Rezumat Teza Codrici Elena

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
IDENTIFICAREA DE NOI BIOMARKERI PRIN

TEHNOLOGII PROTEOMICE
N TUMORI INTRACRANIENE
Coordonator doctorat:
Prof. Dr. Veronica Stoian
Doctorand:
CSIII Elena (Rducan) Codrici
Bucureti
2011
CUPRINS
GENERALITI TUMORI INTRACRANIENE................................ 4
Glioblastoame ......................................................................................................... 4
Tumorile hipofizare ................................................................................................ 4
CLASIFICAREA TUMORILOR INTRACRANIENE........................... 6

CLASIFICAREA GLIOBLASTOAMELOR .......................................... 6
- dup tipul celulei ..................................................................................................................................... 6
dup grad ......................................................................................................................................... 7
- dup localizare ........................................................................................................................................ 7
CLASIFICAREA TUMORILOR HIPOFIZARE ................................... 7

ANGIOGENEZA LA NIVELUL TUMORILOR INTRACRANIENE.. 9
INTRODUCERE ....................................................................................... 9
ANGIOGENEZA CA UN MECANISM PATOGENIC AL BOLILOR. 9
FACTORII ANGIOGENICI................................................................... 10
FACTORII ANGIOGENICI SOLUBILI - POSIBILI MARKERI LA
NIVELUL TUMORILOR INTRACRANIENE..................................... 11
Angiogeneza n glioblastoame.............................................................................. 11
Angiogeneza n tumorile hipofizare...................................................................... 14
INTERLEUKINA 1 (IL-1) ...................................................................... 18

INTERLEUKINA 6 (IL-6) ...................................................................... 18
INTERLEUKINA 8 (IL-8) ...................................................................... 19
PROTEOMICA I BIOMARKERII LA NIVELUL TUMORILOR
INTRACRANIENE ................................................................................. 21
INTRODUCERE ..................................................................................... 21
BIOMARKERII....................................................................................... 26
TEHNOLOGII PROTEOMICE............................................................. 28
ANALIZA PROTEOMIC LA NIVELUL TUMORILOR
INTRACRANIENE ................................................................................. 30
PROTEOMICA N GLIOBLASTOAME ............................................................ 30
PARTEA PRACTIC ............................................................................. 32

MATERIALE I METODE.................................................................... 32
CAZUISTICA .......................................................................................... 32
METODE DE INVESTIGAIE UTILIZATE ..................................................... 32
REZULTATE........................................................................................... 33
CARACTERISTICI GENERALE LOTURI PACIENI.................................. 33
ANALIZA IMUNOHISTOCHIMIC SI SERIC A FACTORILOR

ANGIOGENICI ....................................................................................... 34
Analiza imunohistochimic la nivelul glioblastoamelor....................................... 35
Determinarea seric a VEGF i bFGF la pacienii cu glioame............................. 35
Analiza imunohistochimic la nivelul tumorilor hipofizare ................................. 36
Determinarea seric a VEGF i bFGF la pacienii cu tumori hipofizare .............. 37
Analiza multiparametric xMAP .......................................................................... 38
Tehnologia SELDI-ToF-MS................................................................................. 40
Analiza SELDI-TOF-MS la nivel seric ................................................................ 40
Analiza SELDI-TOF-MS la nivelul lizatului tisular............................................. 40
Electroforeza bidimensional (2DE)..................................................................... 41
DISCUII................................................................................................. 42
CONCLUZII ............................................................................................ 49
BIBLIOGRAFIE SELECTIV:............................................................. 52
CAPITOLUL I Generalitati
GENERALITI TUMORI INTRACRANIENE

Studiul tumorilor intracraniene rmne o provocare pentru diferitele grupuri de cercetare
internaionale, dorindu-se n primul rnd detecia precoce a acestor tumori, ceea ce reprezint un
aspect crucial pentru succesul terapeutic. ns heterogenitatea tumorilor intracraniene face
dificil clasificarea lor histologic, n sensul evalurii prognosticului. Dei au fost identificate
unele aberaii genetice i modificri ale expresiei genice asociate cu oncogeneza tumorilor
cerebrale, contribuia lor n evaluarea prognosticului i optimizarea terapiei rmne limitat. Dei
pe plan internaional se fac cercetri n domeniul biologiei moleculare a tumorilor intracraniene
de peste 10 ani, majoritatea au n continuare un prognostic rezervat, pacienii supravieuind n
medie un an dup tratamentul multimodal (rezecia chirurgical, radioterapie, chimioterapie).
Glioblastoame
Glioblastoamele sunt tumori neuroepiteliale dezvoltate din seria celulelor de susinere ale
sistemului nervos, astrocite i oligodendrocite. Ele reprezint aproximativ 40-50% din tumorile
cerebrale, iar 60% dintre glioame sunt recunoscute ca avnd un grad nalt de malignitate.
Prognosticul lor evolutiv, neurologic i vital este cel mai adesea rezervat fiind grevat de:
- sechele neurologice majore care necesit asisten medical calificat i susinut;
- citoreducie chirurgical total - practic imposibil prin slaba delimitare a tumorii fa
de esutul cerebral nconjurtor;
- rspuns limitat la terapia adjuvant i paleativ;
- rat crescut de recidiv local, asociat frecvent cu creterea gradului de malignitate.
Durata supravieuirii de la diagnosticare, n glioamele maligne, avnd n vedere condiiile
existente n sistemul sanitar autohton, ajunge, fr tratament, la 1-2 luni. Cu tratament complex,
chirurgical, radioterapeutic, citostatic i imunoterapie specific, supravieuirea se poate prelungi
la 18-24 de luni. Pacienii cu glioame cu rat sczut de malignitate, gradul I i II (Organizaia
Mondial a Sntii - WHO), supravieuiesc peste 5 ani n proporie de aproximativ o treime.
Dei se fac intense cercetri n domeniul biologiei tumorale, glioblastoamele au n continuare un
prognostic slab, cu o durat medie de supravieuire foarte sczut de la operaie i cu
administrarea unei terapii adjuvante. Din acest motiv, atenia cercettorilor se ndreapt ctre noi
metode de abordare, prin:
- terapii intite care afecteaz doar celulele tumorale i nu celulele sntoase din jurul lor;
- metode care limiteaz rspndirea cancerului;
- identificarea de noi biomarkeri utili n screeningul i diagnosticul precoce al tumorilor.
Tumorile hipofizare
Dintre tumorile selare epiteliale, majoritatea sunt adenoame hipofizare, tumori benigne ce
se dezvolt din celulele adenohipofizei, constituind ~10-15% din totalul neoplasmelor
intracraniene, fiind mult mai frecvente la aduli. Adenoamele hipofizare clinic simptomatice apar
la 0,8-1% din populaie. Avnd n vedere i existena tumorilor hipofizare asimptomatice,
descoperite accidental la autopsie i avnd dimensiuni mici (de ordinul milimetrilor), ntlnite n
4
CAPITOLUL I Generalitati
peste 25% din cazurile autopsiate neselectiv, incidena adenoamelor este, n realitate, mult mai
mare. O alt categorie de tumori hipofizare, mult mai agresive, dar i extrem de rar nlnite, o
reprezint carcinoamele hipofizare, care au fost raportate numai n 0,2% din cazurile
chirurgicale. Din punct de vedere morfologic, adenoamele i carcinoamele nu se deosebesc ntre
ele, cele din urm distingndu-se prin prezena metastazelor cerebrospinale sau sistemice.
Dup criteriul clinic, tumorile hipofizare pot fi grupate n endocrin inactive (nesecretante)
i endocrin active (secretante). Patogeneza tumorilor hipofizare nu este nc pe deplin elucidat.
Studii experimentale pe animale au demonstrat c factorii hipotalamici nu pot fi exclui din
determinismul acestor tumori. Restul tumorilor adenohipofizare sunt generate de anomalii
genetice dobndite, iniiate la nivelul receptorilor de factori de cretere, care conduc la
modificarea cilor de semnalizare celular i, n final, la modificri nucleare patogene. Astfel,
alterarea materialului genetic individual este considerat factorul predominant.
Necesitatea unor informaii suplimentare, alternative celor oferite de examenul
histopatologic i cel de microscopie electronic, a impus investigarea cu ajutorul tehnicilor de
biologie molecular, a unor noi biomarkeri, prezeni n esutul tumoral.
CAPITOLUL II Clasificarea tumorilor intracraniene
CLASIFICAREA TUMORILOR INTRACRANIENE

Clasificarea GLIOBLASTOAMELOR
Neoplasmele astrocitare se pot ntlni la nivelul ntregului sistem nervos central, de la
nivelul emisferelor cerebrale pn la nivelul mduvei spinrii, fiind cel mai larg grup de tumori
cerebrale. Exist nc diferene de opinie n ceea ce privete clasificarea acestor tumori.
Din numeroasele clasificri existente la ora actual pentru astrocitoame, cea mai folosit
este cea a WHO. Sistemul WHO stabilete 4 grade, de la 1 la 4, gradul 1 fiind cel mai puin
agresiv i gradul 4 fiind cel mai gresiv (Tanaka G., 2011)1, (Kararizou EG., 2011)2, (Cunliffe
CH, 2010)3, (Kim YH., 2010)4.
Clasificarea WHO se bazeaza pe existena (sau absena) a patru criterii: atipii nucleare, mitoze,
proliferare microvascular (proliferare endotelial vascular) i necroz tumoral.
Clasificarea WHO pentru astrocitoame:
WHO Grade 1 ex.: astrocitoamele pilocitice
WHO Grade 2 ex.: astrocitomul difuz sau de grad sczut prezint atipii
nucleare
WHO Grade 3 ex.: astrocitomul anaplazic (malign) prezint atipii nucleare
i mitoze atipice
WHO Grade 4 glioblastoamele multiforme (cel mai comun gliom la aduli) i
variantele sale (GBL cu celule gigante i gliosarcomul) prezint necroze i
proliferare endotelial
Astrocitoamele de grad I sunt considerate tumori benigne, astrocitoamele de grad II apar
de regul la tineri, avnd o durat de supravieuire de 5-8 ani, n timp ce glioamele de grad 4 apar
de obicei la pacienii vrstnici, avnd o durat de supravieuire de 9-12 luni. Glioamele maligne
sunt cele mai comune tipuri de tumori cerebrale la aduli, cu grad mare de invazivitate i
perioad medie de supravieuire dup diagnostic de sub 1 an, n ciuda tratamentelor complexe.
Criteriile anatomo-patologice de ncadrare a astrocitoamelor n gradele respective, conform
sistemului WHO sunt:
glioblastomul multiform: celularitate crescut, pleomorfism celular i nuclear,
proliferare, mitoze i adesea necroze;
astrocitomul anaplazic (n comparaie cu glioblastomul multiform): celularitate i
pleomorfism mai reduse, mai puine mitoze, nu prezint necroz;
astrocitom: tumor glial diferit de cele prezentate anterior, cu celularitate i
modificri pleomorfice minime.
Clasificarea glioamelor dup tipul celulei, grad i localizare:
- dup tipul celulei
Ependimoame celule ependimale
Astrocitoame astrocite (glioblastomul multiform este cel mai comun astrocitom).
Oligodendroglioame oligodendrocite
6
Glioame mixte, precum oligoastrocitoame, conin celule de diferite tipuri.

- dup grad
Glioamele sunt mai mult clasificate n acord cu gradul lor, care este determinat prin evaluarea
patologic a tumorii.
Glioamele cu grad sczut sunt bine difereniate (nu sunt anaplazice); acestea sunt
benigne i, prin urmare, au un prognostic mai bun pentru pacient.
Glioamele cu grad crescut sunt nedifereniate sau anaplazice; acestea sunt maligne i
vor avea un prognostic negativ pentru pacient.
- dup localizare
Glioamele pot fi clasificate n acord cu apariia lor deasupra sau dedesubtul membranei numite
tentorium acesta separ creierul mare de cerebel.
supratentorial: deasupra tentorium-ului, majoritatea adulilor (70%);
infratentorial: sub tentorium, n cerebel, la majoritatea copiilor (70%).
CLASIFICAREA TUMORILOR HIPOFIZARE

Clasificarea WHO din 2004 se bazeaz pe caracterele histologice, histochimice,
imunohistochimice i de microscopie electronic, pe care le combin cu detalii imagistice i
clinice (tabel 2.1) (Al-Shraim M., 2006)20, (Wolfsberger S., 2006)21, (Kontogeorgos G., 2005)22.
TIPUL DE
ADENOM
Adenoame
secretante de
hormon de
cretere (GH) somatotrope
(25-30% din
tumorile
hipofizare)
Adenoame
secretante de
prolactin
(PRL)prolactinoame
Adenoame
secretante de
ACTH-
SUBTIPURI
Cu granulaii dense (adenomul acidofil clasic) - celule
acidofile, imunoreactivitate difuz intens pentru GH, 50% din
adenoame imunohistochimic plurihormonale
Cu granulaii rare - celule cromofobe, imunoreactivitate
variabil pentru GH, corpusculi fibroi intracitoplasmatici
(keratin 8)
Mixte GH-prolactin - celule somatotrope i lactotrope
imunoreactivitate diferit pentru GH i PRL
Mamosomatotrope - celule acidofile, imunoreactivitate difuz
pentru GH i PRL, rari corpusculi fibroi intracitoplasmatici
(keratin 8)
Cu celule stem acidofile - celule acidofile, imunoreactivitate
pozitiv pentru PRL i mai puin intens pentru GH, rari
corpusculi fibroi intracitoplasmatici (keratin 8)
Cu granulaii rare - celule lactotrope; imunoreactivitate
pozitiv pentru PRL paranuclear (model Golgi); corpi
psamomatoi; depozite de amiloid extracelulare; granule PRL
extracelulare
Cu granulaii dense sau rare - adenomul bazofil clasic, celule

