prenclzit, apoi
mediul astIel obtinut se repartizeaz n eprubete, n volum de
cte 5 ml. Se sterilizeaz prin autoclavare, la 121C timp de 15
minute.
Aspect: bulion de culoare glbuie, transparent
Utilizare: puriIicarea suselor de Iungi contaminate cu bacterii; n acest
caz mediul se aditiveaz cu acid clorhidric 1N
Stocarea: o lun la temperatura de reIrigerare
Disponibil comercial: Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Franta), Becton Dickinson
(SUA),bioMerieux (Franta).

M53 CHROMagar Candida

Compoziie
Pepton
Amestec cromogen
Cloramfenicol
Agar
Ap purificat
1 g
22 g
,5 g
15 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat si se Iierb un minut
pn la completa solubilizare. Se autoclaveaz la 121C timp
de 15 minute. Se adaug neomicin, 500 g/ml, n momentul
rcirii mediului la o temperatur de 50-55C.
Aspect: transparent, usor opalescent
pH final la 25
0
C: 6,1 0,1
Candida krusei ATCC 34135
Utilizare: izolarea levurilor din prelevatele patologice si identiIicarea
speciilor: C. albicans - colonii de culoare verde-smarald, C.
krusei - colonii de tip R de culoare roz-pal, albicioase la
periIerie, C.tropicalis - colonii de culoare albastru-verzui pn
la albastru-metalizat, C.glabrata colonii mate de culoare
violet deschis (lila);

79
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Stocare: n plci, 2 luni, la temperatura de reIrigerare
Disponibil comercial: Becton Dickinson (SUA)

M54 Ciree - Agar

Compoziie
Extract de ciree
Agar
Ap distilat
3 ml
2 g
ad 1 ml

Preparare: obtinerea extractului de cirese - se scot smburii din Iructele
rosii, la 450 g pulp de cirese adugndu-se 1000 ml ap
distilat. Amestecul se Iierbe nnbusit 2 ore. Se Iiltreaz prin
tiIon si se sterilizeaz o or la 110C. Extractul se pstreaz n
Ilacoane, la Irigider. Se dizolv agarul n ap si se adaug
extractul. Se distribuie n eprubete sterilizate si se autoclaveaz
5 minute la 120C. Nu se supranclzeste deoarece reactia
acid a mediului mpiedic solidiIicarea.
Aspect: geloz rosiatic, translucid
pH final la 25C: 3,5 - 4,6
Utilizare: Iavorizeaz sporularea la Iungii Iilamentosi superiori
Stocare: n eprubete 4 luni la 2-8C, n plci o lun la 2-8C

M55 Agar - glicerin

Compoziie
Glicerin
Sucro:
Pepton
MgSO
4
x 7H
2
O
KH
2
PO
4
NaCl
Agar
Ap distilat
7,5 g
7,5 g
5, g
,5 g
, g
4, g
2, g
ad 1 ml

Preparare: glicerina, sucroza, sulIatul de magneziu si IosIatul de potasiu
se adaug n 200 ml ap. Se omogenizeaz peptona si clorura
de sodiu cu 200 ml ap prenclzit la 60C si se adaug peste
prima solutie. Agarul se dizolv n 600 ml ap si apoi se
amestec cu celelalte solutii. Nu se ajusteaz pH-ul.
Autoclavarea mediului se Iace la 121C timp de 20 minute.
Medii de cultivare

80
Utilizare: cultivarea si identiIicarea speciilor apartinnd genului
Aspergillus.

M5 Infuzie de cartofi

Compoziie
Cartofi
Ap de robinet
3 g
9 ml

Preparare: se las cartoIii taiati, n ap, la Irigider, timp de 24 de ore, dup
care se Iiltreaz si se autoclaveaz inIuzia 1 or la 110
0
C.
Aspect: lichid alb-glbui, translucid
pH final la 25C : nu se determin
Controlul calitii: nu se realizeaz
Utilizare: pentru prepararea mediului PDA
Stocare: se recomand utilizarea imediat

M57 Mal agar (Malt Agar)

Compoziie
Extract de mal
Agar
Ap distilat
3, g
15, g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute. Mediul nu se va renclzi.
Aspect: geloz de culoarea chihlimbarului, usor opalescent
Utilizare: mediu pentru conservarea Iungilor si pentru studierea
caracterelor morIologice ale acestora n vederea identiIicrii
Disponibil comercial: Merck (Germania), Remel (SUA), Biokar Diagnostics
(Franta).


81
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M58 Mal extract agar (Malt Extract Agar)

Compoziie
Malto:
Dextrin
Glicerol
Pepton
Agar
Ap distilat
12,75 g
2,75 g
2,35 g
,78 g
15, g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute.
Utilizare: mediu pentru cultivarea, identiIicarea si aprecierea cantitativ a
Iungilor Iilamentosi si levuriIormi
Disponibil comercial: Remel (SUA), Becton Dickinson (SUA), Merck (Germania)

Medii de cultivare

82
M59 Mediu baz pentru levuri
(Yeast Carbon Base)

Compoziie
Dextro:
L-histidin
monohidrocloric
LD-metionin
LD-triptofan
Biotin
Calciu pantotenic
Acid folic
Ino:itol
Niacin
Acid p-amino ben:oic
Piridoxin hidrocloric
Riboflavin
Tiamin hidrocloric
Acid boric
Sulfat de cupru
Iodur de potasiu
Clorur feric
Sulfat de mangan
Molibdat de sodiu
Sulfat de :inc
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Clorur de sodiu
Clorur de calciu
Ap distilat
1, g
1, g
2, mg
2, mg
2, ug
4, ug
2, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
5, ug
4, ug
1, ug
2, ug
4, ug
2, ug
4, ug
1, g
,5 g
,1 g
,1 g
ad 1 ml

Preparare: n vederea sterilizrii prin Iiltrare se prepar o solutie de
concentratie 10 x prin dizolvarea a 11,7 g pulbere n 100 ml
ap distilat prenclzit. Apoi se Iiltreaz utiliznd Iiltre cu
porozitate de 0,2 m. Varianta de lucru se prepar prin
adugarea de ap distilat sterilizat n proportie de 9 volume
la un volum mediu concentrat.
Aspect: bulion transparent, de culoare galben-pai
Utilizare: mediu baz pentru auxonograma levurilor
Stocare: 2- 8C


83
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M AM3
(Antibiotic medium 3)

Compoziie
Extract de carne pulbere
Extract de drofdii
Pepton
Dextro:
Clorur de sodiu
Fosfat dipotasic
Fosfat monopotasic
Ap distilat
5, g
1,5 g
5, g
1, g
3,5 g
3,8 g
1,32 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n ap distilat prenclzit sub agitare
continu. Se repartizeaz n tuburi sau Ilacoane si se
autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: mediu transparent de culoarea chihlimbarului
pH final la 25
0
C: 7,0 0,5
Controlul calitii: incubare la 35
0
C 2
0
C / 24 ore
Staphvlococcus aureus ATCC 6538
Utilizare: mediu destinat depistrii rezistentei la amIotericin prin
metoda benzilor E-test.
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: Becton Dickenson (SUA)

M1 Mediu sintetic pentru testul de filamentare

Compoziie
Gluco:
Fosfat monopotasic
Clorur de calciu
Sulfat de magne:iu
Sulfat de amoniu
Ap distilat
,5 g
2, g
,5 g
,5 g
,5 g
ad 1 ml

Preparare: dup solubilizarea glucozei si a tuturor srurilor, pH-ul se
ajusteaz la 6,75 cu ajutorul unei solutii de hidroxid de potasiu
2M si amestecul se sterilizeaz prin autoclavare
Aspect: mediu lichid, transparent
pH final la 25C: 6,75-6,80
Candida parapsilosis ATCC 22019
Medii de cultivare

84
Utilizare: permite producerea de tubi germinativi la tulpinile de Candida
albicans, prin incubare pe baia de ap, la 37C timp de 4 ore.
Este utilizat pentru trierea selectiv a tulpinilor levurice si
identiIicarea prezumtiv a speciilor C. albicans si C.
dubliniensis (diIerentierea ntre acestea necesit teste
suplimentare).

M2 Mediul Bilai

Compoziie
KH
2
PO
4
KNO
3

MgSO
4
x 7H
2
O
KCl
Amidon pudr
Gluco:
Sucro:
Agar
Ap distilat
1 g
1 g
,5 g
,5 g
,2 g
,2 g
,2 g
18, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se dizolv n apa distilat prenclzit, se Iierb un
minut, apoi se autoclaveaz la 121C timp de 15 minute.
Aspect: geloz albicioas, opalescent
intens
Utilizare: mediul induce Iormarea conidiilor la Fusarium

M3 Mediu cu lapte diluat

Compoziie
Lapte natural pasteuri:at
Cloramfenicol
Ap distilat steril
17 ml
,25 g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se omogenizeaz sub protectia unei hote cu Ilux
laminar de clas II si se repartizeaz n Ilacoane. Este
obligatorie Iolosirea laptelui pasteurizat UHT, deoarece este
steril.
Aspect: mediu lichid, de culoare alb, opac

85
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 (dezvoltare abundent, cu
producere de pseudomiceliu si clamidospori)
Utilizare: mediu recomandat pentru studierea caracterelor morIologice la
levuri (clamidospori, hiIe, pseudohiIe, blastoconidii,
artrospori). n acest scop se suspensioneaz o colonie tnr n
3-4 ml mediu si se incubeaz la 28-30C timp de 24-48 ore.
Se observ la microscop ntre lam si lamel (x100 ... x400).
Stocare: 2-8C

M4 Mediu cu pine

Felii de pine se taie n Iorm de prisme de 5 cm lungime si 1
cm ltime. Se introduc n eprubete si se adaug ap. Pentru
sterilizare se nclzeste treptat pentru a evita Irmitarea
miezului. Folosind cantitti variabile de ap se obtine
sporularea speciilor higroIile, mezoIile, xeroIile, n special la
Aspergillus, Penicillium si Mucor; mediu utilizat de asemenea
pentru izolarea zygomicetelor din inIectii cerebrale
(Iragmentele de tesut cerebral cu dimensiuni de ctiva mm
diametru se nsmnteaz n mai multe puncte, pe Iragmentele
de pine, apoi se incubeaz la 37C).

M5 Mediu cu sol

Solul (pmnt de grdin cernut printr-o sit Iin) se introduce
n eprubete sau Ilacoane si se sterilizeaz 30 de minute la
121C. Dup 7 zile se sterilizeaz din nou pentru a distruge
toate microorganismele termorezistente care au supravietuit
primei sterilizri. Se inoculeaz solul si se umezeste n acelasi
timp cu 2-3 ml suspensie de spori. Se incubeaz culturile 10-14
zile apoi se pstreaz la 3-6C. Mediul este recomandat
pentru conservarea Iungilor.

Medii de cultivare

86
M Bulion / Agar Czapek-Dox (Czapek - Dox Broth / Agar)

Compoziie
Zaharo:
Nitrat de sodiu
Fosfat dipotasic
Sulfat de magne:iu
Clorur de potasiu
Sulfat feric
Ap distilat
3, g
3, g
1, g
,5 g
,5 g
,1 g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute; n cazul mediului solid se adaug 15 g agar.
Aspect: transparent, usor opalescent; uneori poate prezenta un usor
precipitat
pH final la 25
o
C: 7,3 0,2
Utilizare: mediu utilizat pentru izolarea Iungilor apartinnd speciilor
Aspergillus, Penicillium si Paecilomvces din probele de ap
conIorm unor standarde; mediu pentru identiIicarea tulpinilor
de Aspergillus
Disponibil comercial: Merck (Germania), Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Franta).

M7 Mediul Kurung-Yegian

Compoziie soluia A
Fulgi de cartofi
Ap deioni:at
5 g
5 ml

Compoziie soluia B
Melanf de ou
Glbenu de ou
25 ml
5 ml

Preparare: se prepar separat cele dou solutii, apoi se amestec si se
repartizeaz n tuburi. Se sterilizeaz prin autoclavare la
110C timp de 10 minute.
Aspect: mediu n tuburi, turnat n pant, de culoare galben, opac

87
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Utilizare: asigur conversia la Iorma levuric n cazul speciilor
Histoplasma capsulatum si Blastomvces dermatitidis
Stocare: n eprubete o lun la 2-8C

M8 Mediul Aikersen-Mankovski

Compoziie
Fosfat monopotasic
Sulfat de amoniu
Biotin
Albastru de tripan
Agar
Ap distilat
1, g
1, g
5, g
,1 g
15, g
ad 1 ml

Preparare: se solubilizeaz toate substantele n apa distilat prenclzit.
Se sterilizeaz prin autoclavare la 121C timp de 15 minute.
Mediului rcit (la 50C) i se adaug 20 g glicogen sau amidon
puriIicat si sterilizat prin tindalizare.
Aspect: geloz opalescent, de culoare bleu- pal
Controlul calitii: Candida albicans ATCC 10231 dezvolt clamidospori n 24-
48 de ore de incubare la 25C
Utilizare: mediu destinat stimulrii producerii de clamidospori la levuri
Stocare: 2-8C

M9 Mediul Pagano-Levin (11C Sabouraud Agar)

Compoziie
Pepton
Dextro:
Agar
Clorur de
trifeniltetra:oliu sol.1
(TTC)
Neomicin sau
Cloramfenicol
Ap distilat
1, g
4, g
15, g
1 ml
,5 g
ad 1 ml

o
C timp de 15
Medii de cultivare

88
minute. La temperatura de 50-55C se adug sol. 1 TTC si
antibioticul.
Aspect: geloz transparent, de culoare slab glbuie, opalescent
pH final la 25
0
C: 5,6 0,2
Candida krusei ATCC 34135
Utilizare: acest mediu diIerential este recomandat pentru identiIicarea
speciei Candida albicans din prelevatele patologice. Tulpinile
acestei specii prezint pe mediul Pagano-Levin culoarea alb-
deschis, n timp ce alte specii din genul Candida prezint
colonii roz, de diIerite nuante.
Disponibil comercial: bioMerieux (Franta).

M7 Mediu pentru izolarea dermatofiilor (D1M)

Compoziie
Pepton din soia
Dextro:
Rou fenol
Cicloheximid
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
1, g
1, g
,2 g
,5 g
,1 g
2, g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute
Aspect: agar galben-portocaliu, usor opalescent
Microsporum audouinii ATCC 9079
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145
Utilizare: mediu selectiv si diIerential pentru izolarea si identiIicarea
dermatoIitilor din prelevatele clinice
Disponibil comercial: Remel (SUA), Becton Dickinson (SUA)


89
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

M71 Mediul RPMI 14 - MOPS (CLSI)

Compoziie
Mediu RPMI 1640
MOPS
Ap distilat
1,4 g
34,53 g
ad 1 ml

Preparare: se amestec ingredientele sub agitare continu pn la
completa dizolvare. La 25
0
C se ajusteaz pH-ul la valoarea 7,0
cu ajutorul unei solutii de NaOH 1M. Se sterilizeaz prin
Iiltrare utiliznd un Iiltru cu porozitate 0,2 m. Se stocheaz la
4C pn la utilizare. nainte de utilizare se testeaz sterilitatea
si pH-ul .
Aspect: bulion transparent, de culoare rosiatic
pH final la 25
0
C: 6,9 - 7,1
Controlul calitii: trebuie s se obtin CMI-urile recomandate pentru tulpinile
test.
Utilizare: mediu destinat testrii susceptibilittii la antiIungice prin
tehnicile CLSI
Stocare: 2C8C

M72 Mediul RPMI 14 - MOPS ( EUCAS1)

Compoziie mediu concentraie uzual 1X
Mediu RPMI 1640
MOPS
Gluco:
Ap distilat
1,4 g
34,53 g
18 g
ad 1 ml

Compoziie mediu dublu concentrat 2X
Mediu RPMI 1640
MOPS
Gluco:
Ap distilat
2,8 g
9, g
3 g
ad 1 ml

Preparare: se adaug ingredientele n ap bidistilat, amestecndu-se
continuu pn la dizolvarea lor complet. Se ajusteaz pH-ul la
valoarea 7,0 Iolosind NaOH solutie 1 M. se completeaz cu
ap bidistilat pn la 1 litru. Se sterilizeaz prin Iiltrare,
utiliznd un Iiltru cu porozitate 0,22 m. Se pstreaz la 4C
pn n momentul Iolosirii. nainte de utilizare, se testeaz
sterilitatea mediului si se veriIic pH-ul.
Medii de cultivare

90
Aspect: bulion transparent de culoare rosiatic
pH final la 25
0
C: 6,9- 7,1
Controlul calitii: trebuie s se obtin CMI-urile recomandate pentru tulpinile test
Utilizare: mediu destinat testrii susceptibilittii la antiIungice prin
tehnicile EUCAST
Stocare: 2-8C

M73 Agar RPMI - MOPS - glucoz 2 "

Compoziie
Mediu RPMI 1640
(cu L-glutamin i rou
fenol, fr bicarbonat)
MOPS
Gluco:
Agar pulbere
NaOH soluie 1M
Ap distilat
8,4 g
34,5 g
2, g
15, g
8-9 ml
ad 1 ml

Preparare: se dizolv pulberile de RPMI si MOPS n cca. 450 ml ap
distilat si se sterilizeaz prin Iiltrare utiliznd un Iiltru cu
porozitate 0,2 m. Se solubilizeaz glucoza si agarul n cca.
450 ml ap distilat si se sterilizeaz prin autoclavare timp de
15 minute la 121C; se rceste apoi amestecul la 45-50C. Se
nclzeste lent solutia continnd RPMI si MOPS la cca. 45C
si se amestec cu cea care contine glucoza si agarul, sub
protectia unei hote microbiologice de clas II. Se ajusteaz
pH-ul amestecului la valoarea 7,0 utiliznd solutie NaOH 1M,
si se aduce volumul Iinal al amestecului la 1000 ml. Se toarn
mediul n plci Petri (cca. 60 ml/ plac 150 mm sau cca 25
ml / plac Petri 90 mm, sub protectia lmpii UV, utiliznd o
hot microbiologic de clas II. Se stocheaz la 4C.
Aspect: geloz translucid, de culoare rosiatic
pH final la 25
0
C: 6,9-7,1
Controlul calitii: se realizeaz cu benzi E-Test la 48 ore


91
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

Intervalul CMI (g/ ml)

Tulpina test FC AP FL IT VO
C.parapsilosis
ATCC 22019
0,064 -
0,258
0,25 - 1
1 - 4 (rar
colonii
izolate la
8)
0,064 -
0,25
0,016 -
0,064
C.krusei
A1CC 258
32 0,5 - 2 128 -256 0,25 - 1 0,25 - 1
C.albicans
ATCC 90028
0,5 - 2 0,125 -0,5 0,125 -0,5
0,064 -
0,25
0,004 -
0,016

Utilizare: mediu destinat testrii susceptibilittii la antiIungice cu benzi
E-test
Stocare: 2-8C
Disponibil comercial: AES Laboratoire (Franta)

M74 Agar Dicloran - Rose Bengal - cloramfenicol
(DRBC Agar)

Compoziie
Pepton protea:ic 3
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Dicloran
Ro: Bengal
Cloramfenicol
Agar
Ap distilat
5, g
1, g
1, g
,5 g
2, m g
25, m g
,1 g
15, g
ad 1 ml

o
C timp de 15
minute
Aspect: geloz de culoare roz, transparent sau usor opalescent
Medii de cultivare

92
Controlul calitii: Aspergillus niger ATCC 1015 - colonii albe
Candida albicans ATCC 10231 - colonii roz.
Escherichia coli ATCC 25922 -
Micrococcus luteus ATCC 10240 -
Utilizare: mediu pentru cultivarea si identiIicarea Iungilor Iilamentosi
Disponibil comercial: Remel (SUA), Biokar Diagnostics (Franta).

M75 1richophyton Agar 1-7

1richophyton Agar 1

Compoziie
Aminoaci:i Casamino
Difco
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Ap distilat
2,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
ad 1 ml

1richophyton Agar 2

Compoziie
Aminoaci:i Casamino
Difco
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Ino:itol
Ap distilat
2,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
5, mg
ad 1 ml


93
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

1richophyton Agar 3

Compoziie
Aminoaci:i Casamino
Difco
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Ino:itol
Tiamina HCL
Ap distilat
2,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
5, mg
2 ug
ad 1 ml

1richophyton Agar 4

Compoziie
Aminoaci:i Casamino
Difco
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Tiamin HCl
Ap distilat
2,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
2 ug
ad 1 ml

1richophyton Agar 5

Compoziie
Aminoaci:i Casamino
Difco
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Acid nicotinic
Agar
Ap distilat
2,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
2 ug
15, g
ad 1 ml

Medii de cultivare

94
1richophyton Agar

Compoziie
Nitrat de amoniu
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Ap distilat
1,5 g
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
ad 1 ml

1richophyton Agar 7

Compoziie
Nitrat de amoniu
Histidin HCl
Dextro:
Fosfat monopotasic
Sulfat de magne:iu
Agar
Ap distilat
1,5 g
3, mg
4, g
1,8 g
,1 g
15, g
ad 1 ml

Preparare: ingredientele se amestec cu apa distilat pn la completa
dizolvare si se Iierb un minut. Se autoclaveaz la 121C timp
de 12 minute.
Controlul calitii: Trichophvton concentricum ATCC 9358
Trichophvton schoenleinii ATCC 4822
Trichophvton verrucosum ATCC 34470
Utilizare: cultivarea si identiIicarea speciilor apartinnd genului
Trichophvton

M7 Agar pepton 3" (Agar Sabouraud conservare)

Compoziie
Pepton
Agar
Ap distilat
3, g
2, g
ad 1 ml


95
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

o
C timp de 15
minute.
Aspect: geloz de culoare galben-pal, translucid
Controlul calitii: M. persicolor - colonii cu tent roz-lila
Utilizare: mediu pentru diIerentierea M. persicolor de T. mentagrophvtes
si pentru conservarea suselor de dermatoIiti
Disponibil comercial: nu se comercializeaz

Medii de cultivare

96

1. Abildgren M P, Lund F, Thrane U, Elmhold S (1987) - Czapek-Dox agar
containing iprodione and dicloran as a selective medium Ior the isolation
oI Fusarium species; Lett Appl Microbiol; 5:83-86.
2. Acha P N, SzyIrer B (1989) - Zoonoses et maladies transmissibles
communes l'homme et aux animaux; OIIice International des
Epizooties; 2
nd
edition; Paris.
3. Andrews S (1992) - DiIIerentiation oI Alternaria species isolated Irom
cereals on dichloran malt extract agar. In Modern Methods in Food
Mycology, Samson R A, Hocking A D, Pitt J I, King A D (eds.); Ed.
Elsevier, Amsterda; 351-355.
4. Andrews S, Pitt J I (1986) - Selective medium Ior the isolation oI
Fusarium species and dematiaceous Hyphomycetes Irom cereals; Appl
Environ Microbiol; 51:1235-1238.
5. Baertschi C, Berthier J, Guiguettaz C, Valla G (1989) - A selective
medium Ior the isolation and enumeration oI Mucor species; Mycological
Research; 95:373-374.
6. Baron E J, Peterson L R, Finegold S M (1994) - Bailay & Scott's
diagnostic microbiology; 9
nd
edition. Mosby-Year Book; Inc; St. Louis;
M.O.
7. Barr F S, Collins G F (1996) - A rapid method Ior isolation and
identiIication oI Candida; 1 Southern Med Assoc; 59:694-695.
8. Baumgartner C, Freydiere A-M, Gille Y (1996) - Direct identiIication and
recognition oI yeast species Irom clinical material by using Albicans ID
and CHROMagar Candida plates; 1 Clin Microbiol; 34:456-465.
9. Bensignore E, Feuilhade de Chauvin M (1999) - Microsporum persicolor
(Sabouraud) Guiard et Grigorakis 1929 chez lanimal et chez lhomme:
etude in vitro et revue de la litterature; Rec Md Jt; 175(1-2):45-60.
10. Booth C (1971) - Fungal culture media. In Methods in Microbiology, ed.
Booth C; Academic Press, London; 49-94.
Bucuresti.
12. Chabasse D (Editor) (2004) - Les dermatophytes; Cahier de formation en
Biologie mdicale; BioIorma; Paris; No. 31.
13. Chabasse D, Cimon B, Gentile L, Bouchara J P (1991) - Les mycoses
transmisees danimal lhomme; Revue franaise des laboratoires;
10(228):77-83.
14. Chermette R, Bussieras J (1993) - Abrg de parasitologie vtrinaire;
Fasc. V; Mycologie veterinaire; ENV dAlIort; Paris.
15. Coman I, Mares M (2000) - Micologie medical aplicat; Ed. Junimea,
Iasi.
16. Constantinescu O (1974) - Metode i tehnici n micologie; Ed. Ceres;
Bucuresti.

97
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

17. Costa S O, de Lourdes Branco C (1964) - Evaluation oI a molybdenum
culture medium as selective and diIIerential Ior yeasts; 1 Pathol Bacteriol;
87:428-431.
18. Cutsem Van J, Rochette F (1992) - Mycoses des animaux domestiques;
Janssen Researchers Foundation.
19. Freydire A M, Guinet R (1997) - Rapid methods Ior identiIication oI the
most Irequent clinical yeasts; Rev Iberoam Micol; 14:85-89.
20. Freydiere A-M, Rousselle P, Gille P (1995) - Apport des milieux
didentiIication rapide de Candida albicans: Fluoroplate et Albicans ID; 1
Med Mycol; 5:190-191.
21. Garcia-Martos P, Garcia-Agudo R, Hermandez- Molina J M et al. (1998) -
IdentiIicacion de levadudas de interes clinico en el medio de cultivo
CHROMagar Candida; Rev Iberoam Micol; 15:131-135.
23. Grillot R (1996) - Les Mycoses humaines: demarche diagnostique; Ed.
Elsevier, Paris.
24. Gueho E, Midgley G, Guillot J (1996) - The genus Malasse:ia with
description oI Iour new species; Antonie van Leeuwenhoek; 69:337-355.
25. Guillot J, Gueho E, Mialot M, Chermette R (1998) - Importance des
levures du genre Malasse:ia en dermatologie veterinaire; Le point
Jtrinaire; 29:691-701.
26. Hocking A D, Pitt J I (1980) - Dichloran-sucrose agar, a diIIerential
medium Ior enumeration oI xerophilic Iungi Irom low-moisture Ioods.
Appl Environ Microbiol; 39:488-492.
27. Hoog de G S, Guarro J, Gene, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical
fungi; 2
nd
Rovira i Virgili.
28. HopIer R L, Blank F (1975) - CaIIeic acid - containing medium Ior
identiIication oI Crvptococcus neoformans; 1 Clin Microbiol; 2:1158-
1200.
29. Jacquemin P, Jacquemin J L (1974) - Abrg de parasitologie clinique;
Masson et C
ie
; Paris.
30. Jarvis B (1973) - Comparison oI an improved rose bengal-chlortetracycline
agar with other media Ior the selective isolation and anumeration oI
moulds and yeasts in Ioods; 1 Appl Bacteriol; 36:723-727.
31. Kane J (1984) - Conversion oI Balstomvces dermatitidis to the yest Iorm at
37C and 26C; 1 Clin Microbiol; 20:594-596.
32. King A D,Hocking A D, Pitt J I (1979) - Dichloran-rose bengal medium
Ior enumeration and isolation oI moulds Irom Ioods; Appl Environ
Microbiol; 37:959-964.
33. Kumar Girish C P, Menon T (2005) - Tobacco agar: a new medium Ior
chlamydosporulation in Candida albicans and Candida dubliniensis; Med
Mycol; 43(5):473-475.
Medii de cultivare

98
34. Kurtzman C P, Boekhout T, Robert V, Fell W, Deak T (2003) - Methods
to identiIy yeasts. In Boekhout T, Robert V (eds) - Yeasts in Food; B
Behrs Verlag GmbH Co; Hamburg; Germany.
35. Kurung J M, Yegian D (1954) - Medium Ior maintenance and conversion
oI Histoplasma capsulatum to the yeast like phase; Am 1 Clin Pathol;
24:505-508.
36. Kwon-Chung K J, Bennett J E (1992) - Medical Mycology; Lea Febiger;
Philadelphia.
37. Leeming J P, Notman F H (1987) - Improved methods Ior isolation and
enumeration oI Malasse:ia furfur Irom human skin; 1 Clin Microbiol;
25:2017-2019.
38. Martin M V, Schneidau J D (1970) - A simple and reliable assimilation
test Ior the identiIication oI Candida species; Am 1 Clin Pathol; 53:875-
879.
39. Mayser P, Wille G, Imkampe A., Thoma W et al. (1998) - Synthesis oI
Iluorchromes and pigments in Malasse:ia furfur by use oI triptophane as
single nitrogen sourse; Mycoses; 41:265-271.
40. Mc Ginnis M R (1980) - Laboratory handbook of medical mycology;
Academic Press; New York.
41. Mitroiu P (1976) - Micoze i micotoxicoze la animale; Ed. Ceres;
Bucuresti.
42. Mosaid al A, Sullivan D, Coleman D C (2003) - DiIIerentiation oI
Candida dubliniensis Irom Candida albicans on Pals Agar; 1 Clin
Microbiol; 41(10): 4787-4789.
43. Mosaid al A, Sullivan D, Salkin I F et al.(2001) - DiIIerentiation oI
Candida dubliniensis Irom Candida albicans on Staib Agar and CaIIeic
Acid- Ferric Citrate Agar; 1 Clin Microbiol; 39(1):323-327.
44. Moser S A, Lyon F L, Greer D L (1988) - Sistemic mycoses; In BB
Wentworth (ed.) - Diagnostic procedures for mycotic and parasitic
infection; American Public Health Association; Washington DC; 173-238.
45. Nelson C S, Yau Y C W, Richardson E S, Matlow A (1995) - Improved
detection oI Malasse:ia species in lipid-supplemented Peds Plus Blood
Culture Bottles; 1 Clin Microbiol; 33:1005-1007.
46. Peman J, Martin-Mazuelos E, Rubio Calvo M C (eds) (2001) - Cuia
Practica de Identificacion y Diagnostico en Micologia Clinica; Rev
Iberoam Micol; Bilbao.
47. Percebois G (1973) - Introduction une etude des dermatophytes;
Societe dImpressions Typographiques; Nancy.
48. PIaller M A, Messer S A, Boyken L et al.(2004) - Evaluation oI the
NCCLS M44-P Disk DiIIusion Method Ior Determining Susceptibilities oI
276 Clinical Isolates oI Crvptococcus neoformans to Fluconazole; 1 Clin
Microbiol; 42(1):380-383.
49. Randhawa H S, Chowdhary A, Sinha K P et al. (2006) - Evaluation oI
peptone glucose Iluconazole agar as a selective medium Ior rapid and
enhanced isolation oI Aspergillus fumigatus Irom the respiratory tract oI

99
!
"
#
$
%
&
'
(
'

+

bronchopulmonary aspergillosis patients colonized by Candida albicans;
Med Mycol; 44(4):343-348.
50. Rousselle P, Freydiere A-M, Couillerot P J et al. (1994) - Rapid
identiIication oI Candida albicans by using Albicans ID and Fluoroplate
agar plates; 1 Clin Microbiol; 32:3034-3036.
51. Segretain G, Drouhet E, Mariat F (1987) - Diagnostic de laboratoire en
micologie mdicale; Maloin; Paris.
52. Sheth C C, Johnson E, Baker E M et al. (2005) - Phenotypic identiIication
oI Candida albicans by growth on chocolate agar; Med Mycol; 43(8):735-
738.
53. Sinski J T, Kelley L M, Reed G L (1975) - Pagano-Levin Candida test
medium; evaluation using vaginal samples; 1 Clin Microbiol; 1:206-211.
54. SliIkin M (2000) - Tween 80 opacity test responses oI various Candida
species; 1 Clin Microbiol; 38(12):4626-4628.
55. Staib F, Arasteh K (2000) - Chlamydospore Iormation on Staib Agar.
Observations made beIore Candida dubliniensis was described; Mycoses ;
44:23-27.
56. Staib F, Seibold M, Antweiler E et al. (1987) - The brown color eIIect
(BCE) oI Crvptococcus neoformans in the diagnosis, control and
epidimiology oI Crvptococcus neoformans inIections in AIDS patiens;
Zentralbl Bakteriol Microbiol Hyg A; 266:167-177.
57. Staib P, Morschhauser J (1999) - Chlamidospore Iormation on Staib agar
as a species-speciIic characteristic oI Candida dubliniensis; Mycoses;
45:521-524.
58. Stepanovic S, Vukovic D, Radonjic I et al. (2002) - Ground red hot pepper
agar in the isolation and presumption identiIication oI Crvptococcus
neoformans; Mycoses; 45:384-388.
59. Strachan A A, Yu R J, Blank F (1971) - Pigment production oI
Crvptococcus neoformans grow with extracts oI Gui:otia abvssinica; Appl
60. Summerbell R C, Rosenthal A S, Kane J (1988) - Rapid method Ior
diIIerentiation oI Trichophvton rubrum, Trichophvton mentagrophvtes,
and related dermatophyte species; 1 Clin Microbiol; 26(11): 2279-2282.
61. Waller J, Koenig H, Debruyne, Contant (1993) - Evaluation dun nouveau
milieu disolement des levures et de diagnostic rapide de Candida
albicans; Revue Franaise de Laboratoire; 252:89-92.
62. Warren N G, Hazen K C (1995) - Candida, Crvptococcus and other yeasts
oI medical importance; In Muray P R, Baron E J, PIaller M A et al. (eds) -
Manual of clinical microbiology; 6
nd
edition; American Society Ior
Microbiology; Washington D C; 723-737.
63. Willinger B, Hillowoth, Selitsch B (2001) - PerIormance oI Candida ID, a
new chromogenic medium Ior presumptive identiIication oI Candida
species, in comparison to CHROMagar Candida; 1 Clin Microbiol;
39:3793-3795.
Medii de cultivare

100
64. Willinger B, ManaIi M, Selitsch B, Hillowoth C (1999) - Bewetung von
CHROMagar Candida zum schnellachweis von Candida - Arten aus
Klinischer Untersuchungsmaterial; Mycoses; 42:61-65.
65. Willinger B, ManaIi, Rotter M L (1994) - Comparison oI rapid methods
using Ilourogenic assays Ior detecting Candida albicans, Lett Appl
66. Yamane N, Saitoh Y (1985) - Isolation and detection oI multiple yeasts
Irom a sigle clinical sample by use oI Pagano-Levin agar medium; 1 Clin
67. CLSI (2002) - Quality assurance for commercially prepared
microbiological culture media; Approved Standard: M22-A2; Villanova;
P.A.
68. Subcommittee on AntiIungal Susceptibility Testing (AFST) oI the
ESCMID European Committee Ior Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST) (2002) - Method for the determination of minimum inhibitory
concentration (MIC) by broth diluation of fermentative yeasts (E. Dis.
7.1).
Mihai Mares, Olimpia Bazgan

101
!
"
#
$
%
&
'
(
'

,


4.1. 1ehnici uzuale

a regul general, nsmntarea prelevatelor se poate Iace prin mai multe
tehnici uzuale:
- epui:are pe medii solide conditionate Iie n plci Petri, Iie n tuburi (n pant)
asigur separarea Iungilor cu semniIicatie clinic de cei contaminanti si inhib
prin diluare eventualele substante antimicrobiene cu rol antiIungic;
- etalare in puncte i:olate prin spotare: la unele prelevate paucibacilare sub
Iorm de lichide organice LCR, pasaje din hemoculturi (Iig. nr. 4-1 ve:i
Anexa), sedimente, Iragmente de tesut si prin inepare. la Iire de pr, scuame,
diverse raclate;
- inglobare n medii solide pretopite si rcite la 45C: la Iire de pr, Iragmente
unghiale, scuame.

n timpul nsmntrilor se va tine seama de urmtoarele reguli:
- nsmntrile se vor executa n boxe sau hote speciale, care se pot steriliza
periodic si nu permit Iormarea de curenti de aer n timpul lucrului.
nsmntarea prelevatelor provenite din situsuri normal sterile se va Iace
preIerabil sub protectia unei hote microbiologice clas 2, pentru a preveni
eventuala lor contaminare cu spori Iungici ambientali.
- Se evit conversatia si orice miscare n jurul operatorului;
- Instrumentul utilizat la nsmntare (ans microbiologic, ac de nsmntare,
pipet etc.) nu se va atinge de obiecte nesterilizate (halat, mas de lucru );
- nsmntrile se vor executa ntr-un timp scurt, pentru a reduce la minim
contactul materialului de nsmntat cu atmosIera ambiant;
- n timpul ct tuburile de cultur sunt deschise, vor Ii tinute ntr-o pozitie oblic,
ct mai aproape de orinzontalitate si cu deschiderea n imediata apropiere a
Ilcrii becului de gaz;
- Operatorul trebuie s poarte masc de protectie;
- Tuburile si plcile Petri nsmntate se noteaz cu markerul, Ir a omite numrul
probei, denumirea abreviat a mediului de cultivare si data nsmntrii.

C
4
Tehnici de nsmntare si transplantare

102
nsmntarea se execut n Iata Ilcrii unui bec de gaz care asigur conditii de
antisepsie n timpul actiunii. n micologia medical, produsele patologice se
nsmnteaz n mod similar cu cel din bacteriologie. Acul de nsmntare / ansa se
Ilambeaz si se rceste n ser Iiziologic sterilizat, apoi se ia un Iragment de produs
patologic ce ader de ac si se depune pe supraIata mediului de cultur. Din aceeasi
prob, se nsmnteaz mai multe plci sau tuburi, n puncte separate, cte 3 4
Iragmente de cercetat.
Culturile se examineaz zilnic, urmrindu-se aspectul macroscopic (supraIata,
relieIul, culoarea, prezenta pigmentrii, consistenta si viteza cresterii). n timpul
dezvoltrii, coloniile si schimb aspectele macroscopice. Aspectele coloniilor se
noteaz periodic, pentru a surprinde toate caracterele culturale. Paralel se Iace si
examenul morIologic al Iragmentelor de colonii.
Sansele de izolare a Iungilor cu semniIicatie clinic cresc direct proportional
cu numrul probelor nsmntate. Temperatura de incubare dup nsmntare este de
36-37C pentru prelevatele interne / proIunde si de 30C pentru cele superIiciale.
Atenie' Fragmentele biopsice recoltate din le:iuni suspecte de :vgomico: nu
se omogeni:ea: cu diluant prin mofarare sau fragmentare, deoarece se distruge
miceliul i cultura va fi fals negativ. Temperatura de incubare recomandat este
37C.
Pentru izolarea levurilor, nsmntarea prelevatelor se Iace pe Agar Sabouraud
aditivat cu cloramIenicol. Acest mediu permite o bun dezvoltare a levurilor si
supreseaz multiplicarea eventualelor bacterii contaminante. Pentru levurile lipo-
dependente ale genului Malasse:ia, cultivarea prelevatelor se Iace Iie pe Agarul
Sabouraud cu cloramIenicol pe supraIata cruia s-a etalat prin striere o Iin pelicul de
ulei de msline sterilizat prin autoclavare, Iie pe medii speciale (Dixon, Leeming). Pe
Agar Sabouraud cu cloramIenicol, culturile mixte aprute prin asocierea a dou sau
mai multe specii de levuri sunt uneori diIicil de observat, de aceea ideal ar Ii ca
nsmntarea prelevatelor s se Iac pe un mediu diIerential cromogen, care pe lng
discriminarea ntre speciile levurice poate aduce inIormatii esentiale pentru
identiIicarea agentului etiologic. Se realizeaz astIel ntr-o singur etap, att izolarea,
ct si identiIicarea levurii / levurilor incriminate. Pe mediile de izolare, levurile de
interes medical se dezvolt n 24-72 ore de incubare. n Iunctie de provenienta
prelevatului se va Iace si alegerea temperaturii de incubare. Pentru prelevatele
provenind din situsuri n care n mod normal temperatura este identic cu cea a
organismului, se va alege temperatura de 37C pentru incubare. n cazul celor
provenind de la nivelul tegumentului sau unghiilor, incubarea se va Iace att la 37C,
ct si la 30C, deoarece unele levuri cultivabile la 30C dar necultivabile la 37C, pot
avea semniIicatie clinic Iiind cauza unor micoze superIiciale.
n cazul dermatoIitozelor, se recomand ca primocultura s se eIectueze n
plci Petri si nu n tuburi, deoarece att nsmntarea ct si manoperele ulterioare sunt
mult Iacilitate. Mediul de electie pentru izolarea dermatoIitilor este Agarul Mycobiotic
(Agar Sabouraud aditivat cu cloramIenicol si cicloheximid); prezenta
cloramIenicolului suprim dezvoltarea bacteriilor care pot contamina prelevatul, iar
cicloheximida (Actidione) inhib multiplicarea Iungilor contaminanti, Iacilitnd
izolarea dermatoIitilor. Materialul patologic se nsmnteaz n mai multe puncte
pentru a creste probabilitatea izolrii dermatoIitilor si a putea acorda semniIicatie

103
!
"
#
$
%
&
'
(
'

,

clinic tulpinii izolate. Cu ct numrul punctelor de nsmntare pozitivate este mai
mare, cu att implicarea clinic a tulpinii izolate este mai sigur. Este posibil si
nsmntarea prin nglobarea prelevatului n mediul de cultur, ns interpretarea
semniIicatiei clinice devine mai diIicil. Incubarea se realizeaz la 25-30C, timp de
cca. 4 sptmni. Cnd se suspicioneaz o inIectie cu T. verrucosum, plcile se vor
incuba la 37C (crestere accelerat). n cazul absentei sporulrii n primocultur,
tulpinile se pot pasa pe medii speciale care Iavorizeaz producerea macroconidiilor si
pigmentogeneza: mediul Lactrimel (Borelli), PDA, agar pepton 3. Se recomand
observarea culturilor de 2 ori / sptmn pentru a surprinde n dinamic aspectele
caracteristice coloniilor de dermatoIiti. Importante din punct de vedere diagnostic sunt
viteza de crestere, caracterele morIologice macro- si microscopice. La unele specii de
dermatoIiti apar asa-numitele ,Iormatiuni ornamentale care reprezint de Iapt hiIe cu
aspect modiIicat, al cror rol nu este nc elucidat: hiIe ,n rachet sau cu aspect de
,tij de bambus, candelabre Iavice, hiIe spiralate (vrile), celule osiIorme (aspect de
,ganter), organe nodulare, hiIe pectinate.

4.2. 1ehnici speciale

4.2.1. 1ehnica de purificare a izolatelor levurice

Dup obtinerea primoculturii, se va veriIica obligatoriu puritatea acesteia
deoarece contaminarea bacterian este indezirabil n actiunea ulterioar de identiIicare
a speciei. n acest scop, se pregtesc Iie preparate ntre lam si lamel, Iie Irotiuri
colorate Gram care se examineaz la microscop, cu obiectivul de imersie. n cazul
prezentei bacteriilor, se recurge la pasarea tulpinii n bulion Sabouraud aditivat cu acid
clorhidric solutie 1N, conIorm schemei prezentate n Iig. nr. 4-2.
Dup incubare si reveriIicare prin coloratia Gram, se epuizeaz 0,1 ml din
tubul cu numrul maxim de picturi de HCl care a permis dezvoltarea levurilor, pe
supraIata unui Agar Sabouraud cu cloramIenicol n vederea obtinerii coloniilor
puriIicate.


