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Sinopsis de las Tcnicas de Bancos de Sangre Rafael Amadeo Mateo Capilla, Tecn. Laboratorio Clnico Indice: Grupo AB0 El fenotipo Rh-Kell La conrmacin de antgeno D El grupo hemtico en tubo El grupo srico en tubo La determinacin del antgeno D en placa La determinacin del grupo ABO en placa La resolucin de discrepancias AB0 La identicacin de Anticuerpos Irregulares La investigacin de anticuerpos irregulares La titulacin de anticuerpos. Mtodo en tarjeta Las pruebas cruzadas Tcnica del Coombs Directo La tcnica del Coombs directo monoespecco Interpretacin de la aglutinacin La determinacin del fenotipo del grupo Lewis La determinacin del grupo MN La determinacin del grupo P La determinacin de los grupos acreditados Ss, Kk, KpaKpb, FyaFyb, JkaJkb, LuaLub La elucin mediante R-E-S La elucin con Gamma EGA La adsorcin autloga de autoanticuerpos calientes La hemoglobinuria paroxstica nocturna Las autoaglutininas fras de ttulos elevados La especicidad de crioaglutininas La tcnica de Donath-Landsteiner Captulo 1. GRUPO AB0 Estudio de anlisis Establecer el grupo ABO (hemtico/srico) y el factor Rh (D) en tarjeta. Exposicion 1. Identicar la tarjeta con el nombre y apellidos del receptor. 2. Preparar en un tubo debidamente identicado una dilucin con 10 l de sangre total del paciente y 0.5 ml de Id-Diluent . 3. Situar 50 l de la dilucin de hemates en los pocillos con anti-A anti-B, anti-AB, anti-D, anti- CDE y control. 4. Situar 50 l de dilucin de hemates comerciales A1 y B en los otros dos pocillos. 5. Ampliar 50 l de suero o plasma del paciente en los pocillos de hemates comerciales. 6. Centrifugar en la centrfuga. 7. Proceder a la lectura. Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte supe- rior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. La gradacin sera: La presencia de hemlisis indica igualmente posi- tividad. Si el botn de hemates se deposita en el fondo del pocillo la lectura es negativa. Si existe discrepancia entre grupo srico y hemti- co habr que resolverla antes de informar el resultado. Captulo 2. El fenotipo Rh- Kell. Estudio de anlisis Establecer los antgenos del sistema Rh y Kell (D, C, c, Cw, E, e y Kell). Exposicin de anlisis de anlisis 1. Identicar una tarjeta DiaClon Rh-subgroups+K con el nombre y apellidos del paciente. 2. Preparar en un tubo debidamente identicado una dilucin con 10 l de sangre total del paciente y 0.5 ml de Id-Diluent 1. 3. Situar 10 l de la dilucin de hemates en los pocillos con anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, anti-K y Control 4. Centrifugar en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura. Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. La presencia de hemlisis indica igualmente positividad. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa Captulo 3. La conrmacin de antgeno D Estudio de anlisis Establecer el antgeno D Exposicin de anlisis de anlisis 1. Identicar un tarjeta Diamed anti-D con el nombre y apellidos del paciente. 2. Preparar en un tubo debidamente identicado una dilucin con 10 l de sangre total del paciente y 0.5 ml de Id-Diluent 1. 3. Situar 10 l de la dilucin de hemates en los pocillos con anti-D y Control 4. Centrifugar en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura. Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. La presencia de hemlisis indica igualmente positividad. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Captulo 4. El grupo hemtico en tubo
Estudio de anlisis Establecer el grupo ABO en tubo. Exposicin de anlisis de anlisis 1. Situar una gota de anti-A, anti-B, y anti-AB, en tres tubos limpios y convenientemente rotulados. 2. Ampliar una gota de hemates problema diluidos en suero salino al 2-5% a cada tubo. 3. Mezclar suavemente agitando el contenido de los tubos y centrifugar durante 20 segundos 3000 rpm 4. Retirar de la centrfuga y resuspender suavemente el sedimento de los hemates. 5. Examinar la presencia o ausencia de aglutinacin y anotar los resultados.
