Facultatea de Agricultura

Program de Studii de Licien:

Ingineria i Protecia Mediului n Agricultura






Testarea toxicitii acute a unor substane
asupra lumbricidelor








Student
Vasile NODI
Ecotoxicologia rezultat ca o stiinta prin fuzionarea a alte doua stiinte ecologia si
toxicologia, cu scopul de a studia efectele toxice ale substantelor chimice asupra
componentelor ecosistemelor(2,3), aceste substante chimice fiind de cele mai multe ori
poluanti rezultati din activitatiile umane.
Ecotoxicololgia este de fapt stiinta ce poate sa faca predictii asupra efectelor unor
agenti potentiali toxici asupra ecosistemelor naturale su asupra speciilor care nu au fost vizate
de acei agenti.
Pentru testarea ecotoxicitatii unor substante lumbricide, o importanta esentiala i se
acorda solului de testare, intrucat lumbricidele sunt organisme al caror mediu de viata este
solul. Diferentele de compozite a solului influentiaza biodisonibilitatea si toxicitatea
poluantilor. Acestia pot deveni mai putini disponibili in solurile cu un continut ridicat de
argila, care poate sa retina anumiti poluanti.
Metoda de lucru pentru testarea toxicitatii unor substante chimice pe lumbricide a fost
standardizata de OECD, fondata in 1961, cu sediu la Paris, Franta si care are in prezent 30 de
state membre. Statele membre majoritatea state europene, sunt in general cele cae folosesc
protocoale de lucru, iar Romania foloseste acelasi protocol, cu toate ca nu este membra a
OECD.
Lumbricidele sunt alese pentru astfel de teste din mai multe considerente.
Aceste organisme sunt ubicviste si abundente in solul tuturor ecosistemelor terestre, cu
exceptia deserturilor. Ele joaca un rol semnificant in formarea solului, aerarea acestora si
circuitului substantelor nutritive. Datorita activitatii lor de sapare prin sol si formare de canale
prin consumul de detritus si de reziduuri aceste organisme imbunatatastesc aerarea solurilor.
n plus, ramele contribuie si la o mai buna infitrare a apei in sol precum si la imbunatatirea
activiatii microbiologice din sol.
Protocolul OECD pentru testare utilizeaza raspunsul unei singure specii, Eisenia
foetida(Savigny, 1826), numita popular rima rma roie(Phyllum Annelida, Clasa
Oligochaeta, Familia Lumbricidae). Ea mai este cunoscuta si sub denumirile de rma de
balegar sau rma tigru,deoarece prezinta pe segmentele corpului benzi transversale de culoare
inchisa. Aceasta specie spre deosebire de ale specii de rme, nu sap prea adanc in sol,
deoarece ea traieste in soluri bogate in materie organica, provenita de obicei din resturi
vegetale descompuse sau dejectii animale si care se afla la suprafata solului,materie pe care o
consuma(fapt ce i-a atras denumirea populara de rma de blegar).
Materiale necesare:
- Camera de cultura;
- Vase de cultura de sticla;
- Fiole de sticla de 8 cm lungime/ 3 cm diametru;
- Etuva;
- Mnui
- Folie de plastic
- Hrtie de filtru de 80-85 cm g/cm
2
, de aprox 0,2 mm grosime;
- Culturi de rame rosii;
- Sol artificial (format din 10 % turba;20% argila caolin si 70% nisip industrial;
- Carbonat de calciu(CaCO
3
) pentru corectarea pH-ului;
- Apa distilata;
- Substanta de testat(pesticide, metale grele,etc.)
Principiul metodei
Solul artificial se obtine prin amestecul celor trei componente enuntate mai sus si se
aduce la un pH de aproximativ 6(0,5) prin adaugare de CaCO
3
.