104

Fig. nr. 4-2. PuriIicarea izolatelor levurice metodologie de lucru


105
!
"
#
$
%
&
'
(
'

,

4.2.2. 1ehnica nsmnrii levurilor pe Agarul cu fin de porumb i tween 8
(metoda Dalmau)

Prin cultivare submers pe acest mediu, levurile si exprim plenar toate
detaliile morIologice: blastospori, pseudohiIe (pseudoIilamente), Iilamente (hiIe),
clamidospori, artrospori, ascospori. n Iunctie de gen si specie, aceste Iormatiuni apar
sau nu si prezint anumite caracteristici utile identiIicrii. Rezultatele acestui test pot Ii
doar rareori utilizate singular; de obicei, ele se coroboreaz obligatoriu cu rezultatele
proIilului biochimic al tulpinii n cauz (Iermentarea zaharurilor, asimilarea diverselor
surse de carbon sau azot, producerea unor enzime ca ureaza, Ienol-oxidaza,
hexozaminidaza, L-prolin-aminopeptidaza, catalaza.
Tehnica de lucru: se pregtesc plci Petri cu o grosime a mediului de 4-5 mm
(cca. 25-30 ml mediu / plac cu 90 mm); dup solidiIicare, cu ajutorul ansei
microbiologice cu care s-a prelevat n prealabil o mic portiune din colonia levurii de
identiIicat, se practic 3 ,incizii ale mediului, dup cum urmeaz: primele dou
paralele ntre ele, la distant de cca. 1-1,5 cm, apoi o aIIIa perpendicular pe celelalte
(Iig. nr. 4-3). n timpul nsmntrii mediului, ansa se mentine nclinat sub o incident
de cca. 60-70 Iat de orizontal. Portiunea de agar astIel nsmntat se acoper cu o
lamel sterilizat. Dup o incubare de 48-72-96 ore la 25C-30C, placa Petri se
examineaz direct la microscop, Iormatiunile dezvoltate n mediu Iiind observabile
prin traversul lamelei. Alternativ, dup nsmntare, mediul nu se acoper cu lamel,
iar pentru examinare se preleveaz cu ajutorul ansei un bloc de geloz de pe linia de
nsmntare si se etaleaz prin strivire ntre lam si lamel. Se examineaz apoi la
microscop, Ir colorare suplimentar, urmrindu-se prezenta clamidosporilor, Iorma si
mrimea pseudohiIelor, modul de dispunere a blastosporilor (blastoconidiilor) de-a
lungul acestora.

Fig. nr. 4-3. Tehnica nsmntrii levurilor pe CMA (cultivare submers).

4.2.3. 1ehnica de cultivare pe suporturi transparente

Metoda const n plasarea unei lamele sterilizate pe supraIata gelozei, Ioarte
aproape de colonia activ. Miceliul va creste peste lamel, care la un anumit interval de
timp poate Ii ridicat si examinat la microscop.

106
n locul lamelelor se pot Iolosi ptrate de celoIan de mrimea lamelelor,
sterilizate prin autoclavare. Inoculul se depune n mijlocul ptratului de celoIan, iar
dup dezvoltarea miceliului, pelicula de celoIan se monteaz pe lam si se examineaz
la microscop.

4.2.4. 1ehnica de cultivare n ,pictur suspendat"

Inele de sticl cu diametrul de 2 cm si nltimea de 1 cm se imerseaz n
paraIin topit si imediat se aseaz pe o lam de sticl sterilizat. n interiorul inelului
de sticl se pune o pictur de ap distilat sterilizat. Lamela de sticl se Ilambeaz si
n zona central se depune o pictur de bulion Sabouraud, n care se nsmnteaz
materialul de cercetat. Marginea superioar a inelului de sticl se greseaz cu lanolin,
se trece prin Ilacr pentru sterilizare si se aplic apoi lamela cu pictura nsmntat
n jos.
Lamela se examineaz la microscop dup cteva zile de incubatie.

4.2.5. 1ehnica de cultivare pe bloc de geloz (cultivarea pe lam)

Cultura pe bloc de gelo: (pe lam) este recomandat pentru studierea n
dinamic a morIologiei structurilor de IructiIicare (generatoare de conidii) la Iungii
Iilamenosi septati (nu ns la cei din genurile Aspergillus si Penicillium). n acest scop,
Iungul de identiIicat se nsmnteaz n dou puncte opuse ale unui bloc de geloz
(PDA) de 1 x 1 x 0,5 cm etalat pe o lam de sticl. Dup nsmntare, acesta se
acoper cu o lamel, iar lama se aseaz pe o baghet de sticl n Iorm de ,U plasat
ntr-o camer umed (de Iapt, o plac Petri ce contine un Iragment de hrtie de Iiltru
umectat cu cca. 5 ml ap distilat). Camera umed (Iig. nr. 4-4) se incubeaz la 25-
30C, un timp variabil, pn la aparitia pe lam a structurilor de IructiIicare cu
morIologie caracteristic, Iapt constatat n urma examinrii microscopice. n Iinal,
blocul de geloz se ndeprteaz, iar din lam, respectiv lamel, se obtin prin adugare
de lactoIenol si montare, dou preparate extemporanee. Aceste dou preparate obtinute
se pot pstra, dac vor Ii lutate, timp de aproximativ cinci ani.

Fig. nr. 4-4. Camer umed pentru cultivarea Iungilor pe bloc de geloz.


107
!
"
#
$
%
&
'
(
'

,

4.3. 1ehnici de transplantare

Prin transplantri sau pasaje se urmreste izolarea n stare pur a Iungilor de
interes medical din culturile mixte sau mentinerea lor n timp, n conditii de laborator
(tulpini de colectie) si obtinerea de colonii monosporale.
Din culturile pe medii lichide, recoltarea materialului de transplantat se poate
Iace cu pipeta Pasteur sau cu ansa de nsmntare. Cu pipeta Pasteur se recolteaz o
cantitate din cultura veche, din care se nsmnteaz cteva picturi n mediul lichid si
cteva picturi pe supraIata mediului solid. n cazul transplantrii cu ansa, se introduce
ansa sterilizat n cultura veche, apoi se Iace nsmntarea pe mediile proaspete (nti
pe mediul lichid si apoi n trei puncte pe mediul solid).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se Iace cu ansa sau cu o
microspatul, lund o cantitate redus de miceliu de la periIeria coloniei vechi. Acest
material biologic se transIer pe bulion si pe un mediu agarizat (Agar Sabouraud, PDA,
Agar Czapek Dox, Agar cu extract de malt etc.).


108


1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator i igiena alimentelor de
origine animal; Ed. Moldogrup; Iasi.
Bucuresti.
3. Coman I, Mares M (2000) - Micologie medical aplicat; Ed. Junimea;
Iasi.
Bucuresti.
6. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
7. Gueho E, Midgley G, Guillot J (1996) - The genus Malasse:ia with
description oI Iour new species; Antonie van Leeuwenhoek; 69:337-355.
fungi; 2
nd
Rovira i Virgili.
9. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) - Zygomycetes in Human
Disease; Col Rev; 2(13):236-301.
10. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) Zygomycetes in Human
Disease; Col Rev ; vol. 13(2): 236-301.


109
!
"
#
$
%
&
'
(
'

-


xamenul microscopic al Iragmentelor de colonii Iungice urmreste:

- Aspectul hiIelor - septate sau nu;
- Aspectul miceliului - diIuz, gros, colorat, incolor;
- Prezenta si tipul sporilor sexuati - zigospori, ascospori;
- Prezenta corpilor IructiIicanti asexuati (tipul si aspectul sistemului sporal,
aranjarea (mbinarea) conidioIorilor si a sporangioIorilor, Iorma, culoarea,
mrimea si eventuala septare a sporului;
- Prezenta si tipul unor structuri particulare: rizoizi, stoloni, scleroti, celule Hlle.
Pentru studiul morIologiei microscopice a Iungilor obtinuti n urma
nsmntrii prelevatelor se utilizeaz mai multe tehnici, n Iunctie de tipul acestora:
- levuri - Irotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen etc.) sau preparate
extemporanee (ntre lam si lamel) cu tus de India sau lactoIenol si albastru
de anilin;
- Iungi Iilamentosi preparate extemporanee cu lactoIenol si albastru de anilin,
preparate cu band adeziv sau preparate obtinute prin cultivare pe lam.

5.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin (levuri)

Este o metod mai rar utilizat pentru studierea morIologiei levurilor, ns este
uneori preIerat pentru expeditivitatea sa, mai ales n cazul levurilor din primoculturi.
n acest scop, pe o lam de microscopie curat si degresat, se depune o pictur de
lactoIenol cu albastru de anilin n care se va suspensiona apoi cu miscri ct mai Iine,
cu ajutorul unei anse microbiologice, o mic portiune din colonia levuric de studiat.
Suspensia astIel obtinut se acoper cu o lamel si se examineaz la microscop (x10,
x20, x40, x100 dup caz). Pentru reusita preparatului, este important cantitatea de
material biologic prelevat din colonie; aceasta trebuie s Iie cat mai redus, astIel nct
densitatea suspensiei obtinute s Iie mic.

E
5
Tehnici de examinare microscopic
a Iungilor din culturi
Tehnici de examinare microscopic a Iungilor din culturi

110

5.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin
(fungi filamentoi)

Se obtine parcurgnd urmtoarele etape:
- se depune o pictur de lactoIenol pe o lam de microscopie, curat si degresat;
- se preleveaz cu ajutorul unui ac sau al unei microspatule metalice un Iragment
de dimensiuni milimetrice din colonia de examinat, se etaleaz n pictura de
lactoIenol si se dilacereaz cu miscri Iine miceliul, utiliznd dou ace;
- se acoper cu o lamel curat, se preseaz, se nclzeste usor la Ilacr pentru a
obtine un Iilm ct mai Iin de lactoIenol si a elimina eventualele bule de gaz;
- se examineaz la microscop, Iolosind succesiv obiectivele x10, x20, x40,
eventual x100;
- n cazul n care se doreste pstrarea preparatului n lamotec, pentru conservarea
sa, acesta se poate luta (Iig. nr. 5-1 ve:i Anexa).

5.3. Preparatul extemporaneu cu band adeziv

n acest caz, prelevarea structurilor Iungice de la nivelul coloniilor se Iace cu
ajutorul unui Iragment de band adeziv transparent (tip scotch), cu dimensiuni de
1,0-1,5 x 2,5-3,0 cm, cu care se amprenteaz marginea coloniei. Acest Iragment de
band adeziv se lipeste apoi pe o lam pe care s-a etalat n prealabil o pictur de
lactoIenol (Iig. nr. 5-2). Optional, peste band se pot etala o nou pictur de lactoIenol
si apoi o lamel, n vederea ameliorrii vizibilittii la examinarea microscopic
ulterioar. n cazul coloniilor care sporuleaz intens (Aspergillus spp., Penicillium spp.
etc.) se recomand pregtirea a 2-3 preparate cu band adeziv din acelasi loc prima
va Iixa sporii, iar urmtoarele vor recolta conidioIorii, astIel nct prin examinarea
ulterioar s Iie surprinse toate aspectele utile ncadrrii taxonomice.

Fig. nr. 5-2. Obtinerea preparatului extemporaneu cu band adeziv

180
scotch
lam
lamel

111
!
"
#
$
%
&
'
(
'

-

O alt variant a tehnicii presupune etalarea Iragmentului de band adeziv pe
o lamel cu o pictur de lactoIenol, adugarea peste aceasta a unei alte picturi de
colorant si apoi a lamei de microscopie. Preparatul se roteste apoi cu 180 pentru a-l
aduce n pozitia de examinare. Prin acest procedeu, claritatea imaginii este maxim
datorit Iaptului c ntre ochiul examinatorului si structurile Iungice se interpune doar
lamela, nu si banda scotch ca n tehnicile anterioare.

5.4. Lutarea preparatelor extemporanee

Etansarea sau lutarea preparatelor este necesar pentru a evita evaporarea
lichidului de montare. SupraIetele lamei si lamelei, pe care se aplic substantele de
etansare, trebuie s Iie perIect uscate si curate. Substantele Iolosite la etansare nu
trebuie s reactioneze cu lichidul de montare, s Iie impermeabile, elastice, persisente
si s adere de supraIata sticlei.

Rinile naturale
Se pot Iolosi pentru lutare coloIoniul, guma arabic, serlacul, balsamul de
Canada.

Lacul pentru unghii este cel mai utilizat la etansarea preparatelor deoarece se
usuc repede si se manipuleaz usor. Se ndeprteaz excesul de lichid de montare de
pe lam si lamel, prin stergere cu un Iragment de hrtie de Iiltru. Cu un penson se
aplic un strat subtire de lac peste marginea lamelei si supraIata lamei din imediata
apropiere a acesteia. Se las s se usuce, apoi se poate stoca.

Cimentul Thorner, cunoscut sub denumirea de ,Glyceel este Iormat din:
- ulei polimerizat .......................... 31,75 ml
- alcool metilic industrial ................ 4,76 ml
- acetat de butil ............................. 20,41 ml
- toluen (Ir sulI) ......................... 20,41 ml
Glyceelul este un lichid siropos, incolor, se usuc repede, Iormnd o pelicul
elastic, rezistent si care ader bine de sticl.

Amestecul de cear galben de albine i colofoniu
20 g cear de albine se topesc ntr-o capsul de portelan, apoi se adaug treptat
80 g coloIoniu si se nclzesc pn la topirea complet. Amestecul se aplic cu o
spatul pe marginile lamei si lamelei montate. nainte de Iiecare Iolosire, amestecul se
retopeste.

Amestecul de colofoniu i lanolin (60, respectiv 40)
Se omogenizeaz prin topire, apoi se distribuie n plci Petri si se las la
solidiIicare. n momentul Iolosirii, se licheIiaz cu ajutorul aplicatorului nclzit la
Ilacr. Se Ioloseste similar cu celelalte lichide de lutare.

Tehnici de examinare microscopic a Iungilor din culturi

112

1. Bazgan O (1999) - Diagnostic de laborator i igiena alimentelor de
origine animal; Ed. Moldogrup; Iasi.
Bucuresti.
Iasi.
Bucuresti.
6. Harris J (2000) - SaIe, low-distortion tape touch method Ior Iungal
mounts; 1 Clin Microbiol; 38(12):4683-4684.
fungi; 2
nd
Rovira i Virgili.

Petru Cazacu

113
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Petru Cazacu

ragmentele de tesut recoltate de la pacient n vederea diagnosticului trebuie
procesate n laboratorul de histopatologie pentru a obtine preparate
permanente care vor Ii examinate microscopic de ctre morIopatolog. Fragmentele de
tesut pot Ii recoltate prin biopsie, prin exerez chirurgical si prin autopsie. Procesarea
tesuturilor n vederea diagnosticului histopatologic presupune o suit de operatiuni si
tehnici care vor permite vizualizarea elementelor Iungice intratisulare si / sau a
leziunilor speciIice determinate de acestea.

.1. Obinerea probelor

Probele de tesut primite n laboratorul de histopatologie trebuie s Iie nsotite
de un Iormular de cerere a examenului de laborator n care vor Ii speciIicate datele
pacientului si istoricul bolii, precum si descrierea zonei de origine a Iragmentului de
tesut. Probelor primite li se va atribui un numr care va identiIica Iiecare prob pentru
Iiecare pacient. Acest numr va corespunde cu numrul de ordine din registrul
laboratorului.

.2. Examenul macroscopic

Examinarea macroscopic const n descrierea probelor, alegerea zonelor
relevante pentru diagnostic si introducerea lor (total sau partial) n mici casete din
plastic, unde vor sta pe toat durata procesrii initiale, pn n momentul includerii n
paraIin. Initial, casetele sunt plasate ntr-un Iixator.

.3. Fixarea

Fixarea are scopul de a conserva morIologia tesuturilor asa cum se prezint ea
n momentul recoltrii. Fixarea trebuie realizat ct mai curnd posibil dup prelevarea
probelor de tesut pentru a preveni autoliza. Nu exist un Iixator perIect, desi
Iormaldehida este considerat aproape un ,gold standard. Exist o varietate de
Iixatori, care se vor Iolosi n Iunctie de tipul de tesut.

F
6
Tehnici de histopatologie

114
Factorii care inIluenteaz procesul Iixrii:
-solutia-tampon;
-penetrarea;
-volumul piesei vs. volumul Iixatorului;
-temperatura;
-concentratia Iixatorului;
-intervalul de timp.

Fixarea trebuie realizat la un pH aproape de neutralitate, adic ntre 6 si 8.
Datorit hipoxiei tesuturilor, Iixatorul trebuie s aib capacitatea de a tampona
aciditatea acestora prevenind dehiscenta lizozomal si autoliza tisular consecutiv
acesteia. Aciditatea Iavorizeaz Iormarea de pigment hem - Iormol care apare colorat
n negru, prin depuneri polarizate n tesuturi. Solutiile-tampon includ IosIatul de sodiu,
bicarbonatul de sodiu, cocodilatul de sodiu si veronalul. Formolul comercial este o
solutie de Iormaldehid n tampon IosIat cu pH 7.
Penetrarea tesuturilor depinde de diIuzibilitatea Iiecrui Iixator. Formolul si
alcoolul penetreaz Ioarte bine, iar glutaraldehida Ioarte prost. Ceilalti Iixatori au un
grad intermediar de penetrabilitate tisular. O posibilitate de a rezolva acest
inconvenient este sectionarea ct mai Iin a tesuturilor (2-3 mm grosime), deoarece
penetrarea unei sectiuni subtiri va Ii mult mai rapid dect cea a unei sectiuni mai
groase.
Volumul de Iixator este de asemenea extrem de important. Acesta trebuie s Iie
n raport de 10:1 (Iixator-tesut). Se recomand schimbarea Iixatorului la diIerite
intervale de timp pentru a evita o eventual scdere a volumului acestuia. Agitarea
probelor n Iixator va intensiIica Iixarea.
Cresterea temperaturii, ca n cazul tuturor reactiilor chimice, va creste viteza de
Iixare, dar se va avea totusi n vedere s nu degradeze tesuturile. Formolul Iierbinte va
Iixa tesuturile mai repede si acesta este adesea primul pas n procesarea automatizat a
tesuturilor.
Concentratia Iixatorului va Ii cea mai redus concentratie activ, acest Iapt
reprezentnd si un avantaj economic. Formolul este cel mai activ la 10;
glutaraldehida este n general activ la concentratii de 0,25-4. Concentratiile prea
ridicate pot avea eIect advers asupra tesuturilor producnd arteIacte asemntoare cu
cele ale cresterii temperaturii Iixatorului.
De asemenea, Ioarte important este intervalul de timp recomandat pentru
mentinerea probelor n aIara Iixatorului. Dup Iixare, probele vor Ii prelucrate rapid
deoarece prin deshidratare se vor produce arteIacte. Tesuturile mentinute temporar n
aIara vasului cu Iixator, se vor umezi cu ser Iiziologic.
Tipul Iixatorului indicat este dat de tipul de tesut si de detaliile histologice care
urmeaz a Ii vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate tesuturile recoltate
chirurgical si necropsic, cnd se doreste obtinerea unor preparate colorate H-E.
Formolul este cel mai putin pretentios dintre toti Iixatorii atunci cnd conditiile de
Iixare nu sunt cele ideale, el dunnd aproape neglijabil tesutului respectiv. Pentru
Iixarea tesuturilor n vederea procesrii lor pentru diagnosticul histopatologic al
micozelor proIunde se Iolosesc Irecvent urmtorii Iixatori: solutia de Iormol 10
tamponat pH 6,8, Iixatorul Bouin si Iixatorul Hollande. Pentru Iixarea Irotiurilor
Petru Cazacu

115
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

citologice cu important n diagnosticul micologic se Iolosesc: metanolul absolut,
etanolul 90 si acidul cromic 5. Alcoolii sunt Iixatori rapizi si ieItini. Deoarece
Irotiurile nu sunt groase, acestea nu pun probleme de contractare si ntruct Irotiurile
nu sunt sectiuni, acestea nu prezint inconvenientul Iriabilittii. Alcoolii nu se
recomand pentru Iixarea Irotiurilor obtinute din Iluide biologice sau patologice.
Alturi de imersie, Iixarea Irotiurilor se poate realiza si prin pulverizarea
Iixatorului peste Irotiu. Fixatorii care se pulverizeaz sunt compusi dintr-un alcool care
Iixeaz celulele si paraIin care Iormeaz un strat protector subtire peste acestea
(Carbowax - contine polietilenglicol). Fixativii de pr (e.g. Diaphine Spray), cu un
continut ridicat de alcool si un minimum de lanolin sau ulei, sunt de asemenea Iixatori
eIicace. Distanta optim de pulverizare a Iixatorilor este de 25-30 cm. Fixarea cu
Iixatori aerosolizabili nu este recomandat pentru Irotiurile de snge sau a celor
executate din lichide hemoragice pentru c determin clumping eritrocitar (aglutinare).
ParaIinele si uleiurile din spray-urile Iixative de pr modiIic reactiile de colorare dac
nu sunt ndeprtate adecvat. AstIel, naintea colorrii, lamele trebuie mentinute peste
noapte n etanol 95 pentru a ndeprta Iixatorul de acoperire.

.3.1. Formol soluie 1" tamponat pH ,8

Scop
Este un Iixator larg utilizat, cu pH 6,8

Reactivi

FosIat de sodiu monobazic ........................... 4,0 mg
FosIat de sodiu dibazic ................................. 6,5 mg
Formaldehid 37 ..................................... 100,0 ml
Ap distilat ............................................... 900,0 ml

Se omogenizeaz, apoi se eticheteaz si se dateaz.
Atenie' Carcinogen.

Timpul de fixare
Fragmentele biopsice ar trebui Iixate timp de minim 1-4 ore. Un timp mai
ndelungat se recomand pentru piesele mai mari.

Tehnica fixrii
1. Piesele recoltate de chirurgi sunt pstrate n acest tip de Iixator;
2. Primele dou statii ale tuturor procesatoarelor de tesuturi contin Iormol 10;
3. Probele pot Ii pstrate n Iormol 10 indeIinit sau sunt transIerate n etanol
70.

Aote:
1. Se lucrea: intr-un spaiu ventilat. Se vor purta ochelari de protecie, mnui i halat.
2. Formaldehida este puternic iritant pentru ochi i piele. Este sensibili:ant (prin
contact) pentru piele i aparatul respirator. Este toxic prin ingestie i inhalare. Are

116
aciune coro:iv i carcinogen. Se etichetea: cu inscripia. ATENIE
FORMALDEHID'

.3.2. Fixatorul Bouin

Scop
Se utilizeaz pentru Iixarea pieselor biopsice; de asemenea este un mordantant
n diIerite tehnici de colorare.

Reactivi

Acid picric saturat .................................... 3000,0 ml
Formaldehid ........................................... 1000,0 ml
Acid acetic glacial ..................................... 200,0 ml

Atenie' Soluia este carcinogen, iritant i toxic.

Timpul de fixare
Probele biopsice de dimensiuni mici, 2-4 ore, iar probele de dimensiuni mari
pot rmne n Iixator pn la trei zile.

Tehnica fixrii
1. Tesuturile Iixate pot rmne n Iormol 10 sau etanol 70;
2. Se ndeprteaz acidul picric din tesut nainte de colorare prin:
a) splare cu ap de robinet;
b) tratare cu etanol 50;
c) sau solutie saturat de etanol 70 cu carbonat de litiu.

Aote:
1. Se lucrea: in spaii bine ventilate, se vor purta mnui, halat i ochelari de protecie.
Se evit contactul i inhalarea.
2. Acidul picric poate deveni explo:iv dac se usuc. Este toxic de contact.
3. Formaldehida este puternic iritant pentru ochi i piele. Este sensibili:ant prin contact,
pentru piele i aparatul respirator. Este toxic prin ingestie i inhalare. Are aciune
coro:iv i carcinogen. Se etichetea: cu inscripia. ATENIE FORMALDEHID'
4. Acidul acetic. aparatul respirator este organul int afectat. Este coro:iv.

.3.3. Fixatorul Hollande

Scop
Acest Iixator conIer o strlucire coloratiilor care utilizeaz hematoxilin -
eozin si reduce consistenta tesuturilor evitnd astIel obtinerea unor sectiuni casante.
Acidul picric lizeaz hematiile.

Petru Cazacu

117
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Reactivi

Acetat de cupru .............................................. 75 mg
Ap distilat ................................................ 3000 ml
Acid picric ................................................... 120 mg
Formaldehid ................................................ 300 ml
Acid acetic glacial .......................................... 45 ml

Se dizolv acetatul de cupru n ap Ir nclzire, apoi se adaug treptat acidul
picric. Se amestec pn se dizolv complet. Se adaug Iormaldehida si acidul acetic.
Se eticheteaz si se dateaz.
Atenie' Soluia este carcinogen, iritant i coro:iv.

Timpul de fixare
Probele de dimensiuni mici 2-4 ore, iar cele mai mari pn la 3 zile.

Tehnica fixrii
1. Probele biopsice sunt imersate imediat n Iixatorul Hollande, notndu-se timpul
pe recipient;
2. Cnd Iixarea este complet, proba de tesut se trece apoi n etanol 70;
3. Nu se permite ca probele Iixate cu Hollande s vin n contact cu solutia de
Iormol 10, deoarece poate determina aparitia unui precipitat albastru.

Aote:
1. Se lucrea: intr-un spaiu bine ventilat sau in nia chimic, se poart mnui, halat i
ochelari de protecie. Se evit contactul i inhalarea.
2. Acidul picric poate exploda dac se usuc. Este toxic prin expunere cutanat.
3. Formaldehida este iritant puternic pentru ochi i piele. Este toxic prin ingestie i
inhalare. Afectea: aparatul respirator. Este coro:iv i carcinogen. Se etichetea:
cu. ATENIE FORMALDEHID '
4. Acidul acetic afectea: aparatul respirator. Este coro:iv.

.4. Procesarea esuturilor

Odat ce tesuturile au Iost Iixate, ele trebuie nglobate ntr-o Iorm care s
permit manipularea si eIectuarea unor sectiuni seriate Ioarte subtiri. Cel mai Iolosit
material n acest scop este paraIina. Tesuturile incluse n paraIin pot Ii sectionate n
Iragmente cu grosimi de la 3 la 10 !m, uzual 4-6 !m. Tehnica de includere n paraIin
a tesuturilor Iixate se numeste ,Procesarea esuturilor. Pasii principali ai acestui
proces sunt deshidratarea si clariIicarea.
- Tesuturile Iixate umed (n solutii apoase) nu pot Ii direct impregnate cu paraIin
deoarece aceasta nu este miscibil cu apa. De aceea, tesuturile trebuie
deshidratate. Aceasta se realizeaz de obicei cu ajutorul unor solutii de etanol,
de concentratii crescnde - 70, 95 si 100. Uneori, primul pas este tratarea
cu un amestec Iormat din Iormol si etanol. Pot Ii utilizati si alti deshidratanti,
dar unii prezint dezavantaje majore: acetona desi este Ioarte rapid, este
inIlamabil, de aceea se poate utiliza doar pentru mici seturi de tesuturi

118
procesate manual. Dioxanul poate Ii utilizat Ir clariIicare, dar vaporii si sunt
toxici.
- Etapa urmtoare se numeste ,ClariIicare si const n ndeprtarea
deshidratantului cu o substant care va Ii miscibil cu mediul de includere
(adic cu paraIina). Xilenul este agentul de clariIicare cel mai Irecvent
ntrebuintat. Toluenul clariIic bine si este mult mai tolerant Iat de cantittile
mici de ap rmase n tesuturi, dar este de 3 ori mai costisitor dect xilenul.
CloroIormul actioneaz lent si este periculos pentru cei care-l manipuleaz.
Salicilatul de metil este rar utilizat datorit costului ridicat.

n Iinal, proba de tesut este impregnat cu agentul de includere care aproape
ntotdeauna este paraIina. ParaIina poate avea diIerite puncte de topire, ceea ce permite
obtinerea unor grade variate de duritate. Un produs numit Paraplast contine un adaos
de plastiIianti care Iac ca blocurile de paraIin s Iie mai usor de procesat de ctre
tehnologi n vederea sectionrii. Pentru a asigura o mai bun penetrare a tesutului de
ctre agentul de includere, n interiorul procesatorului de tesuturi se poate crea o
presiune negativ cu ajutorul unei pompe de vacuum.
Procedurile de mai sus sunt aproape ntotdeauna automatizate pentru un volum
mare de probe ce trebuie procesate de rutin. Automatizarea const ntr-un dispozitiv
circular, programabil, care imerseaz succesiv probele de tesut n diIerite bi de
deshidratare si clariIicare, dup o scal de timp presetat.
Dup procesarea probelor n procesatorul de tesuturi, acestea sunt nc n
casete, urmnd a Ii incluse n paraIin lichid. Procesul este Ioarte important deoarece
tesuturile trebuie orientate corespunztor n momentul includerii pentru a asigura
obtinerea ulterioar a unor sectiuni de calitate. O alternativ pentru includerea n
paraIin este Iolosirea diverselor mase plastice care permit obtinerea unor sectiuni
subtiri. AstIel de mase plastice sunt meta-acrilatul de metil, meta-acrilatul glicol si
eponul. Materialele plastice necesit reactivi speciali pentru deshidratare si clariIicare,
de obicei Ioarte costisitori. Pentru sectionarea acestor blocuri este necesar un microtom
special. Blocurile trebuie s Iie mici, tehnica pretndu-se de exemplu pentru biopsiile
hepatice sau cerebrale.

.4.1. Deshidratarea

1. Dac piesa de tesut a Iost imersat n ap dup scoaterea din Iixator, ea trebuie
s Iie transIerat n etanol 30, 1-2 ore;
2. Etanol 50, 1-2 ore;
5. Etanol 100, 1-2 ore;
6. Etanol 100, 1-2 ore;
7. Tesuturile deshidratate vor Ii pregtite pentru clariIicare, adic se scot piesele
histologice din etanol si se trec n toluen.

Aot: Etanolul absolut produce o deshidratare foarte rapid a esuturilor. pentru a avea
aceast siguran, flacoanele cu etanol se vor pstra inchise etan.
Petru Cazacu

119
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

.4.2. Clarificarea

1. Se transIer piesele histologice din etanol 100 ntr-un amestec constituit din o
parte toluen si 3 prti etanol 100, 1 or;
2. Se trec apoi n amestecul de 1:1 toluen-etanol 100, 1 or;
3. Apoi n amestecul de 3:1 toluen-etanol 100, 1 or;
4. Toluen 100, 3-4 ore;
5. Toluen 100, 3-4 ore;
6. Dup clariIicare, tesuturile sunt gata pentru impregnare cu paraIin.

Aot:
Agenii de clarificare, cum ar fi etanolul, trebuie introdui lent pentru a preveni
degradarea esuturilor. Aceste amestecuri de toluen i etanol permit in plus i indeprtarea
oricror urme de ap. Flacoanele se inchid etan. Apariia unei turbiditi a soluiilor sau a
unor pete opace pe esuturi sunt indicatori siguri ai deshidratrii incomplete. In ambele ca:uri,
lamele cu seciuni se reintroduc in etanol 100 pentru o deshidratare suplimentar, apoi se
continu cu bile de toluen - etanol. Insuficienta indeprtare a alcoolului va determina
imposibilitatea impregnrii cu parafin in :onele respective ale esutului, ceea ce va produce
dificulti de secionare. Actualmente, exist numeroi ageni de clarificare disponibili
comercial (Histosolve, Americlear etc.) care sunt mai puin toxici i au un miros mai plcut
decat toluenul sau xilenul.

.4.3. Impregnarea cu parafin

1. Se transIer tesuturile din agentul de clariIicare ntr-un nou Ilacon cu un amestec
prenclzit de paraIin - toluen 1:2. Se acoper etans Ilaconul si se las la
etuv, la 45C, timp de 1 or;
2. Se transIer tesuturile ntr-un al doilea Ilacon care contine un amestec nclzit de
paraIin - toluen 1:2. Se acoper Ilaconul si se metine la 45C timp de 1 or;
3. Se transIer piesele apoi n prima baie de paraIin pur. Aceasta este un Ilacon
cu paraIin lichid care se mentine n etuv setnd o temperatur superioar
punctului de topire al paraIinei. Piesele se mentin n aceast baie timp de 2-4
ore;
4. Se transIer piesele n a doua baie de paraIin, unde se mentin nc 2-4 ore;
5. Se includ (pasul urmtor).

Aot:
O alternativ a metodei de impregnare.
1. Se introduce piesa histologic in agentul clarificator proaspt i apoi se adaug
parafin pan la saturarea clarificatorului. Se las in repaus 1 or la 30C 60C,
apoi se mai adaug parafin i se las peste noapte. In dimineaa urmtoare, se
adaug parafin pan cand amestecul conine aproximativ 75 parafin, apoi se
menine 1 or la 45C.
2. Se trece piesa apoi direct prin 2 bi de parafin pur.


120
.4.4. Includerea

1. Se lubriIiaz interiorul barelor Leuckart, al sticlelor de ceas sau al diIeritelor
tvite metalice cu un amestec de etanol 60 - glicerin 9:1. Acesta va preveni
aderarea paraIinei la recipientul ce constituie Iorma de turnare a blocurilor.
Acest lucru nu este necesar dac se utilizeaz matrite de hrtie.
2. Se rceste matrita prin mentinerea prtii sale inIerioare pe gheat cteva minute.
3. Se scoate recipientul cu paraIin topit din etuv si se vars n matrit.
4. Se introduce tesutul n matrit cu ajutorul unei pense hemostatice nclzite si se
veriIic dac piesa a Iost orientat corect. n Iunctie de dimensiunea matritei,
se pot include simultan mai multe piese (1-10) obtinndu-se un numr
echivalent de blocuri. Etichetele din hrtie sunt atasate n paraIin, la marginea
matritei, n dreptul piesei histologice.

.4.5. Secionarea

Dup includere, tesuturile trebuie sectionate pentru a putea Ii etalate pe lam.
Sectionarea se realizeaz cu un microtom, la grosimi de 4-6 m. Pentru realizarea unor
sectiuni corespunztoare este necesar ca lama cutitului s Iie perIect ascutit; se preIer
utilizarea cutitelor single use. Odat obtinute sectiunile, acestea se depun pe supraIata
apei dintr-o baie de ap prenclzit, Iapt care ajut la deplierea panglicii sectionate.
Fragmentele de panglic sunt recuperate cu ajutorul unei lame de microscopie. Lama
cu sectiunea etalat este apoi plasat ntr-o etuv timp de aproximativ 15 minute pentru
ca, prin topirea partial a paraIinei, sectiunile s adere mai bine la lam.

1. Blocurile de paraIin cu piesele incluse, se sectioneaz rectangular pe lng
tesut, lsndu-se ctiva milimetri de paraIin pe Iiecare Iat a blocului;
2. Urmeaz o nou Iasonare a blocului cu ajutorul unei lame de ras. Se va ndeprta
mai nti paraIina de pe Iata de sectionare la microtom, ct mai aproape de
tesutul din bloc. Urmtoarele sectionri se vor Iace pe celelalte Iete ale
blocului, n asa Iel ca acestea s devin paralele una cu alta. Se va lsa
suIicient paraIin la baza blocului astIel nct acesta s poat Ii atasat la
obiectiv. Tierea bazei blocului se va Iace n asa Iel nct ea s Iie paralel cu
Iata de sectionare;
3. Se ataseaz blocul de paraIin la discul obiectiv. Se depune un mic Iragment de
paraIin pe discul obiectiv si se modeleaz cu o spatul nclzit prin Ilambare
la un bec de gaz. Se las ca stratul de paraIin s se rceasc, apoi se pregtesc
cele dou supraIete (baza blocului si supraIata obiectului) n vederea aderrii
prin topirea stratului superIicial de paraIin (se ating cele dou supraIete timp
de cteva secunde cu spatula bine nclzit). Se preseaz apoi blocul de
paraIin pe discul obiectiv si se las n repaus pentru solidiIicare;
4. Se Iixeaz discul obiectiv cu blocul atasat n mandrina microtomului, se
ajusteaz pozitia n asa Iel ca blocul s Iie paralel cu tisul cutitului de
microtom;
5. Ajustarea unghiului cutitului se Iace prin ncercri succesive. Unghiul diedru
Iormat de Iata cutitului si Iata blocului trebuie s Iie de aproximativ 5 grade.
Petru Cazacu

121
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

6. Se alege grosimea de sectionare (4-6 !m pentru majoritatea tesuturilor) si se
ncepe sectionarea cu vitez moderat. Se manevreaz panglica rezultat prin
nlntuirea sectiunilor cu ajutorul unui penson, preIerabil din pr de cmil. Se
sectioneaz aproximativ 25 de sectiuni, apoi se ndeprteaz panglica de la
cutit si se depune pe o coal de hrtie colorat n negru.
7. Dac se vor practica sectiuni mai subtiri (de 2-4 !m) sau dac tesutul este dur, se
pot obtine rezultate superioare prin rcirea blocului de paraIin si a cutitului. n
acest scop, se ia un cub de gheat si se las s se topeasc n asa Iel ca gheata
topit s se preling peste partea Irontal a blocului. Alt cub de gheat se pune
pe Iata anterioar a cutitului. Se va Iolosi un material absorbant (lavete,
prosoape de hrtie) pentru colectarea apei rezultate n urma topirii ghetii si
rcirii piesei / cutitului. Cuburile de gheat se vor mentine cca. 1-2 minute,
apoi se ndeprteaz orice pictur de ap de pe cutit si bloc cu ajutorul unui
prosop de hrtie si se ncepe sectionarea. Rcirea blocului de paraIin se poate
Iace si prin mentinerea sa timp de cteva minute n congelator.
8. Microtomul si cutitul de sectionare se toaleteaz dup Iiecare utilizare. Niciodat
nu se las Iixat cutitul n microtom cnd nu este Iolosit.

.4.. Etalarea seciunilor

Albumina Baker

Albus de ou .................................................. 50,0 ml
Ap distilat ................................................. 50,0 ml
NaCl ................................................................. 0,5 g
p-hidroxibenzoat de sodiu
1
............................... 0,1g

n apa distilat nclzit la 90C, se dizolv clorura de sodiu si conservantul (p-
hidroxibenzoatul de sodiu). Dup rcire se adaug albusul, se centriIugheaz pn cnd
supernatantul devine clar, se Iiltreaz prin vat ori se las n repaus pn cnd stratul
superior devine clar. Ca adeziv, se utilizeaz numai supernatantul clar. Pentru o bun
conservare, acesta se pstreaz la Irigider.

Albumina Baker diluat

Albumin Baker........................................ 4 picturi
Ap distilat .................................................... 10 ml

1
Moldex, Tegosept, timolul sau salicilatul de sodiu se pot Iolosi ca substituenti ai
p-hidroxibenzoatului de sodiu.

122
Albumina Baker comercial

Adeziv ........................................................... 2,5 ml
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Solutia trebuie nclzit si corect omogenizat nainte de utilizare. Se va
prepara extemporaneu.

Mod de lucru

Procedura 1
1. Se degreseaz lamele si lamelele prin imersia lor n alcool acidiIiat 95 (1 ml
HCl concentrat la 100 ml etanol) si se sterg energic cu o pnz curat din
bumbac. Sectiunile nu vor adera la lam dac acestea nu sunt complet
degresate. Se evit contactul degetelor cu supraIata lamelor;
2. Se plaseaz sectiunile pe lam cu ajutorul unor ace de disociere. Acestea vor
pluti la adugarea ctorva picturi de albumin diluat la marginea panglicii.
Ne vom asigura c sectiunile au Iost montate pe Iata lamei cu captul mat si nu
pe Iata cu captul lucios;
3. Sectiunile se plaseaz pe lama nclzit cu ajutorul unei platine nclzitoare
reglat la o temperatur cu aproximativ 5-10C sub punctul de topire al
paraIinei;
4. Sectiunile se vor ntinde si netezi rapid. Excesul de Iluid se va ndeprta prin
nclinarea lamei, mentinnd panglica cu sectiuni cu ajutorul unor ace de
disociere;
5. Se transIer lamele cu sectiuni n etuv, la 30-40C si se las peste noapte pentru
a se asigura deshidratarea complet a acestora.

Procedura 2
1. Se utilizeaz lame degresate ca mai sus; se adaug o pictur de adeziv nediluat
pe lam si se etaleaz cu pulpa degetului mic prin miscri circulare. Excesul se
sterge cu pulpa degetului inelar. Degetele vor Ii degresate n prealabil cu alcool
acidiIiat 95 ;
2. Se plaseaz una sau dou sectiuni pe supraIata apei ntr-o baie reglat la o
temperatur cu 5-10C sub punctul de topire a paraIinei. Se las cteva minute
pentru ntinderea sectiunilor;
3. Se introduce lama n baie, sub sectiune si Iolosind un ac de disociere se prinde si
se Iixeaz Iragmentul de panglic pe lam, dup care aceasta se scoate din
baie; Iragmentul de panglic va adera la lam;
4. Se las lamele cu sectiuni n etuv peste noapte pentru uscare. Dezlipirea
sectiunilor de pe lam n timpul colorrii este o problem Irecvent ntlnit la
histotehnicienii debutanti. Dac lamele sunt curate si sectiunile sunt
ntotdeauna uscate complet dup etalare, aceste incidente vor Ii rare.

Petru Cazacu

123
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

.4.7. Colorarea

Procesul de includere n paraIin, necesar sectionrii pieselor, trebuie urmat de
deparaIinarea sectiunilor etalate pe lam astIel nct s Iie permis penetrarea
colorantilor hidrosolubili. Lamele cu sectiuni se deparaIineaz prin trecerea succesiv
n bi de xilen (sau nlocuitori), alcool etilic si ap. Tehnicile de colorare sunt diverse
si se selecteaz n Iunctie de abilitatea lor de a colora diIerite componente celulare si
tesuturi. Coloratia de rutin este Hematoxilin-Eosin (HE), celelalte metode de
colorare sunt ,coloratii speciale, pentru c se utilizeaz n situatii speciIice conIorm
nevoilor de diagnostic.

.4.7.1. Coloraia Hemalaun - Eozin

Scop
Aceasta este cea mai comun coloratie histologic si histopatologic utilizat
pentru studierea de ansamblu a citoarhitectonicii tisulare. n cazul micozelor proIunde,
permite aprecierea leziunilor la nivel microscopic, ns are o valoare diagnostic redus
pentru decelarea speciei implicate. Hemalaun-Eozin este o metod de colorare de
rutin, dar care necesit o executie atent pentru a asigura obtinerea unor rezultate
corecte si uniIorme. Evidentiaz elemente Iungice apartinnd genurilor Pneumocvstis,
Blastomvces, Coccidioides, dar si unele aspecte din cromomicoze, rinosporidioz,
adiaspiromicoz, ca si Ienomenul Splendore-Hoeppli sau culoarea original a Iungilor
dematiacei (pigmentati).

Fixator
Se obtin rezultate excelente, comparabile, Iolosind diversi Iixatori

Tehnica de secionare
Sectiuni cu grosimea de 4-5 !m, din Iragmente de tesut incluse n paraIin

Echipament
Sticlrie de laborator, timer de laborator

Reactivi

Hematoxilina Ehrlich (1886)

Hematoxilin ...................................................... 2 g
Etanol 95 ................................................... 100 ml
Ap distilat .................................................. 100 ml
Glicerin ....................................................... 100 ml
Alaun de potasiu, n exces ..................... aprox. 20 g
Acid acetic ...................................................... 10 ml


124
Hematoxilina Harris

Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Etanol 95 .................................................. 50,0 ml
Alaun de potasiu .......................................... 100,0 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml
Oxid de mercur ................................................ 2,5 g

Se dizolv hematoxilina n etanol si alaunul n ap cu ajutorul cldurii. Se
amestec cele dou solutii. Amestecul se aduce la Iierbere ct mai repede posibil si
apoi se adaug oxidul de mercur. Se continu Iierberea pn cnd apare o culoare
purpurie intens (rosu-nchis, violet), apoi se introduce recipientul ntr-o baie de ap
pn la rcirea complet. Dup rcire, se adaug 40 ml de acid acetic glacial. Cnd se
observ o strlucire aurie a solutiei, aceasta se Iiltreaz. Dac aceast strlucire nu
apare, coloratia va Ii de calitate inIerioar.