Disquisicin del estudio analtico La presencia de aglutinacin o hemlisis indicar que la reaccin es positiva, mientras que una suspensin uniforme de hemates se considerar como resultado negativo. Las discrepancias entre los resultados del grupo ABO hemtico y srico deben resolverse antes de clasicar el grupo ABO del paciente. Captulo 5. El grupo srico en tubo
ESTUDIO DE ANLISIS Establecer la presencia o ausencia de anti-A y anti-B en el plasma o suero del paciente. Exposicin de anlisis de anlisis Utilizaremos hemates reactivo A1 y B de origen comercial. Opcionalmente podemos efectuar el grupo srico utilizando adems hemates A2 y O. 1. Colocar una gota de hemates reactivo en cada uno de los tubos limpios y rotulados. (A1, A2, B y O). 2. Ampliar dos gotas de suero problema a cada tubo. 3. Agitar suavemente y centrifugar durante 20 segundos a 3000 rpm (900-1000 x g). 4. Examinar los tubos en busca de hemlisis. Resuspender suavemente el sedimento de hemates y observar la presencia o ausencia de aglutinacin. Anotar resultados.
Disquisicin del estudio analtico La estampacin de aglutinacin o hemlisis revelar que La estampacin de aglutinacin o hemlisis revelar que la reaccin es positiva, mientras que una suspensin uniforme de hemates se considerar como resultado negativo. * Las diferencias entre los resultados del grupo ABO hemtico y srico deben resolverse antes de clasicar el grupo ABO del paciente. Captulo 6. La determinacin del antgeno D en placa Estudio de anlisis Establecer la presencia del antgeno D (Rh). Exposicin de anlisis de anlisis 1. Colocar una gota de antisuero Anti-D en un porta o placa limpio y rotulado, junto a una gota de sangre del paciente. 2. Colocar una gota de reactivo control (o en su defecto suero siolgico) junto a otra gota de sangre del paciente, en un segundo porta o en la placa. 3. Mezclar con un palillo limpio formando un circulo de 2-3 cm de dimetro. 4. Colocar los portaobjetos sobre el visor y bascular suave y constantemente para observar la presencia de aglutinacin. El mximo de observacin es de dos minutos, superado ese tiempo se puede producir un fenmeno de rouleaux, que puede interpretarse errneamente como aglutinacin. Captulo 7. La determinacin del grupo ABO en placa. Estudio de anlisis Efectuar el tipaje AB0 en placa o porta. Exposicin de anlisis de anlisis 1. Identicar el porta o la placa con el nombre y apellidos del paciente (o nmero de la unidad a tipar) 2. Colocar una gota de Seraclone Anti-A, Anti-B, y Anti-AB. 3. Ampliar una gota de sangre junto a cada gota de los reactivo y mezclarlo en un rea aproximada de 2 cm de dimetro (puede utilizarse para ello palillos higinicos). 4. Se recomienda hacer la lectura de la posible aglutinacin despus de 30 a 60 segundos.
Disquisicin del estudio analtico La presencia de aglutinacin indica la especicidad AB0. Captulo 8. La resolucin de discrepancias AB0. Estudio de anlisis Acordar el grupo ABO cuando no concuerdan el grupo hemtico con el grupo srico. Disquisicin del estudio analtico Se produce una discrepancia cuando los resultados del grupo hemtico y srico no concuerdan. La interpretacin del grupo ABO debe retrasarse hasta que se resuelva la discrepancia. Los primeros pasos a seguir son: 1. Repetir el grupo hemtico y srico en tubo con los hemates lavados. 2. Analizar los hemates frente a anti-A, B, A1. 3. Analizar el suero frente a hemates A1, A2, B. 4. Ampliar la relacin suero/hemates e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar y leer. Capitulo 9. La identicacin de Anticuerpos Irregulares
Estudio de anlisis Identicar la especicidad (por probabilidades) del anticuerpo que descubrimos con la investigacin o escrutinio de anticuerpos irregulares. Esta tcnica, bsicamente es similar a la deteccin de anticuerpos irregulares, con la diferencia de que en este caso enfrentamos el suero a una batera de 11 clulas de grupo 0 ampliamente fenotipadas, y cuya reactividad nos indicar la probable especicidad del anticuerpo en estudio.