PAS pozitive, imunopozitivitate variabil pentru ACTH,
dependent de prezena filamentelor de keratin plemorfism
CARACTERSTICI CLINICE,
IMAGISTICE, PROGNOSTIC
-acromegalie
-gigantism (adenoame
mamosomatotrope)
- hipersecreie GH/IGF1
- macro/microadenoame
extensie/invazie supra\lateroselar
- analogii de somatostatin
determin reducerea secreiei
tumorale de GH, a nivelului
plasmatic de IGF1, inhib
proliferarea celulelor tumorale i
determin fibroz i hialinizare
stromal
- sindrom amenoree-galactoree
(femei); scderea libido/impoten
(brbai)
- hiperprolactinemie
- microadenoame (femei)
- macroadenoame (brbai)
- agonitii de dopamin determin
reducerea neomogen a volumului
citoplasmatic, apopotz i fibroz
perivascular i interstiial
(dependent de prezena
receptorului D2)
- boal Cushing
- hipersecreie de ACTH
- microadenoame (80%)
corticotrope
(10% din tumorile
hipofizare,
predominent la
femeile adulte)
Adenoame
secretante de
TSH (tireotrope)
(1% din tumorile
hipofizare,
predominent la
femeile adulte)
Adenoame
secretante de
gonadotropine
FSH i LSH
(iniial, introduse
n categoria null
cell)
Adenoame null
cell
(predominant la
vrstnici)
Adenoame
plurihormonale
(rare, nefiind
explicabile prin
citodiferenierea
normal a
adenohipofizei)
Carcinoame
pituitare
(aduli, fr
predominen de
sex i vrst)
nuclear i apoptoz posibile
Adenoame Crooke - filamente de citokeratin ce creaz

depozite hialine masive
- celule PAS pozitive, imunopozitivitate pentru subuniti i
-TSH
- elongaii citoplasmatice coninnd granule secretorii
- gu, hipertiroidism
- macroadenoame
- celule polare, de dimensiuni mici sau medii; elongaii

citoplasmatice dispuse sub form de rozete sau pseudopapile,
coninnd granule secretorii pozitive pentru -TSH, glicoproteine, sinaptofizin, cromogranin A;
celule PAS pozitive (de regul) i HE acidofile
- simptomatologie vizual
- macroadenoame nesecretante
- fr markeri ultrastructurali sau imunohistochimici

HE cromofobe, granule rare pentru gonadotropine,
cromogranin A, sinaptofizin
- efect de masa i hipopituitarism

- macroadenoame nesecretante
imunopozitivitate pentru mai multe tipuri de hormoni

3 subtipuri:
1. GH, PRL
2. hormoni glicoproteici (-TSH, -LH, -FSH, subuniti )
3. subtip 3- mut (PRL, TSH)
- comportament agresiv, invazive,

prognostic slab
- fr markeri ultrastructurali sau imunohistochimici
- tumori secretante de PRL i

ACTH; cu metastaze documentate
n spaiul subrahnoidian sau
sistemice (diseminare limfatic,
mai rar hematogen ln cele
sectretante de ACTH)
CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene
ANGIOGENEZA LA NIVELUL TUMORILOR INTRACRANIENE

Introducere
Termenul de angiogenez - definit ca formare de noi structuri vasculare - a fost introdus
n 1787 de John Hunter (Rmali KA, 2006)32, care a descris iniial formarea de noi vase n coarne
de ren. Corelarea angiogenezei cu carcinogeneza s-a realizat cteva sute de ani mai trziu, n
1971, de ctre Dr. Judah Folkman care a emis ipoteza conform creia creterea tumoral este
dependent de angiogenez; teoria sa publicat n New England Journal of Medicine a fost
considerat drept o erezie (Folkman J, 1971; Folkman J, 1972)33,34.
n ultimii ani, angiogeneza a devenit unul dintre cele mai investigate fenomene
fiziopatologice, datorit rolului cheie pe care l joac n patogeneza diferitelor boli ct i datorit
potenialului su ca int terapeutic. Dei este studiat n mare parte la nivel tumoral, se
cunoate faptul c angiogeneza apare i n patologii cronice caracterizate prin inflamaie.
Angiogeneza este un proces complex, care implic numeroi factori (factori de cretere, citokine,
etc), care pot ajunge n cele din urm n circulaia sistemic, devenind astfel markeri solubili uor
de cuantificat (n ser) i totodat un potenial instrument de diagnostic, util att pentru cercettori
ct i pentru clinicieni.
Angiogeneza ca un mecanism patogenic al bolilor

Angiogeneza, este un proces natural care are loc n organism n asociere cu stri normale
ct i patologice (Carmeliet P., 2000)35. n primul caz, cele dou concepte fiziopatologice pot fi
difereniate:
(i) vasculogeneza, se refer la formarea de vase de snge primitive
de la nivelul mezenchimului prin diferenierea angioblatilor n timpul
dezvoltrii embrionare - formarea plexul vascular primar.
(ii) angiogeneza, n cazul n care noi structuri vasculare sunt derivate din cele pre-existente
i invadeaz esutul nconjurtor, aa cum apare, de exemplu, n placent, n timpul
sarcinii.
Angiogeneza a fost de asemenea descris n asociere cu diverse tipuri de patologii, de la
creterea tumoral (Folkman J, 2003)36 (cancerul cavitii bucale - Schimming R 200437, tumori
mamare - Ryden L 200338, Coskun U 200339, cancerul renal - Kinouchi T 200340,
hepatocarcinomul - Semela D 2004)41 pn la bolilor cronice inflamatorii, cum ar fi boala arterei
coronare (Chong AY 2004)42, hepatit cronic viral sau ciroza biliar primar (Medina J
2005)43.
n cazul tumorilor, apariia neovascularizaiei este esenial pentru cretere
i metastazare; tumorile solide recruteaz vase de snge din esuturile nconjurtoare, prin
exprimare i secreia de factori de cretere care vizeaz celulele endoteliale.
Angiogeneza nu este pur i simplu un epifenomen al patologiilor menionate. Dimpotriv,
exist numeroase dovezi indicnd faptul c acesta joac un rol patogenetic, contribuind la leziuni
tisulare. n cazul tumorilor, formarea de noi vase poate fi considerat patologic, deoarece
sprijin n mod direct creterea i viabilitatea tumorii. n cazul bolilor inflamatorii cronice,
9
angiogeneza este iniiat ca un mecanism de aprare care vizeaz prevenirea ischemiei esutului,
cauzat de infiltrate inflamatorii i facilitarea accesului de celule ale sistemului imunitar la site-ul
de leziune. Cu toate acestea, nou formata reea de structuri vasculare este anormal att structural
ct i funcional, i poate contribui, de asemenea, la lezarea esutului. ntr-adevr, angiogeneza i
inflamaia sunt procese ndeaproape asociate, care se pot potena reciproc i s funcioneze
mpreun ca mecanisme patogenetice de boal (Lai WK, 2005)44.
Faptul c angiogeneza joac un rol important la nivel tumoral, devine un fenomen
interesant de studiu, din urmtoarele motive:
(i) poate ajuta la nelegerea mecanismelor moleculare i celulare care au loc la nivel
tumoral;
(ii) ar putea oferi informaii cu privire la evoluia bolii, avnd astfel valoare de prognostic
potenialul;
(iii) ar putea reprezenta o int terapeutic pentru tratamentul bolii i, n sfrit
(iv) ar putea reflecta rspunsul la un tratament specific.
Factorii angiogenici
Angiogeneza este un proces reglat de echilibrul dintre factorii pro- i anti-angiogenici, care
sunt exprimai i produi ca rspuns la factorii externi stimulatori i inhibitori (Longo R, 2002)45
(tabel 3.1). n condiii patologice, se produce un exces de factori angiogenici sau un defect al
moleculelor anti-angiogenice, fapt care conduce la un "switch angiogenic" (figura 3.1), care
iniiaz formarea de noi vase de snge.
Tabel 3.1. Factorii angiogenici i anti-angiogenici care intervin n reglarea angiogenezei
Factori pro-angiogenici
Factori anti-angiogenici
Factorul de cretere al endoteliului vascular VEGF
Angiostatina
Factorul de cretere fibroblastic, basic bFGF
Brain angiogenesis inhibitor (BAI1)
Factorul de cretere derivat din plachete PDGF
Endostatina
Angiogeninele
Interferon , ,
Angiopoetinele
Maspin
Glioma-derived angiogenesis
Factorul transformant al creterii alfa, beta TGF,
Factorul de cretere epidermal EGF
inhibitory factor GD-AIF
Factorul de cretere hepatocitic HGF
Interleukinele IL-12, IL-18
Platelet-activating factor
Platelet factor 4 PF-4
Factorul de cretere placentar PlGF
Angiopoietina 2
Inhibitorul de crestere al endoteliului
Tumor-necrosis factor alfa TNF
vascular VEGI
Granulocyte colony-stimulating factor
Trombostatina
Interleukinele IL-6, IL-8
Trombospondina 1 TSP-1
Prostaglandinele E1, E2
Vasostatina
Vascular integrin v3
Inhibitorii tisulari ai MMP-urilor
Matrix metaloproteinazele (MMP-le)
10
Activatori:
VEGF
bFGF
PDGF
EGF
Inhibitori:
Trombospondina-1
Statine:
- angiostatine
- endostatine
- trombostatina
Figura 3.1. Balana angiogenic.
Factorii angiogenici solubili - posibili markeri la nivelul tumorilor

intracraniene
Angiogeneza n glioblastoame
Aproximativ jumtate din tumorile ntlnite la nivelul creierului reprezint metastaze
provenite de la neoplasmele situate n alt parte a corpului. O mare parte din cealalt jumtate
este reprezentata de meningioame, formate din membranele ce acoper creierul. Restul grupului
const n aa-numitele tumori cerebrale primare, tumori formate din componentele celulare ale
esutului cerebral nsui. Majoritatea acestor tumori sunt numite glioame/glioblastoame,
deoarece acestea apar cel mai probabil din celulele gliale. Glioamele sunt cele mai frecvent
ntlnite subtipuri de tumori cerebrale primare. Celulele tumorale gliale nc afieaz semne de
difereniere glial, ntr-o oarecare msur (Kleihues P., 2002)47. Comparativ cu cele mai
frecvente tipuri de cancer, precum cancerul pulmonar, de sn, de colon, de prostat, neoplasmele
gliale sunt doar o minoritate; cu toate acestea, morbiditatea i mortalitatea produs de aceste
tumori este cea mai mare dintre toate. Prin urmare, impactul acestor tumori asupra bunstrii
pacienilor i conseciele economice ale acestora justific eforturile depuse n studierea lor,
eforturi comparabile cu cele ntreprinse pentru grupurile majore de cancer.
n mai multe privine glioamele difer de alte tipuri de tumori, spre exemplu ele
metastazeaz foarte greu. Mai mult, celulele neoplazice gliale infiltreaz difuz esutul cerebral
prin mecanisme de migraie. Datorit caracterului infiltrativ difuz nu sunt clare frontierele
tumorii i, prin urmare, o intervenie chirurgical radical nu este posibil. O alt particularitate
a glioamelor este metamorfoza lor continu: n timp tumorile i schimb aspectul histologic;
acest lucru merge mpreun cu creterea instabilitii genetice. Astfel, tumorile devin mai
celulare, celulele mai pleomorfice i n final apar arii necrotice. Metamorfoza merge mpreun
cu o cretere a vaselor de snge i cu modificarea structurii pereilor vasculari.
Dei glioamele sunt printre cele mai vascularizate tumori este surprinztor faptul c
terapiile anti-angiogenice au avut un succes relativ pn n prezent. Pentru a mbunti
11
aceast situaie, este necesar s se mreasc specificitatea obiectivelor terapeutice n