Hematoxilina Mayer

Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Ap distilat ............................................... 700,0 ml
Alaun de potasiu ............................................ 50,0 g
Glicerin .................................................... 300,0 ml
Iodat de sodiu .................................................. 0,4 g
Acid acetic glacial ....................................... 20,0 ml

Se dizolv hematoxilina ntr-o cantitate redus de ap, apoi alaunul n
aproximativ 650 ml de ap distilat. Se amestec cele dou solutii si se completeaz
pn la 700 ml. Se adaug iodatul de sodiu n solutie, dup care aceasta se nclzeste
blnd pentru a grbi oxidarea hematoxilinei. Solutia se las la rcit pentru o jumtate
de or, se Iiltreaz, apoi se adaug acidul acetic glacial si glicerina. Solutia poate Ii
utilizat imediat si este stabil 2-3 luni.

Solutia de albstrire Scott

SulIat de magneziu ........................................ 20,0 g
Bicarbonat de sodiu ......................................... 3,5 g
Ap distilat ................................................ 1000 ml

Se dizolv srurile separat, apoi se amestec solutiile si se adaug un cristal de
timol.

Alcool - acid 0,5

Etanol 70 ................................................ 100,0 ml
HCl ................................................................ 0,5 ml
sau
Petru Cazacu

125
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

HCl ................................................................... 3 ml
Etanol 95 ..................................................... 97 ml

Se adaug acidul clorhidric peste alcool.

Eozin Y - alcoolic, solutia stoc

Eosin Y, solubil n ap si alcool ................... 2,5 g
Ap distilat ............................................... 500,0 ml
Acid clorhidric concentrat ................................ 4 ml

Se dizolv eozina (tetrabromIluorescein de sodiu) n ap si se adaug treptat
acidul clorhidric care se va combina cu sodiul. Precipitatul rezultat este Iorma acid a
tetrabromIluoresceinei, insolubil n ap. Se las precipitatul s se stabilizeze si apoi se
decanteaz supernatantul Iluid. Se adaug aproximativ 500 ml ap distilat peste
precipitat si se agit pn cnd colorantul se aIl complet n suspensie, apoi se las n
repaus pentru sedimentare. Se repet procesul de splare de aproximativ 6 ori, pn
dispar toate urmele de ioni de sodiu si clor. Se Iiltreaz si apoi se las hrtia de Iiltru
mpreun cu colorantul la uscat n etuv (max. 60C). Ponderea pulberii de colorant
dizolvate n 100 ml de etanol 95 este de 0,5 g. Se Iiltreaz si se stocheaz ntr-un
recipient transparent cu dop rodat. Tratnd eozina astIel, se va obtine un colorant cu o
putere tinctorial mai mare, colorantul Iiind mult mai stabil n alcool.
Pentru utilizare se dilueaz 1:5 n etanol 95.

Tehnica de colorare

1. DeparaIinarea si hidratarea cu ap distilat a sectiunilor;
2. Se imerseaz preparatele ntr-una din solutiile de hematoxilin, un timp variabil,
conIorm variantei de hematoxilin ntrebuintate: 5-10 minute pentru
hematoxilina Mayer, 5 minute pentru hematoxilina Harris si 15 minute pentru
hematoxilina Ehrlich;
3. Se spal lamele cu ap distilat, apoi se introduc n solutia de albstrire Scott
pentru 1-2 minute. Se cltesc n ap distilat si se examineaz la microscop.
Sectiunea trebuie s Iie supracolorat;
4. Se diIerentiaz cu alcool - acid 0,5 pentru a ndeprta excesul de colorant din
Iond, lsnd colorati numai nucleii;
5. Cltire cu ap distilat si apoi reimersare n solutia de albstrire Scott pentru
nc 1-2 minute;
6. Se reexamineaz la microscop si dac sectiunile sunt suIicient decolorate se
continu cu pasul urmtor. Dac sectiunea este insuIicient diIerentiat atunci se
repet pasii 4 si 5;
7. Splare n ap de robinet 5-10 minute;
8. Colorare cu eozin alcoolic (se las lamele cu sectiuni n solutia de colorare
pn cnd acestea sunt usor supracolorate);
9. Cltire n 2 bi de etanol 95;
10. DiIerentiere n alcool absolut pn cnd se obtine o coloratie optim;

126
11. Deshidratare ntr-o baie de alcool absolut;
12. ClariIicare n cteva bi de xilol;
13. Montarea lamelelor cu balsam de Canada, Xam sau alte medii neutre de
montare care sunt miscibile cu xilolul.

Rezultatul colorrii
Nucleii albastru purpuriu
Hematiile rosu
Celulele musculare roz intens
Fibrele de colagen roz

Aot:
Pentru reali:area coloraiei Hematoxilin-Eo:in, se poate folosi oricare din soluiile
de hematoxilin pre:entate la reactivi.

.4.7.2. Albastru Alcian pH 2,5 - pentru mucopolizaharide acide

Scop
Coloratia cu Albastru Alcian pune n evident mucopolizaharidele acide. Se
poate utiliza pentru evidentierea mucopolizaharidelor capsulare la Crvptococcus
neoformans. Este o metod destul de eIicient pentru diIerentierea criptococilor
capsulati tipici de alti patogeni veast-like, cu Iorm si dimensiuni similare.

Fixator
Formol 10 tamponat pH 6,8, Bouin sau Hollande

Sectiuni cu grosimea de 4 !m, din Iragmente de tesut incluse n paraIin

Echipamente
Pahare Berzelius, pH-metru, cuptor cu microunde, microscop

Reactivi

Acid acetic 3

Acid acetic glacial ............................................ 3 ml
Ap distilat ............................................. ad 100 ml


Solutie Albastru Alcian

Acid acetic glacial 3 .................................. 100 ml
Albastru Alcian 8GX .......................................... 1 g

Petru Cazacu

127
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Se amestec cele dou ingrediente apoi se ajusteaz pH-ul la 2,5, utiliznd acid
acetic. Se Iiltreaz si se adaug un cristal de timol, apoi se eticheteaz si se dateaz.
Solutia este stabil 2 pn la 6 luni.
Atenie' Conine acid, evitai contactul i inhalarea.

Nuclear Iast red (Kernechtrot)

SulIat de aluminiu...25,0 g
Ap distilat.......500 ml
Nuclear Iast red.0,5 g

Se dizolv sulIatul de aluminiu n ap. Se adug Nuclear Iast red si se dizolv
prin nclzirea solutiei. Se Iiltreaz si se adaug un cristal de timol. Solutia este stabil
timp de 1 an.
Atenie' Iritant - se va evita contactul i inhalarea.

Tehnica de colorare
1. Se hidrateaz preparatul n ap distilat;
2. Se introduc lamele n acid acetic 3, 3 minute;
3. Se introduc preparatele n solutia de albastru Alcian, la cuptorul cu microunde
(la o treapt superioar), timp de 30 secunde; n metoda conventional, solutia
de albastru Alcian cu lamele, se mentine la temperatura camerei, timp de 30
minute;
4. Se spal lamele cu ap de robinet 2 minute si apoi se cltesc n ap distilat;
5. Se coloreaz cu Nuclear Iast red, 5 minute, apoi se spal n ap de robinet;
6. Se deshidrateaz, se clariIic si se monteaz lamela.

Rezultatul colorrii
Mucopolizaharidele acide: albastru
Nucleii: roz-rosiatic

Aote:
1. Nu este o coloraie specific pentru capsula C. neoformans, deoarece s-a constatat c
peretele altor fungi ca Blastomvces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis sau
Rhinosporidium seeberi pot fixa colorantul, ins, datorit diferenelor morfologice
certe, aceti fungi nu pot fi confundai cu C. neoformans.
2. Albastru Alcian face parte din grupul coloranilor ba:ici polivaleni solubili in ap.
Culoarea albastr se datorea: pre:enei cuprului in moleculele sale. Soluia de acid
acetic glacial 3 (pH 2,5) i soluia de albastru Alcian colorea: mucopoli:aharidele
acide sulfatate i carboxilate dar i sialomucinele (glicoproteinele) sulfatate i
carboxilate. Se crede c srurile formea: legturi cu gruprile acide ale aci:ilor
mucopoli:aharidici.
3. Pentru siguran se poart mnui, ochelari de protecie i halat. Se adug acidul
acetic in ap. Coloraia se face sub hot. Se evit contactul i inhalarea coloranilor.
Acidul acetic este iritant pentru aparatul respirator. Este de asemenea coro:iv.


128
.4.7.3. Coloraia Bauer

Scop
Coloratia Bauer pune n evident glicogenul, diIerite mucosubstante si Iungii

Fixator
Este recomandat Iormolul 10 tamponat pH 6,8, dar se pot Iolosi si alti
Iixatori. Majoritatea coloratiilor tricromice necesit ca Iixatori acidul picric sau clorura
mercuric. Formolul Iixeaz bine tesuturile, dar pentru obtinerea unei coloratii de
calitate superioar se recomand o Iixare secundar cu lichidul Bouin.


Echipament
Sticlrie de laborator, microscop

Reactivi

Reactiv SchiII de Tomasi

Fucsin bazic .................................................... 1 g
Ap distilat ............................................. ad 200 ml
MetabisulIit de potasiu ....................................... 1 g
Acid clorhidric 1N .......................................... 20 ml
Crbune activat (pulbere) ................................... 2 g

Se nclzeste apa distilat pn la Iierbere ntr-un Ilacon Erlenmeyer de
dimensiuni mari. Se ndeprteaz Ilaconul de pe sursa de cldur si se adaug imediat
colorantul, cu grij, pentru c dizolvarea are loc cu eIervescent. Se agit pn la
dizolvarea colorantului. Se las solutia s se rceasc pn la 50C, apoi se adaug
acidul clorhidric si se omogenizeaz. Se las n continuare solutia la rcit pn la 25C,
moment n care se adaug metabisulIitul de potasiu. Se omogenizeaz din nou. Se
nchide Ilaconul cu dop etans si se pstreaz la ntuneric pentru 1-2 zile. Dac solutia
nu este limpede, se adaug crbune activat si se agit pentru aproximativ un minut. Se
Iiltreaz solutia. Se pstreaz la temperatura de reIrigerare, ntr-un Ilacon de sticl
nchis etans. MetabisulIitul de potasiu se poate nlocui cu cel de sodiu, Ir a diminua
calitatea coloratiei. ConIorm Indexului Merck, bisulIitul de sodiu comercial este
realizat predominant din metabisulIit de sodiu. Solutia Iinal trebuie s Iie incolor sau
de culoarea chihlimbarului, dar Ioarte pal. Solutiile brune vor colora adesea Ioarte
prost. De obicei, acestea au Iost realizate dintr-o Iucsin bazic care contine o cantitate
inIerioar de pararosanilin.

Petru Cazacu

129
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Hemalaun Mayer (hematoxilina Mayer, Langeron 1942)

Hematoxilin ................................................... 1,0 g
Alaun de potasiu ............................................ 50,0 g
Ap distilat ........................................... ad 1000 ml
Iodat de sodiu .................................................. 0,2 g
Acid citric ........................................................ 1,0 g
Cloral hidrat ................................................... 50,0 g

Se dizolv hematoxilina n apa distilat, se nclzeste apoi si se Iierbe timp de
5 minute. Se ndeprteaz recipientul de pe sursa de cldur si se adaug iodatul de
sodiu, apoi se las solutia pentru maturare timp de 10 minute. Se adaug treptat restul
substantelor n ordinea dat, dizolvnd-o pe Iiecare nainte de adugarea celeilalte. Se
eticheteaz cu initialele denumirii si data preparrii, solutia Iiind stabil timp de un an.
Atenie' Se va evita contactul i inhalarea.

Acid cromic

Trioxid de crom .................................................. 4 g
Ap distilat ............................................. ad 100 ml

Acid sulIuros

MetabisulIit de sodiu 10 sol. apoas ............. 6 ml
Acid clorhidric 1N ........................................... 5 ml
Ap distilat ............................................. ad 100 ml

Tehnica de colorare
1. Se introduc sectiunile n ap distilat dup ce au Iost trecute prin bile cu xilen si
etanol;
2. Se oxideaz n acid cromic timp de 40-60 minute;
3. Se cltesc lamele n ap de robinet, apoi n ap distilat;
4. Se introduc preparatele n reactivul SchiII pentru 15 minute;
5. Apoi n acid sulIuros, 3 bi a cte 2 minute Iiecare;
7. Supracolorare cu hemalaun, 1 minut;
8. Se deshidrateaz cu etanol;
9. Se Iace clariIicarea cu xilen si montare cu balsam de Canada.

Rezultatul colorrii
Glicogenul si mucosubstantele rosii
Fungii rosii
Nucleii celulelor somatice albastri


130
Aote:
1. In practica modern se evit cltirea cu acid sulfuros, splarea reali:andu-se cu
cantiti mari de ap de robinet.
2. Mucinele, de obicei, nu sunt aa de intens colorate ca in coloraia PAS.
3. Meninerea in acid cromic un timp mai indelungat va reduce colorarea datorit
continurii oxidrii aldehidelor.

.4.7.4. Coloraia Chick

Scop
Prin aceast coloratie se pot pune n evident Iungii, la microscopul cu
Iluorescent.

Fixator
Formol 10 tamponat pH 6,8


Echipament
Sticlrie de laborator, microtom, microscop cu Iluorescent

Reactivi

Hematoxilin Ieric Weigert

Solutia stoc A

Hematoxilin ................................................... 5,0 g
Etanol 95 ................................................ 500,0 ml

Se omogenizeaz, apoi se eticheteaz, notnd initialele denumirii si data
preparrii. Solutia este stabil 1 an.
Atenie' Inflamabil, se evit contactul i inhalarea.

Solutia stoc B

Clorur Ieric 29 ...................................... 20,0 ml
Ap distilat ............................................... 475,0 ml
Acid clorhidric ............................................... 5,0 ml

Se omogenizeaz, apoi se eticheteaz, notnd initialele si data preparrii.
Atenie' Coro:iv, se evit contactul i inhalarea.

Petru Cazacu

131
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Solutia de lucru

Solutia stoc A .............................................. 25,0 ml
Solutia stoc B ............................................... 25,0 ml

Se omogenizeaz ct mai atent. Solutia va rmne stabil 3-4 zile.

Acridin orange

Acridin orange ............................................... 0,1 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Tehnica de colorare
1. Dup trecerea lamelor cu sectiuni prin xilen si etanol, acestea se introduc ntr-o
baie de ap;
2. Hematoxilin Ieric Weigert (solutia de lucru), 5 minute;
4. Se introduc lamele n solutia de acridin orange, 2 minute;
5. Se spal n ap de robinet, 30 minute;
6. Se deshidrateaz, clariIic si monteaz ntr-o rsin neIluorescent.

Rezultatul colorrii
Se utilizeaz Iiltrele BG 12 si OG 4 (galben) si / sau OG 5 (portocaliu).
Fungii vor apare colorati Iluorescent verde-rosu.

Aot:
Aceasta este cea mai indicat metod de screening.

.4.7.5. Coloraia Cridley

Scop
Coloratia Gridley pune n evident Iungii viabili din preparatele histologice
obtinute din tesuturi incluse n paraIin si sectionate. Nu este satisIctoare pentru
detectia elementelor Iungice neviabile, degradate.

Fixator
Tesuturile se Iixeaz n solutie tamponat de Iormol 10 , cu pH 6,8


Echipament
Sticlrie de laborator, microscop


132
Reactivi

Reactiv SchiII de Tomasi
Vezi coloratia Bauer (6.4.7.3).

Fucsin-aldehid

Fucsin bazic .................................................... 1 g
Paraldehid, proaspt ...................................... 1 ml
Acid clorhidric concentrat ................................ 1 ml
Etanol 70 .................................................. 200 ml

Se dizolv colorantul n etanol, apoi se adaug paraldehida si acidul clorhidric.
Se las la temperatura camerei timp de 48-72 ore, pentru maturare. Se pstreaz la
Irigider, solutia Iiind stabil 2-3 luni.

Acid cromic

Trioxid de crom .................................................. 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml

Decolorant

MetabisulIit de sodiu .......................................... 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml

Metanil yellow (Galben metanil)

Metanil yellow .................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 400 ml
Acid acetic glacial .................................... 2 picturi

Tehnica de colorare
1. Dup trecerea sectiunilor prin bile cu xilen si etanol, acestea se imerseaz n
ap distilat;
2. Se introduc apoi n acid cromic, 1 minut;
4. Se trateaz cu solutie de metabisulIit, 1 minut;
6. Se cltesc cu ap distilat;
7. Se introduc lamele n reactivul SchiII, 20 minute;
9. Se cltesc cu etanol 70;
10. Colorare cu Iucsin-aldehid, 30 minute;
11. Se cltesc cu etanol 95;
Petru Cazacu

133
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

13. Supracolorare cu metanil yellow, 1 minut;
14. Se cltesc cu ap distilat;
15. Preparatele colorate se deshidrateaz, clariIic si apoi se monteaz lamela cu
balsam de Canada.

Rezultatul colorrii
Fungii culoare purpurie
Fondul galben

Aot:
La pasul 2, meninerea in soluia de acid cromic 10 pentru 10 minute va da re:ultate similare.

.4.7.. Coloraia Schmorl

Scop
Aceast metod de colorare pune n evident Iungii din preparatele histologice
obtinute din Iragmente de tesut incluse n paraIin si sectionate la microtom.

Fixator
Fragmentele de tesut se Iixeaz n solutie de Iormol 10 tamponat 6,8, dar se
pot Iolosi si alti Iixatori.


Echipament
Sticlrie de laborator

Reactivi

Decolorantul Mallory

Solutia A

Permanganat de potasiu ...................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 100 ml

Solutia B

Acid sulIuric ..................................................... 1 ml
Ap distilat .................................................. 100 ml


134
Solutia C

Acid oxalic ......................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 100 ml

Solutia de lucru

Solutia A ..................................................... 1 volum
Solutia B ..................................................... 1 volum

Solutie de acid periodic

Se Ioloseste solutia de acid periodic 0,5 (McManus) din coloratia PAS sau
urmtoarea variant:

Iodat de sodiu ..................................................... 1 g
Acid nitric 0,5 solutie apoas .................... 100 ml

Ambele solutii de acid periodic dau aceleasi rezultate.

Acetanilin

Anilin ............................................................ 10 ml
Acid acetic glacial .......................................... 90 ml

Tiosemicarbazid

Tiosemicarbazid ................................................ 1 g
Ap distilat .................................................. 100 ml

Solutie Schmorl

Clorur Ieric, sol. apoas 1 ........................ 30 ml
Ferocianur de potasiu, sol. apoas 1 ............ 4 ml
Ap distilat ...................................................... 6 ml

Soluia trebuie s fie proaspt, preparandu-se inainte de utili:are. Nu se
reutili:ea:'

Tehnica de colorare
1. Dup trecerea sectiunilor prin bile cu xilen si etanol, acestea se introduc
n ap distilat;
2. Urmeaz decolorarea Mallory:
Lamele cu sectiuni etalate se introduc n solutia de lucru timp de
10 minute;
Se cltesc apoi n ap distilat;
Petru Cazacu

135
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Se introduc n solutia C cteva minute, pn cnd se observ
decolorarea sectiunilor;
Se cltesc cu ap;
Se continu cu urmtorii timpi ai tehnicii de colorare;
4. Se oxideaz n acid periodic pentru 10-20 minute;
5. Se cltesc cu ap de robinet;
6. Tratare cu acetanilin, 30 minute;
8. Se readuc preparatele n acid periodic pentru nc 20 minute;
10. Se introduc lamele n tiosemicarbazid, 10 minute;
11. Se spal cu ap de robinet pentru ndeprtarea tuturor urmelor de
tiosemicarbazid;
12. Se introduc lamele n solutia proaspt Schmorl, 10 minute;
14. Optional, supracolorare cu nuclear Iast red sau eosin;
16. Se deshidrateaz cu etanol, se clariIic cu xilen si se monteaz lamelele
cu balsam de Canada.

Rezultatul colorrii
Fungii albastri
Nucleii celulelor somatice rosii
Fondul roz

Aote:
1. Este binecunoscut faptul c a:idele metalelor pot fi explo:ive. Totui, tiosemicarba:ida
nu este o simpl a:id metalic.
2. Formula tiosemicarba:idei este H
2
NNHCSNH
2
. Grupul hidra:inic (H
2
NNH-) combinat
cu orice aldehid generea: prin acidul periodic o reacie de oxidare. Gruparea
tiocarbamilic (-CSNH
2
) este un agent reductor mult mai puternic decat sunt
aldehidele i reduce rapid fericianida la ferocianid, cu formarea imediat a unui
depo:it de albastru de Prusia.
3. Decolorantul Mallorv clarific uor fondul, imbuntind contrastul. El poate produce i
unele aldehide care vor fi indeprtate in etapa 6.

.4.7.7. Coloraia Fontana-Masson

Scop
Aceast metod de colorare se utilizeaz pentru a evidentia melanina si
substantele de tip melanin-like. Melanina este un pigment negru-brun prezent n mod
normal n pr, piele, retin, iris, n unele zone ale sistemului nervos central, dar si n
peretele unor Iungi (Crvptococcus spp., Iungii dematiacei). De asemenea, coloratia
poate Ii utilizat pentru detectia intratisular a Iungilor apartinnd genurilor
Aspergillus, Candida sau zygomicetelor.


136
Fixator
Fragmentele de tesut se Iixeaz n solutie de Iormol 10 tamponat 6,8


Echipamente
Sticlrie de laborator, cuptor cu microunde (sau etuv reglat la 60C),
microscop

Reactivi

Argint amoniacal, solutie stoc

Nitrat de argint 10 .................................... 25,0 ml

Se adaug hidroxid de amoniu, pictur cu pictur, pn la precipitarea
solutiei si apoi limpezirea ei;

Se adaug apoi nitrat de agint 10 ............... 1,0 ml

Solutia va deveni putin tulbure si se va lsa n repaus pentru 4-24 ore. Dup
utilizare, solutia se arunc.
Atenie' Soluie coro:iv - se va evita contactul i inhalarea.

Argint amoniacal, solutie de lucru

Argint amoniacal, solutie stoc ..................... 12,5 ml
Ap distilat ................................................. 37,5 ml

Se pipeteaz tot argintul amoniacal, lsndu-se apoi la decantat. Se Iiltreaz.
Solutia nu se reutilizeaz.
Atenie' Soluie coro:iv - se va evita contactul i inhalarea.

Nitrat de argint 10

Nitrat de argint ............................................... 20,0 g
Ap distilat .......................................... ad 200,0 ml

Se agit amestecul pentru solubilizare. Solutia se pstreaz la Irigider ntr-un
recipient brun de sticl, tratat n prealabil cu amestec sulIo-cromic. Solutia se poate
Iolosi timp de 6 luni de la preparare.

Petru Cazacu

137
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Clorur de aur 0,1

Clorur de aur 1, solutie stoc ...................... 5,0 ml
Ap distilat ................................................. 45,0 ml


TiosulIat de sodiu 5

TiosulIat de sodiu ........................................... 200 g
Ap distilat .................................................... ad 4 l

Se dizolv tiosulIatul de sodiu n apa distilat. Se pstreaz ntr-un recipient cu
volum corespunztor, care se eticheteaz si dateaz.

Nuclear Iast red (Kernechtrot)

SulIat de aluminiu......................................... 25, 0 g
Ap distilat .............................................. 500, 0 ml
Nuclear-Iast red ............................................... 0,5 g

Se dizolv sulIatul de aluminiu n apa distilat, apoi nucler Iast red-ul, Iolosind
cldura (Iierbere pentru 5 minute). Se las solutia s se rceasc, apoi se Iiltreaz,
adugndu-se cteva cristale de timol pentru conservare. Se eticheteaz si se dateaz.
Solutia este stabil timp de 1 an.
Atenie' Iritant, se evit contactul i inhalarea.

Tehnica de colorare
1. Sectiunile etalate se vor deparaIina si hidrata cu ap distilat;
2. Solutia de lucru de argint amoniacal cu lamele se introduce n cuptorul cu
microunde (la o treapt superioar), timp de 2 minute. Se veriIic lamele la
microscop pentru a observa dac intensitatea impregnrii este adecvat, iar
dac este necesar, solutia cu lame se va plasa suplimentar n cuptorul cu
microunde timp de cteva secunde (n metoda conventional solutia se
introduce n etuv la 60C pentru 1 or);
3. Cltire n ap distilat;
4. Clorur de aur 0,1, 10 minute;
6. TiosulIat de sodiu 5, 5 minute;
7. Se spal lamele n ap de robinet si apoi se cltesc n ap distilat;
8. Nuclear Iast red, 5 minute;
9. Se spal n ap de robinet;
10. Se deshidrateaz, clariIic si se acoper cu lamel.


138
Rezultatul colorrii
Melanina si celulele argentaIine negre (Iig. nr. 6-1 ve:i Anexa)
Nucleii celulelor somatice - rosii

Aote:
1. O reacie argentafin po:itiv este dat de faptul c celulele absorb argintul pe care il
reduc apoi la o form metalic vi:ibil, fr afutorul unui agent reductor.
2. Atenie' Se vor purta in timpul lucrului mnui, ochelari de protecie i halat de
laborator. Se evit contactul i inhalarea. Nitratul de argint. este iritant sever pentru
piele i ochi, oxidant, ingestia va produce un puternic disconfort gastrointestinal,
posibil carcinogen. Soluia de argint amoniacal poate fi explo:iv, in ca: de vrsare
accidental, se va indeprta folosind un volum mare de ap de robinet. Hidroxidul de
amoniu. este un iritant puternic pentru ochi i aparatul respirator. Se manipulea: in
ni chimic. Tiosulfatul de sodiu. toxic prin ingestie, iritant gastric, tegumentar,
ocular i respirator.

.4.7.8. Coloraia Cridley fluorescent

Scop
Aceast metod de colorare pune n evident Iungii din preparatele histologice,
prin microscopia cu Iluorescent

Fixator
Fragmentele de tesut se Iixeaz n Iormol 10 tamponat pH 6,8, dar se pot
Iolosi si alti Iixatori.

Sectiuni din Iragmente de tesut incluse n paraIin, cu grosimea de 5 !m

Echipamente
Sticlrie de laborator, microscop cu Iluorescent

Reactivi

Reactiv SchiII Iluorescent

AcriIlavin .......................................................... 1 g
Ap distilat .................................................. 200 ml
MetabisulIit de potasiu ....................................... 2 g
Acid clorhidric 1N .......................................... 20 ml

Se dizolv colorantul n ap si se omogenizeaz. Se adaug apoi succesiv
acidul clorhidric si metabisulIitul, omogenizndu-se ct mai atent. Se nchide etans
recipientul, se las la ntuneric pentru 48 ore, apoi se Iiltreaz. Acridina orange poate Ii
de asemenea utilizat la prepararea acestei solutii.

Petru Cazacu

139
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Solutia A

Trioxid de crom ................................................ 50 g
Ap distilat .................................................. 500 ml

Solutia B

SulIit de sodiu ..................................................... 5 g
Ap distilat .................................................. 500 ml

Solutie C

Etanol 70 ................................................... 495 ml
Acid clorhidric .................................................. 5 ml

Tehnica de colorare
1. Dup trecerea sectiunilor prin bile cu xilen si etanol, acestea se introduc n ap
distilat;
2. Imersare n solutia A, 10 minute;
3. Cltire cu ap de robinet;
4. Decolorare n solutia B, 1 minut;
5. Splare cu ap de robinet;
7. Tratare cu reactiv SchiII Iluorescent, 20 minute;
9. Imersare n solutia C, dou bi, cte 5 minute Iiecare;
10. Splare cu ap distilat;
11. n Iinal, preparatele se deshidrateaz, clariIic si apoi se monteaz lamela cu o
rsin neIluorescent.

Rezultatul colorrii
Pentru examinare se utilizeaz Iiltrele BG 12, OG 4 (galben) si / sau OG 5
(portocaliu). Fungii apar colorati n galben-Iluorescent cu acriIlavin si verde-rosu cu
acridin orange.

Aote:
1. Aceast metod de colorare este utili:at frecvent ca metod de screening.
2. Dac fluorescena fondului este prea intens pentru a distinge fungii, aceasta se poate
atenua prin tratare cu hemalaun (1 minut) sau cu soluie apoas 0,5 de
permanganat de potasiu (1 minut). Aceast atenuare se reali:ea: inainte de
deshidratarea final, cu precauie pentru a nu reduce excesiv fluorescena fungilor.

.4.7.9. Coloraia Comori-Crocott (Methenamine silver - modificat)

Scop
Evidentierea Iungilor n tesuturi. Este o coloratie superioar pentru depistarea
Iilamentelor aspergilare, a chistilor de Pneumocvstis, a elementelor tipice pentru

140
Candida, zygomicete, Crvptococcus, Histoplasma, Blastomvces, Paracoccidioides,
Coccidioides, Laca:ia loboi, Penicillium marneffei, Rinosporidium, Emmonsia. De
asemenea, evidentiaz actinomicetele, Nocardia si algele de tipul Prototheca sau
Chlorela.

Fixator
Fragmentele de tesut se Iixeaz n solutie de Iormol 10 tamponat pH 6,8.

Sectiuni din Iragmente de tesut incluse n paraIin, cu grosimea de 4-5 !m

Echipamente
Sticlrie de laborator, cuptor cu microunde

Reactivi

Acid cromic 2

Trioxid de crom ............................................. 10,0 g
Ap distilat ............................................. ad 500 ml

Dup solubilizare, solutia se transIer ntr-un recipient etans n care poate Ii
stocat pn la 6 luni.
Atenie' Acidul este coro:iv, posibil carcinogen, se evit contactul i
inhalarea.

MetabisulIit de sodiu 1

MetabisulIit de sodiu ....................................... 5,0 g
Ap distilat ............................................. ad 500 ml


Borax 5

Borat de sodiu .................................................. 5,0 g
Ap distilat ............................................. ad 100 ml


Metenamin-argint, solutia stoc

Metenamin 3
(hexametilentetraamin) ........................... .100,0 ml
Nitrat de argint 5 ........................................ 5,0 ml

Petru Cazacu

141
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Cele dou solutii se amestec ntr-un recipient brun de sticl, tratat n prealabil
cu amestec sulIo-cromic, cltit n ap distilat si uscat. Solutia este stabil 3 luni, la
temperaturi de reIrigerare.
Atenie' Coro:iv, posibil carcinogen.

Clorur de aur 0,5

Clorur de aur .................................................. 0,5 g
Ap distilat .......................................... ad 100,0 ml

Se pstreaz la Irigider, n recipiente tratate cu amestec sulIo-cromic, cltite si
uscate. Solutia este stabil 1 an.

Verde luminos 0,2

Verde luminos (Light Green SF yellow) ......... 0,2 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml
Acid acetic glacial ......................................... 0,2 ml


Tehnica de colorare
1. DeparaIinare si hidratare n ap distilat;
2. Lamele cu sectiuni se transIer n solutia de acid cromic 2 si se mentin n
cuptorul cu microunde la o treapt superioar, 45 secunde; alternativ, se pot
mentine si 5 minute, dar la o treapt inIerioar (n metoda conventional,
acidul cromic 5, se mentine pe baie de ap la 60C, timp de 1 or);
3. Se spal lamele n ap de robinet si apoi se cltesc cu ap distilat;
4. Urmeaz tratarea cu solutia de metabisulIit de sodiu 1, 1 minut, la temperatura
camerei;
5. Splare n ap de robinet, apoi cltire n 3 bi succesive de ap distilat;
6. Se introduc lamele cu sectiuni n solutia de metenamin-argint, la cuptorul cu
microunde (treapt superioar), 70 secunde: tesuturile trebuie s capete o
coloratie brun, asemntoare hrtiei de ambalaj. Se agit preparatul n solutia
Iierbinte (n metoda conventional solutia de argint se nclzeste pe baie de ap
la 60C, pentru o or sau pn la aparitia unei coloratii brune);
7. Cltire n 2 bi de ap distilat;
8. Tratare cu clorur de aur 5 , 1 minut sau pn la aparitia unei coloratii gri;
9. Splare n ap distilat;
10. TiosulIat de sodiu 5, 3 minute;
11. Splare n ap de robinet si cltire n ap distilat;
12. Verde luminos 1 minut;
14. Preparatele se deshidrateaz, se clariIic si apoi se monteaz lamela.

142
Rezultatul colorrii
Fungii brun-negri
Fondul verde

Aote:
1. Componentele mucopoli:aharidice ale peretelui celulelor fungice sunt oxidate pan la
punerea in libertate a gruprilor aldehidice. Gruprile aldehidice reacionea:
ulterior cu nitratul de argint, reducandu-l pan la argint metalic.
2. In ca:ul in care culoarea acidului cromic virea: in brun, atunci este necesar ca acesta
s fie schimbat. De notat c soluia 2 este mai indicat decat cea 5, utili:at in
metoda convenional, acidul cromic mai concentrat provocand desprinderea esutului
de pe lam cand se utili:ea: tehnica cu microunde.
3.Cand culoarea fungilor nu virea: in negru, se verific prospeimea acidului cromic, a
metabisulfitului de sodiu i a boraxului.
4. Cand lucrm cu soluia de nitrat de argint, dac se observ o tulburare a sa sau un
aspect de 'oglind` pe faa paharului, atunci este necesar prepararea unei noi
soluii.
5. Pentru protecie se vor purta mnui, ochelari de protecie i halat de laborator. Se
respect modul de lucru cu soluiile sub hot. Se evit contactul i inhalarea. Acidul
cromic. coro:iv pentru piele i mucoase. Foarte toxic' Organul int este rinichiul.
Carcinogen. Metabisulfitul de sodiu. toxic prin ingestie, poate cau:a gastroenterite.
Iritant pentru piele, ochi i mucoase. Nitratul de argint. iritant sever pentru piele i
ochi, oxidant. Posibil carcinogen. Tiosulfatul de sodiu. toxic prin ingestie, poate irita
stomacul. Iritant pentru piele, ochi i tractul respirator. Jerde luminos SF vellow.
posibil carcinogen.
6. Exist in comer i kit-ul de colorare GMS Staining Kit, produs de Jentana, nr. catalog
860-007 , informaii. Europe Jentana Medical Svstems, S.A. Parc dInnovation BP
30 144 Rue G. de Kavsersberg F - 67404 Illkirch Cedex France 33 (0) 3 90 40 52 00.

.4.7.1. Coloraia fluorescent cu acid periodic Schiff
(PAS - fluorescent)

Scop
Aceast metod de colorare pune n evident Iungii, prin microscopia cu
Iluorescent.

Fixator
Fragmentele de tesut sunt Iixate n solutie de Iormol 10 tamponat pH 6,8,
dar pot Ii Iolositi si alti Iixatori.

Sectiuni din Iragmente de tesut incluse n paraIin, cu grosimea de 5 !m

Echipamente
Sticlrie de laborator, microscop cu Iluorescent

Petru Cazacu

143
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Reactivi

Solutie de acid periodic
Vezi coloratia Schmorl (6.4.7.6.).

Reactiv SchiII Iluorescent
Vezi coloratia Gridley Iluorescent (6.4.7.8.).

Alcool - acid 5
Vezi coloratia hemalaun eozin (6.4.7.1.).

Tehnica de colorare
1. Se deparaIineaz si se hidrateaz sectiunile;
2. Tratare cu acid periodic, 10 minute;
3. Splare n ap de robinet;
5. Tratare cu reactiv SchiII Iluorescent, 20 minute;
6. Splare n ap de robinet;
7. Alcool - acid, dou bi a 5 minute Iiecare;
9. Lamele cu sectiuni se deshidrateaz, se clariIic si apoi se monteaz lamela cu o
rsin neIluorescent.

Rezultatul colorrii
Se utilizeaz Iiltrele BG 12, OG 4 (galben) si / sau OG 5 (portocaliu). Fungii
apar colorati n galben-Iluorescent cu acriIlavin si verde-rosu cu acridin orange.

Aote:
1. Unele formaiuni fluorescente vor apare colorate in rou sau ro: la coloraia PAS.
2. Dac fluorescena fondului este prea intens pentru a distinge fungii, aceasta se poate
atenua prin tratare cu hematoxilin 1 minut sau cu soluie apoas 0,5 de
permanganat de potasiu 1 minut. Fluorescena se atenuea: inaintea deshidratrii
finale. Aceasta atenuare a fluorescenei de fond trebuie s se fac cu precauie pentru
a nu reduce fluorescena fungilor.

.4.7.11. Coloraia cu acid periodic Schiff

Scop
Coloratia cu acid periodic SchiII (engl. Periodic Acid SchiII, PAS) se poate
utiliza pentru colorarea Iungilor din preparatele histologice.

Fixator
Probele de tesut sunt Iixate n solutie Iormol 10 tamponat pH 6,8, dar se pot
utiliza si alti Iixatori (ns glutaraldehida trebuie evitat).

Sectiuni din Iragmente de tesut incluse n paraIin cu grosimea de 4-5 !m

144

Echipamente

Reactivi

Acid periodic 0,5 , dup McManus

Acid periodic ................................................... 0,5 g
Ap distilat ............................................... 100,0 ml

Dup completa solubilizare a acidului periodic, solutia se eticheteaz cu data
preparrii si initialele denumirii. Solutia este stabil 1 an.
Atenie' Se va evita contactul i inhalarea.

Reactivul SchiII (Lillie, la rece)

Fucsin bazic .............................................. 10, 0 g
MetabisulIit de sodiu ..................................... 18,0 g
Ap distilat ............................................. 1000,0 ml
Acid clorhidric ............................................. 10,0 ml

Se adaug Iucsina si metabisulIitul n acidul clorhidric. Se agit solutia timp de
2 ore, apoi se mentine la ntuneric, la temperaturi de 8-10C. Solutia devine limpede,
de culoare brun-deschis pn la galben-deschis. A doua zi se adaug:
Crbune activat (pulbere) ................................ 5,0 g

Se omogenizeaz 1-2 minute, apoi se Iiltreaz prin hrtie de Iiltru Whatman nr.
2 ntr-un cilindru gradat de 1000 ml. Hrtia de Iiltru se va nlocui Irecvent. Se readuce
volumul la 1000 ml cu ap distilat. Solutia Iinal trebuie s Iie incolor sau de
culoarea chihlimbarului, dar Ioarte pal. Solutiile brune vor produce Irecvent coloratii
necorespunztoare. De obicei, aceste solutii au Iost preparate cu Iucsin bazic ce
contine o cantitate mic de pararosanilin. Se pstreaz la Irigider, solutia Iiind stabil
timp de 6 luni. La prepararea reactivului se vor purta mnusi, ochelari de protectie,
masc si halat de protectie. Se lucreaz sub hot, recipientul cu reactiv se pstreaz
acoperit, iar solutiile de preparare n nisa chimic.
Atenie' Reactivul este carcinogen i corosiv, se evit inhalarea. Acidul
clorhidric este caustic, se va utili:a cu atenie'

Petru Cazacu

145
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Hematoxilina Gill

Hematoxilin ................................................... 4,0 g
SulIat de aluminiu.......................................... 70,4 g
Ap distilat .............................................. 750,0 ml
Etilenglicol ................................................ 250,0 ml
Iodat de sodiu ................................................. 4,0 g
Acid acetic glacial ....................................... 20,0 ml

Se amestec etilenglicolul cu apa distilat, se adaug hematoxilina, iodatul de
sodiu, apoi sulIatul de aluminiu si acidul acetic glacial. Se agit o or la temperatura
camerei. Se Iiltreaz nainte de utilizare. Solutia poate Ii utilizat imediat si este stabil
pentru aproximativ un an. Hematoxilina trebuie s Iie anhidr; dac este hidratat
(C
16
H
14
O
6
x 3H
2
O) se utilizeaz o cantitate de 4,72 g.

Tehnica de colorare
1. DeparaIinarea si hidratarea sectiunilor cu ap distilat;
2. Se introduc apoi lamele n acid periodic 0,5 , timp de 5 minute;
4. Se introduc lamele cu sectiuni n reactivul SchiII, la cuptorul cu microunde
(treapt superioar), pentru 45-60 secunde; preparatul va cpta o culoare
magenta (n metoda conventional, reactivul SchiII se mentine la temperatura
camerei, timp de 30 minute);
5. Se spal continuu n ap de robinet, timp de 5 minute;
6. Tratare cu hematoxilin, timp de 3 minute;
7. Se spal n ap de robinet, apoi n ap distilat;
8. Se deshidrateaz n alcool, se clariIic si se monteaz lamela.

Rezultatul colorrii
Glicogenul si Iungii: magenta (Iig. nr. 6-2 ve:i Anexa)
Nucleii celulelor somatice: albastri

Aote:
1. Pentru a verifica calitatea reactivului Schiff, se adaug in 10 ml de formaldehid cateva
picturi de reactiv Schiff, culoarea trebuie s vire:e imediat in rou-purpuriu.
2. Dac in timpul pstrrii la frigider a reactivului culoarea acestuia virea: in ro:,
reactivul Schiff se inlocuiete.
3. Dac se observ un precipitat alb in recipientul cu reactiv Schiff, acesta se poate
redi:olva prin incl:irea uoar a rectivului i agitarea soluiei.

.4.7.12. Coloraia Ziehl - Aeelsen

Scop
Aceast coloratie este utilizat pentru evidentierea bacteriilor din genul
Mvcobacterium, diIerentierea Iilamentelor de Nocardia (Ziehl pozitive) si actinomicete

146
(Ziehl negative). De asemenea, se pot pune n evident elemente Iungice caracteristice
speciilor de Histoplasma si Blastomvces.

Fixator
Fragmentele de tesut se Iixeaz n solutie de Iormol 10 tamponat pH 6,8.

Sectiuni din Iragmente de tesut incluse n paraIin, cu grosimea de 4-5 !m

Echipamente

Reactivi

Fenol-Fucsin Ziehl - Neelsen

Fucsin bazic ................................................. 2,5 g
Ap distilat ............................................... 250,0 ml
Etanol absolut ............................................. 25,0 ml
Cristale de Ienol topite ................................. 12,5 ml

Se omogenizeaz, se Iiltreaz si se pstreaz ntr-un recipient brun de sticl.
Acesta se eticheteaz cu data preparrii si cu timpul de stabilitate al solutiei (cca. 1 an).
Atenie' Carcinogen i toxic.

Alcool - acid 1

Acid clorhidric ................................................ 10 ml
Etanol 70 .................................................. 990 ml

Se omogenizeaz si se eticheteaz cu data preparrii si timpul de stabilitate al
solutiei (1 an).
Atenie' Coro:iv.

Albastru de metilen, solutia stoc

Albastru de metilen .......................................... 0,7 g
Ap distilat ................................................. 50,0 ml

Se omogenizeaz, se Iiltreaz si se pstreaz ntr-un recipient etans. Se
eticheteaz mentionndu-se data preparrii si perioada de stabilitate a solutiei (1 an).

Albastru de metilen, solutia de lucru

Albastru de metilen sol. stoc ............................ 5 ml
Ap distilat .................................................... 45 ml
Petru Cazacu

147
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Solutia se pstreaz ntr-un recipient de sticl, Iiind stabil timp de 2 luni. Se
va evita contactul si inhalarea.

Tehnica de colorare
1. DeparaIinare, apoi hidratare cu ap distilat a sectiunilor etalate pe lame;
2. Lamele se introduc n solutia de Ienol-Iucsin, care apoi se mentine n cuptorul
cu microunde (treapt intermediar), 45 secunde. Lamele se vor lsa n solutia
Iierbinte timp de nc 5 minute. Solutia se Iiltreaz o dat pe sptmn;
3. n metoda conventional, preparatele se mentin la etuv, la 60C timp de 1 or;
5. Tratare cu alcool - acid 1 pn la aparitia culorii roz-deschis, persistente;
6. Splare cu ap de robinet, 5 minute;
8. Albastru de metil, solutie de lucru, 30 secunde;
9. Cltire cu ap de robinet;
10. Se deshidrateaz, se clariIic si se monteaz lamela cu balsam de Canada.