Exposicin de anlisis de anlisis 1. Extraer del frigorco las cajas con los paneles comerciales de hemates papainizados y no papainizados. Comprobar la fecha de caducidad. Dar suavemente varias vueltas a la caja entera con el n de resuspender los hemates de cada frasco. 2. Preparar una suspensin de 10 L de sangre total del paciente con 0.5 ml de Id-Diluent 1 y otra suspensin de 10 L de sangre total del paciente con 0.5 ml de Id-Diluent 2. 3. Rotular : 12 pocillos de tarjeta Diamed ClNa 1 al 12, 12 pocillos de tarjeta Diamed LISS/Coombs del 1 al 12, 12 pocillos de tarjeta Diamed ClNa del 1P al 12P y 12 pocillos de tarjeta Diamed LISS/Coombs del 1P al 12P. 4. Ampliar a cada pocillo 25 L del suero problema. 5. Ampliar: 50 L de los hemates no papainizados del vial 1 a los pocillos rotulado 1 de las tarjetas Neutra y Coombs, y as haremos con todos los viales hasta el rotulado como 11. Al pocillo nmero 12 de ambas tarjetas ampliaremos 50 L de la solucin de hemates del paciente preparada con Id-Diluent 2. 6. Ampliar: 50 L de los hemates papainizados del vial 1 a los pocillos rotulado 1P de las tarjetas Neutra y Coombs, y as haremos con todos los viales hasta el rotulado como 11. Al pocillo nmero 12 de ambas tarjetas ampliaremos 50 L de la solucin de hemates del paciente preparada con Id-Diluent 1. Captulo 10. La investigacin de anticuerpos irregulares
Estudio de anlisis Los nicos anticuerpos de grupo que se suelen tener son los anti-A y anti-B. Los dems anticuerpos de grupo no relacionados con el sistema AB0, se les conoce como anticuerpos irregulares. Para detectar estos anticuerpos se enfrenta el suero a estudiar a una serie de hemates de grupo 0 que poseen la mayora de antgenos frente a los cuales estos anticuerpos son especcos. Clsicamente cuando esta prueba se utiliza como parte de los test pretransfusionales se denomina investigacin de anticuerpos irregulares, y cuando se esgrime como parte del protocolo de isoinmunizacin materno fetal se designa Test de Coombs Indirecto. Exposicin de anlisis 1. Identicar la tarjeta Diamed Liss/Coombs con el nombre y apellidos del receptor y rotular cuatro pocillos en cada tarjeta con los nmeros 1, 2 y 3. 2. Ampliar a cada pocillo 25 L del suero problema. 3. Situar 50 l de la dilucin de hemates comerciales Id Diacell I, II y III en los pocillos rotulados de la tarjeta. 4. Incubar durante 10 minutos a 37C la tarjeta en la incubadora Diamed. 5. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. Proceder a la lectura. Captulo 11. La titulacin de anticuerpos. Mtodo en tar- jeta.
