ELECCION DE UN ANIMAL PARA LA PRODUCCION DE ANTICUERPO

Los anticuerpos se preparan inmunizacin a un animal de forma que su propio

sistema inmunitario se desengatille para producir anticuerpos contra los
antgenos de inters. En el laboratorio se han estudiado ampliamente los
ratones y las ratas. El animal se inmuniza a intervalos de una semana, a lo
largo de 3 o 4 semanas, con el antgeno que se va a estudiar y finamente se
mata y se recogen sus linfocitos. En la prctica, esto se hace eliminando de
bazo del animal, que es rico en linfocitos, y preparando una suspensin de
clulas aisladas a partir de la cual pueden separarse posteriormente los
linfocitos. El mismo modo, las lneas de mieloma utilizadas son tambin
procedentes de ratn y de rata y establecidas como cultivo de tejidos. Una de
las primeras cosas observadas es que la hibridacin interespecifica no es fiable
ya que las clulas hijas resultantes tienden a ser inestables en cuanto a su
constitucin gentica. Por ello los linfocitos de ratn se fusionan con lneas de
mieloma de ratn y los linfocitos de rata con lneas de mieloma de rata.
Por ello sera deseable tener anticuerpos monoclonales humanos, es decir,
anticuerpos preparados mediante la fusin de linfocitos B humanos y una lnea
de mieloma humano. Hasta hace poco, esto no ha resultado posible. En primer
lugar est claro que no siempre es ticamente posible inmunizar a sujetos
humanos con antgenos tales como toxinas, bacterias o clulas malignas. En
segundo lugar, ha habido grandes dificultades para producir, en cultivo, lneas
celulares estables de mielomas humanos, libres de infeccin. Sin embargo, los
ltimos avances realizados hacen posible la produccin de lneas estables de
mieloma humano, mientras que los problemas de inmunizacin se han
superado obteniendo linfocitos, para la fusin, a partir de ndulos linfticos de
pacientes que se sabe que padecen una enfermedad en concreto, eliminados
rutinariamente en una operacin quirrgica. Tales clulas se fusionan con una
lnea de mieloma humano y se obtienen clulas hibridas humanas que son
estables. Cuando se contempla la subsiguiente readministacion de estos
anticuerpos monoclonales con fines diagnsticos o teraputicos, los
anticuerpos humanos tienen la enorme ventaja de que, como son una protena
humana que se encuentra de forma natural, sern incapaces de provocar una
reaccin inmunolgica en el receptor, lo cual constituye siempre una
preocupacin cuando se administran protenas de ratn o de rata.