Rezultatul colorrii
Structurile acido-rezistente rosii strlucitoare
Fondul albastru

Aote:
1. Componenta lipoidic a bacteriilor acido-re:istente se colorea: cu fenol-fucsin,
re:istent la decolorarea cu acid diluat.
2. Se utili:ea: filtre ,Millipore
TM
` pentru filtrarea apei necesare in procesul colorrii.
3. In timpul preparrii soluiilor se vor purta mnui, ochelari de protecie i halat. Se
evit contactul i inhalarea soluiilor.
4. Fucsina ba:ic este carcinogen.
5. Acidul clorhidric. iritant puternic pentru piele, ochi i aparatul respirator.

.4.7.13. Reactivi suplimentari

Amestec sulfo-cromic (pentru tratarea sticlriei)

Scop
Curtarea sticlriei utilizate la colorare si pentru proceduri care necesit
sticlrie perIect igienizat.

Echipamente
Balon de 4000 ml, agitator magnetic, un recipient de sticl cu volum de 6-7
litri, cu capac


148
Reactivi

Solutie acid de curtare

Bicromat de potasiu ....................................... 400 g
Ap distilat ................................................ 4000 ml
Acid sulIuric ................................................. 400 ml

Se dizolv bicromatul de potasiu n ap. Se toarn solutia ntr-un recipient de
6-7 litri, apoi se adaug ncet acidul sulIuric. Solutia se pstreaz pn cnd culoarea sa
devine maro-nchis (depinde de Irecventa utilizrii). Se eticheteaz si se dateaz.

Solutie acid de splare a sticlriei 1,5

Ap distilat .................................................. 985 ml
Acid clorhidric ................................................ 15 ml

Se omogenizeaz si se eticheteaz.

Aote:
Pentru protecie se vor utili:a mnui, ochelari i halat. Acidul sulfuric. vaporii sunt
toxici, nu se inhalea:. Afectea: pielea, aparatul respirator, reproductor i esuturile fetale.
Este iritant pentru piele, ochi i aparatul respirator. Acidul sulfuric concentrat se adaug lent
in ap i soluii apoase, nu invers. Bicromatul de potasiu. toxic prin inhalare i ingestie.
Afectea: sistemul reproductor i esuturile fetale. Coro:iv pentru piele, ochi i mucoase.
Acidul clorhidric. puternic iritant pentru piele, ochi i aparatul respirator. Este coro:iv.

.5. Montarea

Montarea presupune n prealabil deshidratarea si clariIicarea sectiunilor.
nainte de introducerea lamelor cu sectiuni n prima baie de etanol, acestea se
usuc prin compresare usoar cu hrtie de Iiltru pe ambele Iete. De asemenea, lamele
se sterg pe verso cu un tiIon curat pentru a ndeprta resturile de colorant.
Urmeaz deshidratarea:

1. Etanol 95 , 5 minute;
4. Etanol 100, 5 minute;
5. Toluen, 10 minute.

Dac sectiunile nu sunt complet deshidratate, la introducerea lor n toluen va
apare o turbiditate albicioas. Aceasta va limita conservabilitatea preparatelor.

Petru Cazacu

149
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.

Medii de montare

Balsamul de Canada

Este o rsin a coniIerului Abies balsamea, dizolvat n proportie de 55 n
xilol. Prin nvechire capt o coloratie glbuie, iar unele coloratii nu se conserv
corespunztor (ex. coloratiile cu Iucsin acid, verde luminos).

D.P.X.

Distiren 80 ..................................................... 10,0 g
DibutilItalat ................................................. 80,5 ml
Xilol ............................................................. 35,0 ml

Este o rsin sintetic, neutr chimic, ceea ce asigur o conservare mai bun a
colorantilor si implicit a preparatelor.

Pe lama umectat cu toluen se pune o pictur de mediu de montare, iar
deasupra se aseaz o lamel:
1. Lamela se aseaz pe lam, sub o incident de 45, atingnd cu marginea pictura
de mediu de montare; dup ce pictura s-a extins pe toat lungimea marginii ce
Iormeaz unghiul diedru cu lama, aceasta se preseaz usor (Iig. nr. 6-3 a, b).
Fig. nr. 6-3
Montarea sectiunilor n medii
anhidre (a, b) si
n medii apoase (c, d).

150
2. Se depune o pictur de mediu de montare pe lam si una pe lamel, apoi
acestea se aduc paralel pn cnd cele dou picturi conIlueaz, apoi lamela se
preseaz usor (Iig. nr. 6-3 c, d).
Se ndeprteaz eventualele bule de aer de sub lamel cu ajutorul unui ac de
disociere. Excesul de mediu de montare se ndeprteaz cu ajutorul unui tiIon mbibat
n benzen. Preparatele histologice astIel obtinute se mentin n pozitie orizontal la
temperatura camerei, timp de 2-3 zile.

.. Etichetarea i arhivarea

Dup ce excesul de mediu de montare este ndeprtat, preparatele se pot
eticheta. Preparatele histologice se eticheteaz prin plasarea unor mici etichete
dreptunghiulare adezive la captul mat al lamei. Aceast etichet se completeaz cu
ajutorul unei tus rezistent la ap si va cuprinde institutia, numrul din registrul
laboratorului, anul, natura probei, coloratia etc.
Arhivarea preparatelor histologice trebuie s asigure n primul rnd protejarea
acestora de socuri mecanice, de lumin, umiditate si praI. Dup interpretarea
microscopic si IotograIierea aspectelor morIologice de interes, preparatele histologice
permanente se arhiveaz n cutii speciale n ordinea seriei, n Iante numerotate, iar
cutiile se introduc n sertarele histotecii. Blocurile de paraIin se vor pstra n plicuri
care vor avea aceleasi nsemnri ca si preparatele si vor Ii depozitate n raIturile unor
dulapuri special destinate acestui scop. n registrul de laborator, n dreptul Iiecrei
probe de tesut, se vor nota datele de identiIicare si locul de depozitare al preparatelor
si blocurilor (Histoteca nr., sertarul nr, cutia nr.., rndul nr...). Ele se
mentin minim 10 ani si sunt reIcute cnd este necesar. Pentru o mai bun conservare,
preparatele histologice permanente se vor luta. Lutarea se poate realiza cu lac de
unghii, paraIin topit sau cu amestecul 3:6:1 Iormat din coloIoniu, cear de albine si
seu. Acestea se aplic cu o pensul Iin pe marginea lamelei, de jur mprejur, astIel
nct s se realizeze etanseizarea sectiunii.

Petru Cazacu

151
!
"
#
$
%
&
'
(
'

.


1. BancroIt J, Stevens A (1982) - 1heory and Practice of Histological
1echniques, 2
nd
ed., Churchill Livingstone, N.Y.
2. BancroIt, J D, Stevens A (1982) - 1heory and practice of histological
techniques 2
nd
ed., Churchill Livingstone, Edinburgh London, UK.
3. Carson F (1990) - Histotechnology: A Self-Instructional 1ext, 1
st
ed., ASCP,
III.
4. Crookham J, Dapson R (1991) - Hazardous Chemicals in the Histopathology
Laboratory, 2
nd
ed., Anatech.
5. Culling C F A (1974) - Handbook of histopathological and histochemical
techniques; 3
nd
ed., Butterworth, London, UK.
6. Golescu M (1997) - Diagnosticul i tratamentul micozelor interne; Ed. Viata
Medical Romneasc; Bucuresti.
7. Gray P (1954) - 1he Microtomist's Formulary and Cuide. The Blakiston
Co. Robert E. Krieger Publishing.
8. Hayashi I , Tome Y, Shimosato Y (1989) - 1hiosemicarbazide used after
periodic acid makes methenamine silver staining of renal glomerular
basement membranes faster and cleaner, Stain Technologv.
9. Humason G L (1967) - Animal tissue techniques, 2
nd
ed., W H Freeman
Company, San Francisco, Ca, USA.
10. Lillie R D (1954) - Histopathologic technique and practical histochemistry 2
nd

ed., Blakiston, New York, USA.
11. Lillie R D, Glenner G G (1957) - 1ournal of Histochemistry and
cytochemistry; 5:311.
12. Luna L (1968) - Manual of Histologic Staining Methods of the AFIP, 3
nd
ed.,
McGraw-Hill, NY.
13. McManus J F A, Mowry R W (1960) - Staining Methods Histologic and
Histochemical; Harper Row, New York, NY, USA.
14. Sheehan D, Hrapchak B (1980) - 1heory and practice of Histotechnology; 2
nd

ed., Battelle Press, Ohio.
15. http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html

Ingrid Apetrei, Mihai Mares

153
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/


7.1 Fungitell (Cape Code Inc. SUA)
1est de detecie rapid a (1,3)--D-glucan-ului

7.1.1. Principiul testului

ungitell este un test cromogen, sensibil si rapid, ce poate detecta (1,3)--D-
glucanul din serul de analizat n circa o or. (1,3)--D-glucanul este un
constituent al peretelui celor mai importanti Iungi de interes medical precum Candida
sau Aspergillus. Abilitatea testului de a detecta n ser (1,3)--D-glucanul cu exprimare
n picograme, reprezint un ,balon de oxigen pentru clinicieni, privind identiIicarea
precoce a inIectiilor Iungice invazive. (1,3)--D-glucanul se regseste n doze mici n
sngele indivizilor sntosi, dar valorile serice de 80 pg/ml sau mai mari, la pacientii
cu risc crescut vor putea Ii corelate cu inIectii Iungice invazive. Analiza seriat a
probelor prelevate de la pacientii cu risc pentru inIectii Iungice a relevat utilitatea
diagnostic a acestui test, rezultatele Iiind veriIicate prin metode alternative de
diagnostic.
Fungii care nu sintetizeaz (1,3)--D-glucan, precum specii din genul
Crvptococcus sau apartinnd clasei Zvgomvcetes, respectiv Absidia, Mucor sau
Rhi:opus, nu vor pozitiva testul. Un rezultat pozitiv nu va indica si clasa Iungic a
speciilor incriminate, testul Iiind recomandat pentru stabilirea unui diagnostic
prezumtiv n colaborare cu alte proceduri de diagnostic, precum examenul micologic al
prelevatelor clinice, tehnicile de histopatologie n cazul prelevatelor biopsice sau
analiza imagistic (Rx, CT, RMN). Testul poate decela (1,3)--D-glucanul produs de
Iungii primar patogeni sau de cei oportunisti apartinnd genurilor: Candida,
Aspergillus, Fusarium, Trichosporon, Saccharomvces, Acremonium, Coccidioides,
Histoplasma, Sporothrix, Blastomvces si Pneumocvstis.
Rezultatele testului sunt cuantiIicate n pg/ml ser, cu valori minime de detectie
stabilite la 31,25 pg/ml. Cu toate acestea, intervalul de detectie a Iost ncadrat n limite
superioare pentru o mai bun acuratete a testrii si pentru evitarea unor posibile
interIerri antigenice. Valori ale (1,3)--D-glucanului mai mici de 60 pg/ml sunt
considerate a Ii negative, iar depsirea acestei valori (pozitivarea testului) nu va putea
Ii automat corelat cu prezenta evolutiv a bolii Ir o serie de investigatii clinice /
F
7

Tehnici de seromicologie

154
paraclinice complementare, n vederea stabilirii unui diagnostic ct mai exact. Valori
mai mari sau egale cu 80 pg/ml sunt interpretate ca Iiind net pozitive, cu valoare mare
de diagnostic pentru evolutia unei aIectiuni invazive cu etiologie Iungic.
Valorile cuprinse n intervalul 60-79 pg/ml sugereaz o posibil inIectie
Iungic, dar acestea au valoare diagnostic incert, Iiind recomandat retestarea seric
a pacientilor la intervale de timp prestabilite (2-3 ori pe saptmn). Rezultate Ials
pozitive au Iost nregistrate la pacientii hemodializati, n cazul Iolosirii membranelor
celulozice sau administrrii unor produse de origine sangvin precum albumina sau
imunoglobulinele, n timp ce utilizarea pentru hemodializ a unor membrane
conIectionate din celuloz triacetat sau polimetil-metacrilat nu au provocat cresteri ale
valorilor de (1,3)--D-glucan seric. Fiind un test cromogen rezultatele obtinute mai pot
Ii interIerate de prezenta bilirubinei serice sau de turbiditatea serului de analizat
cauzat de hiperlipemie.

7.1.2. Materiale furnizate mpreun cu testul Fungitell

Fungitell este destinat diagnosticului in vitro. Urmtoarele materiale (libere de
orice urm de 1,3--D-glucan) sunt Iurnizate mpreun cu kitul si suIiciente pentru 2
plci de microtitrare:
1. Reactivul Fungitell - (1,3)--D-glucan lioIilizat, speciIic LAL (Limulus
Amebocvte Lvsate) sau lizat din amebocitele unei specii de crab;
2. Tampon Pyrosol (Tris HCl 2M pH 7,4);
3. Glucan standard lioIilizat ce contine ntre 250 si 350 pg s.a. / Iiol si solvent
inert;
4. Ap - reactiv conIorm standardului ISO 3696:1987;
5. Microplci de titrare cu 96 godeuri, cu Iund plat;
6. KCl 1,2 M
7. KOH 0,25 M

7.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul

Toate materialele si sticlria trebuie s Iie libere de interIerare glucanic.
Sticlria trebuie s Iie uscat la cald, depirogenat la 235C timp de 7 ore, pentru a Ii
adecvat Iolosirii. Toate recipientele din material plastic vor Ii libere de orice tipuri de
interIerri. Materialele de unic Iolosint sunt de preIerat.
1. VrIuri pipete 10-100 l, 250 l, 1000 l;
2. Micropipete pentru volume de 20l, 200 l si 1000 l;
3. Micropipet multipas pentru volume de 100 l;
4. Tuburi de testare pentru dilutia probelor si pregtirea mixului de extractie seric;
5. Incubator-cititor cu Iluorescent, lungime de und 405 nm monocrom, cu 2500
unitti densitate optic si soItware pentru interpretare asistat de PC;
6. Tuburi sterile de plastic cu dop, pentru mixarea probelor;
7. Tuburi de colectare a serului.
Atenie' Jarfurile de pipet cu filtru de bumbac pot constitui surs de glucan.
Toate produsele furni:ate de Cape Code. Inc. sunt certificate ca fiind libere de
interferare glucanic.

155
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

7.1.4. Atenionri i precauii

Testul Fungitell necesit o atenie sporit din punct de vedere tehnic i
procedural.
1. Specii nedetectate de test. Unele specii Iungice produc cantitti reduse de (1,3)-
-D-Glucan si nu sunt de regul detectate de test. Din aceast categorie Iac parte
specii ale genului Crvptococcus, precum si specii din categoria zygomycetelor,
ca Absidia, Mucor si Rhi:opus;
2. Nu se pipeteaz nici o substant cu gura, nu se Iumeaz, nu se consum alimente
n spatiul destinat testrilor;
3. Se utilizeaz reactivi si materiale care sunt certiIicate ca Iiind libere de glucani,
stiut Iiind c apa, hainele, praIul pot Ii surse de glucan;
4. Nu se utilizeaz reactivi cu termenul de valabilitate depsit, seruri hiperlipemice
sau care contin bilirubin;
6. Se utilizeaz echipament de protectie si mnusi Ir talc n manoperele ce
implic prelevatele;
7. Pacientii hemodializati pot acumula un nivel ridicat de (1,3)--D-glucan cnd
sunt utilizate membrane celulozice. Cele de tipul triacetat sau polimetil-
metacrilat nu par a aIecta concentratia sanguin de glucan;
8. Anumite manopere chirurgicale ce implic utilizarea unor materiale absorbante
sau de sutur derivate din bumbac sau mtase pot conduce postoperator la
acumularea unui nivel ridicat de (1,3)--D-glucan, care s contribuie la Ialsa
pozitivare a rezultatelor testrii acestor pacienti.

7.1.5. Pstrarea reactivilor

Toate substantele se vor pstra la 2-8C, Ierite de lumin. Reactivul Fungitell
reconstituit va Ii pstrat la 2-8C si utilizat n maxim 2 ore. Pe termen mai ndelungat,
solutia reconstituit poate Ii congelat o singur dat la -20C, pentru circa 20 zile.

7.1.. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor

1. Probele de ser se vor recolta n tuburi vidate (tip Venoject) care s permit o
rapid Iormare a coagulului si centriIugarea ulterioar n vederea separrii ct
mai nete a serului de analizat, la 1800 rpm timp de 10 minute. Serul astIel
obtinut, se transIer n conditii aseptice n Iiole sterile si se stocheaz;
2. Stocarea probelor naintea nceperii testrii se realizeaz la 2-8C pentru maxim
48 de ore sau se pot congela la -20C;
3. Marcarea prelevatelor const n notarea numelui si prenumelui pacientului
alturi de data recoltrii sau se utilizeaz sisteme de identiIicare unic.

7.1.7. 1ehnic de lucru

1. Prepararea glucanului standard Iurnizat odat cu kitul
a. Se dizolv o Iiol de glucan standard ntr-un volum corespunztor de ap
standard prembuteliat, pentru obtinerea unei solutii cu 100 pg/ml (solutia 1);

156
Se vortexeaz cel putin 10 secunde pentru omogenizarea solutiei. Solutia astIel
preparat va Ii stocat la 2-8C si utilizat n maxim 3 zile;
b. Se prepar apoi o solutie standard cu 50 pg/ml prin mixarea a 400 l ap
reactiv cu 400 l din solutia 1, ntr-un tub liber de glucan (solutia 2);
c. Din solutia 2 se prepar un nou standard cu 25 pg/ml prin mixarea a 400 l
ap reactiv si 400 l din solutia 2, ntr-un tub liber de glucan (solutia 3);
d. Pornind de la solutia anterioar, se prepar un standard cu 12.5 pg/ml prin
mixarea a 400 l ap reactiv cu 400 l din solutia mentionat, ntr-un tub liber
de glucan (solutia 4);
e. Se prepar apoi un ultim standard cu 6.25 pg/ml prin mixarea 400 l ap
reactiv cu 400 l din solutia 4, ntr-un tub liber de glucan (solutia 5);
2. Prepararea reagentului de tratare a serului
Tratarea alcalin a serului va desIace triplul helix al glucanului conIerindu-i o
reactivitate mai mare n timpul testului. Un pH mai alcalin va inactiva serin-
proteazele precum si inhibitorii acestora, care pot da rezultate Ials positive sau
Ials negative.
a. Pregtirea reagentului de tratare a serului (0.6 M KCl si 0.125 M KOH) prin
transIerarea a 400 l din solutia 0.25 M KOH ntr-un tub liber de glucan si aditia
a 400 l din solutia 1.2 M KCl. Solutia se omogenizeaz usor si se utilizeaz n
cel mult 30 de minute. Fiolele se acoper cu paraIilm, putnd Ii stocate la 2-8C
pentru a Ii utilizate mai trziu, cu cea de-a doua microplac.

Not. Cand se trasea: curba de etalonare, se multiplic pg/ml cu cinci, astfel incat
limita s fie incadrat in intervalul 31.25 - 500 pg/ml. Jolumul standard din testare este de 25
l pentru fiecare godeu, adic de cinci ori volumul probei de ser. Placa de microtitrare are
:on standard (st), :on martor (blank blk) i :on test (unknowns uk) cu fiecare variant
in triplu exemplar, dup urmtorul model (fig. Nr. 7-1).

Fig. nr. 7-1 Zonele standard (st), martor (blk) si test (uk) ale plcii de microtitrare

3. Tratarea serului cu reactivul de tratare a serului. Not. Pentru evitarea
contaminrii accidentale se pstrea: microplcile acoperite pe parcursul
desfurrii manoperelor, capacul indeprtandu-se pentru citire.

157
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

a. Decongelarea probelor de ser se realizeaz la temperatura camerei, iar
omogenizarea lor se realizeaz prin vortexare timp de 10 secunde;
b. Se transIer 5 l din proba de ser n Iiecare din cele trei godeuri desemnate
(uk). Operatiunea se repet pentru Iiecare prob de ser;
c. Se aditioneaz 20 l din reagentul de tratare a serului n Iiecare godeu ce deja
contine cei 5l de ser;
d. Se agit placa 5 secunde si se incubeaz 10 minute la 37C n cititor;
4. Pipetarea blanc-ului si a standardelor. Se ndeprtez microplaca din cititor si:
a. Se adaug 25 l din solutia standard 1 n godeurile notate B2, B3, B4;
b. Se adaug 25 l din solutia standard 2 n godeurile notate C2, C3, C4;
c. Se adaug 25 l din solutia standard 3 n godeurile notate D2, D3, D4;
d. Se adaug 25 l din solutia standard 4 n godeurile notate E2, E3, E4;
e. Se adaug 25 l din solutia standard 5 n godeurile notate F2, F3, F4;
I. Se distribuie cte 25 l ap standard n godeurile notate G2, G3, G4;
5. Prepararea reagentului Fungitell si conduita procedural
a. Se reconstituie o Iiol de reagent Fungitell cu 2,8 ml ap standard si se
aditiveaz cu 2,8 ml de Pyrosol tampon, cu ajutorul micropipetei de 1000 l;
b. Se agit usor Iiola pentru dizolvarea complet a continutului; nu se
vortexeaz. Se adaug apoi 100 l de reagent Fungitell n Iiecare godeu cu
ajutorul micropipetei multicanal. Se ndeprteaz capacul de pe microplac si se
aseaz n cititor odat cu setarea temperaturii la 37C. ndeprtarea capacului
este optional, exceptie Icnd situatiile cnd acesta ar putea mpiedica
vizualizarea probei. Microplaca se agit timp de minim 5 secunde naintea citirii.
Citirea are loc la 405 nm, la intervale de 15-30 secunde, timp de 40 minute, la
37C;
c. Colectarea rezultatelor si analiza acestora: se calculeaz rata medie de variatie
a densittii optice (mili-unitti de absorbant/minut) pentru toate punctele, ntre
0 si 40 minute;
d. Se nregistreaz concentratia de glucan a probelor testate.

7.1.8. Interpretarea rezultatelor

Rezultatele testului Fungitell vor Ii utilizate n diagnosticul inIectiilor invazive
Iungice doar n coroborare cu alte date. Rezultatele sunt exprimate n pg/ml ser,
ncepnd cu valori considerate a Ii nedetectabile ( 31,25 pg/ml) pn la valori mai
mari de 500 pg/ml, acestea Iiind printate cu ajutorul soItului Iurnizat sau sunt citite pe
curba etalon. Pentru acuratetea aprecierilor, n cazul valorilor de peste 500 pg/ml, se
recomand diluarea probei de ser cu ap standardizat si retestarea acesteia.
Laboratorul care eIectueaz testrile are obligatia de a inIorma clinicianul c sIera de
detectie a kitului nu cuprinde specii ale genului Crvptococcus (produc cantitti inIime
de (1,3)--D-glucan) sau specii de zygomycete precum Absidia, Mucor sau Rhi:opus
care nu produc (1,3)--D-glucan.

Rezultate negative: un rezultat negativ nseamn c (1,3)--D-glucanul nu a Iost
detectat sau c valorile s-au ncadrat sub limita de detectie a kitului. Valori ale (1,3)--
D-glucanului mai mici de 60 pg/ml sunt interpretate ca Iiind negative.

158

Rezultate pozitive: un rezultat pozitiv nseamn c (1,3)--D-glucanul a Iost detectat,
dar acest rezultat nu este deIinitoriu pentru prezenta bolii si trebuie interpretat n
coroborare cu rezultatele metodelor complementare de diagnostic. Valorile mai mari
sau egale cu 80 pg/ml sunt considerate pozitive.

Rezultate incerte: valorile cuprinse n intervalul 60-79 pg/ml sugereaz o posibil
inIectie Iungic. Pentru certitudine, sunt necesare probe seriate si testri aditionale
pentru o interpretare corect a rezultatelor.

7.1.9. Controlul calitii

Ghidul controlului de calitate al standardelor de laborator poate Ii accesat la
adresa URL www.nccls.org (documentul C24-A).
- Curba etalon cu cele cinci concentratii de glucan serveste drept model de control
pozitiv a kitului Fungitell. CoeIicientul de corelatie al curbei standard
(ordonat / abscis) ar trebui s Iie mai mare de 0,980;
- Blanc-ul (25 l de ap standard) reprezint controlul negativ, cu valori mai mici
cu 50 dect cea mai mic valoare incert indicat de standard. Dac nu se
ndeplinesc aceste conditii, testarea trebuie repetat cu nlocuirea tuturor
reagentilor;
- Dac se observ c probele de ser sunt hemolizate, prezint turbiditate sau dau
prin citire la densitatea optic de 405 nm o valoare mai mare de 0,06, acestea
vor Ii diluate cu reagentul baz si retestate. O bun practic de laborator
nseamn c ambele veriIicri de pozitivare sau negativare a probelor vor Ii
puse n practic, n vederea veriIicrii reagentilor si tehnicii de lucru. Fiecare
laborator care utilizeaz aceast test de diagnostic va stabili si o serie de criterii
proprii privind controlul de calitate.

7.1.1. Limite

1. Localizarea tisular a inIectiilor Iungice, ncapsularea si nivelul de (1,3)--D-
glucan produs de anumiti Iungi inIluenteaz concentratia seric de antigen.
Crvptococcus spp. produce un nivel sczut de (1,3)--D-glucan. Specii
apartinnd genurilor Absidia, Mucor i Rhi:opus, nu produc (1,3)--D-glucan;
2. Anumiti indivizi sntosi au concentratii serice detectabile de (1,3)--D-glucan
ceea ce poate conduce spre o zon de incertitudine privind calitatea
diagnosticului. n astIel de cazuri sunt recomandate testrile suplimentare;
3. Frecventa testrii pacientilor se va stabili n Iunctie de riscul la care acestia sunt
expusi, cu o rat de cel putin 2-3 ori pe sptmn;
4. Rezultate pozitive datorate cresterii valorilor de (1,3)--D-glucan seric au Iost
evidentiate la pacientii hemodializati al cror tratament const n administrarea
unor produse de origine sanguin, albumin seric sau imunoglobuline;
5. Intervalul de detectie al testului este ntre 31,25 si 500 pg/ml.


159
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

7.1.11. Interferarea cu alte substane

n urmtoarele situatii pot avea loc interIerri privind acuratetea rezultatelor:
Hemoliza;
Turbiditatea probei cauzat de hiperlipemie;
Prezenta vizual a bilirubinei;
Turbiditatea serului.

7.1.12. Jalori ateptate

Valorile crescute de -glucan sunt relevante ntr-o varietate de inIectii Iungice.
Cnd semnele / simptomele sunt prezente la nivelul de 80 pg/ml sau mai mare,
valoarea predictiv la care subiectul este pozitiv pentru inIectii Iungice se ncadreaz n
intervalul 74,4 - 91,7. n absenta semnelor clinice si mai putin de 60 pg/ml,
predictia negativ se ncadreaz n intervalul 65,1 - 85,1.


160
7.2. Platelia

Aspergillus


Kitul Platelia Aspergillus este un test imuno-enzimatic de tip sandwich care
permite detectia galactomananului (GM) n serul uman. Acest test utilizeaz anticorpi
monoclonali (Ac) de sobolan EBA-2, dirijati contra GM aspergilar. Acesti anticorpi
permit o marj de detectie de 1 ng GM/ml. Calitatea si acuratetea rezultatelor depind
de maniera de lucru a Iiecrui laborator n parte, de reactivii utilizati, de urmarea cu
strictete a speciIicatiilor privind protocolul de lucru. Se vor utiliza seruri de control
pozitiv si negativ pentru validarea rezultatelor.
nclzirea serului n prezenta EDTA are rolul de a disocia complexele imune si
de a precipita proteinele serice care ar putea interIera rezultatele testrii, crescnd astIel
sensibilitatea reactiei. Dup tratarea serului si centriIugare, supernatantul este recuperat
si analizat rapid (n aceeasi zi). Dac se doreste retestarea unei probe de ser,
ntotdeauna se depoziteaz serul ca atare si nu prelevatul tratat.
Se vor incuba simultan serul si conjugatul n godeurile microplcii
sensibilizate n prealabil cu anticorpii monoclonali, permitndu-se astIel Iormarea
complexelor de tip Ac GM Ac peroxidaz. Dup splare, complexele sunt
evidentiate prin aditia substratului. Rezultatul reactiei este detectat la un
spectroIotometru cu lungime de und 450 / 620 nm, dup 30 minute de incubare la
temperatura ambiant, reactia Iiind stopat prin adugarea acidului sulIuric 1,5N.
Din cauza problemelor de Ials pozitivitate, serurile intermediare sau pozitive
vor Ii sistematic retestate; este recomandat s se recolteze o nou prob de ser de la
pacientii cu risc, pentru a Ii testat suplimentar. Datorit caracterului ubicuitar al
conidiilor de Aspergillus si Penicillium, n vederea evitrii contaminrii accidentale a
serului sau reactivilor, se vor utiliza doar materiale sterile, Ierite de praI.
Galactomananul Iiind termostabil, sterilizarea nu poate garanta absenta GM
contaminant, de aceea se va limita la maxim contactul serului sau al reactivilor cu aerul
ambiant. Se recomand manipularea n hot cu Ilux de aer laminar clas II.

7.2.2. Materiale furnizate odat cu kitul

Microplci cu 96 godeuri sensibilizate cu anticorpi monoclonali EBA2
antigalactomanan, 1 buc;
Soluie concentrat de splare - solutie concentrat (10X); Tampon TRIS-
NaCl (pH 7,41), Tween 20 sol.1; conservant: 0,01 tiomersal 1x 100ml;
Control negativ - ser de control negativ (lioIilizat): ser uman liber de
galactomanan, negativ la testarea pentru anticorpi anti-HIV1 si anti-HIV2,
pentru antigene HBs si anticorpi anti-HCV; 2 x 1ml;
Ser de calibrare - ser standard (lioIilizat): ser uman cu continut n
galactomanan (1ng/ml), negativ pentru anticorpi antiHIV1 si antiHIV2,
antigene HBs si anticorpi anti HCV; 2 x 1ml.
Control pozitiv - ser de control pozitiv (lioIilizat): ser uman continnd
galactomanan, negativ pentru anticorpii anti-HIV1 si anti-HIV2, pentru
antigene HBs si anticorpi anti-HCV; 2 x 1ml;

161
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

Conjugat - conjugat gata de utilizare: anticorpi monoclonali anti-galactomanan
marcati cu peroxidaz; conservant: 0,01 tiomersal 1 x 8ml;
Soluie de tratare a serului (gata de utilizare): solutie acid EDTA, Ir
conservanti; 1 x 10,5 ml;
TMB (Tetra-Metil-Benzidin) tampon substrat - tampon substrat pentru
peroxidaz (gata de utilizare): solutie de acid citric si acetat de Na, pH 5,2
continnd 0,009 H
2
O
2
si 4 dimetilsulIoxid (DMSO); 1x 60 ml;
Soluie cromogen TMB - solutie cromogen (concentrat): solutie DMSO
90 cu 0,6 Tetra-Metil-Benzidin (TMB); 1 x 1 ml;
Soluie de stopare (gata de utilizare): solutie de acid sulIuric 1,5 N.

7.2.3. Materiale necesare, dar nefurnizate odat cu kitul

Ap distilat sau perIect demineralizat pentru solutia de splare;
Ap puriIicat steril pentru reconstituirea serurilor de control;
Hrtie absorbant;
Mnusi de unic Iolosint;
Ochelari de protectie;
Hipoclorit de Na (ap Javel) si bicarbonat de Na;
Pipete simple si multicanal, reglabile sau Iixe, pentru msurarea si distribuirea a
50l, 100 l, 300 l si 1000 l;
Tuburi EppendorI conice, de 1,5 ml capacitate, cu nchidere ermetic, capabile
s suporte temperaturi de minim 100C;
CentriIug pentru tuburi EppendorI conice de 1,5 ml, care s dezvolte minim
10000 rpm;
Agitator tip Vortex;
Baie de ap cu termostatare la 100
0
C;
Incubator de microplci cu termostatare la 37C;
Sistem de splare automat, semiautomat sau manual pentru microplci;
Sistem de citire a microplcilor echipat cu Iiltre de 450 / 620 nm.

7.2.4. Conservarea reactivilor desigilai i a celor reconstituii

Microplcile dup deschiderea pachetului vidat, pot Ii pstrate la 2-8C n
ambalajul original, timp de pn la 5 sptmni, veriIicndu-se periodic n
privinta desicrii;
Solutia concentrat de splare dup diluare, aceasta se poate conserva 15 zile
la 2-8C. Dup utilizare, dac nu a suIerit contaminri, poate Ii pstrat la 2-
25C pn la data nscris pe ambalaj;
Solutia cromogen, dup ce a Iost diluat, este stabil cca. 6 ore la temperatura
ambiant (18 30C) si la ntuneric;
Serurile de control negativ, pozitiv si solutia de calibrare dup reconstituire,
pot Ii imediat congelate la 20C.


162
Se vor incuba simultan serul si conjugatul n godeurile microplcii
sensibilizate n prealabil cu anticorpii monoclonali, permitndu-se astIel Iormarea
complexelor de tip Ac GM Ac peroxidaz. Dup splare, complexele sunt
evidentiate prin aditia substratului. Rezultatul reactiei este detectat la un
spectroIotometru cu lungime de und 450 / 620 nm, dup 30 minute de incubare la
temperatura ambiant, reactia Iiind stopat prin adugarea acidului sulIuric 1,5N.
Din cauza problemelor de Ials pozitivitate, serurile intermediare sau pozitive
vor Ii sistematic retestate; este recomandat s se recolteze o nou prob de ser de la
pacientii cu risc, pentru a Ii testat suplimentar. Datorit caracterului ubicuitar al
conidiilor de Aspergillus si Penicillium, n vederea evitrii contaminrii accidentale a
serului sau reactivilor, se vor utiliza doar materiale sterile, Ierite de praI.
Galactomananul Iiind termostabil, sterilizarea nu poate garanta absenta GM
contaminant, de aceea se va limita la maxim contactul serului sau al reactivilor cu aerul
ambiant. Se recomand manipularea n hot cu Ilux de aer laminar clas II.

7.2.5. 1ehnica de lucru

Se va urma ntocmai protocolul de lucru. naintea utilizrii, toti reactivii vor Ii
lsati s ating temperatura mediului ambiant.

7.2.5.1. Reconstituirea reactivilor

Solutia concentrat de splare se dilueaz de 10 ori n ap distilat steril,
obtinnd astIel solutia gata de utilizare. Vor Ii necesari 160 ml pentru splarea
a 2 barete cu cte 8 godeuri;
Controlul negativ, solutia de calibrare si controlul pozitiv continutul unui astIel
de Ilacon va Ii reconstituit cu 1000 l de ap steril extrapur, va Ii lsat 2-3
minute pentru rehidratare si omogenizat usor. Se vor repartiza 3 x 300 l, n
tuburi EppendorI, iar dac dou tuburi nu se utilizeaz n aceeasi zi pot Ii
congelate la 20C. Aceast reconstituire trebuie s se realizeze naintea
utilizrii serurilor n reactia imunoenzimatic si tratate ca toate serurile
provenite de la pacienti (300 l de ser 100 l solutie de tratare);
Nu se conserv serurile de control dup tratare;
Se va dilua de 50 de ori solutia cromogen n substratul tampon pentru
peroxidaz. Se vor prepara 4 ml solutie de revelare pentru Iiecare baret de
reactie (e.g. 200 l de solutie cromogen 10 ml de reactiv substrat
peroxidaz).

7.2.5.2. 1ratarea serurilor

Se introduc 300 l ser de testat ntr-un tub EppendorI de 1,5 ml;
Se adaug 100 l din solutia de tratare a serului;
Se omogenizeaz cu ajutorul vortexului;
Se nchide ermetic tubul;
Tubul va Ii plasat 3 minute pe baie de ap la 100
0
C;
Se centriIugheaz la 10000 rpm timp de 10 minute;

163
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

Supernatantul obtinut va Ii utilizat pentru detectia antigenului galactomanan.
Odat ce serul a Iost tratat, va trebui testat n cel mai scurt timp posibil;
Dac dup analiza rezultatelor se decide retestarea unui ser, se va lucra cu serul
de origine si nu cu cel deja tratat;
Stricta respectare a conditiilor de temperatur reprezint un Iactor esential pentru
reusita reactiei, de aceea se recomand ca pe tot parcursul desIsurrii
operatiunilor s se utilizeze un termometru tip sond;
Nu se conserv serul dup tratare, nici cel de control, nici cel provenit de la
pacienti.

7.2.5.3. Reacia imunoenzimatic

Se stabileste un plan de distributie a serurilor de analizat provenite de la pacienti,
precum si a celor de control si calibrare;
Baretele necesare testului se scot din ambalaj, restul Iiind pstrate conIorm
conditiilor amintite;
Se omogenizeaz Ilaconul ce contine conjugatul;
Dac se utilizeaz o pipet multicanal, se va preleva doar volumul necesar
realizrii unei serii, adic 2 ml pentru 16 godeuri;
Se vor distribui succesiv n godeuri, cu respectarea regulilor de mai jos:
50 l conjugat;
50 l din supernatantul serului tratat;
un godeu va Ii destinat serului de control negativ, dou pentru cel de
calibrare si nc unul pentru serul de control pozitiv, distributia
acestora pe plac Icndu-se la alegere;
Se acoper microplaca cu un Iilm adeziv ce s asigure o bun etanseizare;
Incubarea microplcii pe baie de ap cu termostat sau ntr-un incubator, timp de
90 minute la 37
0
C;
Prepararea solutiei de splare (diluat);
Se ndeprteaz Iilmul adeziv, se aspir continutul tuturor godeurilor si se
depune n solutia decontaminant. Apoi se procedeaz la splarea succesiv a
acestora de cinci ori. Ulterior, baretele sunt lsate s se usuce prin ntoarcere
pe o Ioaie absorbant, pentru absorbtia solutiei de splare;
Prepararea solutiei revelatoare - solutia cromogen diluat 1/50 n solutia
tampon pentru substratul peroxidazei si distribuirea rapid a cte 200 l n
Iiecare godeu. Operatiunea se va desIsura n lumin puternic. Se las ca
reactia s se desIsoare apoi n obscuritate, timp de 30 minute la temperatura
laboratorului (18 30
0
C), Ir a se proteja godeurile cu Iilmul adeziv;
Se stopeaz reactia enzimatic prin adugarea a 100 l solutie de stopare n
Iiecare godeu, n ordinea n care a Iost adugat si solutia revelatoare;
Se va citi densitatea optic la 450 / 620 nm cu ajutorul unui cititor de plci, pe
parcursul celor 30 de minute de dup stoparea reactiei;
nainte de transcrierea rezultatelor ne asigurm c exist concordant ntre
valorile citite, aIerente Iiecrui godeu / microplci si planul de distributie
prestabilit al acestora.

164
7.2.. Interpretarea rezultatelor

Rezultatele sunt exprimate prin densitatea optic (DO) a esantionului vs.
valoarea standard. Acest calcul permite limitarea variatiilor de DO ntre testri, ct si
ntre rezultatele raportate ntre diIerite laboratoare.
Testul este valid dac:
Valoarea de reIerint este mai mare sau egal cu valori cuprinse n intervalul
0,3 0,8 DO;
Valoarea serului pozitiv este mai mare de 2 DO;
Valoarea serului negativ este mai mic de 0,5 DO;
Un ser este:
negativ, dac indicele este mai mic de 1 DO;
intermediar, dac se ncadreaz n intervalul 1 1,5 DO;
pozitiv, dac valorile sunt mai mari sau egale cu 1,5 DO.


165
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

7.3. Platelia
Candida Ac
Detecia anticorpilor serici anti-manan
prin metoda imunoenzimatic

7.3.1. Introducere

Incidenta crescut a inIectiilor Iungice invazive reprezint o constant a
patologiei umane n ultimele dou decenii. InIectiile produse de diverse specii
apartinnd genului Candida au rangul de inIectii nosocomiale, oportuniste grave,
caracterizate printr-o morbiditate accentuat asociat mediului spitalicesc, traduse prin
prelungirea perioadei de spitalizare a pacientilor si cresterea consumului de antiIungice
sistemice. Mortalitatea direct atribuabil acestor inIectii se plaseaz n jurul valorii de
40. Diagnosticul se stabileste cu diIicultate ca urmare a lipsei unor semne clinice cu
caracter patognomonic. n practica clinic, la stabilirea unui diagnostic concur o serie
de tehnici - radiologice, micologice etc., care permit evaluarea riscului instalrii unei
candidoze invazive.
n acest context, dozarea anticorpilor anti-Candida, bisptmnal, va ajuta la
orientarea diagnosticului etiologic prin completarea examenelor micologice de rutin.
Seroconversia si nivelul ridicat al anticorpilor sunt n general asociate unui Iocar de
candidoz proIund.
Chiar dac aparitia anticorpilor si cuantiIicarea acestora se realizeaz tardiv,
acestea sunt elemente pretioase n vederea stabilirii unui diagnostic, Iie el chiar si
retrospectiv n cazul n care pacientii au Iost tratati empiric, Ir o examinare
micologic anterioar. Observarea unui nivel ridicat de anticorpi poate pune n discutie
existenta unei candidoze evolutive. n practica clinic, este recomandat ca reactia de
evidentiere a anticorpilor anti-Candida s Iie dublat si de detectia antigenelor
circulante (GM). n Iapt, numeroasele studii eIectuate au demonstrat c pacientii care
au Iost diagnosticati cu o candidoz proIund au prezentat pe parcursul inIectiei o
antigenemie crescut n absenta anticorpilor sau un nivel ridicat al anticorpilor n
absenta antigenelor detectabile, astIel nct cele dou teste sunt complementare.


Platelia Candida Ac este o tehnic imunoenzimatic de tip indirect, n doi
timpi, ce permite detectia anticorpilor anti-manan (izotip A, G si M) n serul uman.
Acest test automatizabil se preteaz practicii medicale ntr-un laborator spitalicesc de
micologie clinic.

7.3.3. Materiale furnizate mpreun cu kitul

- Solutie de lavaj concentrat, care se va dilua de 10 ori n ap distilat steril : 10
ml solutie de lavaj la 90 ml ap distilat;
- Conjugat (gata de utilizare) - anticorpi de capr anti-Ig (A, G, M) umane marcati
cu peroxidaz;
- Diluant pentru esantioane (gata de utilizare);

166
- Tampon pentru substrat de peroxidaz (gata de utilizare) - solutie de acid citric si
acetat de sodiu pH 5,2 continnd 0,009 H
2
O
2
si 4 DMSO;
- Solutie cromogen (concentrat) - solutie de DMSO 90 continnd tetra-metil
benzidin (TMB);
- Solutie de stopare (gata de utilizare) - solutie de acid sulIuric 1,5N;
- Film adeziv.

7.3.4. Materiale necesare dar nefurnizate mpreun cu kitul

- Ap distilat sau perIect demineralizat pentru pregtirea solutiei de lavaj;
- Agitator tip Vortex;
- CentriIug pentru tuburi EppendorI conice, de 1,5 ml capacitate;
- Spltor de microplci;
- SpectroIotometru echipat cu Iiltre de 450 / 620 nm;
- Incubator de microplci (37
0
C);
- Kit comercial Platelia Candida Ac.


naintea utilizrii, toti reactivii vor Ii adusi la temperatura ambiant (20 25
0
C).

Pregtirea gamei de etalonare :

Solutia-mam, gata de utilizare (se dilueaz R4 n raport 1/20).
Exemplu : 40 !l de R4 Ac 800 !l din solutia diluant

Reali:area gamei de etalonare in 6 puncte (concentraii variabile de anticorpi) .

80 UA (unitti anticorpi) - dilutia solutiei-mam 1/5 : 100 !l solutie-mam
400 !l diluant.....Tubul E1;
40 UA : dilutia solutiei-mam pn la punctul 80 UA : 200 !l din tubul E1
2,5 UA : dilutia solutiei-mam pn la punctul 5 UA : 200 !l din tubul E5
200 !l diluant.....Tubul E6.

Diluia eantioanelor (seruri de testat, seruri de control negativ i po:itiv)

Se dilueaz extemporaneu esantioanele - dou dilutii succesive de 1/80 : 10 !l
ser 790 !l de diluant rezultnd 1/80, apoi 10 !l din dilutia precedent 790 !l
diluant rezultnd dilutia Iinal 1/6400.

