Principio Coulter

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Principio Coulter
El inventor Wallace Coulter patent varias
aplicaciones diferentes del Principio Coulter.
Imagen tomada de la patente de Estados Unidos
#2,656,508.
El trmino principio Coulter hace referencia al uso de un campo
elctrico para contar y dimensionar partculas que se encuentran en
suspensin en un lquido conductor. La frase fue acuada cuando
Wallace H. Coulter obtuvo la Patente de EE.UU. # 2,656,508, bajo el
ttulo Medios para contar partculas suspendidas en un fluido. El
principio Coulter tiene su principal aplicacin en los Contadores
Coulter, que son instrumentos diseados para realizar una tarea
especfica tal como el recuento de clulas sanguneas. Sin embargo,
exiten muchas otras implementaciones prcticas del principio Coulter.
Varias de estas aplicaciones han sido puestas en prctica, algunas con
xito comercial, y algunas exclusivamente para la investigacin
acadmica. Hasta la fecha, la aplicacin de mayor xito comercial del
principio Coulter es en hematologa, donde se utiliza para obtener
informacin acerca de las clulas sanguneas de pacientes. Si bien el
principio de Coulter y los contadores Coulter han aparecido en miles
de artculos de investigacin durante las ltimas cinco dcadas, la
mayora de las personas desconocen su existencia a menos que hayan
tenido una experiencia personal con este tipo de contadores en un
entorno de laboratorio.
Descripcin general del principio
Principio Coulter. El aumento transitorio en la Impedancia a travs
del canal por el que circula una corriente elctrica es proporcional al
volumen ocupado en cada instante de tiempo por la partcula que lo
atraviesa. O en otras palabras, el volumen de la partcula es
proporcional al rea bajo la curva de R vs T.
El principio Coulter se apoya en el hecho de que
partculas movindose en un campo elctrico causan
disturbios mensurables en ese campo. La magnitud de
estos disturbios son proporcionales al tamao de las
partculas inmersas en el campo. Coulter identific
varios requerimientos necesarios para la aplicacin
prctica de este fenmeno. Primero, consider que las
partculas deberan encontrarse suspendidas en un
lquido conductor. Segundo, que el campo elctrico
debera encontrarse fsicamente restringido, de modo
que el movimiento de las partculas sumergidas en el
campo causaran cambios detectables en la corriente. Y
finalmente, que las partculas deban encontrarse lo
suficientemente diluidas como para atravesar una a la
vez la regin de restriccin fsica, previniendo de esta
manera un artefacto conocido como coincidencia.
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En lneas generales el principio Coulter indica una partcula que es forzada a atravesar un orificio, por el que circula
una corriente elctrica, produce un cambio en la impedancia a travs del orificio que es proporcional al volumen de
la partcula que est atravesando ese orificio. Este pulso en la impedancia se origina por el desplazamiento de
electrolito causado por la partcula, ya que en las soluciones electroltcas la carga es transportada por los iones
disueltos, y estos encuentran un impedimento a circular cuando una partcula obstruye parcialmente la abertura.
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Implementaciones tpicas
Aunque el principio Coulter puede ser implementado en una variedad de diseos, existen dos que han resultado los
ms relevantes comercialmente. Estas dos implementaciones son conocidas como formato de apertura y formato de
flujo de clulas. La figura de arriba muestra varias otras geometras que Coulter tambin patent.
Formato de apertura
Contador Coulter de Coulter Electronics Ltd.