Estudio de anlisis El ttulo de un anticuerpo, es la dilucin mxima en la que su presencia puede ser demostrada por aglutinacin, y es una forma grosera de valorar la cantidad del anticuerpo. Exposicin de anlisis 1. Rotular los tubos con la dilucin del suero (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64) y aadir 0,1 ml de Id solucin 2 a todos los tubos excepto al primero. 2. Ampliar un volumen igual de suero a los dos primeros tubos. 3. Mezclar con una pipeta limpia varias veces el contenido del segundo tubo y transferir 0,1 ml al siguiente tubo. Repetir el procedimiento con todas las diluciones, utilizando una punta de pipeta nueva con cada tubo. El volumen del ltimo tubo se guarda en un tubo limpio por si se requiriesen nuevas diluciones. 4. Rotular una tarjeta LISS/Coombs con el nmero de identicacin del paciente y en cada pocillo con las diluciones de los tubos empezando por el segundo tubo (2, 4, 8, 16, 32, 64). 5. Dispensar en cada pocillo 50 L de hemates en suspensin al 0.8% (los hemates deben tener el antgeno frente al que se dirige el anticuerpo a titular y ser compatibles ABO con el suero problema). 6. Ampliar a cada pocillo 25 L de la dilucin correspondiente. 7. Incubar durante 10 minutos la tarjeta en la incubadora Diamed. 8. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. Proceder a la lectura. Captulo 12. Las pruebas cru- zadas Estudio de anlisis Control nal de la compatibilidad ABO entre el donante y el receptor. Demuestra la ausencia de anticuerpos irregulares que pudiera tener el receptor frente a los hemates del donante. Exposicin de anlisis 1. Identicar las tarjetas (Diamed LISS/Coombs y Diamed ClNa) con el nombre y apellidos del receptor y rotular cada pocillo con el nmero de la unidad a cruzar. 2. Preparar una dilucin con 50 l de la unidad de concentrado de hemates y 0.5 ml de Id- Diluent 2, en un tubo rotulado con el n de la unidad de concentrado de hemates. 3. Situar 50 l de la dilucin de hemates en los pocillos de la tarjeta Diamed LISS/Coombs y en la tarjeta Diamed ClNa. 4. Situar 25 l de suero del receptor en cada pocillo de las dos tarjetas. 5. Incubar durante 15 minutos, la tarjeta Diamed LISS/Coombs, en la incubadora Diamed. Dejar ese mismo tiempo la tarjeta Diamed ClNa a temperatura ambiente. 6. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. 7. Proceder a la lectura. Captulo 13. Tcnica del Coombs Directo Estudio de analisis Esta tcnica detecta si los hemates estn recubiertos de anticuerpos o complemento. Exposicin de anlisis 1. Identicar una tarjeta Diamed LISS/Coombs con el nombre y apellidos del paciente y/o el nmero de identicacin de la muestra. 2. Preparar una dilucin con 50 l de sangre total en 0.5 ml de Id-Diluent 2, en un tubo debidamente identicado. 3. Situar 10 l de la dilucin de hemates en uno de los pocillos de la tarjeta. 4. Centrifugar en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura. Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Captulo 14. La tcnica del coombs directo monoespec- co Estudio de anlisis Esta tcnica identica la clase de inmunoglobulina o fraccin del complemento causantes de la positividad de un test de Coombs. Exposicin de anlisis 1. Identicar una tarjeta DC Screning I con el nombre y apellidos del paciente y/o el nmero de identicacin de la muestra. 2. Preparar una dilucin con 30 l de hemates de la muestra en 1000 l de Id Solucin 2, en un tubo debidamente identicado. 3. Situar 25 l de la dilucin de hemates en cada uno de los pocillos de la tarjeta. 4. Centrifugar 8 minutos en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura.
Disquisicin del estudio analtico
Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Captulo 15. Interpretacin de la aglutinacin. Estudio de anlisis Valorar las reacciones de aglutinacin de forma estndar. Exposicin de anlisis
Anota- cin
Grado de aglutinacin
Descripcin de la aglutinacin 10 ++++ Botn slido de eritrocitos, ningn eritrocito libre; fondo claro.
10
+++
Varios aglutinados grandes; fondo claro.
8
++
Muchos aglutinados de regular tamao; fondo claro.
5
+
Aglutinados pequeos; fondo turbio.
2
+/-
Aglutinados muy pequeos; fondo turbio.