vascularizarea gliomului.
Neovascularizaia glioamelor
Neovascularizaia i invazia celulelor tumorale sunt procese eseniale pentru dezvoltarea
i creterea glioamelor (Bello L, 2004)48. Neovascularizaia este deosebit de important pentru
creterea i progresia gliomului malign; proliferarea i hiperplazia componentelor celulare ale
vaselor de snge sunt utilizate ca indicatori ai gradul de malignitate al tumorilor gliale (Louis
DN, 2007)49. Nivelul ridicat al neovascularizaiei reprezint o buna int pentru terapia antiangiogenic, cu un potenial impact asupra proliferrii acestor tumori.
Formarea de novo a vaselor de snge are loc prin aciunea celulelor endoteliale unice
(ECS) sau a celulelor endoteliale precursor/progenitoare (EPCs), sau a lanurilor de celule
endoteliale non-canalizate (NCECCs), fie eliberate de la nivelul pereilor vasculari sau
mobilizate de la nivelul mduvei osoase. Un alt mecanism de neovascularizaie care se limiteaz
la tumori este cel n care celulele tumorale preiau vasele de snge gazd (Holash J, 1999)50, sau
din manetele perivasculare din jurul vaselor de snge gazd (Carmeliet P, 2000)51. Dup aceast
faz iniial de cretere vascular i dezvoltarea de complexe vasculare, inclusiv remodelare
continu i adaptare, apare n principal creterea vascular intussusceptiv (IVG) (angiogeneza
intussusceptiva - este un mod de formare i remodelare a vaselor de snge, care are loc prin
diviziunea intern a plexului capilar preexistent fr nmugurire) (Djonov V, 2003)52. O
caracteristic important a IVG este c acesta este realizat la o rat extrem de sczut a
proliferrii EC. n comparaie cu angiogeneza obinuit, n IVG vasele de snge sunt generate
mult mai rapid ntr-un mod energic i metabolic mai avantajos, ne mai fiind necesar degradarea
membranei bazale i invazia esutul nconjurtor (Djonov V, 2003)52.
Caracteristicile structurale ale vaselor de snge n glioblastoame
Dezvoltarea vaselor de snge din tumori difer semnificativ de angiogeneza fiziologic.
Diferenele includ apariia unor structuri vasculare aberante n tumori, maturizarea ntrziat a
vaselor, fluxul de snge anormal, modificarea interaciunilor dintre celulele endoteliale-pericite,
ct i creterea permeabilitii. Celulele endoteliale din vasele de snge situate la nivel tumoral
sunt active mitotic, permeabile iar funciile lor principale sunt perturbate. Exist indicii c, n
ciuda faptului c nu exist diferene morfologice, EC din glioamele de grad nalt, difer din
punct de vedere al expresiei antigenului de EC din glioamele de grad sczut (Miebach S, 2006)53.
Schimbrile rapide n expresia antigenului au fost observate n pasaje timpurii ale EC de cultur.
n pasajele timpurii s-au remarcat diferene fenotipice i funcionale ntre EC derivate din
glioame cu diferite grade de malignitate (Miebach S, 2006)53. Numeroi factori, cum ar fi
angiopoetinele i receptorii acestora Tie (Zadeh G, 2005)54, PDGF-B (Hata N, 2010)55,
proteinele chemotactice monocite 1, ephrins i receptorii Ephi-B (Gale, NW, 2001; Shin D.,
2001)56,57 sunt candidati probabili pentru activarea angiogenezei i medierea interaciunilor
endoteliu-endoteliu i endoteliu-pericitice (Burri PH, 2002)58. Angiogeneza tumoral, depinde de
asemenea, de diferena de expresie a citokinelor specifice. Indicele capilar al glioamelor
anaplazice este cel mai mare n comparaie cu alte tipuri de tumori umane (Lai WK&Adams,
2005)44. Gradul de proliferare microvascular este variabil corelat cu anaplazia celulelor
tumorale i a indicilor de proliferare a celulelor tumorale. n glioblastom multiform, forma cea
12
mai comun i cea mai malign de gliom, angiogeneza de obicei ia forma unor structuri
glomeruloid-like i sarcomatoase (Brat DJ, 2001)59. Intensificarea angiogenezei n
astrocitoamele de grad nalt se realizeaz n paralel cu creterea numrului i a densitii
vasculare. De asemenea, sunt mai frecvent observate elongarea vaselor i a structurilor
glomeruloidale (Sharma S., 2006)60. Structurile neoplazice vasculare sunt de multe ori asociate
cu necroza i probabil originare din zone tumorale hipoxice. Nu numai rspunsul fiziologic la
hipoxie, dar i modificrile genetice, contribuie major n angioneogeneza. Prezena unei regiuni
hipoxice n masa tumorii conduce la supraexprimarea factorilor pro-angiogenici, cum ar fi
VEGF, printr-o activitate crescut a complexului transcripional HIF-1 (factor inductibil de
hipoxie-1) (Fiorenzo P, 2010)61. Medierea expresiei genelor HIF-1 poate fi direct sau indirect,
modulat de modificri ale oncogenelor/genelor supresoare tumorale care apar n timpul
dezvoltrii astrocitomul, respectiv PTEN, TP53, p16 (CDKN2A), p14ARF, EGFR, i PDGFR
(Nishi H, 2002)62. Modificrile genetice se crede de asemenea c influeneaz expresia HIFindependent de factori pro- i anti-angiogenici, cum ar fi bFGF i thrombospondin-1 (TSP-1)
(Kragh M, 2002)63. Evenimente genetice care apar n timpul progresiei astrocitoamelor
promoveaza angiogeneza, att prin modularea hipoxiei indus de expresia genelor ct i prin
reglarea factorilor pro- i anti-angiogenici.
Neovascularizaia glioblastoamelor i bariera hemato-encefalic
Capilarele existente la nivelul unui creier normal constau dintr-un endoteliu continuu n
care celulele sunt unite prin jonciuni bine dezvoltate i complexe; nu exist fenestrare, i exist
foarte puine vezicule plasmalemale. Este general acceptat faptul c meninerea barierei hematoencefalice (BBB) este rezultatul prezenei jonciunilor endoteliale strnse, al lipsei de veziculele
de transcitoz, a membranei bazale i a jonciunilor strnse prezente printre astrocytic foot
processes (Davies DC, 2002)64. n glioame este observat un grad deosebit de ridicat de
vascularizaie, dar microvasele i pierd caracteristicile i astfel se scurge lichid n neuropilema.
Vascularizaia n glioame este foarte dezordonat, cu numeroase unturi vasculare, vase de snge
cu diametre neregulate, jonciuni largi la nivel inter-endotelial, un numr mare de fenestraii i
canale transendoteliale, ct i membrana bazal discontinu sau absent (Davies DC, 2002)64.
Edemul cerebral este o consecin a acestei disfuncii n vascularizaie. Investigaiile
ultrastructurale ale vaselor de snge de la nivelul glioamelor au artat deschiderea jonciunilor
strnse dintre celulele endoteliale (Davies DC, 2002)64. Jonciunile strnse sunt formate de un
grup de molecule care cuprind proteinele ocludin, claudin i molecule de adeziune joncional.
n glioame s-a observat c proteinele care formeaz jonciunile strnse sunt sub-exprimate
(Papadopoulos MC, 2001; Zheng PP, 2004)65,66. Pierderea proteinelor din jonciunile strnse pare
a fi evenimentul central n deschiderea BBB (brain blood barier) n glioame.
Factorii pro- i anti-angiogenici
Procesul de formare a vaselor de snge ntr-un glioblastom implic o interaciune
complex ntre celulele tumorale, celule endoteliale, i membranele bazale din jurul lor i sunt
implicai mai muli factori de cretere. De-a lungul ultimelor decenii s-au fcut progrese n
nelegerea angiogenezei tumorale prin descifrarea mecanismelor de aciune a factorilor de
cretere i a receptorilor acestora ce acioneaz att asupra tumorii ct i a celulelor endoteliale
13
prin bucle paracrine / autocrine. Au fost identificai mai muli factori de cretere i mprii n
trei categorii (Liekens S, 2001)67.
Prima categorie const n factori care acioneaz n mod specific asupra celulelor endoteliale, de
exemplu, familia VEGF i a angiopoietinelor (Brunckhorst MK., 2010)68.
Clasa a doua sunt factori cu aciune direct, care activeaza o gam larg de celule int pe lng /
n afara de celule endoteliale, de exemplu, diferite citokine, chemokine i enzime angiogenice
(Zhang ZL, 2003)69.
Clasa a treia const n factori cu aciune indirect - cu efect asupra angiogenezei, rezultat din
eliberarea de substane din macrofage sau celulele tumorale, de exemplu, factorul de necroz
tumoral alfa (TNF ) i factorul de cretere transformant-beta (TGF-) .
Mai muli dintre aceti factori de cretere manifest activitate angiogenic n sistemul
central nervos la aduli (CNS) n condiiile reactive precum i neoplazice. Mai muli factori de
stimulare angiogenic au fost identificai n glioame i alte tipuri de tumori, inclusiv VEGF
(Onishi M, 2011)70, PDGF (Calzolari F., 2010)71, bFGF (Jang FF., 2008)72, TGF- beta (Anido J.,
2010)73, i EGF (Andersson U., 2010)74. Aceti factori de cretere pot influena neovascularizaia
glioamelor prin stimularea direct a proliferrii celulelor endoteliale, prin medierea expresiei
proteazelor cheie asupra celulelor endoteliale necesare pentru neovascularizaie, sau prin
reglementarea expresiei VEGF, i interaciunile ntre ei. Neovascularizaia tumorii este
considerat a fi mediat de aceti factori solubili eliberai din celulele tumorale i aceti factori
angiogenici ar putea deveni markeri utili de monitorizare a activitii glioamelor sau inte ale
terapiilor anti-angiogenice.
Angiogeneza pare a fi un echilibru ntre factorii pro-angiogenici i anti-angiogenici. Sunt
cunoscui unii inhibitori endogeni ai angiogenezei, de exemplu, angiostatina, endostatina,
antitrombin, prolactina, trombospondina (Feldman L, 2002)75, troponina, IFN-, IFN-,
pigment epithelium-derived factor (PEDF), CXCL10 (IP-10) (Sulpice E, 2004)76, factor
trombocitar 4, IL-12, IL-4, VEGI, inhibitorul tisular al metaloproteinazelor (TIMP), plasminogen
activator inhibitor 1 (PAI1), acidul retinoic, angiopoietin-2 (Ang-2), 2-methoxyoestradiol
(Mentlein R, 2003)77. Factorii anti-angiogenici pot aciona n mod direct sau indirect, pe celulele
endoteliale (Vajkoczy P, 2004)78.
Angiogeneza n tumorile hipofizare

Tumorile hipofizare, dat fiind poziia i funcia hipofizei, constituie o surs important
de morbiditate (10-20% din tumorile intracraniene) prin patologia pe care o antreneaz, patologie
manifestat prin sindromul funcional i cel compresiv sau invaziv n structurile adiacente. Dei
sunt n general benigne, ele prezint o mare variabilitate a comportamentului biologic i a ratei
de cretere. Studiul adenoamelor pituitare a fost aprofundat n ultimii ani prin aplicarea
metodelor moderne de proteomic. Cercetrile de biologie molecular i proteomic ofer un
nivel ridicat al cunotinelor, privitoare la creterea i diferenierea celular, activitatea
endocrin, oncogenez i progresia tumoral. Extinderea rapid a ariei de receptori a ajutat la
dezvoltarea cunotinelor privitoare la funciile celulare i a facilitat modelarea de noi
medicamente, cu aciune intit n tratamentul tumorilor hipofizare. Cunoscndu-se slaba
corelare ntre aspectul histologic i agresivitatea biologic a tumorilor hipofizare, n ultimul timp
s-au ncercat alte posibiliti de apreciere a comportamentului acestor tumori.
14
Tumorigeneza pituitar este un proces nc neelucidat, implicnd dereglri ale ciclului

celular, proliferarea i angiogenez.
Angiogeneza neovascularizaia este un proces esenial n tumorigenez. Reprezint o
etap cheie n creterea i progresia tumoral, avnd un rol important n invazia i metastazarea
tumoral prin asigurarea aportului sanguin necesar creterii i nmulirii celulare. Se realizeaz
prin formarea de noi vase de snge din capilarele preexistente, care ofer esutului tumoral
oxigen i compui energetici de baz. Formarea excesiv a vaselor sanguine este un proces
complex care implic celule tumorale, celule endoteliale, membrana bazal a celor mai apropiate
capilare i celule ale stromei. Se consider c stimulul cheie ce declaneaz angiogeneza este un
defect n aparatul genetic al unei celule tumorale, rezultnd producerea excesiv i constant de
factori de cretere angiogenici (VEGF, bFGF) i reducerea sintezei de proteine endogene cu rol
de inhibitori ai angiogenezei. Inducerea angiogenezei rezult din dezechilibrul factorilor pozitivi
i negativi care controleaz acest proces. Balana complet a factorilor de cretere angiogenici n
hipofiz poate determina fenotipul angiogenetic. Evidenierea fenotipului angiogenetic este
important pentru surprinderea trecerii tumorii de la faza prevascular la faza vascular i pentru
monitorizarea tumorilor. Studii moleculare realizate pe mai multe neoplasme au demonstrat c
un rol important n formarea fenotipului angiogenic este jucat de activarea genei markerului
VEGF (Yamada S., 2003)79. Pn n prezent s-a demonstrat c oncogene ca: v-ras, K-ras, v-raf,
src, fos a v-yes acioneaz ca puternici inductori ai expresiei celulare a VEGF, bFGF i alte
citokine angiogenice (Stepien H.M., 2002)80. Cunoaterea factorilor angiogenici i antiangiogenici poate permite utilizarea ultimilor n terapia anti-tumoral.
Studiile asupra semnificaiei neoangiogenezei n patogenia neoplasmelor glandelor
endocrine au devenit recent una din cele mai rapid dezvoltate ramuri ale endocrinologiei
moleculare. Majoritatea autorilor consider densitatea microvascular tumoral ca factor de
prognostic, independent sau asociat cu ali factori, cu valoare prognostic deja cunoscut (Goth
M.I., 2003)81. Angiogeneza prezint unele particulariti n adenoamele hipofizare; o explicaie
ar putea fi dubl circulaie sanguin i capacitatea secretorie att a unor factori angiogenici ct i
a unor inhibitori ai acestora (Turner H.E., 2000)82. Se pare c metodele standardizate de evaluare
a densitii vaselor sanguine detectate prin anticorpi specifici anti markeri antigenici ai celulelor
endoteliale (CD31, CD34, FVIII) pot fi relevante n diagnosticul i prognosticul acestor
neoplasme.
Microvascularizaia intratumoral poate fi corelat cu comportamentul tumoral sau
secreia hormonal n diferite tumori endocrine (Stepien H.M., 2002)80.
S-a demonstrat c angiogeneza, cuantificat prin densitatea microvascular, se coreleaz
cu comportamentul biologic tumoral, capacitatea de metastazare, prognosticul i rspunsul la
tratament n diferite tipuri tumorale: de sn, gastrice, hematologice, de prostat (Turner H.E.,
2000)82. De asemenea, angiogeneza a fost corelat cu un rspuns slab la tratament i recidiva
tumoral (Turner H.E., 2000; Goth M.I., 2003)8282, 81.
Rezultatele privind angiogeneza tumorilor hipofizare sunt nc subiect de controvers
tiinific. Literatura de specilaitate citeaz relaii pozitive ntre factorii angiogenezei i
dimensiunea, statusul endocrin sau potenialul agresiv al tumorii (Turner H.E., 2000; Yamada S.,
2003)82, 79, n timp ce alte studii susin inexistenta sau slaba corelaie ntre factorii mentionati
(Lee E.J., 2001; McCabe C.J., 2002)83, 84. S-a gsit o corelaie pozitiv ntre expresia factorului
15
VEGF i comportamentul invaziv al adenoamelor somatotrope i prolactinoamelor induse prin

