Aspecte ale cineticii si

mecanismului reactiilor
catalizate enzimatic catalizate enzimatic
Master - An I: Chimie Fizica Avansata
Conf. Dr. Ing. Alexandra Csavdri
Macromolecule de natura proteica
Mase moleculare 10
5
10
6
g/mol
Masuratori experimentale la:
10
-10
10
-8
mol/l Enzima
Caracteristici ale enzimelor
10
-10
10
-8
mol/l Enzima
10
-6
10
-3
mol/l Substrat
Domeniu de actiune (fiziologic):
2537
o
C (E denatureaza peste 50
o
C)
57 pH (altereaza structura gruparii proteice /
ionizeaza centrul activ al enzimei)
[ES] stationar
Caracteristici ale enzimelor
holoenzim = apoenzim + cofactor
(coenzim; ion metalic)
(catalitic activ) (catalitic inactiv)
10
2
10
3
mol/g
10
5
10
6
mol/g 10
5
10
6
mol/g
Enzime : Eficiente / Selective-Specifice
Specificitate: de grupare;
de legtur;
stereochimic
Tipuri de reactii enzimatice
Tip de reacie Tip de enzim (exemple)
Adiie sau eliminare de ap
Hidrolaz (eteraz, carbohidraz, nucleaz,
deaminaz, amidaz)
Hidraz (fumaraz, enolaz)
Schimb de electroni
Oxidaz (pentru glucoz, galactoz,
amionacizi)
Dehidrogenaz (pentru alcool,
Schimb de electroni
Dehidrogenaz (pentru alcool,
hidroxisteroid)
Transfer de radicali
Transglicolsidaz (transfer monozaharide)
Transfosforilaz i fosforaz (transfer
grupare fosfat)
Transaminaz (transfer grupare amino)
Transmetilaz (transfer grupare metil)
Transacetilaz (transfer grupare acetil)
Rupere sau formare legtur C-C
Cataliza enzimatica
- Mecanism -
S + E SE (k
1
, k
-1
)
SE (+ R) P + E (k
2
, k
-2
)
1 intermediar :
SE (+ R) P + E (k
2
, k
-2
)
S + E SE
1
SE
2
P + E
2 intermediari :
k
1
, k
-1
k
2
, k
-2
k
3
, k
-3
Forma legii de viteza NU depinde de numarul de intermediari
Legea de viteza
0 ] ][ [ ] [ ] [ ] ][ [
] [
2 2 1 1
= + =

P E k ES k ES k E S k
dt
ES d
] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [
0 0
P S S ES E E + = + =
] [ ] ][ [
] [ ] [
1 1
ES k E S k
dt
P d
dt
S d

= =
dt dt
{ }
{ }
2 1 2 1
0 2 1 2 1
] [ ] [
] [ ] [ ] [ ] [
k k P k S k
E P k k S k k
dt
S d
+ + +

=


( ) ( )
2
2 1
1
2 1
0 1 0 2
] [ ] [

+
=
+
=
= =
k
k k
K
k
k k
K
E k r E k r
P S
P S
P S
P
P
S
S
K
P
K
S
P
K
r
S
K
r
dt
S d
r
] [ ] [
1
] [ ] [
] [
+ +

= =
Semnificatie termeni
S + E SE (k
1
, k
-1
)
SE (+ R) P + E (k
2
, k
-2
)
( ) [ ][ ] ( ) [ ][ ]
E k r E k r
P S
+ +
= =
0 1 0 2
] [ ] [
S P
P S
K r
K r
k k
k k
S
P
K = = =
2 1
2 1
] [
] [
( ) [ ][ ]
[ ]
( ) [ ][ ]
[ ] SE
E P
k
k k
K
SE
E S
k
k k
K
P S
=
+
= =
+
=

2
2 1
1
2 1
[r
S
] = mol.dm
-3
.s
-1
[K
S
] = mol.dm
-3
[k
2
] = s
-1
Cazuri limita (experimentale)
P S
P
P
S
S
K
P
K
S
P
K
r
S
K
r
dt
S d
r
] [ ] [
1
] [ ] [
] [
+ +

= =
Conversii < 5% ( [P] 0 )
0
0
1
2 1
0
0 2
0 0
] [
] [
] [
] [
] [ S
K S
r
k
k k
S
E k
S r
S
s
+
=
+
+
=

Conversii < 5% ( [P] 0 )