0
-
No aglutinacin ni hemlisis todos los eritrocitos libres.
PH
Hemlisis parcial.
H
Hemlisis completa; no quedan hemates. Siempre debe buscarse la presencia de hemlisis, su presencia indicar un resultado positivo. Captulo 16. La determinacin del fenotipo del grupo Lewis Estudio de anlisis Establecer el fenotipo del grupo Lewis, en este caso para los antgenos Lea y Leb Exposicin de anlisis 1. Rotular 3 pocillos de una tarjeta Diamed ClNa correctamente identicada por cada antgeno a identicar como P, C+ y C- y ampliar por orden; 50 L de hemates del paciente diluido al 0.8% en el primer pocillo, 50 L de hemates comprobados positivos para el antgeno en el segundo pocillo y 50 L de hemates comprobados negativos para el antgeno en el tercer pocillo. 2. Ampliar a cada pocillo 25 L del antisuero correspondiente al antgeno a identicar. 3. Incubar la tarjeta durante 10 minutos a 22C. 4. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura.
Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Una positividad en el control negativo o negatividad en el control positivo invalida la prueba. Captulo 17. La determinacin del grupo MN Estudio de anlisis Establecer el fenotipo del sistema MN, en este caso para los antgenos M y N. Exposicin de anlisis 1. Rotular 3 pocillos de una tarjeta Diamed ClNa correctamente identicada por cada antgeno a identicar como P, C+ y C- y ampliar por orden; 50 L de hemates del paciente diluido al 0.8% en el primer pocillo, 50 L de hemates comprobados positivos para el antgeno en el segundo pocillo y 50 L de hemates comprobados negativos para el antgeno en el tercer pocillo. 2. Ampliar a cada pocillo 25 L del antisuero correspondiente al antgeno a identicar. 3. Incubar la tarjeta durante 10 minutos a 22C. 4. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura.
Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Una positividad en el control negativo o negatividad en el control positivo invalida la prueba. Captulo 18. La determinacin del grupo P Estudio de anlisis Establecer el fenotipo del sistema P, en este caso para el antgeno P 1 . Exposicin de anlisis 1. Rotular 3 pocillos de una tarjeta Diamed ClNa correctamente identicada por cada antgeno a identicar como P, C+ y C- y ampliar por orden; 50 L de hemates del paciente diluido al 0.8% en el primer pocillo, 50 L de hemates comprobados positivos para el antgeno en el segundo pocillo y 50 L de hemates comprobados negativos para el antgeno en el tercer pocillo. 2. Ampliar a cada pocillo 25 L del antisuero correspondiente al antgeno a identicar. 3. Incubar la tarjeta durante 10 minutos a 22C. 4. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura.
Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Una positividad en el control negativo o negatividad en el control positivo invalida la prueba. Captulo 19. La determinacin de los grupos acreditados Ss, Kk, KpaKpb, FyaFyb, JkaJkb, LuaLub Estudio de anlisis Establecer el fenotipo de los hemates para los sistemas de grupo aludidos. Exposicin de anlisis 1. Rotular 3 pocillos de una tarjeta Diamed LISS/ Coombs correctamente identicada por cada antgeno a identicar como P, C+ y C- y ampliar por orden; 50 L de hemates del paciente diluido al 0.8% en el primer pocillo, 50 L de hemates comprobados positivos para el antgeno en el segundo pocillo y 50 L de hemates comprobados negativos para el antgeno en el tercer pocillo. 2. Ampliar a cada pocillo 25 L del antisuero correspondiente al antgeno a identicar. 3. Incubar la tarjeta durante 10 minutos a 37C en la incubadora Diamed. 4. Centrifugar la tarjeta en la centrfuga Diamed. 5. Proceder a la lectura.