estrogeni (Iuchi T., 2000)85.
Corelaia n cadrul adenoamelor hipofizare ntre densitatea microvascular i
dimensiunea tumorii a fost evideniat la nivelul adenoamelor secretante de PRL, dar mai puin
n cazul celor secretante de GH. A fost gasit n schimb o corelaie negativ ntre vrsta
pacientului i angiogeneza la adenoamele GH secretante. S-a mai citat o corelaie pozitiv ntre
prolactinoamele netratate i nivelul crescut al fenomenului angiogenetic (Stepien H.M., 2002)80.
n ceea ce privete proliferarea celular i angiogeneza exist studii care sugereaz ca ambele
fenomene sunt crescute n tumorile pituitare, dar ele nu au fost asociate sugernd ca fenomenele
sunt sub diferite mecanisme de control (Turner H.E., 2000)82.
VEGF este cunoscut a fi un factor angiogenetic puternic n majoritatea tumorilor solide,
el prezentnd rol n activarea neovascularizaiei n jurul tumorii (Lohrer P., 2001)86. Cu toate
acestea sunt puine cunotiine despre producia i reglarea lui n adenoamele pituitare. Prin
investigaii pe diferite linii celulare pituitare de roztoare s-a ajuns la concluzia c celulele
tumorale pituitare sunt capabile s produc VEGF ce poate fi implicat n angiogeneza tumoral
(Lohrer P., 2001)86. n tumori de origine uman, expresia VEGF a fost corelat cu potenialul
proliferativ n cadrul adenoamelor invazive (Iuchi T., 2000)85. Rezultate privitoare la supresia
VEGF prin dexametazon sugereaz c glucocorticoizii pot avea proprieti antiangiogenice cu
relevan terapeutic n tratamentul adenoamelor hipofizare.
Tabel 3.2. Factori angiogenici solubili cu potenial de biomarkeri.
Factorul
Receptor/i
Inhibitori
Membrii
familiei VEGF
Flt-1
Flt-1/KDR
sFlt-1
bFGF
FGF-R1,
FGF-R2
Angiostatin
endostatin
16
Efecte/
Activitatea biologic
Crete permeabilitatea vascular,
prin slbirea contactului
intercelular.
Induce proliferarea EC.
Regleaz formarea lumenului
pentru vasele noi.
Induce adeziunea leucocitelor
Susine angiogeneza i
vasculogeneza.
Stimuleaz proliferarea
microvascular a EC.
Amplific migraia i nmugurirea
EC.
Inhib apoptoza EC.
Crete permeabilitatea EC.
Induce proliferarea EC.
Stimuleaz proliferarea EC.
Susine formarea lumenului
microvaselor.
Promoveaz migrarea EC.
Promotor important pentru
remodelarea vaselor de snge dup
lezarea esutului.
Procesul n care
sunt implicai
nmugurirea de
noi vase, creterea
vaselor,
organizarea 3D.
Creterea vaselor.
Citokine
proangiogenice
IL-1beta
IL-1Ra
IL-6
IL-6R
IL-8
IL-8R
Stimuleaz proliferarea
angiogenic.
Efecte chemotactice i
angiogenice.
Promoveaz
creterea celulelor
tumorale.
VEGF n glioblastoame
Factorii de transcriere care pot s supraregleze transcrierea VEGF sunt: HIF, protooncogena ETS-1 i STAT-3 (Loeffler S, 2005)90. Proteinele ETS activeaz multe gene implicate
n angiogenez, inclusiv cele care regleaz VEGFR-1 i VEGFR-2, integrina beta3, unele MMP
i urokinaza - tip activator de plasminogen (uPA) (Sahin A, 2005)91. Cu toate acestea, VEGF
poate induce expresia ETS-1 n celulele glioamelor, astfel formnd o posibil bucl autocrin
(Sahin A, 2005)91. n consecin, ETS-1 este exprimat mai frecvent n GBM comparativ cu
astrocitoamele de grad sczut, fiind cel mai vizibil observate n structurile glomeruloide din
GBM (Sahin A, 2005)91. n plus fa de factorii de transcriere, o varietate de factori de cretere,
pot supraregla expresia VEGF, inclusiv TGF-b, EGF, PDGF-B i FGF (Loeffler S, 2005; Guo P,
2003)90, 92.
ARNm pentru VEGF-A este puternic exprimat n multe tumori umane (Dvorak HF, 2002)87,
inclusiv n celulele pseudopalisadice din jurul zonelor necrotice de la nivelul GBM. Un spectru
larg de oncogene este asociat cu supraregularea VEGF-A, inclusiv Ras, erbB-2/Her2, EGFR
activat i bcr-abl (Kerbel R, 2002)93. Efectul Ras asupra expresiei VEGF poate fi mediat prin
intermediul cii de semnalizare Ras-Raf-kinaza (MAPK).
Efectele biologice ale VEGF sunt mediate prin diverse ci de semnalizare. VEGF
promoveaz proliferarea endoteliului prin activarea cii MAPK (Doanes AM, 1999)94. VEGF
mbuntete, de asemenea, permeabilitatea vascular prin cascada de semnalizare MAPK, prin
rearanjarea complexelor cadherin / catenin i slbirea jonciunilor aderente ntre celulele
endoteliale. n afar MAPK i cilor de semnalizare Akt i eNOS sunt de asemenea implicate n
medierea permeabilitii vasculare (Lal BK, 2001)95.
bFGF n glioblastoame
Familia de proteine FGF i receptorii lor sunt supraexprimai n diferite tipuri de cancer.
La nivelul glioblastoamelor bFGF este exprimat deopotriv de celulele tumorale ct i n vasele
de snge (Karcher S, 2006)99. FGFR1 este supraexprimat n celulele tumorale i n celulele
endoteliale, n timp ce FGFR4 este exprimat n primul rnd n celulele tumorale (Tate MC,
2009)100. Legarea FGF de receptorii specifici determin transfosforilarea i activarea tirozin
kinazei intrinseci, care rezult n transducia semnalului. Ambele forme aFGF i bFGF sunt
suprareglate n glioblastoame i sunt responsabile pentru rezistena celulelor endoteliale la
apoptoz (Alavi A, 2003)101. Efectul anti-apoptotic al bFGF este mediat prin creterea expresiei
de Bcl-XL i Bcl-2, prin intermediul cilor de semnalizare MEK-dependente (Pardo OE,
2002)102. bFGF mrete efectul angiogenic VEGF-mediat prin inducerea expresiei VEGF
(Yoshiji H, 2002)103. n plus, bFGF stimuleaz i expresia VEGFR n celulele endoteliale.
Similare cu VEGF, aFGF i bFGF induc proliferarea celulelor endoteliale i a migraiei. n plus,
activarea FGF conduce la remodelarea ECM i degradarea membranei bazale prin inducerea
17
produciei de plasminogen activator, colagenaz i MMP-uri n celulele endoteliale (Wonga

MLH, 2009)104.
S-a demonstrat c liniile celulare de glioame ct i glioamele umane, exprim o cantitate
semnificativ de ARNm pentru bFGF, expresie ce a fost asociat cu rata de cretere a glioamelor
maligne (Peles E, 2004)105. Mai mult dect att, FGF-2 a fost n mod repetat, localizat n cadrul
compartimentului microvascular din glioame (Tuettenberg J., 2006)106.
Oricum rolul precis al FGF n angiogenezei tumoral asociat rmne s fie elucidat; cu
toate acestea, ar putea avea implicaii clinice importante, avnd n vedere constatarea c nivelul
seric al bFGF este ridicat la pacieni a cror tumori (glioame) scap tratamentului cu inhibitori al
receptorilor VEGF - AZD2171 (Tate MC, 2009)107.
Interleukina 1 (IL-1)
IL-1 se refer la un grup format din 3 polipeptide (interleukina-1, interleukin-1 i
receptorul antagonist IL-1Ra) implicate n principal n procese inflamatorii, dar avnd de
asemenea i diverse proprieti la nivel imunitar, n degradare ct i n promovare creterii
celulare.
Switch-ul angiogenic este un eveniment genetic discret care duce la modificarea
echilibrului local ntre factorii pro- i anti-angiogenici, factori produi de celulele tumorale,
precum i de celulele stromale din jur i leucocitele infiltrante. n diferite modele experimentale,
IL-1 crete invazia tumoral i metastazarea. De exemplu, expresia IL-1 la situsul de dezvoltare
tumoral amplific expresia molecule de adeziune pe celulele endoteliale i maligne i faciliteaz
invazia celulelor maligne n circulaie ct i diseminarea lor la nivelul altor esuturilor de la
distan. IL-1 recombinant stimuleaz proliferarea celulelor endoteliale, expresia moleculelor de
adeziune i producerea de citokine i molecule mediatoare ale inflamaiei. Este, de asemenea,
evaluat dac inhibarea IL-1 activitat de IL-1Ra poate funciona ca un agent anti-tumoral prin
inhibarea angiogenezei. La nivel cerebral, citokine neuroinflammatorii afecteaz creterea i
diferenierea att a celulelor gliale normale, ct i a celule maligne i s-a dovedit ca IL-1 este
secretat de majoritatea celulelor din glioblastoame (Paugh BS, 2009)108.
IL-6 este o citokin pleiotropic avnd atribuite multe efecte, inclusiv stimularea
reactanilor de faz acut, reglarea rspunsul imun, a inflamaie, implicarea n angiogenez i
activarea osteoclastelor (Hong DS, 2007)109.
Valori crescute ale IL-6 au fost asociate cu stadii avansate de boal ct i cu un
prognostic sczut n multiple neoplasmele, inclusiv cancerul de prostat (George DJ, 2005)111,
limfom non-Hodgkin (el-Far M, 2004)112, tumori cerebrale i ale gtului, carcinomul cu celule
scuamoase (Riedel F, 2005)113, cancerul de sn (Knupfer H, 2007)114, melanom (Soubrane C,
2005)115, i mielom multiplu (Lauta VM, 2003)116. Ulterior s-a emis ipoteza conform creia
nivelurile crescute de IL-6 ct i sIL-6R ar fi legate de agresivitatea tumoral. Aceste constatri
au anticipat apariia unei noi inte terapeutice n cancer i astfel apariia unor noi medicamente
anti-IL-6 (Saidi A, 2009)117.
18
Citokina IL-6 este sintetizat la nivelul glioamelor i expresia ei crescut este corelat cu
comportamentul malign al acestor tumori. IL-6 induce activarea transcripiei pentru VEGF i
regleaz activitatea promotorului pentru VEGF prin intermediul interaciunii directe cu STAT3
(Loeffler S, 2005; Rolhion C, 2001)90, 118. Expresia IL-6 este crescut la nivelul liniilor celulare
de glioame umane ct i la pacienii diagnosticai cu aceast patologie, aceast cretere fiind
corelat cu gradul histopatologic al neoplasmului (Scium G, 2010)119.
IL-6 contribuie la progresia tumoral i la rezistena celulelor la apoptoz, la nivelul
tumorilor cerebrale prin:
(a) controlarea maturrii finale a celulele B n celule productoare de anticorpi, n continuare
stimulnd sinteza de imunoglobuline de plasmocite. A fost descris asocierea rspunsului imun
mediat umoral cu glioamele, ct i volumul mare de complexe imune identificate n serul
pacienilor, fapt ce s-a corelat cu un prognostic sczut.
(b) stimularea activrii celulelor NK i generarea de limfocite-T citotoxice;
(c) acionnd ca un factor de stimulare al hepatocitelor promoveaz sinteza proteinelor
plasmatice hepatice cunoscute sub numele de proteine de faz acut (Scium G, 2010)119.
Mai multe studii au sugerat un posibil rol pentru IL-6 n patogeneza tumorilor astrocitare.
IL-6 este un factor mitogenic pentru astrocite i mpreun cu receptorul sau solubil (sIL-6Ra),
induce o glioz masiv reactiv n oareci dublu transgenici IL-6/IL-6Ra (Weissenberger, J.
2004)120. Supraexprimarea IL-6 n astrocitoame apare prin amplificarea genei pentru IL-6,
ulterior promovnd creterea celulelor tumorale gliale printr-un mecanism auto/paracrin. Studiile
au artat c stimularea celulelor astrocitare cu C3a, C5a, C3aR peptidic i agoniti C5aR induce
o cretere a nivelului de ARNm pentru IL-6. Producerea de IL-6 de ctre astrocitele umane
normale stimuleaz, de asemenea, secreia de IL-1 (Scium G, 2010)119. ntr-un model
experimental de oarece - formare spontan de astrocitom, s-a demonstrat c IL-6 promovez
dezvoltarea tumoral prin activarea STAT3 i nivelul de activare al STAT3 a fost gsit crescut,
n corelaie cu gradul histopatologic. n plus, suprimarea expresie de IL-6 determin reprimarea
formrii tumorilor astrocitare la oareci transgenici GFAP-v-src (Graf, M., 2001)121.
Sasaki A. et al n 2001 au ajuns la concluzia c IL-6 produs n esutul tumoral poate fi
implicat n progresia tumoral n glioamele cu grad nalt de invazivitate, dar nu n cele cu grad
sczut, i c expresia genic pentru IL-6 este strns corelat cu expresia IL-1 la nivelul
biopsiilor, xenogrefelor ct i n culturi de glioame umane122.
Civa membri ai familiei de interleukine au fost gsii responsabili pentru inhibarea
angiogenezei. In vivo IL-4 reduce neovascularizaia indus de bFGF i blocheaz migrarea
celulelor endoteliale in vitro (Volpert OV, 1998)126. n plus, IL-12 suprim expresia ARNm
pentru VEGF, bFGF i MMP-9 (Duda DG, 2000; Oshikawa K, 2001)127, 128. IL-10 realizeaz, de
asemenea, scderea sintezei pentru VEGF, IL-1b, TNF-a, IL-6, i MMP-9 n macrofagele
asociate tumorale (Huang S, 1999)129.
Citokinele proinflamatorii IFN, IL-1, TNF i IL-6 blocheaz proliferarea tumoral.
Interleukina 8 (IL-8) este o alt citokin implicat n dezvoltarea tumorilor cerebrale
prin ambele proprieti ale sale: chemotactice i angiogenice (Rosenkilde, M.M., 2004)123.
Expresia sa este iniiat timpuriu, n dezvoltarea astrocitomul, prin inducerea de stimuli
19
inflamatorii i crete mai trziu, n progresia tumorii datorit scderii presiunii oxigenului n
microenviroment (Scium G, 2010)119.
IL-8 este o citokin produs la nivelul glioblastoame i expresia ei crescut (mRNA i
expresia proteic) este corelat cu comportamentul malign al acestor tumori (Brat DJ, 2005)124.
IL-8 stimuleaz angiogeneza prin interaciunea cu receptorul 1 i 2 de chemokine C-X-C
(CXCR1, CXCR2) i receptorul Duffy pentru citokine (DARC). Expresia DARC a fost detectat
n celulele endoteliale asociate tumorilor, n timp ce CXCR1 i CXCR2 se gsesc n infiltratele
leucocitare din apropierea vaselor de snge (Brat, D.J., 2005)124. IL-8 este implicat n numeroase
procese biologice dintre care cele mai importante sunt angiogeneza, chemotaxia i activare
leucocitelor prin funcii paracrine. IL-8 este probabil un inductor independent de formare
tubular a celulelor endoteliale. Expresia IL-8 este suprareglat n timpul hipoxiei, iar acest
lucru este mediat de situsul AP-1 de pe promotorul pentru IL-8 (Sciume G.,2010)119. De
asemenea, este posibil ca sinteza IL-8 sa fie crescut datorit activrii EGFR prin intermediul
transduciei semnalului dependent de NF-kB.
In vitro, pe liniile celulare de glioblastoame s-a constatat exprimarea constitutiv a
ARNm pentru IL-8 ct i secreia proteinei IL-8. Studiile in vivo au demonstrat prezena
proteinei i ARNm pentru IL-8 n astrocitoamele de grad sczut, astrocitoamele anaplazice,
glioblastoame i n fluidele din chisturile cerebrale (Sciume G.,2010)119. Secreia de IL-8,
stimulat de IL-1, TNF i IL-17 poate fi un factor-cheie implicat n determinarea infiltratelor
limfoide observate n tumorile cerebrale. n plus, a fost demonstrat c nivelurile intracavitare
crescute de IL-8 sunt corelate cu un timp mai scurt de supravieuire (Salmaggi, A., 2003)125.
20
Capitolul IV Proteomica i biomarkerii
PROTEOMICA I BIOMARKERII LA NIVELUL TUMORILOR