El formato de apertura es el que se utiliza en la mayora de los
contadores Coulter. En esta disposicin, se practica un orificio de
tamao definido (usualmente en el rango de 10-100 micrmetros de
dimetro) en un pequeo disco de zafiro. La lmina que contiene el
disco con la apertura se coloca luego obturando un orificio en un tubo
de vidrio que hace las veces de segunda cmara del contador. El
producto de este proceso es comnmente conocido como tubo de
apertura. En su disposicin final, el tubo de apertura se sumerge en
otro recipiente que contiene la solucin de partculas de modo que la
lmina con el orificio de apertura queda completamente sumergida en
la solucin y el tubo puede llenarse de lquido. Los electrodos se
colocan dentro y fuera del tubo de apertura, lo que permite medir la
corriente que circula a travs de la abertura. Se utiliza una bomba de
vaco para crear un vaco parcial en la boca del tubo de apertura, lo que
obliga al lquido a moverse desde la cmara exterior hacia el tubo
atravesando el orificio. Los datos resultantes se recogen grabando los
pulsos elctricos generados cuando las partculas atraviesan la abertura.
Aunque la disposicin bsica del formato de apertura es consistente en
todos los contadores Coulter, la cantidad y calidad de los datos
obtenidos varan en gran medida en funcin del circuito de procesamiento de seal implementado. Por ejemplo, los
amplificadores de muy bajo ruido y gran rango dinmico son capaces de incrementar en gran medida la sensibilidad
del sistema. De manera similar, los analizadores digitales de altura de pulso con anchos de caja variables proveen
una resolucin mucho mayor que sus homlogos analgicos. Adems, al combinar un contador Coulter con un
sistema computacional, es posible capturar muchas otras caractersticas del pulso, mientras que los contadores
analgicos por lo general almacenan mucha menos informacin sobre cada pulso.
Formato de flujo de clulas
Este tipo de formato es el que ms comnmente se emplea en los intrumentos hematolgicos y en algunos tipos de
citmetros de flujo, en este formato los electrodos se encuentran unidos a cada uno de los extremos del canal de flujo
y el campo elctrico es aplicado a travs del canal. Este formato posee varias ventajas con respecto al formato de
apertura. Este arreglo permite un anlisis de muestras continuo, mientras que el formato de apertura sirve nicamente
para procesamientos de una muestra a la vez. Es mas el uso de un formato de flujo de clulas permite la adicin de
un mecanismo que facilite el flujo laminar dentro del canal, lo cual permite mantener a las partculas a ser medidas
circulando exactamente por el centro del mismo (Este mecanismo es llamado a veces enfoque hidrodinmico). La
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utilizacin de canales con flujo laminar previene muchos de los fenmenos que alteran las mediciones en un formato
de apertura tal como el fenmeno de coincidencia, y adems permite implementar varias mediciones simultneas,
por ejemplo al iluminar la partcula simultneamente con luz lser. Las mayores desventajas del formato de flujo de
clulas es que resulta mucho mas costoso de fabricar y tpicamente se encuentra limitado a un nico tamao de
canal, mientras que el formato de apertura ofrece una variedad de tamaos de orificio diferentes.
Consideraciones experimentales
Coincidencia
Se pueden producir pulsos elctricos anmalos si la concentracin de la muestra es tan alta que existe la posibilidad
de que varias partculas entren a la apertura simultneamente. Esta situacin se conoce como coincidencia. El
problema surge de la imposibilidad de asegurar que un nico pulso de gran tamao sea el resultado de una nica
partcula grande o de mltiples partculas de pequeo tamao entrando a la apertura simultneamente. Para evitar
esta situacin por lo general se hace una dilucin previa de las muestras.
Trayectoria de la partcula
La forma del pulso elctrico generado vara con la trayectoria que sigue la partcula al atravesar la apertura. Se
pueden producir artefactos debido a que la densidad del campo elctrico no es uniforme a lo largo del dimetro de la
apertura. Es por eso que la trayectoria de la partcula a travs del campo elctrico impacta en la forma del pulso
elctrico generado. Esta variacin es el resultado de la constriccin fsica del campo y del hecho de que la velocidad
del lquido vara en funcin de su localizacin radial en la apertura. En el formato del flujo de clulas, este efecto se
minimiza ya que el flujo laminar asegura que cada partcula simple describa casi el mismo camino a travs del canal
de flujo. El los formatos de apertura, se utilizan algoritmos de procesamiento de seal para corregir los artefactos
surgidos de la trayectoria de la partcula.