Apoi se stabileste continutul de ap al solului artificial prin uscarea unei mostre din
acest sol in etuva la 105
0
C, dup care se aduce contintul de apa al solului artificial la un nivel
de 35% din greutatea sa uscata prin adaugare de ap distilata. Practic, aceasta inseamna ca va
incepe sa fie observata ap in momentul in care solul va fi strans in mana.
Organismele de testat constau in rme din specia Eisenia foetida. Rmele din aceasta
specie au un ciclu de viata scurt. Ecloznd din coconi in 3-4 saptmani i ating maturitatea
sexuala in 7-8 saptamanide la eclozare, la 20
0
C. Sunt foarte prolifice fiecare rma producnd
2-5 coconi pe saptmna, din fiecare cocon rezultnd mai multe rme.Sunt uor de procurat
comercial(aduli sau coconi) si pot fi uor crescute n medii cu materii reziduale organice.
Rmele utilizate pentru test trebuie sa fie adulte,ceea ce insemana ca trebuie sa aiba o
varsta de celputin doua luni, sa aiba clitellum si o greutate de 300-600 mg.
Testul de toxicitate va cuprinde de fapt doua tipuri de teste: un test de toxicitate pe
hrtie si un test de toxicitate n sol artificial . n cazul testului pe hrtie, concentraia
substanei va fi exprimata n mg/cm
2
, n timp ce la testul n sol artificial concentraia se va
exprima in mg/kg s.u.(adica m.g. substana chimica/ kg sol artifial uscat)
Testul de toxicitate pe hrtie de filtru
Pentru acest test sunt necesare fiole de sticla cu fund plat, de aproximativ 8 cm
lungime si 3 cm diametru. Aceste fiole se vor cptusi cu hrtie de filtru, taiat de dimensiuni
ptortrivite asfel incat sa nu se suprapuna in fiola. Vor fi folosite doua tipuri de fiole: fiola
martor i fiole test in cae se vor testa diferite concentratii ale substantei chimice de interes.
Substanta chimica ce se doreste a fi testata se dizolva in apa distilata, daca este
solubila in apa, la o concentratie de 1000 mg/l (daca substanta nu e solubila in apa, atunci se
va dizolva intr-un solvent potrivit, de exemplu acetona,hexan,cloroform, iar dac nu e solubila
nici in solventi organici, atunci se va depune asa cum este in mai multe straturi pe hartia de
filtru.
Din aceasta solutie se va lua cate 1 ml si se va introduce in fiecare fiola test, dupa care
fiolele se vor expune in pozitie orizontala in fata unui curent slab de aer ventilat pentru ca
hartia de filtru din interior sa se usuce. Dupa uscare, in fiecare fiola test se va adauga cate 1
ml de apa distilata pentru a umecta hartia de filtru.
In fiola martor, hrtia de filtru se va umecta cu 1 ml de apa distilata.
Imediat dupa adaugarea apei distilate, fiolele vor fi inchise cu capace care trebuie sa
prezinte un mic orificiu pentru aerisire.
Susbstanta de interes trebuie sa fie testata in minimi 5 niveluri de concentratie, crestere
care are loc in progresie geometrica.
Pentru fiecare tip de tratament sunt necesare nimim 10 repetii adica 10 fiole martor si
50 de fiole test, dar precizia testului este foarte buna atunci cand sunt folosite 20 de repetitii.
In fiecare fiola se va introduce cate o singura rama adult(daca s-ar introduce mai multe
ar exista posibilitatea ca moartea uneia dintre ele sa aiba efecte adverse asupra celorlalte).
Dar, nainte de a a fi introduse in fiole, rmele vor fi tinute timp de 3 ore pe hartie de filtru
umed, astfel incat ele isi vor goli continutul tubului digestiv, apoi spalate si uscate.
Pe parcursul testului fiolele vor fi asezate in tavi, in pozitei orizontala. Temperatura
camerei trebuie sa fie de aproximativ 20
0
C 2
0
C.