INTRACRANIENE
Introducere
Dogma central a biologiei moleculare descrie transferul de informaii de la acidului
dezoxiribonucleic (ADN) la proteine (Crick, 1970)146. Punctul de plecare este genomul, i anume
setul complet de ADN dintr-un organism. n ADN este codat ntreaga informaie ereditar a
organismului i ca o parte fundamental a diviziunii celulare, ea dispune de capacitatea de a se
duplica printr-un procesul de replicare. Genomului este alctuit din 20.000-25.000 gene
codificatoare de proteine (Collins et al., 2004)147, care rmn statice pe tot parcursul vieii. Prin
procesul de transcriere, aceast informaie este la rndul su, transferat la ARN-ul mesager
(ARNm). Procesul de transcriere este receptiv la o varietate de factori externi, astfel transcrierea
genelor care codific pentru anumite proteine poate fi reglat up sau down ca urmare a unor
comunicri celul-celul sau de factori de stres exogeni ce acioneaz asupra celulelor. n
consecin, i n contrast cu genomul, setul de molecule ARNm prezent ntr-o celul sau un
organism (adic transcriptomului) este dinamic i depinde de diferitele caracteristici ale
mediului. Informaia codat n moleculele de ARNm este n cele din urm transmis la proteine
printr-un procesul de traducere. Proteinele sunt la rndul lor modulatorii principali pentru
majoritatea proceselor biologice, inclusiv pentru cele de replicare, transcriere i traducere. Cu
toate acestea, spre deosebire de ADN i ARN, proteine nu pot reproduce informaia codificat, n
sensul c fluxul de informaii este unidirecional. n similitudine cu genomul i
transcriptomului, un set complet de proteine este menionat ca proteom. Mai mult dect att,
aceste entiti biologice (de exemplu, genomul, transcriptomului i proteomul) sunt de obicei
completate de metabolom, ceea ce reprezint un set complet de metabolii, cu greutate
molecular mic.
Dogma central a biologiei
moleculare
Replicare
Metabolii
Transcripie
ADN
Translaie
ARN
Proteina
Genom
Transcriptom
Proteom
Genomic
Transcritomic
Proteomic
Metabolom
Metabolomic
Figura 4.1. Dogma central a biologiei moleculare i domeniile conexe de cercetare, cascada
omic".
21
Visul de a avea secvenierea complet a genomului - uman i nu numai - este de mult o

realitate. Oricum, ceea ce urmeaz a se realiza reprezint o cale lung i anevoioas de
dezvluire a complexitii sistemelor biologice n care sunt implicate aproximativ jumtate de
milion de proteine.
Unul din scopurile majore/principale ale epocii post-genomice este elucidarea
structurilor, funciilor i proprietilor biochimice ale tuturor proteinelor. Acest lucru devine o
sarcin descurajatoare avnd n vedere estimarea conform creia exist ntre 100.000 i 500.000
proteine individuale care rezult din splicing-ul alternativ al celor aproximativ 30.000 gene
existente la nivelul genomului uman. Deoarece proteomul celular are profil dinamic - existnd
schimbri datorate rspunsurilor la variate semnale intra- sau extra-celulare, modificri
post-translaionale, translocri, interaciuni protein-protein i protein-acid nucleic,
sarcina devine i mai complex.
Termenul de proteom a fost introdus de Wilkins n 1996148 i l-a descris ca fiind the
total PROTEin complement of a genOME. Lottspeich F. a extins aceast definiie, spunnd
c proteomul reprezint coninutul total de proteine al unui organism sau al unei celule la un
moment dat, n anumite condiii de mediu149.
Proteomica cuprinde studiul proteinelor exprimate profil proteic, inclusiv
identificarea i elucidarea interdependenele structur-funcie care definesc condiiile de
normalitate sau patologie. Informaiile de la nivelul proteomul sunt eseniale pentru nelegerea
funciei fenotipului celular i a rolului su n condiii normale sau patologice. Deoarece
evenimentele post-translationale, ct i o evaluare precis a nivelului de proteine nu poate fi
ntotdeauna realizat de analiza ARN-ului mesager, proteomica, utilizat mpreun cu genomica,
pot oferi o nelegere global a mecanismelor celulare i moleculare care stau la baza proceselor
patologice. Provocarea n descifrarea proteomul este dezvoltarea i integrarea de instrumente
analitice, combinate cu bioinformatica fapt care furnizeaz informatii rapide, de mare
acuratee, sensibile i reproductibile. Scopul final al proteomicii este realizarea screeningului de
biomarkeri pentru detecia precoce, diagnosticul i prognosticul diferitelor patologii, ct i
evaluarea rspunsului la tratament.
Avnd n vedere faptul c patologia tumoral reprezint a doua cauz de deces din
lume, depit fiind doar de bolile cardiovasculare, realizarea unui screening al biomarkerilor
este esenial. Descoperirea i dezvoltarea unor sisteme de diagnosticare i terapie mai bune sunt
urgent necesare pentru a lupta cu aceast patologie. Majoritatea testele actuale de diagnostic
realizeaz depistarea cancerul n stadii avansate, atunci cnd tratamentul este adesea dificil i
prognosticul este slab. Numeroase studii au artat c depistarea precoce a cancerului crete
opiunile de tratament i mbuntete rata de supravieuire. Noi biomarkeri pot fi
descoperii prin compararea diferenelor dintre expresiile profilelor proteice - din ser sau
extras din esut, din probe de la pacieni cu cancer i/sau persoane sntoase (martori/control).
Entitile biologice proteinele, pot fi studiate prin dou abordri diferite:
- fie studiul este conceput pentru a investiga una sau cteva molecule specifice ntr-un set (gene,
proteine, etc), bazat pe o ipotez preconceput conform creia moleculele specifice conin
informaii importante FISHING EXPEDITION.
22
- fie, alternativ, studiul este proiectat pentru a realiza un screening global al acestor entiti ntrun mod imparial DISCOVERY SCIENCE (Baak JPA., 2005)150.
Prima abordarea a fost utilizat n mod tradiional n cercetarea de biologie molecular i
a identificat cu succes cele mai multe dintre componentele diverselor entiti biologice. Cu toate
acestea, ea nu ia n considerare marea complexitate a sistemului biologic. Odat cu apariia
tehnologilor care permit screening-ul global, abordarea aceasta din urm a devenit tot mai
popular. Astfel, se sper s se obin o perspectiv asupra complexitii sistemului printr-o
abordare general, n cazul n care toate elementele constitutive, sau o parte ct mai mare posibil
a ntregului sistem, sa fie cuantificat simultan.
Pentru fiecare dintre entitile biologice menionate, exist un domeniu de cercetare
asociat, ce se preocup cu investigarea acesta, la nivel global. Domenii de cercetare sunt: (i)
genomica, (ii) transcriptomica, (iii) proteomica, i (iv) metabolomica. Acestea au fost menionate
n continuare "cascada omic", iar acestea constituie fundamentul pentru sistemele biologice, n
cazul n care metabolomica este considerat a fi mai departe n aval i, ca atare, reflect
evenimentele proceselor din amonte (Dettmer K., 2007)151, (Dunn & Ellis, 2005)152 (figura 4.1).
Avnd n vedere c genomul este static, la om fiind format din aproximativ 20.00025.000 gene, proteomul este dinamic, ca rspuns la factorii de mediu i const n > 500.000
proteine. Discrepana se datoreaz n mare parte variantelor alternative de splicing i
modificrilor posttranslaionale. n scopul de a cerceta efectele tratamentului este evident c
trebuie s se studieze evenimentele aprute n aval de genom. Studierea proteomului deine alte
avantaje n plus fa de studierea genomului, deoarece proteinele sunt componentele biologic
active. n acelai timp, relaia dintre nivelul de transcripie al unei gene specifice (de exemplu,
abundena unei molecule specifice de ARNm), i abundena proteinei corespunztoare, s-a fost
dovedit a fi slab (Lottspeich F., 2010)153. Cu toate acestea, este un domeniu de studiu destul de
nou i nc nu exist multe tehnici care s permit o analiz cu adevrat global a proteomului,
aa cum se ntmpl pentru transcriptom.
Dimensiunea metabolomului la plante este estimata la 200.000 de molecule, n timp ce la
om se speculeaza s fie cu mult mai mare (Dunn WB., 2005)152. Aa cum am menionat mai sus
i ilustrat n figura 4.1, metabolomul pot fi considerat ca n aval fa de procesele biologice
moleculare, ca atare aceasta constituie o legtur cheie ntre genotip i fenotip. Este de ateptat
ca metabolomul s reflecte statusul celular, chiar mai direct dect transcriptomului sau proteomul
(Dunn WB., 2005)152.
n mod tradiional, au fost recunoscute trei tipuri de abordri proteomice:
(1) Expression proteomics - studiul cantitativ al expresiei proteice ntre probe care difer prin
anumite variabile (tumoral/peritumoral, proba/control). Astfel se realizeaz identificarea
markerilor patologiei studiate (markeri tumorali) care ar putea fi importani n depistarea
precoce, diagnosticului i n monitorizarea eficacitii tratamentului i n cele din urm duce la
identificarea de noi scheme terapeutice. Informaiile obinute prin aceast abordare poate
identifica noi proteine specifice anumitor patologii.
(2) Functional proteomics - include analiza interaciunilor protein-protein sau proteinADN/ARN;
23
(3) Structural proteomics - scopul principal al acestei abordri este de a schia structura
complexelor proteice sau a proteinelor prezente n structurile celulare, cum ar fi mitocondrii,
nuclee (Lefkovits I., 2003)154, (Graves PR., 2002)155.
Dei cele 2 abordri majore pentru descoperirea de biomarkeri exist de mult timp, nc
este prezent o anumit ambiguitate cu privire la utilizarea termenilor "top-down - de sus n jos"
i "bottom-up - de jos n sus" n proteomic.
Pe de o parte, aceti termeni desemneaz entitatea care este supus tehnicii de separare
primar. n acest sens, se realizeaz o prim separare de proteine prin electroforez n gel (GE),
urmat de digestia proteolitica n-gel i analiz cromatografica lichid (LC)-MS a peptidelor
poate fi considerat o abordare top-down, deoarece entitile iniial separate sunt proteine.
Pe de alt parte, top-down i bottom-up se refer la entitile introduse n spectrometrul
de mas. Aceasta este terminologia utilizat de ctre Reid i McLuckey n cadrul review-ului lor
de caracterizare a proteinelor i ilustrat n imaginea de mai jos (Reid GE., 2002)156 (figura 4.3).
Figura 4.3. Reprezentare schematic a celor 2 tipuri de abordri proteomice: top-down i