Partculas conductivas
Las partculas conductoras son un problema terico comn para quienes consideran hacer uso del principio Coulter.
Si bien este tema plantea interesantes cuestiones cientficas, en la prctica, rara vez afecta los resultados de un
experimento. Esto es debido a la diferencia de conductividad entre la mayora de los materiales conductores y los
iones disueltos en el lquido (usualmente referido como potencial de descarga) es tan grande que la mayora de los
materiales conductores actan como si fueran aislantes al ser medidos en un contador Coulter. La tensin necesaria
para romper esta barrera de potencial se conoce como voltaje de ruptura. Para aquellos materiales altamente
conductores que presentan un problema, el voltaje utilizado durante un experimento de Coulter se debe reducir por
debajo del potencial de ruptura (esto puede ser determinado empricamente).
Partculas porosas
El principio Coulter mide el volumen de un objeto, ya que la perturbacin en el campo elctrico es proporcional al
volumen de electrlito desplazado de la abertura. Esto da lugar a una cierta confusin entre aquellos que estn
acostumbrados a las mediciones pticas bajo microscopio o por medio de otros sistemas que slo registran dos
dimensiones y los lmites de un objeto. El principio Coulter, por otro lado mide tres dimensiones y el volumen
desplazado por el objeto, no sus lmites aparentes. Para salvar estas diferencias resulta muy til pensar en esponjas,
incluso aunque una esponja hmeda puede parecer muy grande, desplaza significativamente menos lquido que un
ladrillo macizo de las mismas dimensiones.
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Corriente contnua vs corriente alterna
En la mayora de los contadores Coulter utilizados en los laboratorios de investigacin y celulares se utiliza corriente
continua. Las mediciones bajo corriente continua son tiles para una gran variedad de partculas y permiten una
adquisicin y procesamiento de datos mas simple. Las mediciones bajo corriente alterna a veces se utilizan en
instrumentos de hematologa clnica. Esto es debido a la naturaleza particular de las membranas celulares; a bajas
frecuencias (por debajo de 500 kHz), las mediciones bajo corriente alterna y continua se comportan esencialmente de
la misma manera. A frecuencias intermedias (500 kHz-6MHZ), la membrana plasmtica de las clulas se polariza, lo
que conduce a una disminucin de la capacidad de los sistemas de medicin. Sin embargo, a altas frecuencias (6-20
MHz), la membrana celular pierde su polarizacin, comportndose en forma capacitiva, por lo que los impulsos
elctricos proporcionan informacin sobre el citoplasma de la clula.
Principales aplicaciones
Ensayos estandarizados
Nmero Ao Nombre
ASTM C690-86 1997 Standard Test Method for Particle Size Distribution of Alumina or Quartz by Electric Sensing Zone Technique
ASTM E1772-95 Standard Test Method for Particle Size Distribution of Chromatography Media by Electric Sensing Zone Technique
ASTM F751-83 1997 Standard Test Method for Measuring Particle Size of Wide-Size Range Dry Toners
ASTM F577-83 1997 Standard Test Method for Particle Size Measurement of Dry Toners
ASTM D4438-85 1997 Standard Test Method for Particle Size Distribution of Catalytic Material by Electronic Counting
ASTM D3451-92 Standard Practices for Testing Polymeric
ASTM F662-86 1992 Standard Test Method for Measurement of Particle Count and Size Distribution in Batch Samples for Filter Evaluation
Using an Electrical Resistance Particle Counter
ASTM C757-90 1996 Standard Specification for Nuclear-Grade Plutonium Dioxide Powder, Sinterable
ISO
13319:2000(E)
2000 Determination of particle size distributions Electrical sensing zone method
Hematologa
La aplicacin mas importante y comercialmente mas exitosa del principio Coulter es en la fabricacin de contadores
hematolgicos, donde se utiliza para la caracterizacin de clulas sanguneas. La tcnica ha sido utilizada para
diagnosticar una gran variedad de enfermedades, y el mtodo de referencia para la obtencin del recuento de
leucocitos y eritrocitos (ver Hemograma) y de otros parmetros de uso comn. Al ser combinado con otras
tecnologas tales como la espectrofotometra, marcado fluorescente y dispersin luminosa, permite obtener un perfil
muy detallado de las clulas sanguneas de un paciente.