Disquisicin del estudio analtico Si el botn de hemates queda en la parte superior del pocillo indica aglutinacin y la lectura es positiva. Si el botn de hemates baja la lectura es negativa. Una positividad en el control negativo o negatividad en el control positivo invalida la prueba. Captulo 20. La elucin medi- ante R-E-S Estudio de analisis Con la elucin pretendemos separar los anticuerpos unidos a los hemates para poder estudiar dichos anticuerpos. Exposicin de anlisis 1. Solucin de Lavado. Se prepara suciente solucin para lavar cuatro veces los hemates. Es una dilucin 1/10 con disolvente y agua destilada (ej. 2ml de disolvente y 18ml de H2O destilada). 2. Lavar 1 ml (20 gotas) de hemates concentrados 1 vez con salino, y 4 veces con solucin de lavado. 3. Retirar el mximo de sobrenadante del ltimo lavado y utilizarlo como control (en un tubo etiquetado). 4. Colocar 1 ml de clulas lavadas en un tubo y ampliar 1 ml de SOLUCION I (20 gotas y 20 gotas). 5. Mezclar suavemente por inversin 4-5 veces. 6. Centrifugar inmediatamente en 3400 durante 1 minuto. 7. Transferir el sobrenadante (ELUIDO) a un tubo limpio y etiquetado. 8. Ampliar 20 gotas de SOLUCION II (Azul), mezclar bien. Si el color es an amarillo, ampliar gota a gota hasta que alcance un color azul plido. 9. Centrifugar nuevamente para eliminar cualquier precipitado y transferir a un tubo limpio. Investigar la presencia de anticuerpos en el eludo, utilizar el sobrenadante del ltimo lavado como control negativo. Captulo 21. La elucin con Gamma EGA Estudio de anlisis El procedimiento descrito es til para eliminar los autoanticuerpos que recubren a los hemates, para de esta forma poder fenotiparlos. Es igualmente til para clulas no recubiertas con IgG, cuando el n es destruir los antgenos del sistema Kell para ayudar en la identicacin de anticuerpos. Exposicin de anlisis 1. Lavar los hemates tres veces con salino siolgico, y resuspenderlos al 3-5%. 2. Ampliar 30 gotas de esta suspensin en un tubo limpio 3. Centrifugar 1 minuto a 3.400 rpm y eliminar el sobrenadante con cuidado de no tocar los hemates. 4. En otro tubo, preparar la solucin cida de EDTA-glicina aadiendo 4 gotas de EGA solucin 1 y 16 gotas de EGA solucin 2. 5. Ampliar inmediatamente la solucin EDTA- glicina recin preparada al paquete de hemates lavados y mezclar suavemente. 6. Mantener a temperatura ambiente (233C) no ms de 2 minutos (con el cronmetro en mano). Si las clulas estn fuertemente agrupadas o teido, debe acortarse el tiempo de incubacin en perodos de 15 segundos. 7. Ampliar inmediatamente 7 gotas de solucin EGA 3, mezclar bien y centrifugar 30 segundos a 3.400rpm. 8. Eliminar el sobrenadante, y resuspender las clulas en salino. Si en este momento del tratamiento las clulas no estn fuertemente agrupadas o teidas (ver paso 6), lavar las clulas al menos tres veces con salino.