bottom-up.
n proteomica bottom-up, analiii introdui n spectrometru de mas sunt peptide
generate prin scindarea enzimatic a una sau mai multor proteine. Proteinele pot fi separate
iniial prin 2D-GE sau cromatografie, caz n care proba care va conine doar una sau cteva
proteine.
Alternativ, un amestec complex de proteine pot fi digerat iniial la nivel de peptide, apoi
separate prin cromatografie on-line cuplat cu spectrometrie de mas electrospray (ESI-MS). n
acest ultim caz, digestia poate genera/conine mii sau sute de mii de peptide, i necesit separarea
n dou sau mai multe dimensiuni cromatografice nainte de analiza MS. Identitatea proteinei
originale este determinat prin compararea spectrelor de mas peptidic cu calcularea teoretic a
masei peptidelor ntr-o baz de date de proteomic. Exist dou abordri pentru identificarea
proteinelor folosind abordarea bottom-up, peptide mass fingerprinting i MS tandem (MS-MS).
In concluzie:
- analiza proteinelor intacte (top-down proteomics);
- analiza unui amestec complex de peptide, rezultat din digestia proteinelor (bottom-up
proteomics).
24
Figura 4.4. Prezentarea fluxului de activiti pentru celor 2 tipuri de abordri proteomice:
top-down i bottom-up.
Aplicaii ale tehnicilor proteomice n studiul cancerului
n practica curent, proteomica cuprinde patru aplicaii principale (Plebani M., 2005)157.
1. Protein mining
Scopul pentru mining proteome este de a identifica ct mai multe posibil dintre
componentele proteomului, pentru a cataloga proteomul direct, mai degrab dect de a deduce
compoziia sa de la expresia genelor (Gygi SP., 2000)158.
2. (Differential) Protein expression profile
Acesta implic identificarea de proteine ntr-o prob special, n funcie de starea la un
anumit moment al organismului sau n funcie de expunerea la un medicament, stimul chimic sau
fizic. Principala sarcin n protein expression profiling este de a msura expresia unui set de
proteine, n dou probe seriale, i apoi compararea acestora (Gasteiger E., 2005)159.
3. Protein network mapping
Aceasta este o abordare proteomic pentru a determina cum interacioneaz proteine
unele cu altele n sistemele vii, i, prin urmare, se determin funcia reelelor de proteine (Yates,
2000)160. Dei cercetarea proteomic are multe domenii de aplicabilitate, variind de la boli
cardiovasculare (Ballantyne CM., 2001)161, (Zerkowski HR., 2004)162 i neuromusculare
(Pierson J., 2004)163 la transplantului de organe (Borozdenkova S., 2004)164 i infertilitate
(Bohring G., 2003)165, zona cea mai promitoare este descoperirea i identificarea de noi
biomarkeri pentru diagnosticul cancerului (Clarke W., 2003)166. Este de ateptat c, va fi posibil
s reduc intervalul de timp dintre debutul bolii i al descoperirii sale, i acest lucru este de o
importan deosebit, avnd n vedere c cel mai important factor n managementul majoritii
cancerelor const n stadiul clinic la diagnostic (Li G., 2011)167, (Rhea JM., 2011)168. Prin
urmare, exist o mare nevoie pentru a descoperi noi biomarkeri i transferul lor pentru utilizarea
clinic de rutin.
4. Proteomics n biomarker discovery (protein modification mapping)
Biomarkerii furnizeaz o abordare puternic i dinamic n nelegerea spectrului de boli
maligne, cu aplicaii n epidemiologia observaional i analitic, studii clinice randomizate,
25
screening, diagnostic i prognoz. Biomarkerul se refer la o substan care reprezint un indiciu

al prezenei cancerului n organism i au un potenial imens n biologia tumorii, n nelegerea
mecanismelor care se afl n spatele malignitii. Dezvoltarea rapid i integrarea de instrumente
analitice care combin reproductibilitate i sensibilitate au accelerat domeniul proteomicii.
BIOMARKERII
nc de la nceput, atunci cand proteomica a demonstrat ca are capacitatea de a
caracteriza un numr mare de proteine i modificrile lor post-translationale (MPT), inclusiv
identificarea i cuantificarea lor, aceasta a fost aplicat n diverse domenii ale tiinei, variind de
la descifrarea mecanismelor moleculare patologice, la caracterizarea de noi inte terapeutice i la
descoperirea de potenial biomarkeri n diagnostic. Proteomica diferenial este o disciplin
tiinific care identific proteinele asociate cu o patologie, prin intermediul nivelurilor
modificate de expresie ntre control i patologic (ex. biomarkeri candidaii).
ntr-adevr, descoperirea de biomarkeri n esuturi i biofluide este n mod clar una
dintre zonele cu un potenial enorm n cercetarea medical din zilele noastre. Concret,
modificrile post-translationale inclusiv fosforilarea, glicozilarea, oxidarea, etc. sunt procese de
un deosebit interes n domeniu, din moment ce s-a demonstrat a fi relevante pentru patologia
multor boli i inte terapeutice utile.
Proteomica clinic are mari perspective de dezvoltare n medicin cu noile tipuri de
tehnologii proteomice combinate cu bioinformatica avansat, utilizate n prezent pentru a
identifica semnturile moleculare ale bolilor, bazate pe cascadele de semnalizare.
Termenul de biomarker a fost introdus n 1989, definiia n prezent uzitat aparinnd
unui grup de cercettori de la National Institutes of Health. Conform acestei definiii,
biomarkerul/markerul biologic reprezint o caracteristic msurat obiectiv, avnd
semnificaia de indicator al proceselor biologice normale, al proceselor patologice, sau care
evalueaz rspunsul la o intervenie terapeutic.
n plus, biomarkerul poate fi definit ca o molecul derivat in vivo ce prezent o abatere
semnificativ de la nivelurile normale/medii, n asociere cu condiii specifice de sntate. Exist
3 tipuri generale de biomarkeri acizii nucleici, proteinele i metaboliii. Din punct de vedere
biochimic, un biomarker este adesea o protein, a crei prezen sau caracteristici cantitative
sunt msurate de obicei prin metode bazate pe anticorpi (Martins-de-Souza D., 2010)169.
n funcie de scopul n care sunt folosii, biomarkerii pot fi clasificai n:
biomarkeri antecedeni/de risc: identific riscul de a face boala;
biomarkeri de screening /detecie timpurie: screening pentru boala subclinic;
biomarkeri diagnostici: folosii pentru diagnosticul bolii clinic manifeste;
biomarkeri pentru stadializarea bolii: caracterizeaz severitatea bolii;
biomarkeri pentru prognostic: pot prezice un anumit curs al bolii, inclusiv recurenele
i monitorizarea eficienei terapiei (Tainsky MA., 2009)170.
26
Figura 4.5. Clasificarea biomarkerilor - reprezentare schematic.

Un biomarker ideal pentru diagnostic ar trebui s permit stabilirea imparial a
diagnosticului, n special la pacienii fr simptome specifice. Biomarkerii, prin urmare, ar trebui
s ndeplineasc mai multe criterii:
(1) specificitate crescut pentru o anumit boal (puine teste fals pozitive);
(2) sensibilitate mare (puine teste fals negative);
(3) uurina de utilizare;
(4) standardizare;
(5) claritatea i lizibilitatea rezultatelor pentru clinicieni. Toi aceti factori vor afecta
performana biomarkerului n condiii clinice. Din pcate, multe din aceste cerine nu sunt
ndeplinite n prezent de toi biomarkerilor aprobai i utilizai (Anderson L., 2005)171. Teoretic,
orice boal poate fi detectata i caracterizata prin biomarkerii si unici.
Cu toate acestea, dup cum poate fi anticipat, innd cont de complexitatea unui sistem
biologic, n multe cazuri nu exist niciun biomarker unic, care s dein acest potenial
indicativ de la sine. Mai degrab ar putea exista paneluri complexe de biomarkeri (Wulfkuhle
et al., 2003)172. O imagine mai complet pentru un set de biomarkeri este reprezentat de un set
de proteine supra- i sub-exprimate i/sau proteine modificate post-translaional, care difer n
stare patologic fa de normal (Wulfkuhle et al., 2003)173.
n funcie de caracteristicile setului de biomarkeri, acetia ar putea fi apoi folosii ca
indicatori pentru diverse manifestri fiziologice, precum detectarea timpurie a bolii, sensibilitatea
la tratament, prognostic, sau ca msur de rspuns la tratament.
Descoperirea de seturi de proteine biomarker pentru diagnostic i n scopuri terapeutice
este n prezent o zon de interes major n medicin (Garcia-Foncillas J., 2006)174, (Kelleher MT.,
2009)175. Proteinele i peptidele tisulare "eliberate", de exemplu, de la nivel tumoral, n biofluide
uor accesibile n clinic (ex. sngele) au dus la posibilitatea de a diagnostica timpuriu boala sau
de monitorizare a rspunsului la tratament, pur i simplu prin testarea prezenei biomarkerilor
bolii respective n aceste biofluide. Din marea varietate de fluide corporale disponibile, snge
27
este cel mai utilizat, pentru c este uor accesibil; recoltarea presupune o tehnic minim invaziv,
cu risc sczut, i prelucrarea sngelui la nivelul de ser/plasma este o tehnic de rutin n
laboratoarele clinice.
Scopul major al proteomicii este screeningul biomarkerilor pentru detecia precoce,
diagnosticul i prognosticul tumoral, ct i evaluarea rspunsului la tratament.
Tehnicile prin care se realizeaz profilul proteomic, identificarea i validarea de
biomarkeri sunt ilustrate n figura de mai jos.
Etape n studiul biomarkerilor: identificarea, verificarea, calificarea (validarea)
biomarkeri, implementarea preclinic i implementarea clinic.
Figura 4.7. Fluxulul de lucru n studiul biomarkerilor.
TEHNOLOGII PROTEOMICE
Domeniul proteomicii cuprinde metode, tehnologii i abordri specifice pentru studierea
variaiilor proteomului.
Modul de preparare al probelor depinde de scopul cercetrii i reprezint cheia succesului
unui experiment. Prin definiie, n proteomic este inevitabil s ntlneti amestecuri complexe
de proteine. Prin urmare, metodele folosite n continuare, n experimente, trebuie s rezolve
acest problem, a amestecurilor proteice, astfel nct proteinele s poat fi vizualizate,
identificate i caracterizate.
Tehnologiile proteomice pot fi mprite n:
- gel-based 2D-PAGE, 2D-DIGE;
- gel-free LC-MS/MS, SILAC, ICAT, iTRAQ, SELDI-TOF-MS, MALDI-TOF-MS, etc
(Chiou SH., 2011)179.
Tehnica
2D, 2-DE,
2D-PAGE
28
Principii
Separarea proteinelor ntr-un
gel, n funcie de punctul
izoelectric i greutatea
molecular; gelurile sunt
Avantaje
Separare nalt (mii de
proteine /gel); acces la
modificrile posttranslaionale (PTM)
Dezavantaje
Low throughput (o prob pe gel);
laborioas, dificil de automatizat;
nereproductibilitate ntre geluri;
rezoluie sczut pentru proteinele cu
colorate i intensitile
spoturilor din probe sunt
comparate ntre diferite geluri.
2D-DIGE
Protein
array
LC-MS/MS
MALDITOF-MS
SELDITOF-MS
29
Separarea proteinelor realizeaz msurarea a 3

probe/gel, fiecare fiind
marcat cu un alt fluorocrom
(Cy2, Cy3, Cy5) i intensitatea
fiecrui spot din gel este
msurat la lungimi de und
specifice fiecrui fluorocrom
Legarea unei proteine
specifice (clasa), dintr-o prob
la
anumite
sonde
(ex.
anticorpi) pentru forward
microarray; invers, legarea
unei probe specifice la
proteine int (clasa) reverse
microarray;
detectarea
proteinelor legate prin marcare
direct (fluorescent) sau prin
marcarea
anticorpilor
secundari.
Separarea unui amestec de
peptide (rezultat al digestiei
proteinelor cu tripsin) de
ctre una, dou sau treidimensional LC i (online)
msurarea maselor peptidelor
prin MS-MS.
Aplicarea unui amestec de
proteine pe o placa de aur;
desorbia proteinelor din placa
de catre energia laser i
msurarea maselor proteinelor
i a intensitii peak-urilor prin
TOF;
comparaie
ntre
intensitile peak-urilor ntre
mai
multe
eantioane.
Varianta de MALDI-TOF MS
n care o parte selectat de
proteine dintr-un amestec
proteic este legat de o
suprafa cromatografic
specific i restul de proteine
sunt splate.
Comparaie
direct
a
probelor, pe un singur gel,
astfel fiind o mai bun
reproductibilitate
comparativ cu 2D-PAGE
mase moeculare extreme i pentru

proteinele extrem acide sau bazice; nu
se realizeaz direct identificarea
proteinelor; cantitate mare de material
de nceput (50-100 g protein)
comparativ cu alte tehnici.
Low throughput (3 probe pe gel);
proteinele fr lizin nu pot fi legate.
High throughput n ceea ce

privete
numrul
de
sonde per matrice (forward)
sau numrul de probe per
matrice (revers); identificare
de biomarkeri.
Este necesar sinteza de sonde diferite;

identitatea sau clasa de proteine int
trebuie s fie cunoscut; reactivitate
ncruciat de sonde; insuficient legare
pentru proteine cu PTM.
Identificarea direct a cteva

sute
mai mult de 1000 proteine
(pentru trei-dimensional)
per proba de ctre analiza
MS-MS; acces la PTM.
Low throughput (o prob per aplicatie);

consumatoare de timp; detectarea de
ctre MS-MS de multe ori nu este
cuprinztoare,
astfel
complicnd
compararea a diferite probe.
High throughput (pn la