( [S] [S]
0
)
Michaelis Menten (1913)
- aproximatia pre-echilibrului pt SE -
r
0
[ ]
[ ]
S r
r =
max
0
S + E SE (k
1
, k
-1
) rapid
SE (+ R) P + E (k
2
) edv
r
ma
x
[S]
0
r = k
2
/K
M
[S]
0
[E]
0
r
max
= k
2
[E]
0
[ ]
[ ]
M
K S
S r
r
+
=
0
max
0
0
K
M
r
max
/2
unde:
r
max
= r
S
= k
2
[E]
0
K
M
= K
S
= k
-1
/k
1
Briggs-Haldane (1925)
- aproximatia starii stationare SE -
S + E SE (k
1
, k
-1
) edv
SE (+ R) P + E (k
2
)
[ ]
[ ]
S r
r =
max
0
0
unde: r
max
= r
S
= k
2
[E]
0
[ ]
M
K S
r
+
=
0
0
K
M
= K
S
= ( k
-1
+ k
2
) / k
1
K
M
afinitatea dintre S si E, constanta de instabilitate a
SE, valoare de concentratie la care r = r
max
/2
(K
M
mic = afinitate mare intre S si E, E se satureaza la S mici)
K
M
= 10
-2
10
-5
mol/l
Activitatea catalitica
Unit (U) = cantitate E pt conversia 1M S, 1
min, cond. optime (T, pH, sistem tamponare)
katal (kat) = 1M S, 1 s (1 kat = 6x10
7
U)
Activitate specifica = nr. U/ mg(ml) E
Activitate moleculara = nr. U/M E
k
cat
= r
max
/[E]
0
Eficienta catalitica = k
cat
/K
M
= r
max
/[E]
0
K
M
Determinarea parametrilor cinetici
I. Date exp. : [S]
0
r
0
r
0
r
ma
Forme derivate
ale legilor de viteza
0 max max 0
] [
1 1 1
S r
K
r r
M
+ =
Lineweaver-Burk
max
0
max 0
0
] [ ] [
r
S
r
K
r
S
M
+ =
Hanes-Woolf
0
0
max 0
] [S
r
K r r
M
=
Eadie-Hofstee
x
[S]
0
ale legilor de viteza
Tipuri de linearizari
0 max max 0
] [
1 1 1
S r
K
r r
M
+ =
Lineweaver-Burk
1
max
0
max 0
0
] [ ] [
r
S
r
K
r
S
M
+ =
Hanes-Woolf
2
-1/K
M
1/r
0
1/r
max
1/[S]
0
K
M
/r
max
-K
M
[S]
0
/r
0
K
M
/r
max
[S]
0
1/r
max
Linearizari cu puncte mai uniform distribuite
Tipuri de linearizari
3
0
0
max 0
] [S
r
K r r
M
=
Eadie-Hofstee
r
0
r
max
/K
M
r
0
r
max
r
0
/[S]
0
K
M
Exemplu (I)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 2 4 6 8 10 12
3
1
0
6

r

(
m
o
l

/

l
.
s
)
Linearizare Lineweaver-Burk
y = 389.42x + 832313
R
2
= 0.9969
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
-2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000
1
/
r
1
10
3
[S] (mol / l)
Linearizarea Eadie-Hofstee
y = -0.0005x + 1E-06
R
2
= 0.9915
0
0.0000002
0.0000004
0.0000006
0.0000008
0.000001
0.0000012
0.0000014
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002
r/[S]
r
3
Linearizarea Hanes-Woolf
y = 813812x + 408.89
R
2
= 0.9999
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
-0.002 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
[S]
[
S
]
/
r
2
-2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000
1/[S]
Determinarea parametrilor cinetici
II. Date exp. : t [P]
[ ] [ ]
[ ]
[ ] [ ]