167
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

Reacia imunoen:imatic

- Se stabileste un plan de lucru privind distributia serului de control si a etaloanelor
n Iunctie de numrul esantioanelor de testat;
- Se distribuie serul diluat (punctele de reper de la E1 E6, esantioanele de testat si
cele de control) 100 !l per godeu;
- Se identiIic baretele cu ajutorul unui marker permanent;
- Se acoper microplaca cu ajutorul unui Iilm adeziv, ntinzndu-se ct mai bine pe
toat supraIata n vederea asigurrii unei bune etanseizri;
- Se aseaz placa n incubatorul de microplci timp de 60 minute la 37
0
C;
- Se prepar solutia de lavaj (prin diluare 1:10). Se pregtesc 200 ml pentru dou
barete, respectiv 20 ml solutie de lavaj concentrat la 180 ml de ap distilat;
- Se ndeprteaz Iilmul adeziv si se aspir continutul tuturor godeurilor;
- Continutul aspirat se depune ntr-o solutie de hipoclorit de sodiu 2, iar splarea
godeurilor se Iace de 4 ori, cu circa 300 !l solutie de splare / godeu;
- Se usuc baretele prin tamponare cu o hrtie absorbant si se lovesc usor pentru
eliminarea n totalitate a solutiei de splare;
- Se omogenizeaz Ilaconul ce contine conjugatul, apoi se distribuie cte 100 !l n
godeurile aIerente;
- Se acoper din nou microplaca cu Iilmul adeziv si se incubeaz timp de 60
minute la 37
0
C;
- Se ndeprteaz Iilmul adeziv si se aspir continutul tuturor godeurilor, n
maniera prezentat anterior;
- Prepararea solutiei de revelare prin diluarea de 50 de ori a solutiei cromogene
concentrate n solutia tampon pentru peroxidaz (e.g. 5 ml de reactiv tampon
substrat de peroxidaz la 100 !l de solutie cromogen concentrat tetrametil-
benzidin) si distribuirea rapid a acesteia, n volum de cte 200 !l, n toate
godeurile;
- Reactia este lsat s se desIsoare n obscuritate, timp de 30 minute, la
temperatura ambiant;
- Se stopeaz reactia enzimatic prin adugarea a 100 !l solutie de stopare n
Iiecare godeu;
- Se citeste densitatea optic la 450 / 620 nm pe parcursul a 30 de minute dup
stoparea reactiei.

7.3.. Interpretarea rezultatelor

Valori ale densittii optice asteptate:

Densitate optic : 0,400 DO la punctul din scala etalon 5 UA 1,200

Raport :

- DO corespunztoare punctului etalon 20 UA / DO nseamn 5 UA 2
- DO corespunztoare punctului etalon 10 UA / DO nseamn 5 UA 1,4

168
- DO corespunztoare punctului etalon 2,5 UA / DO nseamn 5 UA 0,8
Concentratia n anticorpi;
- C3 2,5 UA/ml
- C5 concentratia indicat pe Ilacon 2,5 UA/ml

Curba etalon este realizat n baza a 6 repere / etaloane - 2,5, 5, 10, 20, 40, 80
UA/ml preparate pe baza R4, etalonul etichetat si Iurnizat odat cu kitul. Se va opta
pentru trasarea sigmoid a curbei de etalonare care s permit extrapolarea pe abscis a
concentratiilor n UA/ml (interpretare logaritmic) si pe ordonat DO (liniar). Dac
cititorul nu permite acest tip de trasare, se poate opta doar pentru o trasare de relieIare
a etaloanelor.

- 0,5 UA/ml: ser negativ
- ntre 5 10 UA/ml: ser intermediar (rezultat incert)
- _ 10 UA/ml: ser pozitiv


169
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

7.4. Platelia
Candida Ag
Detecia mananului seric prin metoda imunoenzimatic

7.4.1. Introducere

Antigenul Candida, n acest caz mananul - polizaharid major de perete,
reprezint markerul principal n identiIicarea unei candidoze invazive. Eliberarea
acestui polizaharid n organism are loc intermitent, iar prezenta seric a acestuia este de
multe ori pasager. Detectia rapid a acestui compus depinde de o serie de Iactori,
precum captarea de ctre anticorpii speciIici circulanti si degradarea de ctre
manozidazele serice. Deci evidentierea mananului seric va trebui corelat cu cea a
anticorpilor antimanan circulanti. Tandemul celor dou tipuri de teste va concura att
la ameliorarea gradului de sensibilitate ct si la cea a precocittii stabilirii unui
diagnostic integrat.


Platelia
Candida Ag este o tehnic imunoenzimatic de tip sandwich ce

permite detectia semicantitativ a mananului n serul uman. Aceast metod se bazeaz
pe utilizarea anticorpilor monoclonali de sobolan (EBCA-1) dirijati contra unui penta
manozid - exprimat prin manan si manoproteine, existent la pricipalele specii de interes
clinic ale genului Candida. Acesti anticorpi sunt utilizati n dublu sens: agenti de
sensibilizare a plcii de microtitrare si revelatori dup cuplarea cu peroxidaza.

7.4.3. Materiale furnizate odat cu kitul

- Solutie de lavaj concentrat care se va dilua de 10 ori n ap distilat;
- Conjugat (gata de utilizare) - anticorpi monoclonali anti-manan, marcati cu
peroxidaz;
- Solutie de tratare a serului (gata de utilizare) - solutie acid EDTA Ir
conservanti;
- Tampon pentru substratul peroxidazei (gata de utilizare) - solutie de acid citric si
acetat de sodiu pH 5,2 continnd 0,009 H
2
O
2
si 4 DMSO;
- Solutie cromogen (concentrat) - solutie de DMSO 90 continnd tetra-metil-
benzidin (TMB);
- Solutie de stopare (gata de utilizare) - solutie de acid sulIuric 1,5N.

7.4.4. Materiale necesare dar nefurnizate odat cu kitul

- Ap distilat sau perIect demineralizat pentru pregtirea solutiei de lavaj;
- Agitator tip Vortex;
- CentriIug pentru tuburi EppendorI conice, de 1,5 ml capacitate;
-Baie uscat cu dispozitiv de nclzire (temperatura preconizat 120
0
C) sau baie
de ap reglabil la 100
0
C;
- Spltor de microplci;
- SpectroIotometru echipat cu Iiltre de 450 / 620 nm;

170
- Incubator de microplci (37C);
- Tuburi EppendorI conice, de 1,5 ml capacitate;
- Kit comercial Platelia Candida Ag.


naintea utilizrii, toti reactivii vor Ii lsati s ajung la temperatura ambiant
(20 25C).
Pregtirea curbei etalon:
- Etalon: concentratia n manan - 2ng/ml, 1ng/ml, 0,5ng/ml si 0,25ng/ml;
- Ser control negativ - 150!l, 225!l si 262,5!l;
- Ser etalon de 2ng/ml - 300 !l, 150 !l, 75 !l si 37,5 !l.

7.4.5.1. 1ratarea serului de control i a celui etalon

Serurile de control (negativ si pozitiv) si concentratiile etalon vor trebui tratate
concomitent cu esantioanele prelevate de la pacienti dup modelul urmtor :
- Se repartizeaz 300 !l ser de testat ntr-un tub EppendorI de 1,5 ml;
- Se adaug 100 !l solutie de tratare;
- Se omogenizeaz energic la Vortex;
- Se nchide ermetic tubul (prin apsarea capacului sau atasarea unui dispozitiv de
sigurant);
- Tubul va Ii plasat 6 min la 120
0
C n vederea distrugerii complexelor imune deja
existente n ser (Ag-Ac);
- CentriIugare la 10000 rpm timp de 10 minute;
- Testarea supernatantului.

7.4.5.2. Reacia imunoenzimatic

- Se stabileste un plan de lucru privind distributia serului de control si a etaloanelor
n Iunctie de numrul esantioanelor de testat;
- Se omogenizeaz Ilaconul ce contine conjugatul prin ntoarceri repetate nainte de
utilizare si se preleveaz doar volumul necesar realizrii seriei (e.g. pentru
dou barete a cte 8 godeuri sunt necesari 2 ml);
- Se distribuie succesiv n godeuri, cu respectarea ordinii de distributie a
reactivilor, 50 !l conjugat si 50 !l supernatant din serul de testat tratat n
prealabil;
- Se acoper microplaca cu ajutorul unui Iilm adeziv, acesta ntinzndu-se ct mai
bine pe toat supraIata n vederea asigurrii unei bune etanseizri;
- Se aseaz placa n incubatorul de microplci timp de 90 minute la 37C;
- Se prepar solutia de lavaj prin diluare 1:10. Se pregtesc 200 ml pentru dou
barete, respectiv 20 ml de solutie de lavaj concentrat la 180 ml de ap
distilat;
- Se ndeprteaz Iilmul adeziv si se aspir continutul tuturor godeurilor;
- Continutul aspirat se depune ntr-o solutie de hipoclorit de sodiu 2, iar splarea
godeurilor se repet de 5 ori cu cca. 300 !l solutie de splare / godeu;

171
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

- Se usuc baretele prin ntoarcere pe o hrtie absorbant si se lovesc usor pentru
eliminarea n totalitate a solutiei de splare;
- Prepararea solutiei revelatoare prin diluarea de 50 ori a solutiei cromogene
concentrate n solutia tampon peroxidaz ( e.g. 160 !l solutie cromogen n 8
ml de reactiv tampon substrat de peroxidaz) si distribuirea rapid a acesteia,
200 !l n toate godeurile. Reactia este lsat s se desIsoare n obscuritate
timp de 30 minute, la temperatura ambiant;
- Se stopeaz reactia enzimatic prin adugarea a 100 !l solutie de stopare n
Iiecare godeu;
- Se citeste densitatea optic la 450 / 620 nm pe parcursul celor 30 de minute de la
stoparea reactiei.

7.4.. Maniera de calcul i interpretarea rezultatelor

Valori ale densittii optice asteptate:
- la 0,5 ng/ml, DO va Ii de 0,300 1,100;
- pentru concentratia de manan a controlului pozitiv, valorile sunt cele indicate pe
Ilacon 20;
- raportul DO privind etaloanele trebuie s Iie mai mare de 2,1.

Trasarea curbei etalon

Curba etalon este realizat n baza a patru repere: 2, 1, 0,5, 0,25 ng/ml. AstIel
se traseaz o curb cu diIerite puncte reprezentate de cantittile amintite, pe abscis
concentratiile de manan n ng/ml si pe ordonat densitatea optic.

Determinarea concentraiei in manan a serurilor de testat i interpretarea
re:ultatelor

Avnd ca punct de plecare valorile prestabilite trasate de curba etalon se poate
determina pentru Iiecare prob de ser concentratia n manan exprimat n ng/ml.
- Mananemia cu valori mai mici de 0,25 ng/ml se consider rezultat negativ;
- n intervalul 0,25 ng/ml 0,5 ng/ml vorbim de un rezultat echivoc, altIel spus
incert;
- Dac valorile constatate depsesc sau sunt egale cu pragul de 0,5 ng/ml, rezultatul
este pozitiv.

Toate rezultatele pozitive vor trebui conIruntate cu simptomatologia observat
clinic si corelate cu alte tehnici n vederea stabilirii unui diagnostic Ir echivoc de
candidoz invaziv, Iapt ce va Ii urmat de instituirea unei medicatii antiIungice.


172
Fig. nr. 7-2. Testul de latex-aglutinare
BICHRO-DUBLI. Aspectul testului
pozitiv (C.dubliniensis) si negativ
(C.albicans).
7.5. Identificarea speciei Candida dubliniensis prin latex-aglutinare
(BICHRO-DUBLI, Fumouze)

Un test expeditiv, perIect adaptat pentru utilizarea n laboratoarele clinice n
vederea diIerentierii speciilor C. albicans si C. dubliniensis, este testul de latex-
aglutinare Bichro-Dubli (Fumouze Franta). Acest test Ioloseste particule de latex
,sensibilizate cu anticorpi monoclonali speciIici unui antigen de supraIat ntlnit
doar la C. dubliniensis.

Tehnica de lucru
- Se depun cte 20 l reactiv n Iiecare cerc al cardului de testare;
- Se stabilesc prin numerotare locurile pentru martorul pozitiv (o tulpin de C.
dubliniensis), martorul negativ (o tulpin de C. albicans) si proba de testat (o
tulpin de interes clinic, pozitiv la testul de Iilamentare);
- Cu ajutorul unei anse microbiologice se preleveaz pe rnd cte 2-3 colonii din
tulpinile respective;
- Se suspensioneaz coloniile n reactivul adugat n prealabil astIel nct s se
obtin un amestec omogen;
- Se imprim cardului de testare o miscare circular lent, timp de 3-5 minute;
- Se noteaz eventuala aparitie a aglutinrii la proba de testat (similar martorului
pozitiv);
-Proba pozitiv este indicat de aparitia unui aspect granular (aglomerri bleu pe
Iond roz sau violet) datorat particulelor de latex care au aderat la celulele de C.
dubliniensis.


173
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/


1. Aketagawa J, Tanaka S, Tamura H, Shibata Y, Saito H (1993) - Activation
oI Limulus coagulation Iactor G by several (1,3)--D-glucans: Comparison
oI the potency oI glucans with identical degree oI polymerization but
diIIerent conIormations; 1 Biochem; 113:683-686.
2. Alexander B (2002) - Diagnosis oI Iungal inIection: new technologies Ior
the mycology laboratory; 1ranspl Infectious Dis; 4 (Suppl. 3):32-37.
3. Becker M J, de Marie S, Willemse D, Verbrugh H A, Bakker-
Woudenberg I A J M (2000) - Quantitative galactomannan detection is
superior to PCR in diagnosing and monitoring invasive pulmonary
aspergillosis in an experimental rat model; 1 Clin Microbiol; 38:1434-
1438.
4. Bretagne S, Costa J-M, Marmorat-Khuong A et al. (1995) - Detection oI
Aspergillus species DNA in bronchoalveolar lavage samples by
competitive PCR; 1 Clin Microbiol; 33:1164-1168.
5. Bretagne S, Costa J-M, Bart-Delabesse E et al. (1997) - Comparison oI
serum galactomannan antigen detection and competitive polymerase chain
reaction Ior diagnosing invasive aspergillosis; 1 Clin Infect Dis; 26:1407-
1412.
6. Chambon-Pautas C, Costa J-M, Chaumette M-T, Cordonnier C, Bretagne
S (2001) - Galactomannan and polymerase chain reaction Ior the
diagnosis oI primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid
leukaemia; 1 Infect; 43:213-214.
7. Costa C, Costa J-M, Desterke C, Botterel F, Cordonnier C, Bretagne S
(2002) - Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and
detection oI galactomannan antigen in serum by enzyme-linked
immunosorbent assay Ior diagnosis oI invasive aspergillosis; 1 Clin
Microbiol; 40:2224-2227.
8. Erjavec Z, Verweij P E (2002) - Recent progress in the diagnosis oI Iungal
inIections in the immunocompromised host; Drug Resist; 5:3-10.
9. Faille C, Mackenzie D W, Michalski J C, Poulain D (1992) - Evaluation
oI an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed Irom
Candida albicans oligomannosides to deIine the speciIicity oI anti-mannan
antibodies; Eur 1 Clin Microbiol Infect; 11:438-446.
10. Fishman J A , Rubin R H (1998) - InIection in organ-transplant recipients;
Aew England 1ournal of Medicine; 338(24):1741-1751.
11. Freydiere A M, Guinet R, Boiron P (2001) - Yeast identiIication in the
clinical microbiology laboratory: phenotypical methods; Med Mycol;
39:9-33.
12. Fukazawa Y (1989) - Antigenic structure oI Candida albicans.
Immunochemical basis oI the serological speciIicity oI the mannans in
yeasts; Immunol Ser; 47:37-62.
13. Georges E, Garrigues M L, Stynen D, Poirot J L (1991) - SpeciIicite in
vitro dun anticorps monoclonal (Acm) anti-mannane et du latex sensibilise

174
par cet anticorps au cours de la candidose disseminee experimentale; 1
Mycol Med; 118:21-24.
14. Hashiguchi K, Niki Y, Soejima R (1994) - Cyclophosphamide induces
Ialse-positive results in detection oI Aspergillus antigen in urine; Chest;
105:975-976.
15. Hashimoto A , Yamakami Y, Kamberi P et al. (1998) - Comparison oI
PCR, (1-3)-beta-D-glucan and galactomannan assays in sera oI rats with
experimental invasive aspergillosis; 1 Clin Lab Anal; 12:257-262.
16. Hebart H, LoeIIler J, Kanz L, Einsele H (2000) - Molecular methods in
the diagnosis oI inIections in the immunocompromised host; Curr Opin
Infect Dis; 13:355-359.
17. Hyams K C (1998) - Developing case deIinitions Ior symptom-based
conditions: the problem oI speciIicity; Epidemiol Rev; 20:148-156.
18. Iwanaga S, Morita T, Nakamura T, Aketagawa J (1986) - The hemolymph
coagulation system in invertebrate animals; 1. Protein Chem; 5: 255-268
19. Jacquinot P M , Plancke Y, Sendid B, Strecker G, Poulain D (1998) -
Nature oI Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a
monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species;
FEMS Microbiol Lett;169:131-138.
20. Jacquinot P M, Plancke Y, Sendid B, Strecker G, Poulain D (1998) -
Nature oI Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a
monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species;
FEMS Microbiol Lett;169:131-138.
21. Jarvis W R (1995) - Epidemiology oI nosocomial Iungal inIections, with
emphasis on Candida species; Clin Infect Dis; 20:1526-1530.
22. Kappe R (1989) - Coexistence oI Iree antigens, Iree antibodies and
immune complexes in sera Irom patients with suspected deep-seated
candidosis; Mycoses; 32:24-32.
23. Kato A, Takita T, Furuhashi M et al. (2001) - Elevation oI blood (1,3)--
D-glucan concentrations in hemodialysis patients; Aephron; 89:15-19.
24. Kawamura S, Maesaki S, Noda T et al. (1999) - Comparison between
PCR and detection oI antigen in sera Ior diagnosis oI pulmonary
aspergillosis; 1 Clin Microbiol; 37:218-220.
25. Kontoyiannis D P, Vaziri I, Hanna H A et al. (2001) - Risk Iactors Ior
Candida tropicalis Iungemia in patients with cancer; Clin Infect Dis;
33:1676-1681.
26. Kurzai O, Heinz W J, Sullivan D J et al. (1999) - Rapid PCR test Ior
discriminating between Candida albicans and Candida dubliniensis
isolates using primers derived Irom the pH-regulated PHR1 and PHR2
genes oI C.albicans, 1 Clin Mircobiol; 37:1587-1590.
27. Latge J P (1999) - Aspergillus fumigatus and aspergillosis; 1 Clin
28. Lescher-Bru V, Cavalier A, Pernot-Marino E et al. (1998) - Aspergillus
galactomannan antigen detection with Platelia
Aspergillus: multiple
positive antigenemia without Aspegillus inIection; 1 Mycol Med; 8:112-
113.

175
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

29. LoeIIler J, Herbart H, Sepe S (1998) - Detection oI PCR - ampliIied
Iungal DNA by using a PCR-ELISA system; Med Mycol; 36:275-279.
30. LoeIIler J, Schmidt K, Hebart H, Schumacher U, Einsele H (2002) -
Automated extraction oI genomic DNA Irom medically important yeast
species and Iilamentous Iungi by using the MagNA Pure LC system; 1
Clin Microbiol; 40:2240-2243.
31. Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, Van Eldere J, Boogaerts M (2001) -
Screening Ior circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool
Ior invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell
transplantation recipients: a prospective validation; Blood; 97:1604-1610.
32. Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J et al. (2002) - Use oI circulating
galactomannan screening Ior early diagnosis oI invasive aspergillosis in
allogeneic stem cell transplant recipients; 1 Infect Dis; 186:1297-1306.
33. Manso E, Montillo M, De Sio G et al (1994) - Value oI antigen and
antibody detection in the serological diagnosis oI invasive aspergillosis in
patients with haematological malignancies; Eur 1 Clin Microbiol Infect
Dis; 13:756-760.
34. Mitsuya M, Wada K, Yamaguchi H (1994) - In vitro studies on the release
oI G Test-positive (1,3)--D-glucans Irom various Iungal pathogens; In
Committee on Organic Dusts, ICOH, Report 1/94, Rylander R, Goto H.
(eds.); 29-37.
35. Miyazaki T, Kohno S, Mitsutake K et al. (1995) - Plasma (1-3)--d-
glucan and Iungal antigenemia in patients with candidemia, aspergillosis,
and cryptococcosis; 1 Clin Microbiol; 33:3115-3118.
36. Morace G, Pagano L, Sanguinetti M et al. (1999) - PCR-restriction
enzyme analysis Ior detection oI Candida DNA in blood Irom Iebrile
patients with haematological malignancies; 1 Clin Microbiol; 37:1871-
1875.
37. Morace G, Sanguinetti M, Posteraro B, Lo Cascio G, Fadda G (1997) -
IdentiIication oI various medically important Candida species in clinical
specimens by PCR-restriction enzyme analysis; 1 Clin Microbiol; 35:667-
672.
38. Obayashi T (1995) - Plasma (1,3)-beta-glucan measurement in diagnosis
oI invasive deep mycosis and Iungal Iebrile episodes; Lancet; 345:17-20.
39. Obayashi T, Yoshida M, Mori T, et al. (1995) - Plasma measurement in
diagnosis oI invasive deep mycosis and Iungal Iebrile episodes; Lancet;
345: 17-20.
40. Odabasi Z , Mattiuzzi G, Estey E, et al. (2004) - -D-glucan as a
diagnostic adjunct Ior invasive Iungal inIections: Validation, cutoII
development, and perIormance in patients with Acute Myelogenous
Leukemia and Myelodysplastic Syndrome; Clin Infect Dis; 39:199-205.
41. PIaller M A, Jones R N, Doern G V et al. (1999) - International
surveillance oI blood stream inIections due to Candida species in the
European SENTRY program: species distribution and antiIungal
susceptibility including the investigational triazole and echinocandin
agents; Diagn Microbiol Infect Dis; 35:19-25.

176
42. PIaller M A, Jones R N, Doern G V et al. (2000) - Bloodstream inIections
due to Candida species: SENTRY antimicrobial surveillance program in
North America and Latin America, 1997-1998; Antimicrob Agents
Chemother; 44:747-751.
43. Pinel C, Fricker-Hidalgo H, Lebeau B et al. (2003) - Detection oI
circulating Aspergillus fumigatus galactomannan: value and limits oI the
Platelia test Ior diagnosing invasive aspergillosis; 1 Clin Microbiol;
41:2184-2186.
44. Podzorski R P, Gray G R, Nelson R D (1990) - DiIIerent eIIects oI native
Candida albicans mannan and mannan-derived oligosaccharides on
antigen-stimulated lymphoproliIeration in vitro, 1 Immunol; 144:707-716.
45. Ponton J, Quindos G (2002) - Non-culture-based diagnostics, In R. A.
Calderone (ed.), Candida and candidiasis; American Society Ior
Microbiology; 393-425.
46. Reiss E, Morrison C J (1993) - Nonculture methods Ior diagnosis oI
disseminated candidiasis; Clin Microbiol Rev; 6:311-323.
47. Richardson M D, Kokki M H (1999) - New Perspectives in the diagnosis
oI systemic Iungal inIections; Ann Med; 31:327-333.
48. Saito H, Yoshioka Y, Uehara N (1991) - Relationship between
conIormation and biological response Ior (1,3)--Dglucans in the
activation oI coagulation Iactor G Irom Limulus amebocyte lysate and
host-mediated antitumor activity. Demonstration oI single-helix
conIormation as a stimulant; Carbohydrate Res; 217:181-190.
49. Sanguinetti M, Posteraro B, Pagano L et al. (2003) - Comparison oI real-
time PCR, conventional PCR and galactomannan antigen detection by
enzyme-linked immunosorbent assay using bronchoalveolar lavage Iluid
samples Irom hematology patients Ior diagnosis oI invasive pulmonary
aspergillosis; 1 Clin Microbiol; 41:3922-3925.
50. Sendid B, Poirot J L, Tabouret M et al. (2002) - Combined detection oI
mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy Ior the diagnosis oI
systemic inIection caused by pathogenic Candida species; 1 Med
51. Sendid B, Tabouret M, Poirot J L et al. (1999) - New enzyme
immunoassays Ior sensitive detection oI circulating Candida albicans
mannan and antimannan antibodies: useIul combined test Ior diagnosis oI
systemic candidiasis; 1 Clin Microbiol; 37:1510-1517.
52. Sendid B, Tabouret M, Poirot J L, Mathieu D, Fruit J, Poulain D (1999) -
New enzyme immunoassays Ior sensitive detection oI circulating Candida
albicans mannan and antimannan antibodies: useIul combined test Ior
diagnosis oI systemic candidiasis; 1. Clin. Microbiol; 37:1510-1517.
53. Skladny H, Buchheidt D, Baust C et al. (1999) - SpeciIic detection oI
Aspergillus species in blood and bronchoalveolar lavage samples oI
immunocompromised patients by two-step PCR; 1 Clin Microbiol;
37:3865-3871.
54. Stynen D, SarIati J, Symoens F, Goris A, Nolard N, Latge J-P (1991) -
Rat monoclonal antibodies against exocellular carbohydrate antigens oI

177
!
"
#
$
%
&
'
(
'

/

Aspergillus and dermatophytes; Latge J-P, Boucias D (eds.), Fungal cell
wall and immune response; Springer - Verlag; 181-193.
55. Sulahian A,Touratier S, Ribaud P (2003) - False positive test Ior
Aspergillus antigenaemia related to concomitant administration oI
piperacillin and tazobactam; A Engl 1 Med; 349:2366-2367.
56. Suzuki S (1997) - Immunochemical study on mannans oI genus Candida. I.
Structural investigation n oI antigenic Iactors 1, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 13b
and 34. Curr. Top; Med Mycol; 8:57-70.
57. Swanink C, Meis J F G, Rijs A J M M, Donnelly J P, Verweij P E (1997) -
SpeciIicity oI a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay Ior
detecting Aspergillus galactomannan; 1 Clin Microbiol; 35:257-260.
58. Tamura H, Tanaka S, Obayashi T, Yoshida M, Kawai T (1992) - A new
sensitive microplate assay oI plasma endotoxin; 1 Clin Lab Anal;
6(4):232-238.
59. Tanaka S, Aketagawa J, Takahashi S, Tsumuraya Y, Hashimoto Y (1991) -
Activation oI a Limulus coagulation Iactor G by (1,3)--D-glucans;
Carbohydrate Res; 218:167-174.
60. Trinel P A, Faille C, Jacquinot P M, Cailliez J C, Poulain D (1992) -
Mapping oI Candida albicans oligomannosidic epitopes by using
monoclonal antibodies; Infect Immun;60:3845-3851.
61. van Burik J, Myerson D, Schreckhise R, Bowden R (1998) - PanIungal
PCR assay Ior detection oI Iungal inIection in human blood specimens; 1
Clin Microbiol; 36:1169-1175.
62. Verweij P E, Figueroa J, van Burik J, Holdom M D, Del-Cas E, Gomez B-
L, Mendes-Giannini M-J (2000) - Clinical applications oI non-culture
based methods Ior the diagnosis and management oI opportunistic and
endemic mycoses; Med Mycol; 38:(Suppl. 1):161-171.
63. Verweij P E, Meis J F (2000) - Microbiological diagnosis oI invasive
Iungal inIections in transplant recipients; 1ransplant Infect Dis; 2:80-87.
64. Walsh T J, Groll A H (1999) - Emerging Iungal pathogens: evolving
challenges to immunocompromised patients Ior the twenty-Iirst century;
1ranspl Infectious Dis;1:247-261.
65. Yeo S F, Wong B (2002) - Current status oI non-culture methods Ior
diagnosis oI invasive Iungal inIections; Clin Microbiol Rev;15:465-484.
66. Yera H, Sendid B, Francois N, Camus D, Poulain D (2001) - Contribution
oI serological tests and blood culture to the early diagnosis oI systemic
candidiasis; Eur 1 Clin Microbiol Infect Dis; 20:864-870.


179
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0


ungii prezint o serie de nsusiri metabolice si eco-Iiziologice care pot Ii
utile n demersul de identiIicare a speciei, n special pentru discriminarea
ntre specii cu caractere culturale si aspecte microscopice similare. Evaluarea prezentei
sau absentei acestor nsusiri se realizeaz prin punerea n practic a unor teste cum ar Ii
cele biochimice si cele Iiziologice.
Aceste teste sunt mijloace absolut necesare n laboratorul clinic, n special
pentru identiIicarea levurilor de interes medical. Desi importanta lor este covrsitoare
si unanim recunoscut, aceste teste nu reusesc de Iiecare dat s elucideze cu exactitate
apartenenta taxonomic a unei anumite tulpini si sunt necesare teste suplimentare, n
principal de biologie molecular, pentru identiIicarea acesteia. Deoarece testele de
biologie molecular bazate pe analiza ADN-ului sunt accesibile doar laboratoarelor din
Centrele de ReIerint si sunt relativ costisitoare, utilizarea proIilul biochimic si a
caracterelor morIologice reprezint o solutie acceptabil pentru laboratoarele clinice,
rspunznd de manier satisIctoare cerintelor de diagnostic din spitale si ambulatorii
de specialitate. ProIilul biochimic cuprinde datele obtinute prin eIectuarea unei
multitudini de teste, ntre care cele mai importante sunt redate n continuare.

8.1. Fermentarea zaharurilor

Utilizarea metabolic a zaharurilor n conditii de anaerobioz presupune
cultivarea levurilor pe medii minimale continnd 0,3 extract de drojdie si 0,5
pepton, aditivate cu un anumit substrat glucidic n proportie de 2. Interpretarea se
Iace pe baza dioxidului de carbon acumulat n tubuletele Durham introduse n mediu.
Cele mai utilizate zaharuri sunt: D-glucoza, D-galactoza, maltoza, sucroza, raIinoza,
trehaloza si D-xiloza. Acest test este util n diIerentierea diverselor specii apartinnd
genului Candida, dar nu si a levurilor din genurile Crvptococcus si Rhodotorula care
sunt neIermentative.

F
8
Teste biochimice si Iiziologice

180
8.2. Capacitatea de asimilare a surselor de carbon

Abilitatea levurilor de a creste pe diverse medii n prezenta anumitor substante
chimice adugate ca unic surs de carbon, poart numele de auxanogram.
Substantele Iolosite pentru acest test sunt mai numeroase si mai diverse n ceea ce
priveste complexitatea structural:
- hexoze: D-glucoz, D-galactoz, L-ramnoz, L-sorboz;
- pentoze: D-xiloz, D-riboz, L-arabinoz, D-arabinoz;
- dizaharide: sucroz, maltoz, celobioz, trehaloz, lactoz, melibioz;
- trizaharide: raIinoz, melezitioz;
- polizaharide: amidon solubil, inulin;
- alcooli: eritritol, adonitol, D-manitol, m-inozitol, metanol, etanol, glicerol, glicol,
1,2-propandiol, 2,3-butandiol, dulcitol, D-sorbitol;
- acizi organici: succinat, citrat, DL-lactat, D-gluconat, D-glucuronat, 2-ceto-D-
gluconat, 5-ceto-D-gluconat;
- alti compusi: D-glucozamin HCl, N-acetil-glucozamin.

8.3. Capacitatea de asimilare a surselor de azot

Principiul acestui test este similar cu cel al testului anterior. Sursele de azot
testate sunt: nitratii, etilamina, L-lizina, cadaverina, nitritii, creatina, creatinina. Testul
de asimilare a nitratului de sodiu este important pentru diIerentierea levurilor
apartinnd genurilor Crvptococcus si Rhodotorula prin determinarea activittii nitrat-
reductazei cu anumiti agenti revelatori de tipul acidului sulIanilic si alIa-naItilaminei.

8.4. 1estul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la levuri

Scop
Acest test pune n evident capacitatea unor levuri de a produce enzima numit
ureaz. Se Ioloseste pentru identiIicarea prezumtiv a levurilor apartinnd genurilor
Crvptococcus, Rhodotorula si Trichosporon.

Tehnic de lucru
Se Iolosesc medii lichide care contin uree si un indicator (rosu-Ienol): bulion
Christensen preparat n laborator, medii gata de utilizare comercializate de diverse
Iirme (BD Diagnostics, BioMerieux, Remel etc.). n urma scindrii ureei de ctre
ureaza secretat de levuri, se produce o crestere a pH-ului prin eliberarea amoniacului,
Iapt semnalat de virarea culorii indicatorului de la galben-chihlimbar la roz-rosu.
Se nsmnteaz 0,5 ml mediu de testare cu o ans ncrcat de celule,
prelevat din cultura levurii de identiIicat. n paralel, se nsmnteaz obligatoriu un
martor pozitiv (Crvptococcus neoformans) si unul negativ (Candida albicans).
Rezultatele se citesc dup 3, respectiv 24 ore de incubare la 37C. Interpretare: testul
este pozitiv pentru genurile Crvptococcus, Rhodotorula, Trichosporon si negativ
pentru Blastoschi:omvces, Candida si Geotrichum.


181
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0

Precauii
Tulpina de testat trebuie s Iie necontaminat bacterian, deoarece se pot
produce erori prin interIerarea reactiei.

8.5. 1estul de hidroliz a ureei (producerea de ureaz) la dermatofii

Scop
Pune n evident producerea de ureaz de ctre dermatoIiti, prin cultivare pe
bulion sau agar Christensen. n cazul producerii acestei enzime, ureea din mediu este
descompus cu generare de amoniac care va modiIica pH-ul mediului (alcalinizare),
Ienomen indicat de schimbarea culorii indicatorului; astIel, culoarea mediului va vira
de la galben-orange la roz-rosu (Iig. nr. 8-1, ve:i Anexa).

Tehnic de lucru
Mediul solid, turnat n pant, se inoculeaz ntr-un singur punct, cu tulpina de
analizat. n paralel, se inoculeaz un martor pozitiv (e.g. T. mentagrophvtes) si un
martor negativ (e.g. T. verrucosum). Dup inoculare, mediul se incubeaz la 25-30C,
timp de pn la 7 zile.

Testul ureazei este:
- pozitiv pentru urmtoarele specii de dermatoIiti M. canis, M. cookei, M.
gvpseum, M. nanum, M. persicolor, M. praecox, T. afelloi, T. mentagrophvtes
(ambele varietti) si T. Terrestre;
- slab pozitiv pentru urmtoarele specii de dermatoIiti E. floccosum si rar M.
canis;
- variabil (inconstant pozitiv sau negativ, n Iunctie de tulpin) pentru urmtoarele
specii de dermatoIiti M. audouinii, T. rubrum, T. schoenleinii, T. tonsurans si
T. violaceum;
- negativ pentru urmtoarele specii de dermatoIiti M. ferrugineum, T.
concentricum si T. verrucosum.

Precauii
Este obligatorie absenta contaminrii bacteriene a culturii dermatoIitului din
care se Iac pasajele pe mediul Christensen.

8.. 1estarea rezistenei la cicloheximid

Testul se reIer la abilitatea levurilor de a se dezvolta pe medii de cultur
continnd dou concentratii de cicloheximid 0,01, respectiv 0,1. Aceste
concentratii pot Ii critice pentru anumite specii, supresndu-le total sau partial
dezvoltarea, sau dimpotriv, pot Ii permisive pentru altele, cresterea lor neIiind deloc
stnjenit.


182
8.7. Producerea de fenol-oxidaz

Producerea acestei enzime este detectat cu ajutorul unor discuri impregnate
cu acid caIeic (Caffeic Acid Disk, Remel SUA) sau prin cultivarea levurilor pe medii
bogate n poliIenoli de tip acid caIeic (Agar pe baz de extract din seminte de Niger
sau Agar cu acid caIeic si citrat Ieric) si permite identiIicarea speciei Crvptococcus
neoformans pe baza unei reactii de culoare. Sub actiunea Ienol-oxidazei, care
catalizeaz oxidarea poliIenolilor si transIormarea lor n pigment melanic, apare o
bruniIicare a discului ntr-un interval de aproximativ 4 ore de incubare la 30C,
respectiv colonii brune pe mediile amintite, dup 48-72 ore (Iig. nr. 8-2, ve:i Anexa).

8.8. 1estarea producerii altor enzime

Enzime cum ar Ii -galactozaminidaza, L-prolin-aminopeptidaza etc., sunt
evidentiabile prin cultivarea levurilor pe medii cromogene: CandiSelect 4 (Iig. nr. 8-
3, ve:i Anexa), Candichrom
II, Albicans ID2 agar, CHROMagar Candida (Iig. nr. 8-4,

ve:i Anexa), Oxoid Chromogenic Candida Agar (Iig. nr. 8-5, ve:i Anexa).
DiIerite combinatii ale acestor nsusiri biochimice au Iost Iolosite pentru
conceperea unor teste comercializabile, utile pentru identiIicarea rapid a speciilor
levurice de interes medical n laboratoarele clinice. Aceste teste pot identiIica un
numr diIerit de specii, dup cum urmeaz:
- o singur specie: CaIIeic Acid Disk (Remel), C. albicans Screen (Remel), Rapid
Trehalose Assimilation (Remel), RTT Glabrata (Fumouze);
- cteva specii: CandiSelect (Bio-Rad), CHROMagar Candida (BD Sciences),
Candida ID2 (bioMerieux), Candichrom II (International Microbio),
Chromogenic Candida Agar (Oxoid);
- specii multiple (zeci de specii din cteva genuri): ID 32C (bioMerieux), RapID
Yeast Plus Panel (Remel), Uni-Yeast Tek Plates (Remel), Auxacolor 2 (Bio-
Rad) (Iig. nr. 8-6 si 8-7, ve:i Anexa), Microplate (Biolog) (Iig. nr. 8-8, ve:i
Anexa).

8.9. 1estul de depistare a necesitilor nutritive speciale

Unele specii de dermatoIiti au exigente nutritive particulare, reclamnd
prezenta n mediile de cultur a unor Iactori troIici ca vitaminele (acid nicotinic,
inozitol, tiamin) sau aminoacizii (histidin). Testul presupune cultivarea susei de
identiIicat pe un set de 7 medii (Trichophyton Agar) notate 1...7:

1. mediu bazal ce contine cazein, Ir vitamine;
2. 1 inozitol;
3. 1 inozitol tiamin;
4. 1 tiamin;
5. 1 acid nicotinic;
6. mediu bazal continnd nitrat de amoniu, Ir aminoacizi;
7. 6 histidin.


183
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0

Acest set de medii este disponibil comercial: Trichophyton Agar 1-7 (Remel,
BD Diagnostics).
Tuburile cu cele 7 medii se nsmnteaz prin transIerul unui mic Iragment din
colonia de testat, avnd grij s nu se preleveze si portiuni de mediu. Ele se incubeaz
apoi la 25-30C sau la 37C (cnd se suspicioneaz T. verrucosum), timp de 14 zile.
Interpretarea rezultatelor se Iace dup 7, respectiv 14 zile, tinnd cont de eventuala
stimulare a cresterii pe mediile aditivate cu vitamine sau aminoacizi comparativ cu cea
observat pe mediile bazale (tabelul 8-1).

Tabelul 8-1
Comportamentul dermatofiilor pe setul de 7 medii aditivate cu factori trofici
Specia 1 2 3 4 5 6 7
E. floccosum
M. audouinii
M. canis
M. cookei
M. ferrugineum
M. gvpseum
M. nanum
M. persicolor
M. praecox
T. afelloi
T. concentricum - -
T. mentagrophvtes
var. interdigitale

T. mentagrophvtes
var. mentagrophvtes

T. rubrum , -
T. schoenleinii
T. terrestre
T. tonsurans , - , - , - , - , - , -
T. verrucosum - - - -
T. violaceum , -
Legend: (crestere normal), - (absenta cresterii), (crestere stimulat), (crestere disgonic)

8.1. 1estul de cultivare pe Agar BCP - lapte - glucoz.

Scop
Permite observarea schimbrilor de pH datorit indicatorului (bromcrezol
purpur) inclus n mediu si ajut la diIerentierea speciilor de dermatoIiti de interes
clinic.

Tehnic de lucru
Mediul, turnat n plci Petri sau Ilacoane cu capacitate de 25-30 ml (nclinat n
acest caz), se nsmnteaz cu tulpina dermatoIitului de identiIicat ntr-un singur punct.
Recipientele nsmntate se incubeaz la 30C timp de 5-10 zile, Iunctie de viteza de
crestere a Iiecrei tulpini n parte. Alcalinizarea mediului n urma dezvoltrii culturii

184
dermatoIitului va antrena virarea culorii acestuia, de la albastru-pal la violet-purpuriu.
Speciile capabile s alcalinizeze mediul sunt: E. floccosum, M. audouinii, T.
mentagrophvtes (var. interdigitale), T. schoenleinii, T. terrestre, T. verrucosum, T.
violaceum. Unele specii (T. verrucosum) sunt capabile s hidrolizeze cazeina din lapte,
producnd o clariIicare a mediului n jurul coloniei.

Precauii
Trebuie s ne asigurm c tulpina de testat nu este impuriIicat cu alte
microorganisme (bacterii sau Iungi) care ar putea da reactii pozitive eronate.

8.11. 1estul de perforare a firului de pr in vitro

Scop
DiIerentierea speciilor de dermatoIiti de interes clinic pe baza producerii
organelor perIoratoare in vitro.

Tehnic de lucru
Se utilizeaz Iire de pr de copil, care se cupeaz n Iragmente de 0,5-1 cm si
se autoclaveaz n plci Petri timp de 10 minute la 121C. Dup autoclavare, se adaug
n Iiecare plac cte 25 ml ap distilat sterilizat si cteva picturi extract de drojdie
10. Plcile astIel pregtite se nsmnteaz cu cteva Iragmente din colonia
dermatoIitului de identiIicat, apoi se incubeaz la 25C, timp de 21 zile. La Iiecare 7
zile, utiliznd Iragmente de pr inoculate, se pregtesc preparate extemporanee (cu
lichid clariIicant, ntre lam si lamel). O alt variant, ar Ii etalarea unor Iragmente de
0,5-1,5 cm din Iirele de pr autoclavate direct pe supraIata coloniilor dezvoltate pe
Agar Sabouraud si continuarea incubrii timp de 21 zile. Testul pozitiv este indicat de
prezenta organelor perIoratoare care strbat tija pilar din loc n loc, avnd traiect
perpendicular pe aceasta (Iig. nr. 8-9, ve:i Anexa). Comportamentul speciilor de
dermatoIiti la acest test este prezentat n tabelul 8-2.

Tabelul 8-2
Comportamentul speciilor de dermatofii la testul de perforare a firului de pr
Test de perforare pozitiv Test de perforare negativ Test de perforare variabil
M. canis M. audouinii E. floccosum
M. cookei M. praecox T. erinacei
M. gvpseum T. equinum T. tonsurans
M. persicolor T. concentricum
T. afelloi M. ferrugineum
M. galinae T. rubrum
M. nanum T. schoenleinii
T. terrestre T. verrucosum
T. mentagrophvtes T. violaceum
T. soudanense


185
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0

8.12. 1estul de cultivare pe boabe de orez

Scop
Este util pentru diIerentierea M. audouinii (crestere restrictiv, pigment brun-
maroniu, absenta sporulrii) de M. canis (crestere abundent, pigment galben,
sporulare intens) (Iig. nr. 8-10, ve:i Anexa). Aceast metod este util si pentru
inducerea sporulrii unor tulpini dermatoIitice nesporulate, disgonice sau cu sporulare
atipic.

Tehnic de lucru
Mediul se prepar n Ilacoane Erlenmeyer cu capacitate de 100 ml, n care se
adaug 8 g orez decorticat si 25 ml ap distilat. Se sterilizeaz prin autoclavare la
121C timp de 15 minute. Dup inoculare, Ilacoanele se incubeaz la 25-30C timp de
pn la 2 sptmni.