1563
de
probe
pe
placa); acces la PTM.
Este nevoie de fracionare probei

pentru eantioanele complexe (offline);
este necesara mai multa proba
biologica prima pentru fracionare
eantionului offline; impropriu pentru
proteine cu greutati moleculare mari
(>100 kDa).
High throughput (pn la 96

de
probe
pe
bioprocesor);
aplicarea
direct
a
ntregului
eantion (curatare rapida a
probei on-chip); acces la
PTM; cantitate mic de
proba la pornire.
Nepotrivit pentru analiza proteinelor cu

greutate molecular mare (>100 kDa);
limitat la detectarea proteinelor legate;
rezoluie i precizie de mas moleculara
mai mic dect, MALDI-TOF.
ANALIZA PROTEOMIC
INTRACRANIENE
LA
NIVELUL
TUMORILOR
Modificrile din structura, abundena, sau funcia proteinelor acioneaz ca un indicator

util n diferite patologii, nainte de apariia simptomelor clinice i, ca atare, sunt biomarkeri utili
de diagnostic i prognostic. Mecanismele care stau la baza unor boli precum cancerul sunt,
totui, destul de complicate i de aceea sunt implicate mai multe proteine supra- sau subexprimate. Acesta este motivul pentru care ipoteze recente sugereaz c detectarea unor seturi de
biomarkeri poate oferi sensibiliti i specificitati mai mari pentru diagnosticarea cancerului,
dect biomarkeri unici (Xiao Z, 2005)209.
Cele mai multe tumori intracraniene sunt diagnosticate i clasificate pe baza metodelor
histologice i sunt legate de schema de clasificare OMS, care este folosit ca o msur de
malignitate i ofer unele informaii de prognostic. Exist totui un grad de inconsecven n
cadrul procedurii de diagnosticare, n mare msur datorit heterogenitii tumorale i limitri
tehnicilor de histologie. Astfel, este dificil s se prevad modul n care pacienii individuali vor
rspunde la tratament, deoarece acest lucru difer de obicei chiar i pentru pacieni din cadrul
aceluiai subgrup patologic. n acest scop se ncearc identificarea biomarkerilor moleculari cu
capacitatea de anticipare, n special pentru a ajuta dezvoltarea i utilizarea tratamentelor
specifice.
Sunt necesare eforturi mrite n cercetarea neuro-oncologic pentru a atinge progrese
similare n eficacitatea tratamentului pentru tumorile intracraniene, progrese realizate deja pentru
alte tipuri de cancer n ultimii ani. n plus fa de nevoia urgent de a identifica noi inte
terapeutice mpotriva glioamelor maligne i tumorilor hipofizare, cutarea de biomarkeri la
nivelul glioamelor i tumorilor hipofizare, ct i identificarea profilului proteic n aceste
patologii va oferi o contribuie att de necesar n vederea optimizrii diagnosticul, prognosticul,
a deciziei de tratament i de evaluare a rspunsului la tratament. S-a ncercat, de-a lungul
ultimilor ani, realizarea studiului proteomic al glioamelor i tumorilor hipofizare la diferite
niveluri, inclusiv analiza proteomului la nivelul biopsiilor i al fluidelor corporale, ct i la
nivelul liniilor celulare i al modelelor animale.
n continuare voi oferi o examinare aprofundat cu privire la rezultatul mai multor studii
n ceea ce privete identificarea proteinelor, cu un accent pe metodele folosite i pe limitrile de
studii cu privire la descoperirea de biomarkeri. Aceasta este urmat de o perspectiv asupra
tehnologiilor noi i pe viitor contribuia potenial a proteomicii n sens larg, pentru nelegerea
biologiei glioamelor (Niclou SP.,2010)210.
PROTEOMICA N GLIOBLASTOAME
Biomarkerii serici/plasmatici au potenialul de a revoluiona procesul de diagnostic,
prognostic i monitorizare a rspunsului la tratament n cancer, datorit faptului c sngele este
obinut de la pacieni cu un minimum de invazivitate iar componentele sale sunt dinamice i pot
reflecta statusul normal sau patologic. Proteinele coninute la nivelul serului pot include: proteine
secretate de tumorile solide, imunoglobuline, citokine, hormoni peptidici/proteici, proteine
30
scurse din esut, care sunt proteine normal exprimate n celule, dar care pot fi eliberate n snge
ca rezultat al morii celulare (Somasundaram K, 2009)211.
Bolile sistemului nervos central (SNC) sunt adesea nsoite de modificri n compoziia
proteinelor din lichidului cefalorahidian (LCR), fapt ce a determinat intensificarea studiilor
acestui biofluid. Detecia noilor biomarkeri proteici prezeni n concentraii sczute la nivelul
biofluidelor este ngreunat de efectul de mascare al proteinelor abundente albumina i IgG,
de aceea se recomand depleia acestor proteine nainte de analiza proteomic.
Exista numeroase grupuri de cercetare in acest domeniu, dintre acestea amintesc pe Liu J
i colaboratorii (Liu J., 2005)212; Khwaja FW i colectivul (Khwaja FW., 2006)213, (Khwaja FW.,
2006)214 (Khwaja FW., 2007)215; Zhang H. et al (Zhang H., 2007)216; Petrik V. (Petrik V.,
2008)217, Schuhmann MU et al n (Schuhmann MU., 2010)218.
Analiza proteomic la nivel tisular este esenial n identificarea de biomarkeri la nivelul
tumorilor intracraniene, n special datorit faptului ca multe proteine-poteniali biomarkeri nu pot
depi bariera hematoencefalic i nu pot fi regsite astfel la nivelul biofluidelor. Lucrari precum
cele ale grupului condus de Iwadate Y. (Iwadate Y., 2004)219, (Iwadate Y., 2005)223, Furuta M.
(Furuta M., 2004)220, Schawartz (Schwartz SA., 2004)221, (Schwartz SA., 2005)226, Chumbalkar
VC (Chumbalkar VC., 2005)222, Wang Y. (Wang Y., 2005)224, Oderman F. et al (Oderman F.,
2005)225, Jiang R et al. (Jiang R., 2006)227, Li J et al. (Li J., 2006)228, (Li J., 2008)231, Khalil AA
(Khalil AA., 2007)229, Mustafa DA et al (Mustafa DA., 2007)230, An JH et al (An JH., 2009)232,
Melchior K. (Melchior K., 2009)233, Park CK (Park CK., 2009)234.
n urma analizei publicaiilor existente n domeniul proteomicii n glioblastoame pe
PubMed Deighton RF. a identificat 10 proteine menionate a fi modificate n cel puin 2
publicaii: prohibitin (PHB), alfa B cristalin (CRYAB/HSP20), serum albumin, epidermal
growth factor receptor (EGFR), phosphoprotein enriched n astrocytes (EA-15), RhoGDP
dissociator inhibitor (RhoGDI), apolipoproteina A1 (APOA1), glial fibrillary acidic protein
(GFAP), heat shock 70 kDa protein 5 (HSP70/HSPA5), protein disulfide isomerase 3
(PDIA3) (Deighton RF., 2010)235.
31
CAPITOLUL V - Materiale i metode
PARTEA PRACTIC
Materiale i metode
Scopul acestei lucrri a fost identificarea unor biomarkeri prin analiza profilului
angiogenic, al citokinelor i analiza profilului proteic, n vederea obinerii unui diagnostic
molecular performant, util n prognosticarea comportamentului biologic al tumorilor
intracraniene i optimizarea conduitei terapeutice.
n acest sens lucrarea de fa i-a propus s aduc unele contribuii privind:
- analiza profilului angiogenic prin tehnologia xMAP, ELISA i examenul
imunohistochimic,
- analiza profilului de citokine prin tehnologia xMAP,
- stabilirea profilului proteic prin tehnici proteomice - electroforeza bidimensional
(2D) i SELDI-ToF-MS (time of flight-mass spectrometry),
- identificarea de biomarkeri utili n diagnosticul tumorilor intracraniene.
Identificarea acestor biomarkeri, n corelaie cu markerii de angiogenez i profilul
citokinelor pro- i anti-inflamatorii ar putea oferi date utile n estimarea predictibilitii
comportamentului biologic al tumorilor cerebrale, n selectarea celor cu prognostic rezervat i
individualizarea strategiei terapeutice.
CAZUISTICA
Studiul a fost efectuat pe 66 cazuri de tumori hipofizare i 40 de glioame, selecionate din
cazuistica de patologie a Clinicii de Neurochirurgie a Spitalului Bagdasar-Arseni, Spitalului de
Urgenta ELIAS n perioada 2004-2010.
Au fost luate n studiu cazurile care au ndeplinit criteriile de includere n lotul de
pacieni. Toi pacienii, respectiv martorii luai n studiu au semnat fia de consimmnt
informat n ceea ce privete prelevarea i analiza probele biologice.
Materialul utilizat, reprezentnd fragmente de esut tumoral i peritumoral
(considerat control), a fost prelevat intraoperator i repartizat n tampoane specifice, necesare
prelucrrii ulterioare i pastrat la -800C pn la analiz.
Sngele venos periferic, provenind de la pacieni sau de la martori sntoi a fost
recoltat n tuburi sterile (Vacutainer System; Becton Dickinson), centrifugat la 2000 rpm timp de
10 minute, serul alicotat n tuburi de 0,5 mL i pastrat la -800C pn la determinare.
METODE DE INVESTIGAIE UTILIZATE
Prelucrarea i analiza materialului biologic s-a realizat prin metode clasice
imunohistochimie pentru evidenierea markerilor endoteliului vascular: VEGF i bFGF.
La nivel seric markerii angiogenici i citokinele implicate n angiogenez au fost
determinate prin metodele ELISA i tehnologia xMAP (Luminex200).
Pentru identificarea profilului proteic la nivel tisular, pentru glioblastoame s-au folosit
tehnici proteomice de nalt nivel precum electroforeza bidimensional (2DE) i SELDI-ToFMS.
32
Capitolul VI - Rezultate
REZULTATE
CARACTERISTICI GENERALE LOTURI PACIENI
Studiul a fost efectuat pe 3 loturi:
- un lot cuprinznd un numr de 66 de cazuri de tumori hipofizare;
- un lot cuprinznd un numr de 40 de cazuri de glioblastoame;
- un lot cuprinznd un numar de 33 de cazuri control,
cazuri selecionate din cazuistica de patologie a Clinicii de Neurochirurgie a Spitalului BagdasarArseni, a Spitalului de Urgen ELIAS sau din cazuistica de rutin a Institutului Naional "Victor
Babe".
Dintre acestea:
- tumorile hipofizare au provenit de la 27 de brbai i 39 de femei, remarcndu-se o uoar
diferen ntre cele 2 sexe. Vrsta depistrii tumorii hipofizare a fost cuprins ntre 18 73 de
ani. Repartiia cazurilor pe grupe de vrst evideniaz preponderena pentru decadele III, IV, V
cu un maxim de inciden la grupa de vrst 41-50 de ani (grafic 6.1).
Distributia cazurilor de tumori hipofizare pe grupe de varsta si sex
12
Nr. de cazuri
10
8
Nr. femei
Nr. brbai
0
11-20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
71-80
Grupe de v arsta
Grafic 6.1. Distribuia cazurilor de tumori hipofizare pe grupe de vrst i sex.