Fiolele vor fi pastrate in intuneric timp de 254h, iar dupa 72h se vor inregistra primele
date referitoare la mortalitatea rmelor testate. Se considera ca rmele sunt moarte atunci cand
acestea nu raspund la un stimul mecanic fin aplicat la capatul anterior al corpului lor. Orice
simptome comportamentale sau patologice trebuie raportate.
Testul de toxicitate in sol artificial
Si pentru acest test, ca si in cazul testului pe hartie de filtru, vor exista vase de cultura
martor si vasa de cultura test. Si in acest caz sunt necesare minim 5 niveluri de concentratie a
substanetei testate, cresterea nivelurilor de concentratie fiind in progresie geometrica.
Substanta de testat se amesteca cu apa distilata iar solutia rezultata se adauga solului
artifical, amestecandu-se bine cu aceste sau se va pulveriza cu un pulverizator adecvat pe sol.
Daca substanta nu e solubila in apa, atunci se va dizolva in solventi organici, ca de exemplu
acetona, hexan, cloroform, iar dca nu e solubila nici in solventi organici, atunci se va
amesteca cu nisip fin de cuart (10 g de nisip de cuart la 740 g sol artificial cu un continut de
apa de 35%, astfel inct cantitatea totala de sol artificial folosit la test sa fie de 750g).
Vasul de cultura martor va trebui sa primeasca exact aceleasi cantitati de substante
aditive(apa distilata sau solventi organici sau nisip de cuart) ca si vasele de cultura test, in
afara de substanta de testat.
Fiecare vas de cultura va trebui sa fie de sticla si va contine 750 g de sol artificial. In
fiecare vas se vor introduce cte zece rme(care in prealabil au fost conditionate timp de 24 h
intr-un alt vas cu sol artificial si apoi spalate inainte de introducere in vasele cu substanta de
testat). Vasele se vor acoperi cu folie de plastic perforata care sa impedice evaporarea si care
sa permita in acelasi timp aerarea mediului de testare.
In cazul acestui tip de test sunt recomandate 4 repetitii pentru fiecare tratament(4 vase
martor si 20 vase test).
Durata testului va fi de 14 zile, iar in a 7-a si a 14-a zi se vor inregistra datele
referitoare la mortalitatea rmelor testate.
Evaluarea starii de mortalitate in a 7-a zi se face golind continutul vaselor de sticla pe
o tava si sortand rmele si testndu-le reacia la stimuli mecanici aplicati pe partea anterioara
a corpului. Dupa aceasta, contintul golit se va pune din nou in vasele din care a fost scos, iar
evaluarea mortalitatii va fi reluata in a 14-a zi a testului. Orice simptome comportamentale
sau patologice va trebui sa fie raportate. La sfarsitul testului se va stabili care este nivelul
umiditatii solului.
Rezultatele care trebuie obtinute vor consta in:
- Stabilirea biomasei medii vii si a numarului de rame vii/tratament la inceputul si
sfasitul testului;
- Descrierea simptomelor fizice(pierderea in greutate) si patologice (leziuni, ulceratii ale
mucoasei tegumentului) observabile sau a schimbarilor evidente de comportament la
organismele supuse testului(capacitatea de sapare a galeriilor);
- Trasarea grafica a curbei concentratiei/efect (valorile concentratiilor vor fi redate
logaritmal)
- Stabilirea ratei mortalitatii in varinatele martor;
- Stabilirea ratei mortalitatii in variantele test(deoarece ramele se descompun foare
repede dupa ce mor, se vor considera moarte toate acele organisme care lipsesc sau nu
pot fi observate in mediul de cultura);
- Stabilirea valorii DL50(DL 50 reprezinta concentratia medie letala, adica acea
concentratie a substantei testate la care mor 50% din organismele supuse testului, pe
toata durata acestuia)
- Determinarea umiditatii solului artificial la inceputul si sfarsitul testului;
- Precizarea celei mai mari concentratii care nu a cauzat mortalitate;
- Precizarea celei mai mici concentratii care a cauzat mortalitate 100%