8.13. 1estul de filamentare (testul de blastez sau germ-tube test)

Scop
Test tip screening pentru trierea izolatelor de levuri n laboratorul clinic si
identiIicarea prezumtiv a tulpinilor de C. albicans si C. dubliniensis.

Tehnic de lucru
Ca medii pentru blastez se utilizeaz serul sanguin de cal, serul sanguin uman
(Atenie' Risc crescut de contaminare cu HIJ, HJB) sau medii artiIiciale
comercializate de diverse Iirme (Germ Tube Solution Remel, SUA). n Iiole cu
capacitatea de 2 ml se pun n contact 0,5 ml suspensie levuric si 0,5 ml ser sanguin de
cal. Fiolele se mentin apoi n baia de termostatare la 36C timp de 2 ore. Suspensia
levuric se prepar n solutie salin Iiziologic, densitatea acesteia ajustndu-se la 0,5
Mc Farland (cca. 10
5
-10
6
celule/ml). Dup expirarea celor 2 ore, Iiolele se agit si din
Iiecare amestec se preleveaz un volum de 25 l care se etaleaz apoi ntre lam si
lamel. Preparatul extemporaneu astIel obtinut se examineaz la microscop n vederea
decelrii tubilor germinativi caracteristici tulpinilor de Candida albicans si Candida
dubliniensis Iilamente scurte care emerg din blastospor Ir strangulare (Iig. nr. 8-11,
ve:i Anexa). Ca martor al Iilamentrii, se utilizeaz de Iiecare dat o tulpin-tip de
Candida albicans. Se va avea n vedere c si alte levuri pot produce Iormatiuni
similare de tipul pseudoIilamentelor, ns ele se diIerentiaz de adevratii tubi
germinativi prin existenta unei strangulri la locul de emergent din blastospor.

Precauii
Nu se recomand suspensionarea levurilor direct n mediul de blastez,
deoarece concentratia mare a acestora pe unitatea de volum scade sensibilitatea reactiei
prin diminuarea drastic a numrului de celule care vor produce tubi germinativi.
Nivelul rezultatelor Ials negative este n mod normal de cca. 5, ns el tinde s
creasc odat cu mrirea densittii suspensiei levurice.


186

8.14. 1estul de termotoleran / termostimulare

Scop
Testul este Iolosit n special pentru diIerentierea speciilor de dermatoIiti, dar
este aplicabil si n cazul altor Iungi Iilamentosi sau levuriIormi. Are la baz Iaptul c
unele specii de dermatoIiti tolereaz temperatura de 37C pentru dezvoltare (E.
floccosum, T. mentagrophvtes, T. rubrum, T. schoenleinii, T. tonsurans, T. verrucosum,
T. violaceum), altele nu (T. afelloi, T. terrestre etc.); n plus, pentru unele specii (T.
verrucosum, T. soudanense), temperatura de 37C actioneaz chiar stimulativ asupra
dezvoltrii coloniilor comparativ cu temperaturile mai sczute (25C, 30C).

Tehnic de lucru
n vederea studierii acestor caracteristici, se nsmnteaz perechi de tuburi
continnd Agar Sabouraud solidiIicat n pant cu tulpinile n cauz si se incubeaz
diIerentiat la 25 sau 30C si 37C (n cazul dermatoIitilor), la 30C, 37C, 40C, 42C
si 45C (n cazul levurilor) si la 30C, 37C, 40C, 42C, 45C, 52C si 54C (n cazul
Iungilor Iilamentosi) . Interpretarea testului se realizeaz n momentul cnd coloniile
ajung la maturitate pe mediile incubate la temperatura cea mai sczut (25-30C sau
37C). Principalele aspecte privind permisivitatea dezvoltrii la aceste temperaturi n
cazul unor specii de Iungi de interes clinic sunt prezentate n tabelul 8-3.


187
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0

Tabelul 8-3
Comportamentul diverselor specii de fungi la testul de termotoleran
Nr. crt. Specia 37C 40C 42C 45C 52C 54C
1 Absidia corvmbifera -
2 Cunninghamella bertholletiae -
3 Mucor circinelloides - - - -
4 Mucor indicus - - -
5 Rhi:omucor variabilis - - - - -
6 Rhi:omucor pussilus - -
7 Rhi:omucor miehei
8 Rhi:opus a:vgosporus -
9 Rhi:opus microsporus - -
10 Rhi:opus orv:ae ? -
11 Saksenaea vasiformis - - -
12 Svncephalastrum racemosum - - - -
13 Malasse:ia furfur - - - -
14 Malasse:ia pachvdermatis - - - -
15 Malasse:ia sloofiae - - - -
16 Malasse:ia svmpodialis - - - -
17 Arxio:vma telluris - - - -
18 Candida albicans - -
19 Candida chiropterorum - - - -
20 Candida dubliniensis - - -
21 Candida glabrata - - -
22 Candida kefvr - - - -
23 Candida krusei - - - -
24 Candida lusitaniae - - -
25 Candida tropicalis - - - -
26 Geotrichum capitatum - - - -
27 Pseudoalescheria bovdii - - - -
28 Acremonium alabamense - -
29 Coccidioides immitis - - -
30 Cladophialophora arxii - - - -
31 Cladophialophora bantiana - - - -
32 Emmonsia parva - - -
33 Epidermophvton floccosum - - - - -
34 Exophiala dermatitidis - - - -
35 Trichophvton mentagrophvtes - - - - -
36 Trichophvton rubrum - - - - -
37 Trichophvton schoenleinii - - - - -
38 Trichophvton tonsurans - - - - -
39 Trichophvton verrucosum - - - - -
40 Trichophvton violaceum - - - - -
41 Scedosporium prolificans - - - -
42 Sporothichum pruinosum - -
43 Aspergillus fumigatus v v
44 Bipolaris specifera - - - -
Legend: (dezvoltare normal), ? (nu sunt date disponibile), v (rspuns variabil), - (absenta dezvoltrii)

188

1. Artal M E (2004) - Diagnostico histopatologico de las micosis; Rev
Iberoam Micol; 21:1-9.
2. Barnett J A, Payne R W, Yarrow D (2000) - Yeasts: Characteristics and
Identification; 3
nd
edition; Cambridge University Press; Cambridge.
3. Bosnea D, Diaconescu V, Colar L et al. (2003) - Particularittile izolatelor
din hemoculturi la Centrul de Cardiologie Iasi (2001-2003); Rev Med
Chir; 107-3(Supl.1):176-179.
4. Buiuc D (1998) - Microbiologie clinic; Ed. Didactic si Pedagogic RA;
Bucuresti.
Bucuresri.
Iasi.
7. Fidel P L, Vazquez J A, Sobel J D (1999) - Candida glabrata: review oI
epidemiology, pathogenesis and clinical disease with comparison to
Candida albicans; Clin Microbiol Rev ; 12(1):80-96.
8. Freydire A-M, Guinet R (1997) - Rapid methods Ior identiIication oI the
most Irequent clinical yeasts; Rev Iberoam Micol; 14:85-89.
9. Giammanco G M, Pizzo G, Pecorella S, DisteIano S, Pecoraro V, Milici M
(2002) - IdentiIication oI Candida dubliniensis among oral yeastisolates
Irom an Italian population oI human immunodeIiciency virus-inIected
(HIV) subjects; Oral Microbiol Immunol; 17:89-94.
11. Gorka B Z (2002) - Vulvovaginitis candidiasica; Rev Iberoam Micol;
19:22-24.
12. Grillot R (1996) - Les mycoses humaines - dmarche diagnostique;
Elsevier; Paris.
13. Hazen K C, Howell S A (2003) - Candida, Crvptococcus and other yeasts
oI medical importance; In Murray P (ed.) - Manual of clinical
microbiology; 8
th
edition.; ASM Press; Washington.
14. Hoog G S de, Guarro J (1995) - Atlas of clinical fungi; Centraalbureau
voor Schimmelcultures; Baarn.
fungi; 2
nd
Rovira i Virgili.
16. Jabra-Rizk M A, Ferreira S M S, Sabet M et al.(2001) - Recovery oI
Candida dubliniensis and other yeasts Irom human immunodeIiciecy
virus-associated periodontal lesions; 1 Clin Microbiol ; 39(12):4520-4522.
17. Ribes J A, Vanover-Sams C L, Baker D J (2000) - Zygomycetes in Human
Disease; Clin Microbiol Rev; 13(2):236-301.
18. Salkin I F, Gordon M, SamsonoII W, Rieder C (1985) - Blastoschi:omvces
capitatus, a new combination; Mycotaxon; 22:375-380.

189
!
"
#
$
%
&
'
(
'

0

19. Samaranayake Y H, Samaranayake L P (1994) - Candida krusei: biology,
epidemiology, pathogenicity and clinical maniIestations oI an emerging
pathogen; 1 Med Microbiol; 41:295-310.
20. Silva V, Cabrera M, Diaz C M, Abarca C, German H (2003 a) -
Prevalencia de serotipos de Candida albicans en aislamientos de
hemocultivo en Chile y primer caso de candidemia por Candida
dubliniensis; Rev Iberoam Micol; 20:46-51.
21. Silva V, Zepeda G (2003 b) - First chilean report oI nosocomial urinary
tract inIection due to Trichosporon asahii, in 2 patients; Rev Med Chil;
131(4):461-463.
22. Smith A (2004) - IdentiIying Candida species - An increasing cause oI
serious systemic inIections; Eur Clin Lab; 23(6):12-15.
23. Sullivan D J, Westerneng T J, Haynes K A, Bennett D E, Coleman D C
(1995) - Candida dubliniensis sp. nov: phenothypic and molecular
characterisation oI a novel species associated with oral candidosis in HIV-
inIected individuals; Microbiol; 141:1507-1521.
24. Sullivan D, Moran G, Donnelly S, Gee S, Pinjon E et al. (1999) - Candida
dubliniensis: An update; Rev Iberoam Micol; 16:72-76.
25. Sutton D A, Fothergill A W, Rinaldi M G (1998) - Cuide to clinically
significant fungi; Williams Wilkins; Baltimore.
26. Warren G, Hazen K C (1995) - ,Candida, Crvptococcus and other yeasts
oI medical importance n Fromtling R A - Mycology; VII
th
section;
Murray P R, Baron E J, PIaller M A, Tenover F C, Yolken R A (eds.):
Manual of Clinical Microbiology; VI
th
ed.; ASM Press; Washington DC.

Mihai Mares

191
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1

Mihai Mares

9.1. Extracia ADA-ului pentru PCR

e preIer Iolosirea kit-urilor comercializate (e.g. High Pure PCR Template
Preparation Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)
metodelor artizanale de extractie a ADN-ului. Recomandabil este ca Iiecare laborator
s se Iamiliarizeze si s Ioloseasc de rutin unul, cel mult dou metode / kit-uri de
extractie.

9.2. Extracia ADA-ului cu ajutorul kit-ului
High Pure 1emplate Preparation Kit (levuri)

Principiul metodei
Reactivii acestui kit permit lizarea celulelor ntr-o scurt perioad de timp de
coincubare cu proteinaza K, n prezenta unui inactivator al nucleazelor (guanidina
hidrocloric). Acizii nucleici precipit si ader la supraIata unor Iibre de sticl
existente ntr-un microtub, ceea ce ulterior va permite prezervarea lor n timpul
operatiunilor de splare-centriIugare destinate ndeprtrii moleculelor indezirabile. Nu
sunt necesare precipitri sau extractii suplimentare cu solventi organici.

Etape

1) din cultura tulpinii levurice (pe medii solide uzuale, veche de 24-48 ore)
se preleveaz o ans de 10 l bine ncrcat (aproximativ 10
8
- 10
9
celule);
2) se suspensioneaz levurile prelevate ntr-un ml ap puriIicat / distilat
sterilizat;
3) se centriIugheaz suspensia obtinut 5 minute la 10000 rpm;
4) se ndeprteaz supernatantul, apoi se adaug peste sediment 200 l
Tissue lvsis buffer (TLB);
5) se adaug 40 l proteinaz K;
6) se vortexeaz energic;
7) se incubeaz la 55C timp de 30 de minute;
8) se centriIugheaz imediat pentru a readuce n supernatant picturile de
condens aprute pe buson;
9) se adaug 200 l Lvis Binding Buffer (LBB);
S
9
Tehnici de micologie molecular

192
10) se vortexeaz;
11) se incubeaz la 70C timp de 15 minute;
12) se repet etapa nr. 8;
13) se adaug 100 l izopropanol;
14) se vortexeaz;
15) se transIer n microcoloan (disponibil n kit);
16) se centriIugheaz 1 minut la 8000 rpm;
17) se nlocuieste tubul colector pentru microcoloan;
18) se adaug 450 l Inhibitor Removal Buffer;
20) se repet etapa nr. 17;
21) se adaug 450 l Washing Buffer;
22) se centriIugheaz 2 minute la 13000 - 14000 rpm;
23) se aseaz microcoloana pe un tub EppendorI de 1,5 ml;
24) se adaug exact n centrul microcoloanei 50 l Elution Buffer prenclzit
la 70C;
26) se marcheaz corespunztor si se pstreaz la 4C.

9.3. Extracia ADA-ului prin crioprecipitare (fungi filamentoi)

Principiul metodei
Celulele sunt lizate cu ajutorul cloroIormului, dup care ADN-ul este precipitat
prin mentinerea la temperaturi sczute.

Etape

1) ntr-un tub EppendorI de 1 ml capacitate, continnd 40-100 mg Kieselgel-
2, se introduc 300 l CTAB buffer;
2) se adaug apoi cu ajutorul unei spatule, o mic portiune din colonia de
analizat, care se Iragmenteaz n portiuni ct mai mici;
3) se adaug 200 l CTAB buffer;
4) se vortexeaz;
5) se incubeaz la 65C, timp de 10 minute;
6) se adaug 500 l cloroIorm;
7) se vortexeaz;
8) se centriIugheaz 5 minute la 14000 rpm;
9) se transIer stratul superior ntr-un nou tub EppendorI;
10) se adaug un volum dublu (aprox. 800 l) de alcool etilic absolut prercit
( 4C);
11) se agit usor;
12) se mentine amestecul la 20C, minim 30 minute (chiar si pn a II-a zi),
pentru precipitarea ADN-ului;
13) se centriIugheaz 5-10 minute la 14000 rpm;
14) se las n repaus pentru decantare;
15) se spal precipitatul cu alcool etilic 70 rece;
Mihai Mares

193
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1

16) se usuc timp de 10 minute ntr-o instalatie de vacuum;
17) se resuspend precipitatul n 97,5 l TE buffer cu 2,5 l ribonucleaz.

9.4. Controlul calitii acizilor nucleici extrai

Indicaii
ConIirmarea calittii acizilor nucleici obtinuti n urma extractiei si a lipsei
degradrii acestora

Metoda
ElectroIorez n gel de agaroz

Etape

1 - Prepararea gelului de agaroz 1 n TAE 1x
a) se adaug pulberea de agar n solutia TAE, apoi se nclzeste amestecul pe
o plit electromagnetic sau ntr-un cuptor cu microunde pn la
solubilizarea total;
b) se rceste cteva minute sub agitare continu;
c) se toarn gelul n suport, evitnd Iormarea de bule care pot aIecta
migrarea ADN-ului si se las n repaus pn la solidiIicarea sa complet.
2 - Pregtirea probelor de ADN si a markerilor de greutate molecular
a) probe: 10 l extract ADN 2 l albastru de bromIenol 2x;
b) markeri de greutate molecular (500 g/ml):
1 l marker 1 kb 9 l ap distilat steril 2 l albastru de
bromIenol 6 x;
c) pipetarea probelor de ADN si a markerilor de greutate molecular pe linia
de start a gelului de agaroz (12 l);
3 - ElectroIoreza : ca tampon se Ioloseste TBE 0,5x, iar migrarea va dura 20 minute la
100 V;
4 - Colorarea: dup ncheierea migrrii, blocul de gel se imersioneaz timp de cel putin
15 minute ntr-o baie de colorare continnd bromur de etidiu n TAE 1x (10
g/ml).
Atenie ''' Bromura de etidiu este o substan cu potenial carcinogen. Se va
manipula doar cu mnui de protecie '
5 - Vizualizarea gelului n lumin ultraviolet (Iolosind un transluminator) si
IotograIierea acestuia; ADN-ul de calitate se prezint sub Iorma unei benzi
compacte, cu greutate molecular mare (Iig. nr. 9-1)

194

Fig. nr. 9-1 Controlul calittii ADN-ului

9.5. Identificarea speciei Candida dubliniensis prin PCR duplex

DiIerentierea cu acuratete a speciilor Candida albicans si Candida dubliniensis
exclusiv pe baza caracterelor Ienotipice este discutabil datorit rezultatelor
inconstante. n vederea identiIicrii corecte a speciei Candida dubliniensis, este
preIerabil, pentru siguranta si expeditivitatea ei, o tehnic de biologie molecular care
presupune Iolosirea a dou perechi de primeri (amorse): una de amorse speciIice unui
intron al genei codante pentru actin (DUBF / DUBR) si alta de amorse universale
pentru ADN-ul ribozomal (ITS1 / ITS4). Dintre cele dou specii amintite, doar
Candida dubliniensis genereaz n urma ampliIicrii dou benzi - una de 288 perechi
de baze (pb) cu setul DUBF / DUBR si una de cca. 600 pb, cu amorsele universale (Iig.
nr. 9-2). Candida albicans va genera o singur band, pe cea de 600 pb, cu amorsele
universale.

ITS 1: 5TCCTGAGGTGAACCTGCGG3
ITS 4: 5TCCTCCGCTTATTGATATGC3
DUBF: 5GTATTTGTCGTTCCCCTTTC3 (nucleotidele 251-270)
DUBR: 5GTGTTGTGTGCACTAACGTC3 (nucleotidele 519-538)

Reactivi necesari

- ADN Candida albicans (martor pozitiv 1)
- ADN Candida dubliniensis (martor pozitiv 2)
- ADN-ul tulpinii de identiIicat
- solutii stock ale reactivilor destinati PCR
- ap puriIicat (martor negativ)
Mihai Mares

195
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1

Fig. nr. 9-2 Aspectul celor dou tipuri de
benzi dup developarea gelului de agaroz n
bromur de etidiu si IotograIiere n UV; n
ordine, de la stnga la dreapta: Candida
albicans martor, Candida dubliniensis
martor si o tulpin de identiIicat (1B5D - C.
dubliniensis).

Mod de lucru

1 - Se calculeaz cantittile de reactivi necesare preparrii mixului (conIorm
tabelului 9-1) avnd n vedere cele patru esantioane ce vor Ii Iolosite (martor
pozitiv 1, martor pozitiv 2, martor negativ, proba de testat). Se vor aduga n
plus cantittile de reactivi necesare pentru nc un esantion, astIel nct n
momemtul divizrii mix-ului, cantittile necesare pentru cele patru esantioane s
Iie suIiciente.
Tabelul 9-1
Prepararea mixului
Numr de esantioane: 41
MIX Volum / esantion (l) Volum / Mix (l)
PCR BuIIer 10x 2 10
MgCl
2
25 Mm 2 10
dTTP, dATP, dCTP, dGTP 2,5 mM 2 10
Amorse
DUBF (20 M) 0,5 2,5
DUBR (20 M) 0,5 2,5
ITS 1 (20 M) 0,5 2,5
ITS 4 (20 M) 0,5 2,5
Amplitaq gold
5 U/l
0,25 1,25
Ap puriIicat
ad 20 l
10,5 52,5
ADN 1 l


196
2. Se decongeleaz reactivii (cu exceptia Amplitaq gold) si se mentin la gheat
pn la utilizare;
3. Se prepar mixul, se adaug enzima si apoi se vortexeaz;
4. Se distribuie mixul n tuburi PCR de 0,2 ml;
5. Se adaug:
- 1 l ADN Candida albicans n esantionul pentru martorul pozitiv 1;
- 1 l ADN Candida dubliniensis n esantionul pentru martorul pozitiv 2;
- 1 l ADN tulpin de identiIicat n esantionul probei de testat;
- 1 l ap puriIicat n esantionul martorului negativ.
6. Se introduc tuburile n thermocvcler si se supun urmtorului regim termic:
50C/5 minute
95C/ 10 minute

apoi, 94C/ 30 sec.
58C/ 30 sec.
72C/ 30 sec.

30 cicluri

apoi, 72C/ 10 minute

7. Dup ncheierea ampliIicrii, esantioanele se mentin la 4C pn la
vizualizarea pe gel de agaroz.

9.6. Identificarea molecular a levurilor prin PCR
i secvenializarea regiunilor ITS

Reactivii necesari acestei tehnici constau n:
- matricea ADN care contine regiunea de ampliIicat (n cazul de Iat :
ITS 1 si ITS 4 din cadrul ADN-ului codant al ARN-ului ribozomal);
- doi primeri (amorse) speciIici care identiIic nceputul si sIrsitul
regiunii de ampliIicat;
- ADN-polimeraza care copie regiunea de ampliIicat;
- nucleotide, cu ajutorul crora ADN-polimeraza va genera noul ADN;
- solutia tampon care asigur conditiile de reactie necesare activittii
ADN-polimerazei;

Primeri pentru regiunile ITS

ITS 1 : 5-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG (3)
ITS 4 : 5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC (3)
ITS 5: 5-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG (3)
LR6: 5-CGC CAG TTC TGC TTA CC (3)
V9D: 5-TTA AGT CCC TGC CCT TTG TA (3)
LS266: 5- GCA TTC CCA AAC AAC TCG ACTC (3)

Mihai Mares

197
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1

Tehnica de lucru

1. Se decongeleaz reactivii necesari (cu exceptia enzimei Taq) si apoi se mentin la
gheat pn n momentul utilizrii;
2. Se calculeaz cantittile necesare pentru ampliIicarea numrului de esantioane
luate n lucru (conIorm tabelului 9-2), adugnd totdeauna un supliment pentru
un esantion n plus (n vederea suplinirii pierderilor din timpul pipetrii
ulterioare a mix-ului). Volumul Iinal al Iiecrui esantion va Ii de 50 l. AstIel,
dac avem doar o singur prob de ADN pentru identiIicare, vom pregti un
mix pentru 31 esantioane: proba ADN pentru identiIicare, un martor pozitiv,
un martor negativ si un esantion suplimentar; n cazul a dou probe pentru
identiIicare: 41 s.a.m.d.

Tabelul 9-2
Prepararea mixului
Reactivi
Volum/eantion
(l)
Volum/ total mix (l)
Concentraia
final
Tampon PCR 10x 5 (nr. esantionsupliment)x5 1x
MgCl
2
25 mM 5 (nr. esantion supliment)x5 2,5 mM
dNTP 2,5 mM 5 (nr. esantion supliment)x5 0,25 mM
Primer ITS 1 20M
sau primer V9D 20
M
1,25
(nr. esantion
supliment)x1,25
25 p mol
Primer ITS 4 20 M
sau primer LS 266
20 M
1,25
(nr. esantion supliment)x
1,25
25 p mol
Amplitaq Gold 5U/
l
0,25
(nr. esantion
supliment)x0,25
1,25 U
Ap distilat steril
ad 45 l
27,25
(nr. esantion
supliment)x27,25
-
ADN 5 l -
Iiecare esantion cu ADN-ul su, exceptnd martorul negativ si esantionul
suplimentar

3. Se vortexeaz mix-ul si se repartizeaz cte 45 l n tuburi PCR cu volum de
0,2 ml;
4. Se adaug n Iiecare tub (martor pozitiv, probe de analizat) 5 l ADN,
omogeniznd apoi continutul cu ajutorul pipetei;
5. Se plaseaz tuburile n thermocvcler si se supun urmtorului regim termic:
95C/ 10 min
apoi, 94C/ 30 sec.
58C/ 30 sec.
72C/ 30 sec.

30 cicluri
apoi, 72C/ 10 min.

198

6. PuriIicarea produsilor PCR obtinuti, cu ajutorul kit-urilor comercializate (de tip
QIAquick, Qiogen)
Aceast etap este necesar pentru ndeprtarea primerilor, nucleotidelor,
enzimelor, srurilor, agarozei, bromurii de etidiu si a altor impuritti restante n
esantioanelor de ADN si obtinerea n stare pur a regiunilor ampliIicate prin PCR.
- se transIer produsii de PCR ntr-un tub EppendorI de 1,5 ml;
- se adaug un volum de 5 ori mai mare de tampon PB si se omogenizeaz (225 l
tampon PB pentru 45 l);
- se introduce amestecul ntr-o coloan QIAquick;
- se centriIugheaz apoi timp de 30-60 sec la 13000 rpm pentru Iixarea ADN-ului
pe coloan;
- se ndeprteaz Iaza lichid, plasndu-se coloana pe acelasi tub colector;
- se spal ADN-ul Iixat pe coloan adugnd 0,75 ml tampon PE si se
centriIugheaz apoi 30-60 sec la 13000 rpm;
- se ndeprteaz lichidul si se recentriIugheaz;
- se aseaz coloana pe un tub EppendorI de 1,5 ml;
- se elueaz ADN-ul prin depunerea strict n centrul membranei a 50 l tampon
EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5);
- se mentine 1 minut la temperatura camerei;
- se centriIugheaz 1 minut la 13000 rpm;
7. VeriIicarea produsilor de PCR prin migrare n gel de agaroz.
Preci:ri importante
- gel de agaroz 3 n TAE 1x;
- esantioanele ce urmeaz a Ii pipetate se compun din 5 l produs PCR si 2 l
albastru de bromIenol;
- martorii de greutate molecular ce urmeaz a Ii co-pipetati (500 g/ml) se prepar
din 1 l marker 100 pb, 9 l ap distilat steril si 2 l albastru de bromIenol
6x;
- migrare timp de o or la 100 V;
- developare n baie cu bromur de etidiu, timp de minim 15 minute;
- vizualizarea gelului n lumin UV (la transluminator si IotograIierea benzilor de
ADN).
8. Secventializarea Iragmentelor de ADN ampliIicate prin PCR (de preIerat
utiliznd un secventializator de tip BigDve Perkin Elmer, SUA)
9.Analiza secventelor cu ajutorul unui soIt specializat (e.g. CHROMAS Iig. nr.
9-3) si compararea cu secventele dintr-o baz de date n vederea detectrii
speciilor cu un nalt grad de omologie a secventelor. Sistemul BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool) (Iig. nr. 9-4) si baza de date GenBank a National
Center Ior Biotechnology InIormation (NCBI) - Bethesda (SUA) sunt cele mai
utilizate mijloace pentru identiIicarea Iungilor (adresa URL:
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Mihai Mares

199
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1

Fig. nr. 9-3. InterIata de lucru a soItware-ului CHROMAS

Fig. nr. 9-4. Pagina de lucru pentru analiza secventelor de ADN


200

9.7. Reactivi utilizai n tehnicile de biologie molecular

- CTAB tampon

Tris ............................................ 2,42 g
Clorur de sodiu .......................... 8,2 g
EDTA sodic .............................. 0,74 g
Bromur de cetil-amoniu ............ 2,0 g
Ap bidistilat .......................... 100 ml

Se ajusteaz pH-ul la valoarea 7,5
cu ajutorul unei solutii HCl 1N.
Se autoclaveaz 15 minute la
121C. Se pstreaz la temperatura camerei.

- Proteinaza K

Proteinaz K .......................... 10 U/ml
Tris (pH 7,4) .............................. 0,24 g
Clorur de calciu dihidrat ........ 3,0 mg
Ap bidistilat .......................... 100 ml

Se sterilizeaz prin Iiltrare si se
pstreaz n Iiole la -20C.

- TAE tampon 50x (Tris-acetate
EDTA buffer 50x)

Tris-HCl ...................................... 240 g
Acid acetic glacial .................. 57,1 ml
EDTA disodic 0,5 M ............... 100 ml
Ap bidistilat ................... ad 1000 ml

Se sterilizeaz prin autoclavare timp
de 15 minute la 121C. Se stocheaz la
temperatura camerei. Se dilueaz cu ap
bidistilat n momentul Iolosirii.

- TE tampon (Tris-EDTA buffer)

Tris ............................................ 0,12 g
Na-EDTA .................................. 0.04 g
Ap bidistilat ..................... ad 100 ml

Se ajusteaz pH-ul la valoarea 8,0 cu
solutie NaCl 1 N. Se sterilizeaz prin
autoclavare timp de 15 minute la 121C. Se
stocheaz la temperatura camerei.

- TBE tampon (Tris Borate ETDA
buffer)

Tris ............................................ 108 g
Acid boric ..................................... 55 g
EDTA tetrasodic ......................... 9,3 g
Ap bidistilat ................... ad 1000 ml
pH 8,3

- PB tampon (Phosphate Buffer 0,2 M)

FosIat disodic anhidru ............... 21,8 g
FosIat monosodic anhidru ........... 6,4 g
Ap bidistilat .................. ad 1000 ml

Se ajusteaz pH-ul la 7,4; se
stocheaz la temperatura camerei.

- PE tampon (Phosphate Elution
Buffer)

Const ntr-o solutie 4mM de IosIat
monopotasic care se prepar prin diluarea cu
ap bidistilat a unei solutii stoc de IosIat
monopotasic 1M.

Mihai Mares

201
!
"
#
$
%
&
'
(
'

1


1. Donnely S M, Sullivan D J, Shanley D B, Coleman D C (1999) - Phylogenetic
analysis and rapid identiIication oI Candida dubliniensis based on analysis oI
ACT 1 intron and exon sequences; Microbiol; 145(8):1871-1882.
2. Hoog de G S, Guarro J, Gene, Figueras M J (2000) - Atlas of clinical fungi; 2
nd

edition ; Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.
3. Kawasaki M, Aoki M (2006) - Application oI molecular biological techniques to
medical mycology; In Topley Wilsons, Microbiology and Microbial
Infections 10
th
edition; Hodder Arnold.
4. Kurtzman C P, Boekhout T, Robert V, Fell W, Deak T (2003) - Methods to
identify yeasts; In: Boekhout T, Robert V (eds) - Yeasts in Food; B.Behrs
Verlag GmbH Co; Hamburg; Germany.
5. Peman J, Martin-Mazuelos E, Rubio Calvo M C (eds) (2001) - Guia Practica de
IdentiIicacion y Diagnostico en Micologia Clinica; Rev Iberoam Micol; Bilbaos.

Mihai Mares

203
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
2

Mihai Mares

Tabelul 10-1
Codul si intervalul concentratiilor de antiIungic al benzilor E-test
(AB Biodisk, Solna-Suedia)

Cod Denumire antiIungic Intervalul concentratiilor
(m /ml)
AP AmIotericin B 0,002 32
FC 5 Flucitozin 0,002 32
FL Fluconazol 0,016 256
IT Itraconazol 0,002 32
VO Voriconazol 0,002 32
CS CaspoIungin 0,002 32
POS Posaconazol 0,002 - 32

1.1. 1ehnica de lucru pentru levuri
(fungi din genurile Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, 1richosporon)

1 - Prepararea inoculului
Pornind de la culturi eIectuate pe Agar Sabouraud sau PDA, vechi de 24 ore
(Candida spp.) sau 48-72 ore (Crvptococcus neoformans) se prepar o suspensie n ser
Iiziologic sterilizat utiliznd ansa microbiologic.
Densitatea suspensiei se ajusteaz la valoarea 0,5 McFarland pentru levurile genului
Candida si 1 McFarland n cazul tulpinilor de C.neoformans.
2 - Insmanarea mediului
Ca mediu de testare se Ioloseste Agar RPMI MOPS glucoz 2, cu grosime de 4
0,5 mm. n cazul amIotericinei B, pentru depistarea cu acuratete a rezistentei este
recomandat mediul AM3.
n vederea nsmntrii mediului, se depun n centrul plcii cca. 200 l inocul (pentru
cele cu 90 mm) sau 400 l (pentru cele cu 150 mm). Inoculul se disperseaz apoi n trei
directii cu ajutorul unui tampon. Plcile se las n repaus la 35C timp de 1015 minute,
10
Tehnici de evaluare a sensibilittii la
antiIungice
Tehnici de evaluare a sensibilittii la antiIungice

204
pentru uscarea supraIetei mediului (o alternativ ar Ii expunerea supraIetei mediului la Iluxul
de aer laminar dintr-o hot microbiologic cls. II).
3 - Alegerea antifungicelor
n Iunctie de tulpinile testate vom alege benzile E-test cu antiIungice (tabelul 10-2).

Tabelul 10-2
Alegerea antifungicelor pentru testare
Trichosporon spp. Candida spp. Crvptococcus spp. Rhodotorula spp.
AP (CMI-uri
obisnuit crescute)
FL
IT
VO
AP
CS (Irecvent CMI-uri
crescute pentru
C.parapsilosis)
FC
FL (rezistent
primar pentru
C.krusei)
IT
VO
AP
FL
VO
AP
FL(Irecvent CMI-uri
crescute)
IT
VO

4 - Aplicarea ben:ilor E-test
- Numrul optim al benzilor ce vor Ii aplicate este de 5/plac 150 mm si 1/plac
90 mm, dispuse radiar, concentratia maxim Iiind plasat excentric;
- Benzile se stocheaz la -20C si se las la temperatura camerei 15 20 de minute,
nainte de a Ii utilizate;
- Benzile se pot aplica cu ajutorul unei pense, cu aplicatorul manual, cu stiloul
vacuumatic Nema C88 sau cu aplicatorul automat Simplex C76. Dup aplicare, se veriIic
contactul ntre benzi si mediu, eliminnd prin presare eventualele bule de gaz;
- Benzile se aplic cu scala gradat nspre capacul plcii si cu concentratia maxim
spre periIeria acesteia;
- Odat aplicate, benzile nu se misc.
5 - Incubarea plcilor se Iace cu capacul n jos, timp de 24-48 ore (Candida spp.) si 48-72 de
ore (C.neoformans).
6 - Citirea concentraiei minime inhibitorii (CMI) se Iace lund n considerare punctul n care
elipsa zonei de inhibitie intersecteaz banda E-test.

Reguli de citire a CMI n cazul levurilor

- AP: se va tine cont de toate coloniile ; citire la 100 inhibitie (Iig. nr. 10-1);
- FL, IT, VO: citire la 80 inhibitie; se tine cont de prima schimbare n modul de crestere a
coloniilor (diminuarea dimensiunilor acestora). Nu se va tine cont de microcolonii (chiar
semiconIluente) care pot apare n interiorul zonei de inhibitie. n schimb, dac sunt prezente
macrocolonii ele semniIic heterorezistent (prezenta unei clone rezistente pe lng cea
sensibil) si se va raporta CMI-ul maxim (Iig. nr. 10-2);
Atenie' Plcile se citesc sistematic la 24 i 48 de ore.
- FC: citire la 90- 95 inhibitie. Nu se tine cont de microcoloniile ce pot apare la periIeria
zonei de inhibitie (Iig. nr. 10-3);
Mihai Mares

205
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
2

- CS : citire la 100 inhibitie. Poate apare uneori eIecul paradoxal de crestere - microcolonii
n jurul concentratiilor maxime: nu va Ii luat n considerare la lectura CMI (Iig. nr. 10-4);
n cazul asimetriilor (concentratii diIerite pe cele dou laturi ale benzii E-test) se va raporta
drept CMI concentratia cea mai mare.

Fig. nr. 10-1. Aspectul zonei de inhibitie n
cazul AP (CMI: 0,064 mg/l)

Fig. nr. 10-2. Aspectul zonei de inhibitie n
cazul FC (CMI: 0,064 mg/l)


206

Fig. nr. 10-3. Aspectul zonei de inhibitie
n cazul unei tulpini de C. krusei
(rezistent la FL); CMI: 256 mg/l

Fig. nr. 10-4. Aspectul zonei de inhibitie
n cazul CS (CMI: 0,094 mg/l)

1.2. 1ehnica de lucru pentru fungi filamentoi
(fungi din genurile Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Scedosporium)

1- Prepararea inoculului
Peste culturile de 5-7 zile dezvoltate pe SDA sau PDA nclinat, se adaug 1-2
ml ser Iiziologic steril si cu ajutorul unei pipete Pasteur sau anse microbiologice se
realizeaz o suspensie de spori si hiIe care se transIer ntr-un tub steril. Acesta se
vortexeaz usor si apoi se las n repaus cca. 15-20 minute pentru sedimentarea
particulelor grosiere. Dup expirarea acestui interval de timp, supernatantul se
recupereaz si se transIer n alt tub steril. Turbiditatea acestuia se ajusteaz cu ser
Iiziologic la 0,5 McFarland sau se corecteaz astIel nct s se obtin o transmitant de
cca. 70 prin citire la spectroIotometru (530 nm). Concentratia obtinut va Ii de cca.
10
6
UFC/ml inocul.
2- Inocularea plcilor
Se realizeaz n mod similar celui prezentat pentru levuri.
3- Alegerea antifungicelor (tabelul 10-3)

Mihai Mares

207
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
2

Tabelul 10-3
Alegerea antifungicelor pentru testare
Aspergillus spp. Fusarium spp. Rhi:opus spp. Scedosporium spp.
AP (A.terreus
rezistent primar)
CS
IT
POS
VO
AP
VO
POS
AP
POS
CS
POS

VOR

doar pentru S. apiospermum si S.aurantiacum

4 - Aplicarea ben:ilor E-test
Se realizeaz n mod similar celui prezentat la levuri.
5 - Incubarea plcilor
Se realizeaz la 35C timp de 24-48-72 de ore n Iunctie de dinamica dezvoltrii
Iiecrei tulpini. Pentru tulpinile de Fusarium spp. plcile se incubeaz la 35C timp de
24-48 de ore, apoi se mentin la 25C pentru 24-48 ore n vederea clariIicrii CMI.
6 - Citirea CMI.
- Rhi:opus spp. - la 18-24 ore;
- celelalte specii- 24-48 (chiar 72 ore pentru tulpinile cu crestere lent) .

Reguli de citire a CMI n cazul fungilor filamentoi
- AP: citire la 100 inhibitie; elipsa zonei de inhibitie trebuie s Iie clar (Iig. nr. 10-5)
- IT, VO, POS : citire la 100 inhibitie (Iig. nr. 10-6)
- CS : citire la inhibitie partial (Iig. nr.10-7)

Fig. nr. 10-5 Aspectul zonei de
inhibitie n cazul AP
(CMI: 16 mg/l)


208

1.3. 1estarea sensibilitii la antifungice prin metoda difuzimetric Kirby-Bauer
(cu discuri)

Pentru testarea sensibilittii la voriconazol si Iluconazol a levurilor din genul
Candida si Crvptococcus se poate Iolosi si metoda recomandat de CLSI (M44-A). n
acest scop, se utilizeaz ca mediu de testare Agarul Meller-Hinton aditivat cu 2
glucoz (ca agent de stimulare a cresterii) si 0,5 !g/ml albastru de metilen (pentru
evidentierea optim a conturului zonelor de inhibitie a cresterii), volumul repartizat n
Fig. nr. 10-6. Aspectul zonei
de inhibitie n cazul IT
(CMI: 0,75 mg/l)
Fig. nr. 10-7. Aspectul zonei de
inhibitie n cazul CS
(CMI: 0,047 mg/l)

Mihai Mares

209
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
2

placa Petri Iiind de aproximativ 25 ml/plac cu 90 mm si 67-70 ml/plac cu 150
mm. Mediul se inoculeaz cu 200 !l (400 l n cazul plcilor cu 150 mm) suspensie
levuric 0,5 McFarland care se distribuie uniIorm prin strieri n 3 directii cu ajutorul
unui tampon steril. SupraIata plcilor astIel nsmntat se usuc la Iluxul de aer
laminar al unei hote microbiologice dup care se etaleaz n centrul acestora cte un
disc de voriconazol (1 g) sau Iluconazol (25 g).
Plcile se incubeaz 20-24 ore la 36 1C, dup care se msoar diametrul
zonei de inhibitie (Iig. nr. 10-8). Se consider c procentul de 80 inhibare a cresterii
este aplicabil si n cazul acestor 2 derivati azolici, de aceea microcoloniile aprute la
limita sau n interiorul zonei de inhibitie nu vor Ii luate n considerare. Pentru
interpretarea semniIicatiei diametrului zonei de inhibitie a cresterii se utilizeaz
recomandrile prezentate n tabelul 10-4 si tabelul 10-5.

Fig. nr. 10-8. Aspectul zonei de inhibitie pentru voriconazol
n cazul unei tulpini de Candida albicans

Tabelul 10-4
Recomandri de interpretare a susceptibilitii la fluconazol
Sensibil Sensibil dependent de doz Rezistent
_ 19 mm 15 18 mm _ 14 mm
_ 8g/ml 16 32 g/ml _ 64 g/ml

Tabelul 10-5
Recomandri de interpretare a susceptibilitii la voriconazol
Sensibil Sensibil dependent de doz Rezistent
_ 17 mm 14 16 mm _ 13 mm
_ 1g/ml 2 g/ml _ 4 g/ml


210

1. Espinel-IngroII A, Rezusta A (2002) - E-Test Method Ior Testing
Susceptibilities oI Aspergillus spp. to the New Triazoles Voriconazole and
Posaconazole and to Established AntiIungal Agents: Comparison with
NCCLS Broth Microdilution Method; 1 Clin Microbiol; 40(6):2101-2107.
2. Groll A. H, Kolve H (2004) - AntiIungal Agents: In Jitro Susceptibility
Testing, Pharmacodynamics, and Prospects Ior Combination Therapy, Eur
1 Clin Microbiol Infect; 23(3):256-270.
3. John H R, PIaller, M A, Walsh T J et al. (2001) - AntiIungal Susceptibility
Testing: Practical Aspects and Current Challenges; Clin Microbiol Rev;
14(4): 643-658.
4. PIaller M A , Boyken L, Messer S A et al. (2005) - Comparison oI Results
oI Voriconazole Disk DiIIusion Testing Ior Candida Species with Results
Irom a Central ReIerence Laboratory in the ARTEMIS Global AntiIungal
Surveillance Program; 1 Clin Microbiol; 43(10):5208-5213.
5. PIaller M A, Messer S A, Boyken L et al. (2004) - Evaluation oI the
NCCLS M44-P Disk DiIIusion Method Ior Determining Susceptibilities oI
276 Clinical Isolates oI Crvptococcus neoformans to Fluconazole; 1 Clin
Microbiol; 42(1):380-383.
6. Peman J, Martin-Mazuelos E, Rubio Calvo M C (2001) - Guia Practica de
IdentiIicacion y Diagnostico en Micologia Clinica; Rev Iberoam Micol;
Bilbao.

211
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)


gam variat de metode analitice este astzi disponibil pentru a studia
agentii biologici din spatele usilor nchise. Din moment ce nu exist la ora
actual o metod standardizat, universal acceptat, n plan national si international
pentru determinarea / cuantiIicarea Iungic de macro / microclimat, studierea
comparativ a mai multor metode sau tehnici de recoltare si analiz va servi unei mai
bune aprecieri ambientale, dezideratul Iinal constnd n scderea ncrcturii
microbiologice n ansamblu. n general, ncrctura Iungic de microclimat ar trebui s
aib corespondent cu cea exterioar n privinta genurilor / speciilor identiIicate si s
Iie mai redus din punct de vedere cantitativ.
Fungii aeropurtati sunt Iactori antisanogeni binecunoscuti, producnd alergeni,
substante cu eIect iritant si/sau toxic. Inhalarea sau contactul direct cu aceste subtante
pot induce la indivizii mai sensibili un rspuns alergic amplu cu episoade Iebrile,
strnut, congestie conjunctival, rinoree, dermatit etc. n Iunctie de particularittile
imunitare ale Iiecrui caz n parte, rspunsul alergic poate Ii imediat sau ntrziat.
Cercetrile privind inIluenta sporilor Iungici din habitate asupra snttii umane sau
animale sunt n continu desIsurare. Dac se constat un nivel Iungic mai ridicat n
spatiile nchise dect n exterior, atunci sigur se poate vorbi de existenta unor Iactori
care Iavorizeaz aceast schimbare a raportului de Iorte. n plus, identiIicarea anumitor
genuri / specii Iungice, chiar n cuantum sczut, la nivel de microclimat, impune
eIectuarea unor evaluri ulterioare ce s conduc la interpretri statistice. Scopul
recoltrii probelor este acela de a aprecia ntregul prin analiza subseturilor
populationale ale acestuia. La ora actual exist o multitudine de metode de testare ce
pot Ii utilizate pentru detectia Iungilor aIlati n aerosuspensie sau sedimentati si a celor
care se dezvolt pe diverse suporturi / substraturi inerte din diverse spatii.