INMUNIZACION
Los animales son inmunizados al serles inyectados el antgeno
subcutneamente o bien en la cavidad peritoneal que rodea al intestino. Al
mismo tiempo puede estimularse en sistema inmunitario del animal al
inyectndole una mezcla de estimulantes inmunolgicos potentes. Lo ms
comnmente utilizado es el adyuvante de Freund. Esta mezcla de organismos
de la tuberculosis muertos, en una sustancia grasa, tiene el efecto de estimular
el sistema inmunitario haciendo que reconozca vidamente cualquier antgeno
inyectado con la mezcla. Normalmente los animales son inyectados en varias
ocasiones, generalmente con intervalos de una semana, para asegurar una
buena estimulacin inmunolgica. Con cada inmunizacin sucesiva se logra
una mayor estimulacin de los clones de linfocitos B que hay dentro del animal
y que responden al antgeno. El lote final del antgeno se administra
intravenosamente, en general tres das antes de recoger las clulas del bazo,
con el fin de asegurar que los clones de clulas B de inters, estn estimulados
al mximo. Las clulas que mejor crecen despus de la fusin son aquellas que
se dividen rpidamente. Se ha demostrado que el tiempo de tasa mxima de
crecimiento de las clulas inmunitarias estimuladas es 3 das despus de la
inmunizacin. La razn por la que se administra la inyeccin intravenosa es dar
una levada dosis de antgeno. De esta manera un gran ejrcito de clulas se
estimula simultneamente.
FUSION
Despus de matar al animal se le abre el abdomen, se extrae el bazo y se
coloca en fluido para el cultivo de tejidos. A partir de este momento, todo debe
hacerse en condiciones estriles para evitar que las placas de cultivo se
contaminen de bacterias u hongos y causen una infeccin.
Para evitar esto, el fluido en el que se han puesto las clulas contienen
antibiticos, habitualmente penicilina y estreptomicina, para impedir el
crecimiento bacteriano. Los bazos se desmenuzan para que libere los linfocitos
que hay en su interior. Los agregados de membranas se eliminan dejando que
se sedimente la suspensin de clulas de bazo y los restos de la superficie del
bazo, quedan as en el fluido una preparacin de clulas aisladas.
El bazo contiene no solo linfocitos sino tambin abundantes glbulos rojos
sanguneos. Estos pueden ser eliminados por centrifugacin en un fluido
denso, Ficoll. El Ficoll se coloca en un tubo de centrifuga y con cuidado,
utilizando una pipeta Pasteir, se depositan en la superficie las clulas del bazo.
Se centrifuga durante 20 minutos a poca velocidad, generalmente a 400g. la
masa de glbulos rojos se sumerge y va al fondo junto con las clulas muertas.
Los linfocitos permanecen en la parte superior del Ficoll, formando una banda
de color blando plido.
El fluido en el que fueron suspendidas las clulas del bazo queda situado por
encima de os linfocitos. Los linfocitos pueden recogerse utilizando una pipeta
Pasteur y se lavan por centrifugacin, estas clulas se mezclan ahora con un
mieloma recin preparado y dispuesto para la fusin. Como todas las clulas
malignas, las clulas de mieloma tienen una capacidad de replicacin infinita.
Existen varios tipos de lneas de mieloma disponibles para la fusin, que han
sido obtenidas a partir de ratones, de ratas o de personas. Una caracterstica
vital de estas lneas de mieloma es un mecanismo inherente de destruccin, de
forma que las clulas de mieloma que no se han fusionado pueden ser
fcilmente destruidas despus de proceso de fusin. Un nmero de clulas de
mieloma se mezcla con un nmero aproximadamente igual de linfocitos del
bazo procedentes del animal inmunizado, en presencia de polietilenglicol.
Originalmente, en este paso se utilizaba un virus, el llamado virus Sendai, pero
resulta complicado mantenerlo en el laboratorio y ha sido casi totalmente
sustituido por el polietilenglicol (PEG). El PEG es similar a las sustancias
usadas en soluciones anticongelantes que se utilizan para los radiadores de los
automviles. Destruye las fuerzas de tensin superficial que normalmente
hacen que las clulas se repelen entre si cuando estn mezcladas en un tubo
de ensayo. En presencia de PEG, las clulas pueden mezclarse ntimamente.
Sus membranas se fusionan, permitiendo que el ncleo de una clula penetre
en el citoplasma de su vecina.
Se utiliza una gran variedad de trucos para aumentar la frecuencia del proceso
de fusin. Uno de ellos consiste en poner otra sustancia, llamada
dimetilsulfoxido (DMSO), en la mezcla se fusin junto con el PEG. Esto
aumenta tambin la proximidad del contacto entre las clulas durante la fusin
e incrementa las posibilidades del xito. Tanto el DMSO como el PEG son muy
venenosos para las clulas a estas sustancias. Normalmente, las clulas solo
se mantienen durante unos minutos en la mezcla de estos productos qumicos.
Durante este tiempo, la proximidad de las clulas se aumenta, aglomeradas
suavemente por centrifugacin durante cinco minutos. Los productos qumicos
se diluyen con fluido nuevo de cultivo de tejidos y las clulas se lavan. Despus
de la fusin, las clulas se siembran en placas para cultivo de tejidos. La
mezcla consta ahora de clulas de mieloma que n no se hao se han fusionado,
linfocitos que fusionado e hibridomas que son clulas hibridas de linfocito y
mieloma.





CITOTOXICIDAD
Si la finalidad de un anticuerpo monoclonal es matar clulas, entonces
claramente, resulta esencial una prueba de screening para ver la citotoxicidad.
Los anticuerpos pueden matar a las clulas de dos maneras: activando una
cascada de factores del suero, denominada complemento, o bien, atrayendo a
su sitio de unin una poblacin de linfocitos llamados clulas asesinas o clulas
K. en ambos casos, el anticuerpo proporciona la especificidad del
reconocimiento, en tanto que el complemento o las clulas K proporcionan el
mecanismo para matar, simplemente haciendo agujeros en la superficie de las
clulas diana. La actividad citotoxica de un anticuerpo se determina
habitualmente mediante ensayos en los que se libera como radiactivo. Las
clulas diana se cultivan en un cultivo de tejido y se incuban en cromato
sdico, preparado con cromo radiactivo. Luego considerarse a las clulas
como bolsas de radiactividad que, si se perforan, liberan grandes cantidades de
cromato radiactivo que es posible medir. El anticuerpo se aade durante una
hora y luego se lavan las clulas por centrifugacin, se aade luego el suero
que contenga complemento, o bien una poblacin de linfocitos que contengan
clulas K. Si el anticuerpo se ha fijado, entonces el cromo ser liberado al fluido
que baa las clulas. Una hora ms tarde, las clulas daadas forman un
sedimento en el fondo y la cantidad de radiactividad liberada al sobrenadante
se determina con un contador de radiaciones ama.
Es posible calcular su ndice, denominado citotoxicidad especfica,
determinando la proporcin de cuentas registradas durante el ensayo en
relacin con el nmero mximo de cuentas que se liberan al aadir detergente
y restando luego el background correspondiente al control.