Recuento de clulas y sus dimensiones
En adicin al recuento clnico de clulas sanguneas (que tpicamente miden entre 6 y 14 m), el principio Coulter se
ha posicionado como el ms confiable mtodo de laboratorio para contar una gran variedad de clulas, yendo desde
bacterias (con un tamao menor a 1 micrmetro) hasta agregados de clulas vegetales (de mas de 1200 micrmetros)
pasando por clulas adiposas (~400 m) y cuerpos de clulas totipotenciales embrionarias (~900 m). La tcnica se
ha estandarizado hasta tal punto que la ASTM internacional (Antiguamente llamada American Society for Testing
and Materials) ha publicado un procedimiento con el ttulo:Standard Test Method for Automated Analyses of
Cells-the Electrical Sensing Zone Method of Enumerating and Sizing Single Cell Suspensions
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Caracterizacin de partculas
El principio coulter ha demostrado ser til para muchas aplicaciones muy diferentes de los estudios celulares. El
hecho de que permite medir partculas individuales, es independiente de cualquier propiedad ptica, resulta
extremadamente sensible, y muy reproducible ha permitido aplicarlo a un amplio rango de campos. A modo de
ilustracin a continuacin se detalla una lista de algunos de los mtodos que la ASTM ha estandarizado para la
utilizacin del principio Coulter. Ntese la gran variedad de materiales que recoge.
Historia del invento
Necesidad de pruebas sanguneas bajo amenaza nuclear
Wallace H. Coulter descubri el principio que lleva su nombre a fines de los aos 1940, aunque la patente no fue
entregada sino hasta el 20 de octubre de 1953. Es importante notar que Coulter se vio profundamente impresionado
por las bombas atmicas lanzadas por Estados Unidos sobre Hiroshima y Nagasaki. Estos eventos motivaron a
Coulter a simplificar y mejorar los mtodos de anlisis sanguneos de modo que grandes poblaciones pudieran ser
rpidamente testeadas en caso de guerra nuclear. Parte de los fondos para financiar el proyecto provinieron de una
subvencin de la Oficina de Investigacin Naval. Mientras que otras fuentes a veces refieren una historia en torno al
anlisis pintura, esto no es apoyado por los hechos histricos o por las personas que vivieron y trabajaron con
Coulter lo largo de los aos. Recursos autorizados sobre el tema estn disponibles en Journal of Laboratory
Automation, December 2003. Cytometry volume 10 y en The Coulter Principle: Foundation of An Industry, una
serie de DVD por los Laboratorios de Citometra de la Universidad de Purdue.
Relaciones con la citometra de flujo
El principio Coulter ha jugado un importante papel en el desarrollo del primer seleccionador de clulas creado, y
estuvo involucrado en los primeros tiempos del desarrollo de la citometra de flujo. Incluso en nuestros das, algunos
citmetros de flujo utilizan el principio Coulter para proveer informacin ltamente exacta sobre el tamao y
recuento celular. Existe mucha mas informacin disponible sobre este tema en Cytometry volume 10, una serie de
DVD producida por los Laboratorios de Citometra de la Universidad de Purdue.
Referencias
[1] ASTMF2149-01(2007) Standard Test Method for Automated Analyses of Cells-the Electrical Sensing Zone Method of Enumerating
and Sizing Single Cell Suspensions(http:/ / www. astm. org/ Standards/ F2149. htm).
Fuentes y contribuyentes del artculo
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Fuentes y contribuyentes del artculo
Principio Coulter Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=68714508 Contribuyentes: Enrique Cordero, J3D3, 1 ediciones annimas
Fuentes de imagen, Licencias y contribuyentes
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