O
11
Tehnici de aeromicologie

212
11.1. Caseta AIR-O-CELL
2

Principii procedurale
Caseta Air-O-Cell destinat colectrii probelor de aer este un dispozitiv
destinat analizrii rapide a unei game variate de particule aerosolizate (aeroparticule),
precum spori Iungici, pollen, celule epiteliale, Iibre, particule anorganice sau portiuni
din corpul unor insecte (Iig. nr. 11-1).
Aerul ptrunde n caset absorbit cu ajutorul unei pompe, iar particulele sunt
impactate pe un substrat incolor si aderent, ntr-o camer numit ,capcan de spori, ca
apoi acesta s Iie eliberat printr-un oriIiciu de evacuare.
Designul si constructia casetei sunt gndite de o asa manier nct particulele
aspirate s Iie distribuite si depozitate uniIorm pe supraIata aderent a lamei de sticl
din interior.

Beneficii
Acest instrument de recoltare este util pentru testrile initiale, mai ales atunci
cnd cresterea Iungic nu este vizibil. Este o tehnic rapid, simpl si Ierit de
contaminrile ce pot surveni n timpul manoperelor clasice.

Dezavantaje
Fungii nu vor putea Ii identiIicati cu usurint la nivel de specie prin utilizarea
acestei metode, deoarece ei nu sunt cultivabili. De exemplu, Aspergillus spp. si
Penicillium spp. sunt de cele mai multe ori identiIicate mpreun ca urmare a
similitudinilor privind morIologia sporilor. Viabilitatea sporilor nu va putea Ii de
asemenea analizat. Calibrarea Iluxului de aer nu va putea Ii modiIicat dect la cerere,
depinznd de posibilittile Iirmei productoare, iar caseta va Ii utilizat doar cu
minipompa Iurnizat la livrare (Iig. nr. 11-2).

Fig. nr. 11-1 Caseta AIR-O-CELL

Prelevarea probelor
Caseta este destinat pentru un debit de aspirare de 15 l/minut. Dac rata de
absorbtie scade, sporii se pot pierde iar repartizarea particulelor n ansamblu se va

2
Air-O-Cell este marc inregistrat a Zefon International. EMSL Analvtical
Fig. nr. 11-2. Mini pomp
ZEFON, adaptat
Casetei AIR-O-CELL

213
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

realiza de o manier neuniIorm, n timp ce cresterea acesteia poate duce la deprecierea
materialului recoltat.

1. Se calibreaz pompa la 15 l/minut;
2. Se ndeprtez si se retine banda adeziv ce obtureaz oriIiciile de intrare si
iesire ale casetei Air-O-Cell;
3. Se ataseaz capacul la tubul adaptor (valabil la cerere/comand).
4. Se deschide pompa de aspirare pentru o perioad variabil de timp;
5. Dup expirarea timpului de aspirare, se ndeprteaz caseta Air-O-Cell de la
conexiunea cu tubul de absorbtie si se resigileaz cu benzile adezive originale;
6. Proba astIel obtinut se trimite spre analiz unui laborator.

Durata de recoltare
Timpul de expunere al casetei este dependent de densitatea estimat a
particulelor n spatiul analizat. Este important s se tin seama c suprancrcarea
casetei va Iace imposibil o identiIicare cu precizie a tipurilor de spori sau a altor tipuri
de particule prezente. Timpii urmtori sunt recomandati Iunctie de spatiul vizat, pentru
obtinerea unei ct mai bune dispersii a sporilor:

- Spatiu nchis curat sau spatiul ambiental: 10 minute;
- Spatiu nchis cu activitate sustinut si personal prezent: 5 minute;
- Spatiu n amenajare, industrial sau murdar, cu miros sesizabil de mucegai: un
minut.

Recomandri privind controlul de calitate
- O interpretare judicioas a rezultatelor se va realiza n urma comparrii datelor
obtinute prin colectarea probelor de exterior cu cele de interior. Prelevarea si
analiza probelor de exterior va oIeri o baz de calcul / raportare privind
ampliIicarea Iungic din spatiile nchise;
- Se vor preleva spre comparare si probe din zonele adiacente celor supuse
controlului;
- Rata de aspirare trebuie respectat cu strictete pentru acuratetea rezultatelor,
aceasta va Ii calibrat si reglat dup Iiecare recoltare (15 l/minut);
- Nu se utilizeaz casete expirate sau uzate.


214
11.2. Caseta MICRO-5

Micro-5 (Iig. nr. 11-3), prin utilizarea unei camere de
impactare de 360 a reprezintat o premier n maniera de colectare a
aeroalergenilor precum polenul, sporii Iungici, praIul si alte
particule animate sau inerte.
Caseta este destinat s opereze la o vitez de impactare de
5 l/minut n vederea obtinerii unei eIiciente maxime a colectrii.
Caseta trebuie stocat la 20-27C. Ca principiu de Iunctionare,
caseta contine o lam de sticl acoperit cu o substant adeziv
pentru capturarea sporilor. EIicienta colectrii la 5 l/minut este de
50 pentru o dimensiune a particulelor de 0,8 microni si un volum
total de aspirare de 25 litri.

Dezavantaj
Inconvenientul utilizrii acestui dispozitiv este acela c
timpul de expunere este prea scurt si probele astIel obtinute nu pot
Ii reprezentative.

Prelevarea probelor
1. Se ndeprteaz capacul din partea inIerioar a
casetei Micro-5;
2. Dac se utilizeaz o pomp de aspiratie
conventional se va conecta tubul de aspirare
la oriIiciul inIerior al casetei, descoperit dup
ndeprtarea capacului, neIiind necesari alti
adaptori (Iig. nr. 11-4);
3. Se conecteaz apoi cellalt capt al tubului la
pompa de aspirare precalibrat la o rat de 5
l/minut;
4. Se ndeprteaz capacul superior conic al
casetei;
5. Se porneste pompa si se preleveaz proba de aer;
6. Dup recoltare, se repun capacele casetei Micro-5, att cel superior ct si cel
inIerior.

Durata de recoltare
- Spatiu nchis, curat sau spatiu ambiental: 8-10 minute;
- Spatiu nchis cu activitate sustinut si personal prezent: 5 minute;
- Spatiu n amenajare, industrial sau murdar, cu miros sesizabil de mucegai: 1-3
minute;
- Spatiile cavitare, cu adaptor special (guri de aerisire, hote): 1-2 minute;
A nu se utili:a la temperaturi mai mici de 0
0
C '

Fig. nr. 11-3
Caseta
Micro5
Fig. nr. 11-4.
Adaptarea casetei la
pompa de aspiratie

215
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

11.3. Caseta CYCLEX-D

Att maniera de recoltare a probelor, ct si modul de utilizare a casetei Cyclex-
D sunt asemntoare cu cele ntlnite n cazul modelelor comerciale mai sus amintite.
DiIerentele sunt legate de viteza aerului pompat n caset, n cazul de Iat 20 l/minut.

Durata de recoltare
- Spatiu nchis curat sau spatiu ambiental: 10 minute;
- Spatiu nchis cu activitate sustinut si personal prezent: 5-8 minute;
- Spatiu n amenajare, industrial sau murdar cu miros, sesizabil de mucegai: 1-2
minute.

11.4. Caseta BIOCELL

Din punct de vedere procedural, pentru caseta BIOCELL (Iig. nr. 11-5) se
urmresc instructiunile precizate la caseta Air-O-Cell.

Durata de recoltare
- Spatiu deschis (15 l/minut): 8-10 minute;
- Spatiu curat, Ir depuneri de praI observabile (15
l/minut) : 5-8 minute ;
- Spatiu nchis, cu activitate sustinut si personal prezent
(15 l/minut): 3-5 minute ;
- Spatiu n amenajare, industrial sau murdar, cu miros
sesizabil de mucegai (15 l/minut): 1-3 minute;
- Spatiile cavitare, cu adaptor special (guri de aerisire,
hote) (15 l/minut): 30 secunde 1 minut.

Fig. nr. 11-5
Caseta
BioCELL

216
11.5. Caseta LARO 1
3

Caseta LARO-100 (Iig. nr. 11-6) poate absorbi n
procent de 100 particulele Iungice din aer, precum si orice
alte tipuri de
particule sau Iibre, utiliznd un Iiltru celulozic cu pori de 0,8
microni.
Durata de recoltare poate atinge 8 ore la un debit de
aspirare de 0,5-1 l/minut (pentru a obtine n Iinal un volum total
de 240-480 litri). Suprancrcarea dispozitivului prin depsirea
perioadei de recoltare va ngreuna mult analiza ulterioar.
Probele obtinute mai pot Ii analizate si prin imersarea Iiltrului
n ap, dup recoltare, urmat de colectarea lichidului de splare
si nsmntarea acestuia pe medii de cultur.

Caseta LARO-100 produce presiune negativ astIel nct este necesar
utilizarea unui rotametru calibrat deja la standardele indicate de productor, ntre
pomp si dispozitivul de recoltare. Pompa va Ii amplasat la captul de descrcare al
casetei, iar productorul recomand setarea acesteia la un volum de aspirare de 4-5
l/minut. Prelevarea probelor si stabilirea volumului de aer aspirat depind de conditiile
de micro / macroclimat constatate. Gradul de vizibilitate n interiorul casetei este mare,
astIel nct observarea nivelului de recoltare pe Iiltru se poate realiza cu usurint.

Beneficii
Caseta, conceput ca un vortex, prezint un spatiu ngust, rectangular, prevzut
cu un Iiltru de captur, Iiind metoda ideal sub raport pret / calitate pentru analiza
individual a gradului de expunere la poluarea aeromicrobiologic. Probele astIel
recoltate pot Ii analizate imediat prin microscopie optic.

Durata de recoltare
- Interior/exterior, Ir prezent Iungic vizibil (4 l/minut): 10 minute sau mai
mult ;
- Monitorizare personal 8 ore (12 l/minut): timpul necesar pentru a obtine 300
480 l ;
- Zone comune de acces (4 l/minut): 36 minute;
- SupraIete plane (4 l/minut): se esantioneaz supraIete de 10-100 cm
2
.

3
Environmental Monitoring Solutions www.emssales.net EMSL Analvtical
Fig. nr. 11-6
Caseta
LARO 100

217
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

11.. Impactorul Zefon Z-A
4

Particulele aerosolizate, solide sau lichide, pot avea dimensiuni cuprinse ntre
0,1 si 100 microni diametru, putnd Ii individuale, neatasate sau agregate. Aceste
caracteristici particulare produc diIicultti n obtinerea unor probe de aer reprezentative
care s poat Ii utilizate n vederea aprecierii din punct de vedere microbiologic a
calittii aerului. Mai nti, microorganismele vor recoltate din aer, pentru ca apoi,
particulele viabile, capabile de multiplicare, s poat Ii analizate, iar rezultatele
interpretate statistic.

ZeIon Z-A6 este un dispozitiv din aluminiu, Iormat din dou prti metalice
sustinute lateral de trei cleme (Iig. nr. 11-7) Dispozitivul este prevzut cu un tub lateral
de circulatie a aerului, un con superior cu o baz plat si 400 oriIicii. Cnd aerul este
aspirat n aparat sub Iorma jeturilor multiple, particulele din aer sunt directionate spre
supraIata mediului de colectare din dispozitiv. Aceast metod de recoltare implic
impactarea unui volum de aer cunoscut pe supraIata mediului de cultur dintr-o plac
Petri. Ulterior, plcile sunt incubate astIel nct microorganismele impactate s se
poat multiplica si genera colonii cuantiIicabile, att din punct cantitativ, ct si
calitativ.
Prtile componente livrate odat cu aparatul :
Pomp de vacuum
Rotametru
Tub Ilexibil

Beneficii
Cultivarea prelevatelor poate determina gradul de
viabilitate Iungic si permite ulterior
identiIicarea la nivel de gen si specie.

Dezavantaje
Dezvoltarea culturilor urmat de identiIicarea microorganismelor poate dura o
perioad ndelungat de timp (6-10, chiar 30 zile);
Chiar dac sunt prezente aeroparticule neviabile care nu se vor dezvolta pe
mediile de cultur, acestea pot juca un rol semniIicativ n instalarea unor reactii
alergice sau iritative;
Exist posibilitatea ca unele microorganisme s nu poat Ii identiIicate ca urmare
a absentei corpilor IructiIicanti sau s nu mai Ii Iost caracterizate anterior din
punct de vedere al apartenentei taxonomice. De asemenea, particulele neviabile
de origine Iungic nu pot Ii identiIicate.

Prelevarea probelor
1. n vederea evitrii supracontaminrii probelor se vor utiliza mnusi de protectie;

4
EMSL Analvtical, Inc. www.emssales.net

Fig. nr. 11-7
Dispozitiv ZeIon Z-A6

218
2. Se conecteaz tubul Ilexibil la pomp si apoi la dispozitivul lateral al
colectorului;
3. naintea nceperii recoltrii se porneste si se calibreaz pompa de vacum la 1
ACFM (28.3 l/minut) cu ajutorul rotametrului;
4. Dup calibrare, se sterge dispozitivul pe ntreaga sa supraIat cu alcool
izopropilic, utiliznd un tampon steril;
5. Dup pregtirea aparatului, se ndeprteaz partea superioar a acestuia n
vederea introducerii n interior, pe Iundul plat, a unei plci cu mediu solid ce
va servi drept supraIat de recoltare. Placa a Iost lsat n prealabil acoperit
pentru a ajunge la temperatura camerei. Se Iixeaz componentele aparatului cu
cele trei cleme metalice prin rsIrngerea acestora, acoperindu-se astIel imediat
placa cu mediu prin atasarea prtii superioare a dispozitivului;
6. Se porneste pompa de vacuum pentru 2-5 minute. Aerul este aspirat prin conul
superior si dirijat prin oriIiciile de precizie, Iiind apoi impactat pe supraIata de
recoltare placa Petri cu mediu solid. Exhaustarea se realizeaz prin
mpingerea aerului spre tubulatura de la baza aparatului unde va Ii colectat de o
camer de vid atasat pompei de vacuum;
7. Dup recoltare, se va ndeprta dispozitivul de nchidere si se va nlocui placa
substrat, aceasta Iiind acoperit, sigilat si trimis laboratorului spre analiz n
cel mai scurt timp;
8. nainte de a se recolta o alt prob, dispozitivul de recoltare va trebui
dezinIectat, iar manipularea se va Iace rapid si doar cu mnusi de protectie.

Mediile de cultivare i manipularea lor
n principiu, pot Ii utilizate pentru recoltare cu acest impactor diverse medii de
cultivare, turnate n prealabil n plci Petri standard de 15 x 90 mm. Mediile de
cultivare recomandate prelevrii si analizei Iungice sunt:
PDA (Agar cu extract de cartoI glucozat)
MEA (Agar cu extract de malt)
DG 18 (Agar dicloran glicerol-18)

- Plcile cu medii agarizate vor Ii pstrate la temperatura de reIrigerare pn n
momentul utilizrii, cnd vor Ii lsate (aproximativ 20 minute) s ajung la
temperatura mediului ambiant;
- Capacul plcii Petri se ndeprteaz doar n momentul recoltrii;
- Dup recoltarea probelor, capacul plcii se repune iar placa se va sigila cu
ParaIilm sau band adeziv si se va trimite laboratorului spre analiz n cel
mult 24 de ore;
- Dac placile se transport cu o geant IrigoriIic acestea nu vor Ii lsate s vin
n contact direct cu gheata pentru a se preveni degradarea mediului, testarea n
acest caz Iiind invalidat.

Recomandri
- Se vor purta mnusi de latex pe tot parcursul desIsurrii manoperelor de
recoltare;

219
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

- Se va Iolosi alcoolul izopropilic 70 pentru decontaminarea dispozitivului de
recoltare dup Iiecare prelevare;
- Pe parcursul recoltrii, capacul plcii Petri se va pstra ntr-un sac steril de
plastic;
- Pompa de vacuum trebuie s Iie calibrat cu ajutorul unui rotametru, cu att mai
des cu ct nu sunt ntotdeauna ntrunite conditiile optime de presiune si
temperatur. O plac martor, neexpus recoltrii, va servi la Iiecare prelevare
drept control negativ. Probele prelevate din mediul ambiant vor Ii comparate
cu cele de microclimat. De asemenea, vor trebui recoltate probe si din zonele
adiacente celei de interes. Niciodat nu se vor utiliza medii de cultivare
expirate sau contaminate.

11.7. Dispozitivul CIP 1M

CIP 10 este un dispozitiv de dimensiuni reduse
destinat colectrii particulelor aerosolizate si a praIului
din aer (Iig. nr. 11-8). A Iost schitat ca si concept n
anii 80 la CHERCHAR (Centre dtudes et de
Recherches de Charbonnage de France) actualmente
INERIS (Institut National de lEnvironnement
Industriel et des Risques) de ctre Paul Courbon. n
prezent este produs si comercializat cu licent INERIS
de ctre ARELCO A.R.C.
n 2003, a Iost perIectat un nou subansamblu
destinat recoltrii microorganismelor, dispozitivul
schimbndu-si denumirea din CIP 10 n CIP 10 M.
Pentru recoltare, n mod normal este amplasat
ct mai aproape de cile respiratorii, la nivelul
toracelui, dar poate Ii amplasat si n diverse zone ale
spatiului de lucru considerate a Ii puncte critice. Mai mult, scopul utilizrii
dispozitivului este acela de a recolta particulele ce reprezint o real amenintare la
adresa snttii umane (cantonabile la nivel alveolar, bronsic, sinusal ), n conIormitate
cu CEN 481 si standardul ISO 7708. Particulele astIel recoltate pot Ii cntrite gratie
interschimbabilittii selectorilor, determinndu-se totodat si greutatea probei recoltate,
urmat cnd se impune si de analiza compozitiei probei.
Dispozitivul are Iorm alungit, de bloc compact prevzut cu un selector
cilindric, o incint rotativ n partea superioar - destinat colectrii particulelor, si o
baz plat de separare a circuitului electric din partea inIerioar motor, baterii si
circuit electric. Forma ergonomic a dispozitivului Iaciliteaz atasarea acestuia cu un
sistem de curele ct mai aproape de cile respiratorii sau purtarea acestuia ntr-un
buzunar.

Fig. nr. 11-8
Dispozitivul CIP 10M

220
Beneficii
- Este de dimensiuni mici, compact, usor, silentios;
- Arhitectura modular permite aprecierea tuturor Iractiilor respiratorii conIorm
standardelor, prin utilizarea la recoltare a selectorilor si a unui debit de aer
prestabilit;
- Supapa omnidirectional protejat de capac blocheaz ptrunderea accidental pe
parcursul aspirrii, a unor particule de mari dimensiuni sau a picturilor de ap;
- Aparatul nu este aIectat de schimbarea pozitiei sau de miscri bruste, avnd o
constructie intern robust si un exterior din plastic antistatic;
- Debitul este constant, iar Iiltrele sunt reutilizabile;
- Colectorul prezint o serie de elemente de sigurant precum suruburi speciale de
nchidere, ntreruptor magnetic, led de Iunctionare este compus din materiale
conIorme standardelor europene privind utilizarea aparaturii de recoltare n
medii ostile;
- nltime total : 175 mm, diametru : 45 mm, greutate total 300 g.

CIP 10 este echipat cu selectori de recoltare pentru aerosoli si praI, conIorm
standardelor europene n vigoare NF EN 481, existnd abateri doar n cazul
particulelor Ioarte Iine.
CIP 10 sau varianta CIP 10 M nu necesit pe parcursul timpului de Iunctionare
un control extern sau ajustri suplimentare. Se remarc printr-o remarcabil stabilitate
a Iluxului de aer n corelatie cu viteza de rotatie a cupei mentinut constant de ctre
un regulator de vitez.
Porii Iiltrului poliuretanic au cteva sute de microni diametru si cu toate
acestea, rmn larg deschisi pe parcursul recoltrii pn n momentul cnd praIul
colectat atinge valoarea de 50 mg n cupa de rotatie si cteva sute de miligrame la
nivelul selectorului destinat Iractiilor respirabile alveolare.

1. Selectorul de particule destinat fraciilor respirabile alveolar

Aceast selectie a particulelor respirabile alveolar se realizeaz cu aspirare n
unghi de 45 prin dou Iiltre poliuretanice. Fractiile aerosolizate obtinute astIel,
ntrunesc conditiile impuse de standardele europene CEN AFNOR 481 si ISO 7708.

2. Selectorul de particule destinat fraciilor respirabile toracic

CIP 10 T sau CIP 10 MT reprezint dou variante constructive ale
dispozitivului destinat selectiei particulelor ce pot ptrunde bronsic, printr-o serie de
Iante de dirijare a aerului n unghi de 90 ctre opt oriIicii dispuse radiar n
extremitatea superioar a tubului de inox. ntruct particulele de dimensiuni mari
exercit Iorte gravitationale sporite acestea nu sunt deviate, Iiind capturate la baza
selectorului (Iiltrului).


221
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

3. Selectorul de particule destinat fraciilor inhalabile

CIP 10 I sau CIP 10 MI servesc selectiei particulelor inhalabile prin
directionarea supapei de admisie si prezenta oriIiciilor de selectie, tubul conic
ghidndu-le n continuare spre cupa rotativ de colectare.

4. Un nou selector destinat fraciilor inhalabile

O nou metod de selectare a Iractiilor inhalabile a Iost dezvoltat pentru a
diminua depunerile nedorite pe supraIata interioar / superioar a peretelui capsulei de
colectare si pentru o mai bun satisIacere a cerintelor standardului EN 481. Fluxul de
aer va Ii Iortat s urmeze un traseu concentric convergent spre un punct de retur care s
imprime apoi o directionare vertical.

5. Selectorul de praf total fracii maximale

Cu ajutorul dispozitivului CIP 10 se pot aprecia Iractiile maximale / praIul
total, n acest scop Iiind indicat utilizarea unui cap alveolar cu pstrarea camerei de
recoltare si a duzei aIerente. AstIel, toate particulele suspendate n aer, inclusiv cele
recent depuse vor Ii aspirate de dispozitiv.

Prelevarea probelor
CIP 10 include o cup de rotatie echipat cu un Iiltru poliuretanic montat pe
axul de rotatie al motorului ce Iunctioneaz la turatie mare ntr-o incint, cu Iluxul de
intrare axial si cel de iesire tangential. Datorit rotatiei cupei, se genereaz un Ilux de
aer asemntor cu eIectul unui ventilator, asigurndu-se astIel captura particulelor ce
au scpat de selectia Iiltrelor anterioare.
Motorul este actionat de acumulatori, iar viteza sa este setat de ctre un
circuit de control electromagnetic. Debitul de aer este direct proportional cu viteza de
rotatie. Aerul este aspirat prin supapa omnidirectional, iar n interior acesta urmeaz o
cale sau alta n Iunctie de dimensiunea particulelor ce urmeaz a Ii studiate. Fractiile
nedorite din punct de vedere dimensional vor Ii oprite de selectoarele superioare.
Particulele care strbat selectorul rmn n suspensie n lichidul de eluare, iar aerul
astIel Iiltrat se rentoarce n atmosIer prin Iantele laterale ale cupei de rotatie.
Dispozitivul CIP 10M este dotat cu o cup de rotatie prevzut n partea
superioar cu lame orizontale care n miscare imprim aerului aspirat eIectul de rotatie
centriIugal. Frecarea aerului de partea superioar a lichidului continut de cup,
precum si de peretii laterali ai acesteia va genera o zon de presiune sczut ce
Iaciliteaz directionarea aerului dincolo de lichidul de recoltare. n acest mod, aerul
astIel aspirat va urma o miscare de rotatie helicoidal pentru captarea usoar a celulelor
n lichidul colector, garantndu-se astIel viabilitatea acestora. naintea nceperii
colectrii cupa trebuie sterilizat prin autoclavare sau tratare cu solventi speciali si
alimentat cu 2-2,5 cm
3
lichid de colectare - ap distilat sau solutie peptonat etc.
Dac solutia este adugat n exces, aceasta va Ii eliminat n momentul nceperii
recoltrii.


222
Colectarea probelor in atmosfer uscat

Umiditatea relativ sczut a mediului ambiant poate limita eIicienta recoltrii
n sensul epuizrii rapide a lichidului de recoltare, reducndu-se astIel si perioada de
recoltare.

Colectarea sporilor sau a miceliului

Lund n considerare natura hidroIob a sporilor sau a miceliului, se poate
anticipa o rat sczut de capturare a acestora, de aceea este recomandat adugarea n
lichidul colector a unui agent surIactant tensioactiv pentru Iortarea mixrii
bioaerosolilor cu lichidul camerei de compactare (de obicei Tween 80 n proportie de
0,05-0,1).
1211
Transportul probelor

CIP 10 nu necesit precautii speciale privind transportul probelor. Este
recomandat totusi, transportarea n pozitie vertical a dispozitivului atunci cnd cupa
de recoltare nu a Iost ndeprtat.

Manipularea in laborator dup colectare

Dup recoltare, aparatul CIP 10 (sau CIP 10M) este mentinut n pozitie
vertical, i se ndeprteaz capacul si se scoate cupa colectoare cu un extractor special.
Se recolteaz lichidul din cup, cupa splndu-se de trei ori, lichidul de splare
pstrndu-se de asemenea n vederea analizrii prin cultur, identiIicare PCR,
determinare ATP, epiIluorescent.

Afustarea i controlul debitului de aer

Reglarea debitului de aer ntre 7 si 10 l/minut, n Iunctie de necesitti,
reprezint singura ajustare necesar pentru Iunctionarea dispozitivului CIP 10M si se
realizeaz cu ajutorul unui potentiometru plasat n interiorul carcasei. Operatiunile
procedurale implic urmatorii pasi: veriIicarea gradului de ncrcare a bateriilor,
ndeprtarea clemelor de Iixare ale cupei de rotatie si ndeprtarea acesteia pentru a
avea acces la locatia potentiometrului.
Se plaseaz apoi cupa de rotatie ce contine Iiltrul poliuretanic deasupra
motorului, se aseaz capacul, se porneste aparatul, potentiometrul ajustndu-se pentru
ca cititorul manometrului s indice 0 Pa si astIel s existe un echilibru ntre debitul de
aer ce ptrunde n aparat si cel evacuat, Ir pierderi de aer, urmrindu-se gradul de
etanseizare al aparatului. Cu ajutorul unui tahometru se va aprecia, dup ndeprtarea
capacului, viteza cupei de rotatie Ir ca aceasta s Iie atins de dispozitiv pentru a se
evita ncetinirea acesteia (ntre 6800 - 7000 rpm n Iunctie de varianta constructiv).
Doar n cazul n care se observ o deviatie mai mare de 150 rpm de la standard se poate
interveni cu ajustri suplimentare asupra dispozitivului. n caz contrar orice valoare
observat sub cea amintit este considerat valoare nominal.

223
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

Determinarea greutii probei recoltate

Determinarea masei praIului colectat se realizeaz prin cntrirea cupei de
rotatie ce contine Iiltrul poliuretanic, att nainte ct si dup colectarea probelor,
utilizndu-se o balant electronic de laborator cu o deviatie standard admis de maxim
0,1 mg. Filtrul poliuretanic este sensibil la umiditatea aerului, de aceea Iormula Iinal
de calcul va tine cont de schimbrile majore privind umiditatea relativ a zonei de
microclimat unde are loc recoltarea.

INRS recomand urmtoarea succesiune procedural.

- Pregtirea cupei se va realiza cu atentie: va Ii splat cu o solutie decontaminant
Iierbinte si cltit de mai multe ori, de preIerat numai cu ap distilat steril;
- Va Ii lsat 12 ore s se usuce la temperatura de 50C - 60C;
- Filtrul se va pregti separat si se va pstra ntr-un loc uscat Ierit de praI sau alte
impuritti;
- Se vor purta mnusi de protectie pe toat durata desIsurrii manoperelor de
recoltare.

Procesarea probelor dup recoltare

Dup recoltare, cupele sunt reconditionate de maniera amintit anterior, Iiind
totusi recomandat plasarea lor, dup nlturarea capacului protector, ntr-un termostat
la 50 60C timp de 4 ore, dac prelevarea a avut loc ntr-un spatiu cu umiditate
relativ prea ridicat. Dup conditionare, se determin masa probei colectate cu
Iormula:

H = H
m
-H

unde:

H
m
- reprezint diIerenta de greutate a cupelor nainte si dup recoltare;
H
- reprezint cea mai mare valoare de diIerent nregistrat ntre cele dou cntriri,
nainte si dup recoltarea probelor.

Determinarea concentraiei particulelor

Concentratia se calculeaz n mg/m
3
Iiind determinat prin Iormula :

C [
mg
m
3

=
M
F

unde :
M - reprezint masa probei colectate, dup speciIicatiile amintite (n mg);
V - reprezint volumul de aer Iiltrat (n m
3
).


224
Manipularea filtrului poliuretanic al dispo:itivul CIP 10

Filtrul poliuretanic este deosebit de rezistent la actiunea agentilor chimici si
stabil din punct de vedere structural. Poate Ii splat prin metode uzuale, incinerat sau
mineralizat Iunctie de tipul analizei ce urmeaz a Ii realizat.
Urmtoarele operatiuni de splare sunt permise asupra Iiltrului poliuretanic, n
vederea recuperrii praIului recoltat:
- Se las Iiltrul ntr-o solutie cald de splare,15 minute;
- Se extrage din solutie cu mna protejat de mnusi;
- Se clteste cu ap distilat de mai multe ori pn cnd solutia de splare rmne
clar;
- Se recupereaz si praIul depus la baza cupei de recoltare tot prin splare si se
adaug lichidului deja obtinul prin splarea Iiltrului;
- Urmeaz Iiltrarea si centriIugarea n vederea recuperrii depozitului de analizat,
pierderile ce apar pe parcursul desIsurrii manoperelor Iiind neglijabile

11.8. Aprecierea ncrcturii fungice aeropurtate
prin tehnica sedimentrii Koch

Se utilizeaz plci Petri sterilizate, cu diametrul de 90 mm, n care se
repartizeaz cte 15-20 ml mediu agarizat special destinat cultivrii Iungilor
(Sabouraud cloramIenicol agar, PDA, Agar cu extract de malt). Se opreste instalatia de
climatizare si n absenta personalului de lucru se expun plcile cu mediu, Ir capac, n
anumite puncte prestabilite, un interval de timp variabil ntre 5 si 15 minute.
n Iiecare punct de recoltare se expun cte 2 plci din Iiecare mediu. Pe
capacul Iiecrei plci se inscriptioneaz tipul de mediu, data si ora recoltrii, pozitia
plcii, timpul de expunere. Dup expirarea timpului de expunere stabilit, plcile se
acoper cu capacele proprii, se nvelesc n hrtie si se transport n caserole de plastic
la laborator, unde se incubeaz, la temperatura de 25
o
C. Obligatoriu, n paralel se
incubeaz cte o plac martor continnd aceleasi medii, Ir a Ii deschise n prealabil.
Dup 5 zile se monitorizeaz eventuala dezvoltare a coloniilor si se calculeaz
nr. UFC /m
3
aer.

N.0PC
m
3
uc
=
N 10 000
SK

N - media numrului de colonii dezvoltate pe supraIata mediului din cele 2 plci
expuse;
S - supraIata plcii (cm
2
) (3,14 x R
2
);
K - coeIicientul timpului de expunere: pentru 5 minute este egal cu 1, pentru
10minute este egal cu 2, iar pentru 15minute este egal cu 3.


225
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)

11.9. 1ehnici de recoltare/examinare direct a probelor
de pe suprafee

Examinarea direct permite detectarea rapid a prezentei sporilor Iungici ntr-
un spatiu examinat precum si genurile incriminate ntr-o astIel de contaminare,
contribuind astIel alturi de alte metode de analiz la acuratetea rezultatelor obtinute.

11.9.1. Banda adeziv BIO 1APE
1M
(Zefon International)

Acest tip de band reprezint varianta standardizat de recoltare a
specimenelor de pe supraIete. Probele se mai pot recolta si prin utilizarea unei benzi
adezive tip scoth. n vederea examinrii microscopice a particulelor colectate, banda
adeziv trebuie s aib proprietti optice superioare si s suporte toate tipurile de
coloranti ce pot Ii utilizati n practica de laborator Iunctie de speciile suspectate.

Prelevarea probelor

1. Se pregteste lama prin exteriorizarea benzii adezive duble, evitndu-se
atingerea prtii ce serveste pentru colectarea probei (Iig. nr. 11-9);

2. Se aplic zona central a benzilor pe supraIata de recoltare, prin apsare
moderat (Iig. nr. 11-10);
3. Se desprind usor benzile si se reataseaz una de alta
sau se lipesc de supraIata interioar a unui sac de
plastic steril (ziplock), avnd grij ca acesta s nu
prezinte cute;
4. n Iiecare ambalaj va Ii transportat o singur prob.

Recomandri
Benzile se vor utiliza doar n scopul pentru care au Iost
concepute si nu la temperaturi mai mici de 5C;
Se ndeprteaz celoIanul
protector
Se nscriu elementele de
identiIicare a probei
Mijlocul zonei adezive,
de recoltare a probei
Fig. nr. 11-9 Componentele lamei Bio-Tape
Fig. nr. 11-10.
Recoltarea probelor

226
Nu se vor trimite ctre laborator, benzi atasate unei lame sau acoperite cu o
lamel, ci doar n ambalajul special destinat transportului, Iurnizat odat cu
pachetul standard.

11.9.2. Recoltarea fragmentelor inerte

Aceste probe sunt reprezentate de portiuni din diverse materiale ce ar putea Ii
contaminate, constituind astIel substrat al dezvoltrii Iungice (sectiuni de tapet,
covoare, mochete, Iiltre de aer, Iragmente de mobilier, de instalatie sanitar ). Dac
specimenul are dimensiuni mari, se vor alege Iragmente de recoltat reprezentative,
evitndu-se contaminarea prin manopere suplimentare.
Scopul acestui tip de recoltare este acela de a obtine portiuni din materialele de
analizat, suIicient de mici pentru a putea Ii usor transportate si manipulate, dar
reprezentative sub aspectul ncrcturii Iungice. Analiza probelor se va realiza prin
cultivarea pe medii speciale sau prin microscopie direct.

11.9.3. Recoltarea cu ajutorul tamponului tip exsudat

Principiul de lucru este Ioarte asemntor cu cel al benzii adezive. Tija cu
tamponul steril este gzduit de o eprubet / un tub cu solutie tampon pH 7,0 sau
solutie de eluare a sporilor (ser Iiziologic cu 0,05 Tween 80). Probele astIel obtinute
pot Ii analizate prin cultivare sau prin microscopie direct.

Beneficii
Examinarea direct este necostisitoare si poate Ii rapid eIectuat.
Reprezint un test preliminar de valoare si poate indica sursele generatoare de
spori aeropurtati.

Dezavantaje
Zona de recoltare Iiind redus ca dimensiuni, nu va oIeri o imagine de ansamblu
asupra gradului de contaminare Iungic a unui habitat, de aceea se recomand
recoltarea din mai multe puncte.
Problemele de sntate cauzate de multiplicarea Iungic din habitate sunt corelate
cu inhalarea unui numr substantial de spori aeropurtati, uneori perioade
ndelungate de timp. Prezenta microorganismelor sub Iorm de depozite pe
diverse supraIete nu poate constitui un indicator direct al aeropolurii.
Prin intermediul acestor tehnici se pot detecta att sporii viabili, ct si cei
neviabili, Ir a se putea Iace o distinctie ntre cele dou tipuri. Dac testrile
intereseaz n mod special cunoasterea viabilittii recoltatului este indicat
combinarea tehnicilor directe cu cele de cultivare.
De cele mai multe ori, Iungii nu pot Ii identiIicati la nivel de specie si nici chiar la
nivel de gen prin intermediul tehnicilor directe, n absenta corpilor de
IructiIicare.


227
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
)


1. Barry S L, Wegman D H (2000) - Occupational Health: Recognizing &
Preventing Work - Related Disease Injury, 4
th
edition; Lippincott
Williams Wilkins.
2. EMSL Analytical (2003) - LARO-1 Sampling Cuide.
3. Goddish Thad (2002) - Indoor Environment Aotebook: Everything You
Wanted to Know About Indoor Air Pollution and More; Ball State
University, Department oI Natural Resources and Environmental
Management; LARO-100 Product InIormation.
4. Grinshpun Surgey A (2002) - Collection and Enumeration of Airborne
Spores Using Aerosol Impactors with Low 1et-1o-Plate Distance, Project
3, Micro5 Microcell (5 lpm); University oI Cincinnati Environmental
Health Foundation.
5. - Minnesota Department oI Health (2003) - Environmental Health in
Minnesota: Testing Ior Mold; Sampling methodology Ior Iungal
bioaerosols and ampliIiers in cases oI suspected indoor mold proliIeration.
6. - Qualite de lair. Air des lieux de travail - Determination du dept
alveolaire de la pollution particulaire. Methode de la coupelle rotative.
(Air-Quality: Workplace Air - Gravimetric determination oI particulate
pollution deposits. Rotating disk method); NF X43-262.
7. - Atmosphres sur les lieux de travail - DeIinition des Iractions de
taille pour le mesurage des particules en suspension dans lair. (Workplace
Atmospheres - Size Iraction deIinitions Ior measurement oI airborne
particles.); NF EN 481 X43-276.
8. - Air des lieux de travail - Determination par rayons X de la
concentration de dept alveolaire de silice cristalline- chantillonnage par
dispositiI coupelle rotative. (Workplace Air - X-Rays Determination oI
the conventional alveolate Iraction oI crystalline silica - Sampling using a
rotating cup device); NF X43-295.
9. - Qualite de lair - DeIinitions des Iractions de taille des particules
pour lechantillonnage lie aux problmes de sante. (Air Quality - Particle
size Iraction deIinitions Ior health related sampling); NF ISO 7708.
10. - Air des lieux de travail - Dosage par spectrometrie inIrarouge
transIormee de Fourier de la silice cristalline - chantillonnage par
dispositiI coupelle tournante ou sur membrane Iiltrante. (Workplace Air -
Fourier TransIorm InIrared Spectrometric determination oI crystalline
silica - Sampling using a rotating cup device or Iiltering membrane); XP
X43-243.

Luminita-Iuliana Malic

229
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
*


12.1. Clasificarea fungilor n funcie de clasele de risc biologic

n Iunctie de gradul de risc biologic pe care microorganismele l prezint
pentru om, acestea se clasiIic n trei clase:
- Clasa I cuprinde acele microorganisme care rareori pot maniIesta risc de
mbolnavire la om si animale;
- Clasa II cuprinde acele microorganisme care pot cauza aparitia de aIectiuni la
om si animale si pot reprezenta un pericol pentru personalul din laborator risc
individual redus, risc colectiv neglijabil. ProIilaxia si tratamentul Iolosite n
aIectiunile cauzate de aceste microorganisme sunt eIicace. Cuprinde
majoritatea Iungilor de interes clinic (tabelul 12-1);
- Clasa III cuprinde acele microorganisme care pot cauza aIectiuni la om si care
reprezint un real pericol pentru personalul din laboratoarele de micologie
risc individual mare, risc colectiv semniIicativ. De asemenea, exist riscul
diseminrii n colectivitate. Tratamentul si proIilaxia sunt eIicace;
- Clasa IV cuprinde acele microorganisme care pot cauza aIectiuni grave la om si
care reprezint un pericol pentru personalul din laborator risc individual
crescut, risc colectiv crescut. De asemenea, exist riscul de contaminare a
colectivittilor, iar de cele mai multe ori, nu exist un tratament eIicace al
aIectiunilor cauzate de aceste microorganisme

12
Norme generale de biosecuritate n
laboratoarele de micologie medical
Norme generale de biosecuritate n laboratoarele de micologie medical

230
Tabel 12-1
Clasificarea principalelor specii de fungi n funcie de grupa de risc biologic i
capacitatea alergizant
Specia
Clasa de
risc
biologic
Capacitatea
alergizant
Aspergillus fumigatus 2 X
Blastomvces dermatitidis 3
Candida albicans 2 X
Cladophialophora bantiana 3
Candida tropicalis 2
Coccidioides immitis 3 X
Crvptococcus neoformans var. neoformans 2 X
Crvptococcus neoformans var. gattii 2 X
Emmonsia parva var. parva 2
Emmonsia parva var. crescens 2
Epvdermophvton floccosum 2 X
Fonsecaea compacta 2
Fonsecaea pedrosoi 2
Histoplasma capsulatum var. capsulatum 3
Histoplasma capsulatum var. duboisii 3
Madurella grisea 2
Madurella mvcetomatis 2
Microsporum spp. 2 X
Paracoccidioides brasiliensis 3
Penicillium marneffei 2 X
Scedosporium apiospermum 2
Scedosporium prolificans 2
Sporothrix schenckii 2
Trichophvton rubrum 2

12.2. Aorme generale de biosecuritate

- Accesul n laborator este permis doar personalului autorizat;
- Personalul din laborator trebuie s participe la implementarea si respectarea
normelor de biosecuritate;
- Pardoseala laboratorului va Ii conIectionat din materiale rezistente acoperite cu
rsini epoxidice sau linoleu antistatic, neted, usor lavabil;
- Pe usile de acces n Laboratorul de Micologie Medical se va aplica semnul
international Pericol biologic (Bioha:ard) care, n cazul acestor laboratoare
corespunde nivelului 2 de securitate microbiologic (Iig. nr. 12-1). Cu acelasi
semn se vor marca Irigiderele si congelatoarele Iolosite pentru pstrarea
microorganismelor cu risc biologic 2;


231
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
*

Fig. nr. 121. Semnul conventional pentru risc biologic (Biohazard)

- Usile si Ierestrele laboratorului trebuie sa Iie n permanent nchise pentru
asigurarea izolrii spatiului;
- Laboratorul va Ii separat de zona de circulatie a personalului cu ajutorul unui sas;
- Laboratorul trebuie s Iie n permanent ventilat Iortat. Aportul de aer va Ii de
cca. 60 m
3
per persoan per or;
- Toate supraIetele de lucru se vor spla si dezinIecta zilnic. Toate reziduurile vor
Ii incinerate n incinte speciale, autorizate, iar depozitarea si transportul
acestora se va Iace n cutii nchise ermetic, rezistente si impermeabile, n
Iunctie de Iiecare tip de reziduu, marcate de asemenea cu semnul de risc
biologic;
- Laboratorul trebuie s beneIicieze de un lavoar pentru splarea minilor, care s
Iunctioneze prin actionarea cu ajutorul cotului sau cu o pedal;
- Transportul probelor de la si ntre laboratoare se va realiza cu ajutorul lzilor
izoterme, ermetice, rigide, rezistente la lovituri, usor de curtat si dezinIectat;
- Personalul din laborator va evita contactul direct cu materialele potential
patogene. n acest scop se va Iolosi echipament de protectie adecvat n
momentul manevrrii probelor sau a culturilor Iungice. Echipamentul de
protectie va Ii ndeprtat n momentul prsirii zonei de lucru. Minile se vor
spla n mod repetat cu spun lichid antiseptic, dup Iiecare ndeprtare a
mnusilor de protectie;
- Este interzis pipetarea materialului patologic cu gura;
- n zona de lucru nu se vor depozita crti sau hrtii, deoarece sunt diIicil de
sterilizat;
- n laboratoarele de micologie medical sunt strict interzise:
Consumarea de alimente sau buturi de orice Iel;
Depozitarea de alimente si buturi;
Folosirea lentilelor de contact;

232
Aplicarea de produse cosmetice;
- Plgile se vor acoperi cu bandaj nainte de aplicarea echipamentului de
protectie.

12.2.1. 1ehnici de laborator folosite n zona de lucru

- Toate culturile Iungice (n special la speciile cu miceliu aerian sporulat) si
prelevatele clinice se vor manevra de preIerat n interiorul unei hote de
protectie biologic clas II, pentru evitarea contaminriii personalului si
incintei laboratorului;
- Plcile ce contin mediu de cultivare pentru Iungi se vor nchide si se vor aseza cu
capacul n jos pentru evitarea deschiderii accidentale si contaminrii;
- Incubarea plcilor se va Iace n termostate cu umidiIicatoare;
- n cazul utilizrii mediilor de cultivare repartizate n tuburi, acestea trebuie s
beneIicieze de dopuri Iixe, sigure;
- Deschiderea plcilor si tuburilor ce contin medii de cultivare se va Iace doar sub
protectia unei hote microbiologice de clas II sau n vecintatea Ilcrii unui
bec de gaz;
- n cazul Iungilor dimorIici se impune analizarea acestora sub protectia unei hote
de securitate biologic grad III. Plcile cu astIel de culturi se etanseizeaz
obligatoriu cu Parafilm.