+ =
P S
S
P r
K
r P
t
M
0
0
max max
ln
1 1
Forma integrata
a legii de viteza
Michaelis Menten
1/r
0
1/r
max
K
M
/r
max
[ ]
[ ]
[ ] [ ] P S
S
P
0
0
ln
1
Influenta pH
pH 7
Substratul are grupari ionizabile, Enzima actioneaza
doar asupra uneia dintre aceste forme
Schimbari pH modifica activitatea catalitica a Enzimei
r
max
pH
K
M
pH
pH
optim
7
pH
optim
7
Influenta temperaturii
lg(r
max
)
T
optim
1/T
T
optim
Modificatori - cataliza enzimatica
Activator: creste r - (vezi cofactor)
nu sunt specifice
r = f ([activator]) similar cu r= f([S])
Inhibitor: scade r
prin: substrat S, produs P, inhibitor I
reversibila (echilibru formare complex EI)
ireversibila (legatura covalenta EI)
tip: competitiva, necompetitiva, non-competitiva
Activator
Enzima: apoenzima inactiva devine
catalitic activa prin cofactor (ion metalic /
coenzima)
intervine in mecanism prin:
coenzima)
Substrat: generare in situ complex SA
S + A SA
SA + E ASE
ASE (+ R) P + E
Inhibitor
S + E SE (K
S
)
E + I EI (K
I
)
SE + I SEI (K
I
)
S + EI SEI (K
S
)
[ ][ ]
[ ] SE
E S
K
S
=
[ ][ ]
[ ] IE
E I
K
I
=
[ ][ ]
[ ] SEI
I SE
K
I
=
'
[ ][ ]
[ ] SEI
EI S
K
S
=
'
S + EI SEI (K
S
)
SE (+ R) P + E
SEI (+ R) P + EI
[ ] IE [ ] SEI

+ +

+
=
] [
] [
1
] [
1
] [
'
0 2
S
K
K
I
K
I
E k
r
S
I
I
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] IES EI ES E E + + + =
0
Inhibitie
Competitiva: I concureaza cu S la centrul activ
contracarare: [S] mari, enzima saturata cu S
r
max
nealterat, K
M
creste
Necompetitiva: I se leaga de SE complex SEI Necompetitiva: I se leaga de SE complex SEI
inactiv
Scad r
max
si K
M
Non-competitiva: I se leaga de E sau SE (in alta
parte decat centrul activ)
K
M
nealterat, r
max
scade
Linearizari Lineweaver-Burk
Inhibitie competitiva Inhibitie necompetitiva
Inhibitie
non-competitiva
1. Mecanism cu 2 substrate
S
1
+ S
2
P
1
+ P
2
Mecanism cale obligatorie (compulsory pathway)
Ordinea de legare S
1
si S
2
de E este intotdeuna aceeasi
1/r
diverse [S ]
S
1
+ E ES
1
1/[S
1
]
1/r
diverse [S
2
]
constante
ES
1
+ S
2
ES
1
S
2
ES
1
S
2
P
1
+ EP
2
EP
2
P
2
+ E
[ ]
[ ] [ ] [ ][ ]
2 1
4
2
3
1
2
1
0
S S S S r
E
+ + + =
2. Mecanism cu 2 substrate
S
1
+ S
2
P
1
+ P
2
Mecanism dute-vino (ping-pong) Inainte de legarea
S
2
de E, se formeaza P
1
si complex derivat al ES
1
1/r
diverse [S ]
S
1
+ E ES
1
1/[S
1
]
1/r
diverse [S
2
]
constante
S
1
+ E ES
1
ES
1
ES
1
+ P
1
ES
1
+ S
2
ES
1
S
2
ES
1
S
2
P
2
+ E
[ ]
[ ] [ ]
2
'
3
1
'
2
'
1
0
S S r
E
+ + =
3. Mecanism cu 2 substrate
S
1
+ S
2
P
1
+ P
2
Mecanism legare intamplatoare (random addition)
Legarea S
1
si S
2
de E nu urmeaza o anumita ordine
S
1
+ E ES
1
E + S
2
ES
2
ES
1
+ S
2
ES
1
S
2
EP
2
+ P
1
ES
2
+ S
1
ES
1
S
2
EP
2
+ P
1
EP
2
P
2
+ E
ES
1
S
2
E + P
1
+ P
2
Bibliografie + Teme Obligatorii
1. I. Baldea, Cinetica chimica si mecanisme de reactie,
Presa Universitarea Clujeana, Cluj-Napoca, 2002, pg.
286-300
2. I. Baldea, Deducerea mecanismului de reactie, Presa
Universitarea Clujeana, Cluj-Napoca, 2008, pg. 159-171 Universitarea Clujeana, Cluj-Napoca, 2008, pg. 159-171
Tema: Problemele 2/pg 298, 3/pg 299, 4/pg 299, 6/pg
299 referinta 1 (vezi mai sus)