Arrostracin Es de mxima cautela que en el tratamiento con EGA hace que las clulas se puedan hemolizar con facilidad. En caso que se produzca un retraso entre el lavado y el tipaje, se requerirn mas lavados Disquisicin del estudio analtico Efectuar la prueba de antiglobulina directa (Coombs Directo) de las clulas tratadas. Si es negativo, se procede al tipaje de los hemates. Captulo 22. La adsorcin autloga de autoanticuerpos calientes Estudio de anlisis Los auto-anticuerpos (Ac) calientes pueden enmascarar la presencia de alo-Ac en el suero. La adsorcin del suero con hemates autlogos puede eliminar los auto- Ac y desenmascarar los posibles alo-Ac. Exposicin de anlisis 1. Preparar dos alcuotas de 1 ml de hemates del paciente tratados segn la Tcnica de Elucin con GammaEGA (T-22). 2. Ampliar 2 ml de suero del paciente a una de las alcuotas, mezclar e incubar a 37C durante 30 minutos. 3. Centrifugar a 3400 rpm durante 2 minutos y transferir el suero a la segunda alcuota de hemates. Mezclar e incubar a 37C durante 30 minutos. 4. Centrifugar a 3400 rpm 2 minutos. Transferir el SUERO ADSORBIDO, a un tubo limpio y etiquetado. 5. Efectuar una investigacin de anticuerpos irregulares, y una identicacin si procede. En caso de positividad puede utilizarse este suero para la realizacin de pruebas cruzadas. Observacin primordial: No es propio para llevar a efecto la autoadsorcin con hemates de un paciente recin transfundido, puesto que los hemates transfundidos circulantes pueden adsorber los alo-Ac que se estn inquiriendo. Captulo 23. La hemoglobinuria paroxstica nocturna Estudio de anlisis El Test de HPN (hemoglobinuria paroxstica nocturna) sirve para detectar la ausencia o dcit de protenas implicadas en la mayor sensibilidad de las clulas de serie roja al complemento en estos pacientes. Valora el DAF (factor acelerador del decaimiento CD55) y el MIRL (inhibidor de membrana de la lisis reactiva).
Exposicin de anlisis 1. Recoger un tubo de sangre citratada (protrombina) del enfermo. En este caso tambin sirve tubo con EDTA, heparina o CPD- A. Es importante que sea sangre fresca recin extrada. 2. Preparar una solucin 0,8 % con diluyente 2 de DiaMed (10 mcl de sangre y 1 ml de diluyente) para usar inmediatamente. 3. Ampliar 50 mcl de suspensin de hemates a los pocillos DAF, MIRL y ctl de la tarjeta DiaMed. 4. Ampliar 50 mcl de cada solucin (MIEL, DAF y ctl) al pocillo correspondiente 5. Repetir la operacin con sangre de un paciente sin HPN, que servir como control negativo en la misma tarjeta. 6. Incubar 15 minutos a 37 C. 7. Centrifugar en la centrfuga Dia Med (ID centrifuga 24 S) durante 10 minutos. Leer los resultados Captulo 24. Las autoaglutini- nas fras de ttulos elevados Estudio de anlisis Precisar a que concentracin se detentan anticuerpos fros. Los autoanticuerpos fros, si estn presentes a ttulos elevados tienen signicacin clnica y pueden causar hemlisis maniesta, sntomas sistmicos e indicar una neoplasia subyacente. Exposicin de anlisis 1. Obtener suero (mantenido a 37C desde el momento de la extraccin) separado a 37C de una muestra de sangre que se deja coagular a 37C o plasma, separado de una muestra anticoagulada despus de inversiones peridicas a 37C durante 15 minutos. 2. Preparar una suspensin al 1% en salino de eritrocitos de los siguientes fenotipos: OI (pueden prepararse a partir de un segmento tomado de una unidad de sangre extrada dentro de los 7 das precedentes o de una muestra extrada con EDTA dentro de los tres das precedentes). Oi (Cordn) Autlogos. 3. Diluir el suero o plasma al 1/5 en salina. 4. Preparar tres hileras de doce tubos con diluciones seriadas al doble de suero o plasma diluido al 1/ 5 (1/10,....1/20.480). Utilizar volmenes de 0,5 ml cuando se hacen las diluciones. 5. Agregar a cada tubo 0,5 ml de los hemates correspondientes. 6. Mezclar e incubar toda la noche a 4C. 7. No centrifugar. Examinar los eritrocitos sedimentados macroscpicamente en busca de aglutinacin. Anotar los resultados.