12.3. Metode de protecie primar

Aceste metode se reIer la echipamentele de protectie a personalului si la
aparatura utilizat n vederea realizrii protectiei microbiologice.

12.3.1. Hote de protecie biologic

Hotele sau cabinetele de protectie sunt incinte n care Iluxul de aer este Iiltrat
si dirijat astIel nct s se obtin diIerite grade de protectie biologic. Exist trei tipuri
de astIel de incinte specializate, n Iunctie de domeniul n care sunt Iolosite: hote Iizico
chimice, hote cu Ilux laminar verical sau orizontal, hote de protectie biologic clasa
I, clasa II, clasa III si cabinete destinate aplicatiilor PCR.
Hotele fizico - chimice sunt Iolosite pentru retinerea Iumului si vaporilor
chimici ce apar n urma manipulrii diIeritilor reactivi, dar nu realizeaz protectia
biologic.
Hotele cu flux laminar de aer sunt dotate cu Iiltre principale HEPA (High
Efficiencv Particulate Air) aIlate n spatele zonei de lucru, aerul Iiind ntotdeauna
Iiltrat nainte de a trece peste probe. Fluxul de aer poate Ii verical sau orizontal. Aceste
hote oIer protectie doar pentru materialul care se aIl n interior, operatorul neIiind
protejat microbiologic. Aceste hote sunt recomandate pentru protectia n momentul
manevrrii mediilor de cultivare si a reactivilor sterilizati.
Hotele de protecie biologic sunt incinte puternic ventilate, destinate limitrii
riscului de contaminare a personalului din laborator ce lucreaz cu agenti patogeni.
Aceste echipamente sunt destinate limitrii zonei de lucru si evitrii diseminrii

233
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
*

particulelor patogene pe calea aerului spre operator si n spatiul laboratorului. Hotele
de protectie biologic dispun de dou sisteme care mpiedic diseminarea agentilor
patogeni: bariera de aer si Iiltrele. Bariera de aer se realizeaz prin recircularea aerului
din incinta hotei ntr-o singur directie, cu vitez constant, Ir turbulente si poart
numele de Ilux de aer laminar. Filtrele au ca scop retinerea particulelor existente n
Iluxul de aer. Cele mai uzitate sunt Iiltrele tip HEPA care retin particulele cu diametrul
de pn la 0,3 microni, n proportie de 99,9.
Exist trei tipuri de hote de protectie biologic: clasa I, clasa II si clasa III.
Hotele de protectie biologic clas I
Sunt incinte nchise, cu deschidere Irontal, ce permit accesul bratelor
operatorului. Aerul ptrunde Irontal n spatiul de lucru si este evacuat n exterior dup
trecerea prin Iiltrele HEPA. Viteza Iluxului de aer este de cca. 4,4 m/s. Acest tip de
hot este recomandat pentru manipularea microorganismelor de clas 1, 2 si 3.
Dezavantajul acestui tip de hot de protectie biologic este acela c nu asigur
protectia materialului biologic, existnd riscul contaminrii acestuia. Din acest motiv,
hotele de protectie biologic clas I nu se recomand a Ii Iolosite n laboratoarele de
micologie medical.
Hotele de protectie biologic clas II
Se diIerentiaz de cele prezentate anterior prin gradul ridicat de protectie oIerit
utilizatorului, mediului ambiental, dar mai ales materialului biologic analizat, Iat de
posibilii agenti contaminanti.
Spatiul de lucru este ventilat utilizndu-se aer Iiltrat prin Iiltrele HEPA. De
asemenea, evacuarea aerului se realizeaz dup o Iiltrare ulterioar prin alte Iiltre
HEPA. Acest tip de hot este recomandat pentru manevrarea microorganismelor din
clasa de risc biologic tip 1, 2 si 3, n care sunt inclusi si Iungii.
n Iunctie de caracteristicile de Iabricatie, Iluxul de aer si sistemul de evacuare,
hotele de protectie biologic clas II sunt clasiIicate n:
- Hote de protectie biologic clasa II-A: evacueaz aerul Iiltrat n incinta
laboratorului sau n aIara acestuia. Aerul poate Ii recirculat n proportie de
70;
- Hote de protectie biologic clasa II-B1: evacueaz aerul Iiltrat n aIara
laboratorului. Recircularea aerului se realizeaz n proportie de 30;
laboratorului Iar ca acesta s Iie recirculat;
laboratorului dup o recirculare n proportie de 70.

12.4. Substane decontaminante folosite n laboratoarele de micologie medical

Capacitatea antiIungic (Iungicid si Iungistatic) a substantelor
decontaminante este diIerit n Iunctie de structura chimic a acestora si de clasa de
Iungi asupra creia dorim s actionm. AstIel, gama este destul de limitat, existnd
doar cteva optiuni utilizabile eIicient (tabelul 12-2).


234
Tabel 12 2
Capacitatea antifungic a substanelor decontaminante
Substana
dezinfectant
Exemple
Nivelul
de
aciune
Mod de aciune
Concentraii
recomandate
Fenoli / Bi-Ienoli
Triclosan,
HexacloroIen

Actioneaz
asupra
membranei
citoplasmatice
1 3
Hipocloriti
Hipoclorit de Na,
K, Ca
EIect oxidant
0,5 1
Cl activ
Alcooli
Alcool etilic
Alcool izopropilic
-
Nu maniIest
eIect Iungicid
60- 90
Aldehide Glutaraldehida
Actioneaz
asupra peretelui
Iungic
interactionnd
cu chitina
2
Stocarea la
pH acid,
potentare la
pH alcalin
Formaldehid
EIect Iungicid
mai redus dect
al
glutaraldehidei
4
Biguanidine
Clorhexidina
gluconat

Actiune
levuricid prin
coagularea
constituentilor
citoplasmatici
0,2 0,5
IodoIori Povidon iod
Actiune asupra
nucleotidelor,
acizilor grasi si
a unelor
proteine
1 10
Compusi
cuaternari de
amoniu
Clorur de
benzalkoniu
Clorur de
cetilpiridiniu

Actiune prin
dezorganizarea
membranei
plasmatice
0,5

- Zilnic, dup terminarea programului, se va eIectua curtirea supraIetelor cu
hipocloriti, n concentratie de 0,5 Cl activ.
- SupraIetele de lucru se vor sterge cu detergent lichid si prosoape de hrtie pentru
ndeprtarea substantelor organice cu potential contaminant, dup care pot Ii
aplicati compusi pe baz de iod. Datorit coloratiei imprimate de iod
supraIetelor tratate, se recomand utilizarea derivatilor iodoIorici, de exemplu
povidon-iod (polivinilpirolidon-iod) n concentratie de 2, datorit eIectului
antiIungic imediat, si cltirea cu ap dup cteva minute pentru eliminarea
coloratiei reziduale.

235
!
"
#
$
%
&
'
(
'

)
*

- n cazul contaminrii accidentale cu suspensie Iungic, supraIata respectiv se va
acoperi cu hrtie de Iiltru pentru evitarea extinderii ei, se va pulveriza
hipoclorit cu o concentratie superioar Iat de concentratia uzual. Timpul de
actiune va Ii de minim 20 minute. De asemenea, pot Ii Iolositi si compusi pe
baz iod. Toate materialele care intr n contact cu supraIata contaminat vor Ii
aruncate ntr-o cutie special pentru materiale patogene si se trimit spre
incinerare.

12.5. Msuri de protecie mpotriva substanelor chimice

- Hipocloritul de sodiu - produsele dezinIectante care contin n compozitia lor
hipoclorit de sodiu sunt agenti oxidanti puternici care elibereaz clor gazos;
eliberarea acestuia este accelerat n mediul acid.
- Compusii cuaternari de amoniu - sunt substante ncorporate n multiple produse
dezinIectante, datorit gradului redus de periculozitate. Se va tine ns seama
de capacitatea iritativ pentru tegument si de cea alergizant;
- Formaldehida si glutaraldehida - sunt produse cu un nalt grad de toxicitate;
Iormaldehida poate Ii stocat n laborator n Iorma gazoaz, lichid (solutie de
Iormalin) sau solid (paraIormaldehida). Aceste substante pot produce, n
urma contactului direct, iritatii oculare si ale tractului respirator superior, iar
contactul prelungit duce la aparitia dermatitelor, alergiilor cutanate si
respiratorii. Ambele substante posed eIect cancerigen. Din acest motiv,
manipularea acestora se va Iace doar cu masc si ochelari de protectie;
- Colorantii - sunt substante Iolosite pentru diagnostic, n cantitti Ioarte mici. Cu
toate acestea, se va evita contactul direct cu acestia, n special cu produsii
derivati din acridin cunoscuti ca substante cancerigene.


236

1. Block S S (1991) - Desinfection, sterilization and preservation;
Pennsylvania; Lea Febiger.
2. Borell N, Mesquida X, Alomar P (2001) - Normas de seguridad; In Peman
J, Martin-Mazuelos E, Rubio Calvo M C (eds) - Cuia Practica de
Identification y Diagnostico en Micologia Clinica; Rev Iberoam Micol,
Bilbao.
3. Collins C H (1993) - Laboratory-acquired; History, incidence, causes and
prevention; OxIord, Butterworth - Heinemann.
fungi; 2
nd
Rovira i Virgili.
5. Loza E, Alomar P, Bernal A, et al. (1999) - Seguridad en el Laboratorio
de Microbiologia clinica; Procedimientos en Microbiologia clnica;
Recomendaciones de la Sociedad Espanola de EnIermedades inIecciosa y
Microbiologia Clinica; Madrid, SEIMC.
6. McDonnell G, Russell A D (1999) - Antiseptics and desinIectants: activity,
action and resistance; Clin Microbiol Rev; 12:147-179.
7. Sewell D L (1995) - Laboratory-associated inIections and biosaIety; Clin
Microbiol Rev; 8:389-405.
8. Warnock D W (2000) - Mycotic agents oI human disease; In Fleming D O,
Hunt D L (eds.) Biological safety principles and practices; American
Society Ior Microbiology Press;
Washington D C.
Anex

237
3
4
5
6

Anex
Fig. nr. 2-1.
Zygomicoz cerebral experi-
mental; examen microscopic
direct; Irotiu prin amprent,
coloratie cu calcoIluor, x 200.
Fig. nr. 2-2.
Frotiu secretie vaginal;
col. Gram, x 400.
Fig. nr. 2-3.
Frotiu sediment LCR; col. tus
de India, x 400.
Anex

238

Fig. nr. 2-4.
Frotiu mduv osoas
hematogen;
Col. May-Grunwald-Giemsa,
x 400.

Fig. nr. 2-5.
Frotiu hemocultur;
necolorat, x 900.
Fig. nr. 2-6.
Preparat extemporaneu cu
band adeziv; lactoIenol cu
albastru de metilen, x 900.
Anex

239
3
4
5
6

Fig. nr. 4-1.
nsmntarea hemoculturii n pictur.
Fig. nr. 5-1.
Lutarea preparatelor extemporanee.

Fig. nr. 6-1.
Zygomicoz pulmonar;
Col. Fontana-Mason, x 400.

Anex

240

Fig. nr. 6-2.
Candidoz renal;
col. PAS, 400.
Fig. nr. 8-1.
Testul de hidroliz a ureei negativ
(stnga), pozitiv (dreapta)

Fig. nr. 8-2.
Colonii de C. neoformans pe Agar cu
extract din seminte de Niger

Anex

241
3
4
5
6

Fig. nr. 8-3.
Aspectul coloniilor apartinnd
speciilor levurice identiIicabile
prin cultivare pe CandiSelect
4.

Fig. nr. 8-4.
prin cultivare pe CHROMagar
Candida.
Fig. nr. 8-5.
prin cultivare pe Chromogenic
Candida Agar.

Anex

242

Fig. nr. 8-6.
Kitul Auxacolor 2

Fig. nr. 8-7.
Aspectul galeriei Auxacolor 2
n cazul speciei C. tropicalis
Fig. nr. 8-8.
Aspectul galeriei de
identiIicare -Microplate
(Biolog)
Anex

243
3
4
5
6

Fig. nr. 8-9.
Aspect microscopic, preparat
extemporaneu, x 1000 Iir de
pr - organe perIoratoare in
vitro.
Fig. nr. 8-10.
Cultur de M. canis pe boabe
decorticate de orez

Fig. nr. 8-11.
Candida albicans
Tubi germinativi, preparat
extemporaneu cu lactoIenol si
albastru de anilin; x 400

Index

245
7
4
8
5
6

Index

!
!"#$%&'()*+,# ------------------------------------------- ".$
"
. /()*01230, -------------------------------------------------- 45$
#
+6*78 8)6*)1+,+1 -------------------------------------------- "4
+*09 *+/70* ----------------------------------------------------- ":4
+*09 ,0*210,0* ------------------------------------------------- ":4
+*;090, --------------------------------------------------------- 4$.
<&=>2(0?7;+3+ ------------------------------------------- "@A
<'+;
+*71+1 B2C7(( --------------------------------------------- DA
+*71+1 E*F(+;G ------------------------------------------ DA
+*09 +*710* 90*(2;+, 7H1;+*1 97 9;2I907 ------ .@
+> 97 ;260,71 ------------------------------------------- JA
KFL F+,909+ ---------------------------------------------- DJ
KMLLN -------------------------------------------------------- DJ
K(+812 O&O -------------------------------------------------- D:
K2;7((0 -------------------------------------------------------- AD
K;2?*;732( >);>); *+370, '()*23 ---------- D@
FP;0817,87, ----------------------------------------------- .5
F02*2(+1 ----------------------------------------------------- D@
*0;77 --------------------------------------------------------- J@
*) +*09 *+/70* 0 *01;+1 /7;0* ------------------------ ."
*) +?092, -------------------------------------------------- JA
*) 7H1;+*1 97 *+;12/ 0 '()*23 ------------------- .4
*) 7H1;+*1 97 9;2I907 0 *(2;+?/7,0*2( ------- .4
*) 7H1;+*1 97 9;2I907 0 /012, -------------------- .$
*) 7H1;+*1 97 ?+( ------------------------------------- :"
*) 7H1;+*1 97 2;73 -------------------------------------- .$
*) 7H1;+*1 97 >+>;0Q+ --------------------------------- .D
*) 7H1;+*1 97 82( ---------------------------------------- .D
*) 7H1;+*1 97 1)1), ------------------------------------ ..
*) /0, 97 2R3 ----------------------------------------- AA
*) /0, 97 >2;)?6 ----------------------------------- ..
*) /0, 97 >2;)?6 0 SC77, :5 --------------- .A
*) /;),37 97 '+;2+/ --------------------------------- .A
*) 0,/)307 97 =0'7; ------------------------------------- JD
*) T*+,+R+,0, '(0*0, +(6+81;) 97
6;2?10?2( -------------------------------------------- .J
*) 8)*;23 0 *;7+10, -------------------------------- .:
*) 8)*;23# *;7+10, 0 90*(2;+, ----------------- .@
F3+>7Q&2H ----------------------------------------------- :A
&0*(2;+, U287 K7,'+( *(2;+?/7,0*2( --- @"
90*(2;+,# 7H1;+*1 97 9;2I907 ": V '(0*7;2( -- A5
90/7;7,07;7 !"#$%&'(()" ----------------------------- A5
&0H2, --------------------------------------------------- A"# A4
'(0*7;0, ----------------------------------------------------- J@
'()*23 >7>12, 9;2I907 ----------------------- A4
0,/)307 *2;9 *;707; ---------------------------------- A$
032(+;7 *+,-'-+ ----------------------------------------- A$
T+*1;0?7( --------------------------------------------------- AD
T77?0,'----------------------------------------------------- A.
T011?+, ------------------------------------------------------ A.
?+( ----------------------------------------------------------- :5
E)7((7; W X0,12, '()*23 4 V ----------------- AA
=0*Q7;82, -------------------------------------------------- DJ
Y+( ------------------------------------------------------------- AJ
>7,1;) 81)907;7+ ?2;/2(2'070 (7R);0(2; ----- A:
>7>12, '()*23 /()*2,+32( ------------------ A@
>7>12, $V ----------------------------------------------- @D
UYEM EZY[ '()*23 ------------------------------ @5
[<KXM -------------------------------------------------------- J"
[+62);+)9 *0*(2P7H0?09 -------------------------- J"
[+62);+)9 *(2;+?/7,0*2( -------------------------- J4
[+62);+)9 90()+1 --------------------------------------- J.
[+62);+)9 \??2,8 ---------------------------------- J4
[+62);+)9 SSF ------------------------------------------ :J
8],'7 '()*23 *08170, -------------------------- J$
87(7*10R *) 1;0>12/+, ---------------------------------- JD
[1+06 ---------------------------------------------------------- JD
S+Q+8*P02 -------------------------------------------------- J.
S;0*P2>PG12, ------------------------------------- @4# ":4
S;0*P2>PG12, " ------------------------------------------ @4
S;0*P2>PG12, 4 ------------------------------------------ @4
S;0*P2>PG12, $ ------------------------------------------ @$
S;0*P2>PG12, D ------------------------------------------ @$
S;0*P2>PG12, . ------------------------------------------ @$
S;0*P2>PG12, A ------------------------------------------ @D
S;0*P2>PG12, J ------------------------------------------ @D
SC77, :5 -------------------------------------------- .A# J.
+(6+81;) 97 ?710(7, $V ---------------------------------- 44
+(*+(0,03+;7 --------------------------------------------------- ":$
+(*22( 710(0* --------------------------------------------------- 4$D
+(*22( 032>;2>0(0* ------------------------------------------ 4$D
+(*22(0 ----------------------------------------------------------- 4$D
+(97P097-------------------------------------------------------- 4$D
<E$ ---------------------------------------------------------------- :$
+?/217;0*0, K ---------------------------------------------- 45$
+?2;87 --------------------------------------------------------- "@A
+?>(01+^ '2(9 ----------------------------------------------- "@.
+,1060210* ?790)? $ --------------------------------------- :$
Index

246
<,10/),'0';+?+
+(7'7;7+ +,10/),'0*7(2; ------------------- 45D# 45A
+>(0*+;7+ 67,30(2; \1781 -------------------------- 45D
!"#$%&'(()" ----------------------------------------------- 45A
*+,-'-+ --------------------------------------------------- 45$
FT[M EDD< ---------------------------------------------- 45:
*%.#/01011)" ------------------------------------------- 45$
2)"+%')3 -------------------------------------------------- 45A
P717;2;730817, -------------------------------------- 45D
?7129+ 90/)30?71;0* _0;6GK+)7; ---------- 45:
>;7>+;+;7+ 0,2*)()()0 ---------------------- 45$# 45A
;7*2?+,9;0 97 0,17;>;71+;7 ------------------ 45@
;7')(0 97 *010;7 + FEM ----------------------- 45D# 45J
45'60#)" -------------------------------------------------- 45A
450-0/0%)(+ -------------------------------------------- 45$
71$-0"#0%')3 ------------------------------------------ 45A
17P,0*+ 97 ()*;) >7,1;) /),'0
/0(+?7,120 ----------------------------------------- 45A
17P,0*+ 97 ()*;) >7,1;) (7R);0 ----------------- 45$
8%'150"#0%0,-------------------------------------------- 45$
+>+;+17 >;21710*7 +?2R060(7 --------------------------- "4
+;1;28>2;0 -------------------------------------------------------- :.
+8*28>2;0 -------------------------------------------------------- DA
+80?0(+;7+ 8);87(2; 97 +321 --------------------------- ":5
+80?0(+;7+ 8);87(2; 97 *+;62, ---------------------- ":5
+8>0;+1)( 7,921;+P7+( ------------------------------------- "5
+8>0;+1)( >;281+10* ------------------------------------------- ".
+8>0;+1)( >)(?2,+; ----------------------------------------- ""
+8>0;+1)( 1;+P72812?0* ----------------------------------- "5
$
6+,9 +9730R ------------------------------------------------- 44
6+,9+ +9730R KMZ S<Y\ ------------------------------- 44.
KXM ------------------------------------------------------------------ A$
60/7,2(0 -------------------------------------------------------- 4$D
60')+,090,7 --------------------------------------------------- 4$D
602>80+ >)(?2,+; ------------------------------------------ ""
602>80+ 17810*)(+; ------------------------------------------ ".
60287*);01+17 ------------------------------------------------- 44@
K(+,Q2>P2; ----------------------------------------------------- 4"
K(+81 -------------------------------------------------------------- "@:
6(+812*2,0900 --------------------------------------------------- :.
6;2?*;732( >);>); --------------------------------------- ":$
6;2?); 97 71090) ----------------------------------------- "@$
6;2,P28*2>0+ -------------------------------------------------- ""
K)(02,
*) );77 ------------------------------------------------------ JJ
F3+>7Q&2H ------------------------------------------------ :A
[+62);+)9 ------------------------------------------------- J:
%
*9 +(:'1+," ---------------------------------------------------- ":.
*9 -):(','$,"'" --------------------------------------- ":.# "@D
*+(*2/()2; ------------------------------------------------------- 4"
*+>+*01+17 +(7;'03+,1 ---------------------------------- 4$5
F+871+
<MUZF\TT ---------------------------------------------- 4"4
KMZF\TT --------------------------------------------------- 4".
FNFT\`& ------------------------------------------------- 4".
T<UZ "55 ------------------------------------------------ 4"A
EMFUZ. -------------------------------------------------- 4"D
*+8>2/),'0, ------------------------------------------------ 45$
*+1717; -------------------------------------------------------------- $
*7;,7+( Y+;Q7; ---------------------------------------------- 4"
FXUZE+'+; *+,-'-+ -------------------------------- D.# J:
FP;2?+8 ------------------------------------------------------- "@:
*(+?0928>2;0 ---------------------------------- ..# AJ# :.# :J
*(+;0/0*+;7+ *) _ZX 0 90?710( 8)(/2H09 ------------ 4.
*(+87 97 ;08* 602(2'0* ------------------------------------- 44@
*(2;P7H090,+ '()*2,+1 ----------------------------------- 4$D
*(2;); 97 67,3+(Q2,0) --------------------------------- 4$D
*(2;); 97 *710(>0;090,0) -------------------------------- 4$D
*2(2;+,0 ------------------------------------------------------- 4$.
F2(2;+0+
+(6+81;) <(*0+, W >7,1;) ?)*2>2(03+P+;097
+*097 -------------------------------------------------- "4A
K+)7; ------------------------------------------------------- "4:
FP0*Q -------------------------------------------------------- "$5
*) +*09 >7;0290* [*P0// ----------------------------- "D$
*) *+(*2/()2; +(6 0 _ZX "5V --------------------- 4A
*) P09;2H09 97 >21+80) 0 *7;,7+( Y+;Q7; - 4.
*) (+*12/7,2( 0 +(6+81;) 97 +,0(0, ------------ 4D
*) ?)*0*+;?0, [2)1P'+1 --------------------------- $.
/()2;78*7,1 *) +*09 >7;0290* [*P0// -------- "D4
B2,1+,+E+882, ------------------------------------- "$.
L07?8+ ------------------------------------------------------ $"
L2?2;0L;2*211 -------------------------------------- "$@
L;+? --------------------------------------------------------- 4:
L;+? *+(*2/()2; +(6 --------------------------------- $5
L;09(7G ----------------------------------------------------- "$"
L;09(7G /()2;78*7,1 -------------------------------- "$:
X7?+(+), W \230, --------------------------------- "4$
E+GL;),C+(9L07?8+ ----------------------------- $4
?71P7,+?0,7 80(R7;?290/0*+1 -------------- "$@
E)812 -------------------------------------------------------- $A
,7'+10R *) ?7;*);2*P;2? 4 V 0 1) 97
M,90+ ----------------------------------------------------- 4$
,7'+10R *) 1) 97 M,90+ ---------------------------- 44
Y<[ ---------------------------------------------------------- "D$
Y<[ /(2);78*7,1 ------------------------------------- "D4
[*P?2;( --------------------------------------------------- "$$
a;0'P1 ------------------------------------------------------- $D
Index

247
7
4
8
5
6

b07P( =77(87, ----------------------------------------- "D.
*2?>2300+ ?7900(2; 97 *)(1); ----------------------- D4
*2?>)0 *)+17;,+; 97 +?2,0) ---------------------- 4$D
*2,87;R+;7 97;?+12/00 ----------------------------------- @.
*2,1;2()( *+(0100 +*030(2; ,)*(70*0 ----------------- "@$
*2,1;2()( 97 *+(01+17 --------------------------------------- DD
*;2?2?0*23 -------------------------------------------------- "4
*)(10R+;7 8)6?7;8 --------------------------------------- "5.
*)(10R+;7+ c, d>0*1); 8)8>7,9+1e ------------- "5A
*)(10R+;7+ >7 6(2* 97 '7(23 ------------------------- "5A
*)(10R+;7+ >7 (+? ---------------------------------------- "5A
*)(10R+;7+ >7 8)>2;1);0 1;+,8>+;7,17 ----------- "5.
&
97;?+12/00 --------------------------------------------------- ":D
9717*0+ FZ
4
------------------------------------------------------ D
90/7;7,07;7 --------------------------------------------------- ":.
908>23010R7 0,1;+R+8*)(+;7 --------------------------------- $
908>23010R)( FMY "5E ------------------------------------- 4"@
&SE ---------------------------------------------------------------- ::
9);+1+ 0,*)6;00 ------------------------------------------------ J
'
7(7*1;2/2;73+ c, '7( 97 +'+;23 -------------------- "@$
7,9292,1017 ---------------------------------------------------- "4
7>)03+;7 >7 ?7900 82(097 ------------------------------- "5"
71+(+;7 c, >),*17 032(+17 ------------------------------- "5"
7R097,07;7+ *+>8)(70 -------------------------------------- 44
7H+?7, ?0*;28*2>0* 90;7*1 ----------------------------- 4"
7H>7*12;+07 0,9)8 ---------------------------------------- "5
7H>7*12;+07 8>2,1+, ------------------------------------ "5
7H1;+*1 97 *+;12/0 -------------------------------------------- :5
7H1;+*0+ <&= ----------------------------------------------- "@"
7H1;+*0+ <&=)()0 >;0, *;02>;7*0>01+;7--------- "@4
(
/7,2(0------------------------------------------------------------- 4$D
/7;?7,1+;7+ 3+P+;);0(2; ------------------------------- "J@
/0(1;7 X\Y< ---------------------------------------------------- 4$4
/0;7 97 >; --------------------------------------------------------- @
/0H+;7+ ----------------------------------------------------------- ""$
B0H+12;0
K2)0, ----------------------------------------------- ""D# ""A
X2((+,97 ------------------------------------------ ""D# ""A
82()0+ 97 /2;?2( "5V 1+?>2,+1 --- ""D# "".
/(+*2+,7 97 P7?2*)(1); ---------------------------------- 4
/()*2,+32( ----------------------------------------------------- 45$
/()097(7 0,1;+2*)(+;7 ----------------------------------------- @
/2;?+(97P09 ------------------------------------------------ 4$D
/2;?)(+; 97 *7;7;7 ------------------------------------------- "
/;+'?7,17 108)(+;7 602>80*7 ---------------------------- ".
/;+'?7,17 ),'P0+(7 ------------------------------------------ @
/;210) *0126+*17;02(2'0* ----------------------------------- "D
/;210) *2(2;+1 E+GL;),C+(9L07?8+ ------------ 44
/),'0 +7;2>);1+0 ------------------------------------------ 4""
B),'017(( -------------------------------------------------------- ".$
*2,1;2()( *+(0100 ------------------------------------- ".:
0,17;>;71+;7+ ;73)(1+17(2; ----------------------- ".J
(0?017 ------------------------------------------------------- ".:
17P,0* 97 ()*;) -------------------------------------- "..
R+(2;0 +17>1+17 --------------------------------------- ".@
)
'+(+*12?+,+, ----------------------------------------------- "A5
'7( 97 +'+;23 "V ----------------------------------------- "@$
L7,K+,Q ------------------------------------------------------- "@:
'7;?1)67 1781 --------------------------------------------- ":.
'()1+;+(97P09+ ---------------------------------------------- 4$D
;)'60/'+ +:.""','1+ ----------------------------------------- JD
*
X7?2*)(1);+
R2()?)( 97 8],'7 ---------------------------------------- D
P7H+*(2;2/7, ------------------------------------------------ 4$D
P09;2(03+ *+370,70 ------------------------------------------ ":D
P0/7 ----------------------------------------------------------------- :.
P0>2*(2;01 97 F+ -------------------------------------------- 4$D
P0>2*(2;01 97 _ ---------------------------------------------- 4$D
P0>2*(2;01 97 =+ -------------------------------------------- 4$D
P0>2*(2;00 ----------------------------------------------------- 4$D
P081090, -------------------------------------------------------- ":4
X081090, XF( --------------------------------------------------- @D
P217 97 >;217*07 602(2'0* -------------------------- 4$4
P217(7 97 >;217*07 602(2'0* ----------------------- 4$$
+
0?>+*12;)( b7/2, b<A ---------------------------------- 4"J
0?>710'2 ----------------------------------------------------------- @
0?),2/()2;78*7, ----------------------------------------- 44
0,/)307 97 *+;12/0 -------------------------------------- .4# :5
c,'(26+;7 ------------------------------------------------------ "5"
0,23012(---------------------------------------------------------- ":4
Index

248
0,23012( ------------------------------------------------------------ @$
0292/2;0 --------------------------------------------------------- 4$D
01;+*2,+32( ---------------------------------------------------- 45$
MS[ " -------------------------------------- "@D# "@.# "@A# "@J
MS[ D -------------------------------------- "@D# "@.# "@A# "@J
,
Q01);0 97 7H1;+*07 <&= -------------------------------- "@"
-
(+17H+'()10,+;7 *9 -):(','$,"'" --------------------- "J4
(+R+I)( 6;2,P2+(R72(+; ------------------------------------ ""
TK< ------------------------------------------------------------------ ""
(0*P09 >7;0*+;90* ---------------------------------------------- ""
(0*P09 >7;012,7+( ---------------------------------------------- ""
(0*P09 >(7);+( --------------------------------------------------- ""
(0*P09 80,2R0+( -------------------------------------------------- ""
(0*P09)( *7/+(2;+P090+, ------------------------------------- :
T>;2(0,+?0,2>7>109+3+ ------------------------------ ":4
T)1+;7
>;7>+;+17 7H17?>2;+,7) ------------------------ """
.
<9 +)-0)','' ------------------------------------------------- ":.
<9 1+,'" -------------------------------------------------------- ":.
?9)R+ 282+8 P7?+12'7, ---------------------------- :
?+,+, 87;0* -------------------------------------------------- "A@
?+;Q7;0 97 ';7)1+17 ?2(7*)(+; ------------------- "@$
?7900 *;2?2'7,7-------------------------------------------- D.
?7900 97 *)(10R+;7 ------------------------------------------- DA
?7900 90/+30*7 ---------------------------------------------------- .
?7900 90/7;7,0+(7 ------------------------------------------- D$
?7900 P0>7;12,7 ------------------------------------------------ A
E790)
6+3 >7,1;) (7R);0 ------------------------------------- :4
*) (+>17 90()+1-------------------------------------------- :D
*) >]0,7 ----------------------------------------------------- :.
*) 82( --------------------------------------------------------- :.
97 *2,R7;807 ---------------------------------------------- :A
>7,1;) 032(+;7+ 97;?+12/00(2; ------------------- ::
80,1710* >7,1;) 1781)( 97 /0(+?7,1+;7 -------- :$
?790)(
FP;0817,87, --------------------------------------------- ":"
E790)(
K0(+0 ------------------------------------------------------------ :D
_);),'N7'0+, ------------------------------------------- :A
=0Q7;87,E+,Q2R8Q0 ---------------------------------- :J
Y+'+,2T7R0, --------------------------------------------- :J
UYEM "AD5 ------------------------------------------- J5# :@
UYEM "AD5 EZY[ !FT[M% ---------------------------- :@
UYEM "AD5 EZY[ !\fF<[S% ---------------------- :@
?7129+ &+(?+) -------------------------------------------- "5.
?7129+ (0370 *) *7,1;0/)'+;7 ----------------------------- .
?0*712? --------------------------------------------------------- "4
?2?7,1)( >;7(7R;00 ----------------------------------------- D
?)*2+8+ 2;+( ------------------------------------------------ "4
?)*2>2(03+P+;097 *+>8)(+;7 ------------------------ "4A
E)812 ------------------------------------------------------------- 44
/
=FKM -------------------------------------------------------------- "@:
,7';) *(2;+32( ------------------------------------------------- 4"
0
2;'+,7 >7;/2;+12+;7 ------------------------------------- ":D
1
>81;+;7+ ?7900(2; ------------------------------------------ DD
YFU --------------------------------------------------------------- "@"
YFU 9)>(7H --------------------------------------------------- "@D
Y&< ----------------------------------------------------- D4# .4# :5
>7;0+I)( 6;2,0* ----------------------------------------------- ""
='/.%'+"'" >$%"'10(0% ----------------------------------- "5# 44
>('0 978*P087 ------------------------------------------------- "4
Y(+17(0+
g
<8>7;'0(()8 -------------------------------------- "A5
Y(+17(0+ <8>7;'0(()8
0,17;>;71+;7+ ;73)(1+17(2; ----------------------- "AD
>;0,*0>0)( 1781)()0 ------------------------------------ "A5
17P,0*+ 97 ()*;) -------------------------------------- "A4
Y(+17(0+ F+,909+ <F
0,17;>;71+;7+ ;73)(1+17(2; ----------------------- "AJ
>;0,*0>0)( 1781)()0 ------------------------------------ "A.
17P,0*+ 97 ()*;) -------------------------------------- "AA
Y(+17(0+ F+,909+ <'
0,17;>;71+;7+ ;73)(1+17(2; ----------------------- "J"
>;0,*0>0)( 1781)()0 ------------------------------------ "A@
17P,0*+ 97 ()*;) -------------------------------------- "J5
Y(+17(0+
g
F+,909+ <* ------------------------------------- "A.
Y(+17(0+
g
F+,909+ <' ------------------------------------- "A@
>28+*2,+32(-------------------------------------------------- 45$
>2R092, 029 ------------------------------------------------ 4$D
>;7(7R+17 6+(+,2>;7>)0+(7 --------------------------- ".
>;7(7R+1)( 210* -------------------------------------------------- @
>;7>+;+;7+ ?7900(2; --------------------------------------- D$
Index

249
7
4
8
5
6

>;7>+;+1 7H17?>2;+,7) --------------------------- 4"# 44
Y;7>+;+1)( 7H17?>2;+,7)
*) 6+,9 +9730R ------------------------------------- ""5
*) (+*12/7,2( 0 +(6+81;) 97 +,0(0, ---------- "5@
>;0?7;0 ---------------------------------------------------------- "@A
>;0,*0>0)( 0?>;7',;00 +;'7,10* --------------------- $:
>;267(7 602>80*7 1;+,86;2,P0+(7 --------------------- ""
>;2*78+;7+ 78)1);0(2; ---------------------------------- ""J
Y;2*78+;7+ 78)1);0(2;
*(+;0/0*+;7+ ----------------------------------------------- ""@
*2(2;+;7+ ------------------------------------------------- "4$
978P09;+1+;7+ ------------------------------------------ "":
71+(+;7+ 87*0),0(2; --------------------------------- "4"
710*P71+;7+ 0 +;P0R+;7+ --------------------------- ".5
0?>;7',+;7+ *) >+;+/0, ------------------------- ""@
0,*()97;7+ ----------------------------------------------- "45
?2,1+;7+ ------------------------------------------------- "D:
87*02,+;7+ ---------------------------------------------- "45
>;29)*7;7+ +(12; 7,30?7 ------------------------------ ":4
>;29)*7;7+ 97 /7,2(2H09+3 ------------------------ ":4
>;29)*7;7+ 97 );7+3----------------------------------- ":5
>;2170,+3+ _ -------------------------------------------------- "@"
>87)92P0/7 ------------------------------------------------------ :.
>),*07 ;+P090+, ---------------------------------------------- :
>),*07 817;,+( ------------------------------------------------ :
>),*07 R7,2+8 >7;0/7;0* ------------------------------- $
>),'0 >+;292,1+(7 ------------------------------------------ "4
>);0/0*+;7+ 032(+17(2; (7R);0*7 ----------------------- "5$
2
;+*(+1)( *2;,7+, ------------------------------------------------ @
U7*2(1+;7
>;7*+)00 ------------------------------------------------------ "
;730817,+ (+ *0*(2P7H0?09 --------------------------- ":"
;08* *2(7*10R --------------------------------------------------- 44@
;08* 0,90R09)+( ------------------------------------------------ 44@
3
8],'7 ---------------------------------------------------------------- 4
8*21*P ----------------------------------------------------------- ""5
8*)+?7 *)1+,+17 ---------------------------------------------- @
87*;70+ >;281+10* ------------------------------------------ ".
87*;700 >);)(7,17 ------------------------------------------- "4
87*;700 ;78>0;+12;00 I2+87 -------------------------------- "5
87*;700 R+'0,+(7 ---------------------------------------------- "D
87*R7,0+(03+;7+ /;+'?7,17(2; +?>(0/0*+17 --- "@:
87*R7,0+(03+;7+ ;7'0),0(2; MS[ ---------------------- "@A
87*R7,0+(03+12; -------------------------------------------- "@:
87?0,7 97 =0'7; ------------------------------------------ ":4
87?,0/0*+0+ P7?2*)(1);0(2; >23010R7 ---------------- :
87; 8+,')0, --------------------------------------------------- ":.
80817?7 +)12?+17 -------------------------------------------- D
80817?7 87?0+)12?+17 ------------------------------------- D
8>(1);+ 6;2,0* ------------------------------------------ ""
8>7*)()? -------------------------------------------------------- "D
8>2;21P;0*23 ------------------------------------------------- "4
8>)1+ -------------------------------------------------------------- "5
817;0(03+;7+ ?7900(2; --------------------------------------- D$
8)681+,7 *+,*7;0'7,7 --------------------------------- 4$.
8)681+,7 97*2,1+?0,+,17 -------------------------- 4$$
4
S7P,0*+
c,8?],;00 (7R);0(2; >7 <'+;)( *)
/0, 97 >2;)?6 0 1C77, :5 ------------------ "5.
17P,0*+ +8>0;+070 *) +* /0, ------------------------------ "A
17P,0*+ 8790?7,1;00 _2*P ---------------------------- 44D
S7P,0*0
97 +7;2?0*2(2'07 ------------------------------------ 4""
97 7R+()+;7 + 87,8060(0100
(+ +,10/),'0*7 ------------------------------------ 45$
97 7H+?0,+;7 ?0*;28*2>0* + /),'0(2;
90, *)(1);0 ------------------------------------------ "5@
97 P0812>+12(2'07 ------------------------------------ ""$
97 c,8?],+;7 --------------------------------------- "5"
97 ?0*;28*2>07 90;7*1 ------------------------------ 4"
97 >;2*78+;7 >;0?+; ---------------------------------- "
97 ;7*2(1+;7 ------------------------------------------------- "
97 87;2?0*2(2'07 ------------------------------------- ".$
97 1;+,8>(+,1+;7 ----------------------------- "5"# "5J
97 1;+,8>2;1 ------------------------------------------------ "
1781 97 2>+*0/07;7 ------------------------------------------- J.
1781 );7+3 ------------------------------------------------------ JJ
17817 602*P0?0*7 ------------------------------------------- "J@
17817 /0302(2'0*7 -------------------------------------------- "J@
S781)(
97 6(+8173 ---------------------------------------------- ":.
97 *)(10R+;7 >7 <'+; KFY(+>17'()*23 -- ":$
97 *)(10R+;7 >7 62+67 97 2;73 ----------------- ":.
97 97>081+;7 + ,7*78010(2; ,)1;010R7
8>7*0+(7 ---------------------------------------------- ":4
97 /0(+?7,1+;7----------------------------------------- ":.
97 P09;2(03 + );770 (+ 97;?+12/00 ----------- ":"
97 P09;2(03 + );770 (+ (7R);0 -------------------- ":5
97 >7;/2;+;7 + /0;)()0 97 >; 0, R01;2 ------- ":D
97 17;?2810?)(+;7 ---------------------------------- ":A
97 17;?212(7;+, ---------------------------------- ":A
10+?0, --------------------------------------------------------- ":4
10+?0, XF( ----------------------------------------------------- @$
10,7+ ----------------------------------------------------------------- @
Index

250
1;+,8()?0,+12; ---------------------------------------------- "@$
1;0*(28+, -------------------------------------------------------- 4$D
1)6 '7;?0,+10R ---------------------------------------------- ":.
1)60 '7;?0,+10R0 ---------------------------------------------- :D
1) 97 M,90+ ----------------------------------------------------- 44
5
f;0,+
*+1717;08? R730*+( -------------------------------------- "$
*+1717;03+;7 R730*+( ---------------------------------- "$
;7*2(1+;7 (+ 6;6+0 ------------------------------------ "$
;7*2(1+;7 (+ /7?70 -------------------------------------- "4
;7*2(1+;7+ >7 *+1717; >;77H0817,1-------------- "$
;7*2(1+;7+ >;0, >),*07 8)>;+>)60+, ------- "$
6
R+(R7 --------------------------------------------------------------- "D
R03)+(03+;7+ '7()()0 --------------------------------------- "@$
R2;0*2,+32( --------------------------------------------------- 45$
7
N7+81 F+;62, K+87 ------------------------------------------ :4
8
3G'2?0*717 ----------------------------------------------------- :.
3G'2?0*23+ ----------------------------------------------------- ".

'+(+*123+?0,09+3+------------------------------------- ":4

w
w
m

P

J

A

Se

Tr

www.Iungi.ro
www.journal.Iu
micologiemedi
OP 6, C
Iasi, Ro
Consil
Preedinte.
Jicepreedinte
dministrator p
ecretar.
Tre:orier.

Iungi.ro
icalagmail.c
CP 1356
omnia
liul director
e.
publicaii.
de M

251

com
:
Dr. M
mih
Dr. Bo
bogd
Ing. Io
ionu
Dr. In
ingr
Dr. Lu
lum
Soci
Micologie M
1
Mihai Mares
aimaresIun
ogdan DoroIte
dandoroItei
onut Ailinci
utailincaiIun
ngrid Cezara A
ridapetreiIun
uminita Malic
initamalicIu
ietatea Rom
Medical si M
ngi.ro
ei
Iungi.ro
ngi.ro
Apetrei
ngi.ro
c
Iungi.ro
mn
Micotoxicoloogie

Tehnici de Laborator in Micologia Medicala

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tehnici de Laborator in Micologia Medicala

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Sub red

Candida Ac ............................................................................ 165

Candida Ag ........................................................................... 169

FA (bioMerieux) sau, mai recomandat, BD

Candida Ag este o tehnic imunoenzimatic de tip sandwich ce

II, Albicans ID2 agar, CHROMagar Candida (Iig. nr. 8-4,

S-ar putea să vă placă și