Disquisicin del estudio analtico El ttulo es la reciproca de la dilucin ms alta del suero en la que se observa aglutinacin. Los ttulos por encima de 1/40 se consideran elevados, pero la anemia hemoltica por autoaglutininas reactivas en fro rara vez ocurre a menos que el ttulo sea superior a 1/640. Captulo 25. La especicidad de crioaglutininas Estudio de anlisis Establecer la especicidad de las autoaglutininas que reaccionan en fro. Para ello se estudia el suero frente a eritrocitos que presenta antgenos ante los cuales reaccionan las aglutininas fras. Exposicin de anlisis 1. Suero (mantenido a 37C desde el momento de la extraccin) separado a 37 C de una muestra de sangre que se deja coagular a 37C o plasma, separado de una muestra anticoagulada despus de inversiones peridicas a 37C durante 15 minutos. 2. Suspensin al 5% en salino de eritrocitos de los siguientes fenotipos. a. Dos muestras de clulas OI (puede utilizarse hemates del panel de investigacin de anticuerpos). b. Una muestras de hemates del paciente c. Una muestra de hemates A o B si el paciente no es grupo 0 d. Una muestra OI tratada con enzimas (bromelina) e. Una muestra de hemates Oi (cordn umbilical) 3. Preparar cinco hileras de doce tubos con diluciones seriadas al doble de suero o plasma (1/2,....1/4096) 4. Mezclar tres gotas de cada dilucin con una gota de hemates al 5% de cada muestra de eritrocitos. 5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar (1000 x g 30 segundos)y examinar (golpear suavemente) macroscpicamente en busca de aglutinacin. Anotar los resultados. 6. Colocar los tubos a 4C e incubar a esta temperatura durante 1 hora. Centrifugar y examinar macroscpicamente en busca de aglutinacin. Anotar los resultados. Disquisicin del estudio analtico Sntesis Eritrocitos Anti-I Anti-i Anti-H A n t i - IH Anti-Pr OI NR/ Oi NR/ < AI OI enzimas NR/ Autlogo
Algunos autoanticuerpos fros pueden no mostrar especicidad aparente a temperatura de 4C, en estas circunstancias las pruebas pueden ser incubadas a 30- 37C. La reactividad diferencial puede hacerse ms aparente si se prolonga el tiempo de incubacin y la aglutinacin se evala despus de la sedimentacin sin centrifugacin. Captulo 26. La tcnica de Do- nath-Landsteiner Estudio de anlisis Esta tcnica se emplea para detectar la hemolisina bifsica responsable de la anemia hemoltica autoinmune paroxstica fra. Exposicin de anlisis 1. Obtener suero separado de una muestra de sangre recogida y mantenida a 37 C y suero fresco (como fuente de complemento). 2. Preparar eritrocitos del grupo O lavados y resuspendidos al 50%. 3. Rotular tres las de tubos como sigue: ? A 1 A 2 A 3 ? B 1 B 2 B 3 ? C 1 C 2 C 3 4. A los tubos 1-2 de cada la ampliar 10 volmenes de suero del paciente. 5. A los tubos 2-3 de cada la ampliar 10 volmenes de suero fresco. 6. A todos los tubos ampliar un volumen de la Encuentra ms encuentra cursos grati s sobre sal ud y medi ci na en nuestro Centro de Aprendi zaj e gratui to: http://www. enpl eni tud. com/cursos suspensin de eritrocitos. Mezclar. 7. Colocar los tres tubos de la hilera A en hielo fundido durante 30 minutos y luego pasarlos a 37 C durante 1 hora. 8. Colocar los tres tubos de la hilera B en hielo fundido durante 90 minutos. 9. Centrifugar todos los tubos e investigar hemlisis en el liquido sobrenadante. Disquisicin del estudio analtico La prueba se considera positiva cuando el suero del paciente, con complemento o sin el, produce hemlisis en los tubos que se han colocado primero en hielo y luego a 37 C (tubos A 1 A 2 ) y no hay hemlisis en los mantenidos a 37 C o en hielo. Los tubos A 3 B 3
C 3 sirven como control del complemento y deben ser negativos.
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