- glioblastoamele au provenit de la 24 de brbai i 16 femei, remarcndu-se o uoar diferen
ntre cele 2 sexe. Vrsta depistrii glioblastoamelor a fost cuprins ntre 20 80 de ani.
Repartiia cazurilor pe grupe de vrst evideniaz preponderena pentru decadele IV i V, cu un
maxim de inciden la grupele de vrst 41-50 i 51-60 de ani (table 6.2 i grafic 6.2).
33
Distributia cazurilor de glioblastoame pe grupe de varsta si sex

8
7
Nr. de cazuri
6
5
4
Nr. femei
Nr. brbai
3
2
1
0
11-20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
71-80
Grupe de varsta
Grafic 6.2. Distribuia cazurilor de glioblastoame pe grupe de vrst i sex.

martori (17 brbai i 16 femei), clinic sntoi, de la care s-a prelevat snge venos
periferic. Vrsta a fost cuprins ntre 19 62 de ani (tabel 6.3 i grafic 6.3).
Distributia martorilor pe grupe de varsta si sex

5
4,5
4
Nr. de cazuri
3,5
3
2,5
Nr. femei
Nr. brbai
2
1,5
1
0,5
0
11-20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
Grupe de varsta
Grafic 6.3. Distribuia martorilor/controalelor pe grupe de vrst i sex.
ANALIZA IMUNOHISTOCHIMIC
ANGIOGENICI
SERIC
FACTORILOR
Un aport deosebit n caracterizarea agresivitii glioamelor, ct i a invazivitii tumorilor

hipofizare l are evaluarea/determinarea profilului angiogenic, respectiv a factorilor angiogenici.
n acest scop s-a realizat analiza imunohistochimica, ELISA i xMAP array.
34
Analiza imunohistochimic la nivelul glioblastoamelor

Prin tehnica de imunohistochimie s-a observat expresia pozitiv pentru VEGF i bFGF la
nivelul glioblastoamelor.
Analiza imunohistochimic a demonstrat prezena expresiei VEGF i bFGF n
majoritatea cazurilor studiate, cu preponderen n tumorile cerebrale invazive, ceea ce concord
cu potenialul de proliferare Ki67. S-a remarcat reacie imunopozitiv comparabil pentru
VEGF i bFGF, n majoritatea cazurilor, att n ceea ce privete intensitatea reaciei ct i
numrul de celule imunoreactive (50-60% celule pozitive). n tumorile studiate, VEGF i bFGF
au prezentat o reacie intens pozitiv, difuz, att n endoteliul vascular ct i n celulele tumorale
(figurile de mai sus). Imunoreacia pentru VEGF a fost observat att la nivelul celulele
endoteliale ct i n cele tumorale, n procent mai ridicat n cele cu grad nalt de agresivitate.
bFGF a prezentat o imunoreacie mai pronunat dect VEGF n celulele tumorale, n
concordan cu gradul de agresivitate tumoral.
Determinarea seric a VEGF i bFGF la pacienii cu glioame

Sngele venos periferic a fost recoltat n tuburi sterile (Vacutainer System; Becton
Dickinson), centrifugat la 2.000 rpm timp de 10 minute i serul pstrat la -800C pn la
determinare. Pentru analiza factorilor angiogenici VEGF i bFGF prin ELISA au fost luate n
studiu 40 cazuri de pacieni diagnosticai cu glioame.
- Analiza VEGF
Curba de calibrare se obine ca medie a 2 determinri repetate (duplicate) cu produi
standard, din care rezult 2 curbe standard.
Pe baza curbei de etalonare i a ecuaiei curbei (y=0,0005x+0,0574; R2=0,9978) obinute
s-au determinat concentraiile VEGF din serul pacienilor i la martori.
Comparaie control/pacieni (cut-off)
VEGF
1250
pg/mL
1000
750
500
250
0
control
pacienti
Grafic 6.5. Reprezentarea grafic a nivelului seric al VEGF (pg/mL) la martori i la pacienii cu
glioblastoame.
35
- Analiza bFGF
Curba de calibrare se obine ca medie a 2 determinari repetate (duplicate) cu produi
Pe baza curbei de etalonare i a ecuaiei curbei (y=0,0037x+0,0692; R2=0,998) obinute
s-au determinat concentraiile bFGF din serul pacienilor, respectiv al martorilor.
Comparatie control/pacieni (cut-off)
bFGF
100
pg/mL
75
50
25
0
control
pacienti
Grafic 6.7. Reprezentarea grafic a nivelului seric al bFGF (pg/mL) la martori i la pacienii cu
glioblastoame.
Analiza prin ELISA a serului provenit de la pacienii cu glioblastoame a relevat diferene
semnificative ntre lotul martor i cel al pacienilor.
Analiza imunohistochimic la nivelul tumorilor hipofizare

Analiza imunohistochimic a demonstrat prezena expresiei VEGF i bFGF n
majoritatea cazurilor studiate, cu preponderen n adenoamele invazive i recidivate, ceea ce
concord cu potenialul de proliferare Ki67.
Cu toate c n majoritatea cazurilor studiate analiza imunohistochimic a relevat prezena
expresiei factorilor angiogenici VEGF i bFGF, la nivelul adenoamele hipofizare invazive
preponderena a fost mai mare, fapt corelat i cu expresia potenialului de proliferare. S-a
remarcat o reacie imunopozitiv mai pronunat pentru VEGF fa de bFGF, n majoritatea
cazurilor, att n ceea ce privete intensitatea reaciei ct i numrul de celule imunoreactive. n
tumorile invazive, bFGF i VEGF au prezentat o reacie intens pozitiv, difuz, att n celulele
tumorale ct i n endoteliul vascular. n adenoamele hipofizare neinvazive s-a remarcat o reacie
pozitiv, zonal pentru VEGF, n celule tumorale.
36
Determinarea seric a VEGF i bFGF la pacienii cu tumori hipofizare

determinare. Pentru analiza factorilor angiogenici VEGF i bFGF prin ELISA au fost luate n
studiu 66 cazuri de pacieni diagnosticai cu tumori hipofizare.
- Analiza VEGF
Pe baza curbei de etalonare i a ecuaiei curbei (y=0,0011x+0.0064; R2=0,998) obinute
s-au determinat concentraiile VEGF din serul pacienilor i la martori.
Comparaie control/pacieni
VEGF
pg/mL
300
200
100
0
control
pacienti
Tabel i Grafic 6.9. Nivelul seric al VEGF la nivelul pacienilor cu tumori hipofizare versus
control.
Analiza seric a VEGF la nivelul tumorilor hipofizare, efectuat prin metoda enzimatic
sandwich ELISA a evideniat o diferen net ntre lotul de pacienii cu aceast patologie i lotul
martor. De asemenea, au fost nregistrate diferene semnificative statistic ntre lotul de pacieni
cu tumori hipofizare invazive i lotul de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive (p<0,05). La
compararea lotului de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive n sinus cu lotul de pacieni cu
tumori hipofizare invazive n sinus au fost obtinue diferene statistice semnificative p<0,05.
- Analiza bFGF
Pe baza curbei de etalonare i a ecuaiei curbei (y=0,0392x+0.0007; R2=0,9984) obinute
s-au determinat concentraiile bFGF din serul pacienilor i la martori.
Comparaie control/pacieni
37
bFGF
25
pg/mL
20
15
10
5
0
control
pacienti
Grafic 6.13. Nivelul seric al bFGF la nivelul pacienilor cu tumori hipofizare versus control.
Analiza seric a markerului angiogenetic bFGF la pacieni cu tumori hipofizare a variat
ntre 6,28 pg/mL i 16,28 pg/mL, cu o medie de 12,58 pg/mL versus 10,83 pg/mL (lot martor)
(p<0,05). Au fost nregistrate diferene statistic semnificative ntre lotul de pacieni cu tumori
hipofizare invazive 14,71 pg/mL i cel de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive 8,59
pg/mL (p<0,01).
La compararea lotului de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive n sinus 11,62 pg/mL
cu lotului de pacieni cu tumori hipofizare invazive n sinus 14,25 pg/mL au fost obinute de
asemenea, diferene statistice semnificative p<0,05.
Analiza seric a factorilor angiogenici, la nivelul tumorilor hipofizare, efectuat prin
metoda enzimatic sandwich ELISA a evideniat o diferen net ntre lotul de pacienii cu
aceast patologie i lotul martor, att n cazul VEGF ct i bFGF.
Analiza multiparametric xMAP (LUMINEX200) - determinarea factorilor

angiogenici, a citokinelor i a altor factori de cretere n serul pacienilor cu tumori
intracraniene
determinare.
Pentru analiza citokinelor i a factorilor de cretere: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL10, IL-12, GM-CSF, INF, TNF, VEGF i FGF-2 prin xMAP technology Luminex 200 au
fost luate n studiu 33 cazuri de pacieni diagnosticai cu glioame i 66 pacieni diagnosticai cu
tumori hipofizare.
Curba de calibrare pentru fiecare analit luat n calcul se obine ca medie a 2
determinri (duplicate), cu produi standard, iar pe baza curbei de etalonare i a ecuaiei curbei
obinute s-au determinat concentraiile analiilor luai n studiu VEGF, FGF-2, IL-1, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, GM-CSF, INF i TNF din serul pacienilor i la martori.
38
Stimulation index
Glioblastomas/control
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GM-CSFIFNg IL-1b
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10 IL-12p70TNFa FGF-2 VEGF
Grafic 6.28. Indicele de stimulare dintre citokine respectiv factorii de cretere versus control la
nivelul glioamelor.
Pituitary adenomas/control
Stimulation index
0
GM-CSFIFNg IL-1b
IL-2
IL-4
IL-6
IL-8
IL-10 IL-12p70TNFa FGF-2 VEGF
Grafic 6.29. Indicele de stimulare dintre citokine respectiv factorii de cretere versus control la
nivelul adenoamelor hipofizare.
Analiza citokinelor i factorilor de cretere serici prin metoda multiplex a relevat
modificri ale nivelurilor de expresie, n cazul glioamelor fa de tumorile hipofizare i fa de
martor, dup cum urmeaz:
Creteri semnificative ale nivelurilor de expresie n glioame fa de tumorile
hipofizare i fa de controale, pentru:
- GM-CSF; IFNg; IL-1b; IL-2; IL-6; IL-8; IL-10; TNFa; VEGF; bFGF;
Scderi semnificative ale nivelurilor de expresie n glioame fa de tumorile
hipofizare i fa de controale, pentru:
- IL-4; - IL-12.
Astfel, n urma analizei xMAP s-a detectat o puternic supraexpersie pentru IL-6, IL-1,
IL-10 i TNF (> 3 ori la pacienii cu glioame; > 2 ori la pacienii cu tumori hipofizare). O
supraregalare semnificativ a fost gasit i pentru VEGF, FGF2, IL-8, IL-2 i GM-CSF. Expresia
39
acestor citokine a fost semnificativ crescut i puternic corelat cu gradul tumoral, markerii de
proliferare i agresivitatea clinic att n glioame ct i n tumorile hipofizare.
S-a decis realizarea profilului proteomic pentru glioblastoame, acestea fiind tumori
maligne, foarte agresive. n vederea realizrii acestui desiderat s-au utilizat 2 tehnologii
proteomice: SELDI-TOF-MS i electroforeza bidimensional (2DE).
Tehnologia SELDI-ToF-MS
n vederea realizrii profilului proteomic prin SELDI-ToF-MS au fost analizate:
- seruri provenite de la 24 de pacieni cu glioblastoame i 24 de seruri de la martori;
- esut provenind de la 12 pacieni cu glioblastoame (peritumoral/tumoral).
S-a realizat optimizarea protocolului de lucru pe SELDI-TOF-MS, pe mai multe variante
experimentale, utilizndu-se:
- 2 tipuri de chipuri CM10 (suprafa cationic) i Q10 (suprafa anionic);
- timpi diferii de incubare a probei;
- prelungirea timpului de splare sau nu, pentru a fi nlturai contaminanii i proteinele
nelegate;
- adugare de matrici diferite (CHCA - alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid, SPA acid
sinapinic, EAM1) cu proprietatea de a absorbi i a disipa energia transferat de fasciculul laser.
Selectarea chipului s-a fcut n funcie de proprietile proteinelor analizate.
Analiza SELDI-TOF-MS la nivel seric

Analiza seric a fost realizat pe chipuri CM10 i s-a folosit matrice EAM1. La nivel
seric, datorit sensibilitii ridicate a deteciei picurilor proteice - s-au detectat 110 picuri
distincte pe intervalul de mas molecular 0-30.000 Da, cu diferene semnificative ntre
glioblastoame i controale, cu valori ROC cuprinse 0,843-0,930 i p < 0,0001.
Analiza de date predictive a evidentiat picuri modificate in patologic fata de martor n
intervalul 1000 1500 Da, 2000 3500 Da (p <0,0001) si interval 5500 10500 Da (p
<0,0001). n final au fost selectate 9 clustere relevante cu diferene statistice semnificative.
Detaliile curbelor ROC (Receiver operator characteristic curve), spectrele i identitatea
clusterelor pot fi regasite in teza.
Analiza SELDI-TOF-MS la nivelul lizatului tisular

Analiza seric a fost realizat pe chipuri Q10 i s-a folosit matrice SPA. La nivelul
lizatului tisular, au fost detectate 130 picuri distincte pe intervalul de mas molecular 0-35.000
Da, cu diferene semnificative ntre glioblastoame i controale, cu valori ROC cuprinse 0,25-0,65
i p < 0,05.
Analiza de date predictive a evidentiat picuri modificate in patologic fata de martor n
intervalul de mas 10000 14000 Da (p<0,05), 14000 18000 Da (p<0,05), 15000 19000 Da
(p<0,05), 1450-1550 Da (p<0,05), 600-700 Da si 700-800 Da. n urma analizei datelor au fost
identicate 87 clustere din care 6 au prezentat diferene semnificative.
Detaliile privind curbelor ROC (Receiver operator characteristic curve), spectrele i
identitatea clusterelor pot fi regasite in teza.
40
Analiza clusterelor selectate relev faptul c diferenele ntre medianele grupului control i
pacieni sunt bine separate, totui, este de remarcat prezena ctorva valori ce se situeaz n afara
distribuiei grupului, fapt ce se datoreaz n parte numrului nu foarte mare de probe analizate.
Din acest motiv este necesar continuarea cercetrile, astfel nct prin acumularea unui numr
mai mare de probe, semnificaia statistic i potenialul predictiv al biomarkerilor selectai mai
sus s se mbunteasc.
Acumularea suplimentar de date, coroborat cu accesul la un set mai complet de
nregistrri clinice, ar putea clarifica i consolida posibila aplicare a unor clustere secundare, ca
markeri de stratificare/stadializare a pacienilor.
Electroforeza bidimensional (2DE)

Au fost luate n analiz acele glioblastoame care au prezentat la analiza SELDI diferene
semnificative ntre esutul tumoral i peritumoral, sau care au prezentat peak-urile cele mai
interesante. Astfel s-a realizat profilul proteomic i prin tehnica de electroforez 2DE, lundu-se
n comparaie esut peritumoral versus tumoral.
S-a realizat optimizarea protocolului de lucru pentru 2DE prin utilizarea a:
- diferite concentraii pentru substanele existente n tamponul de liz;
- tipuri diferite de rehidratare (activ/pasiv/activ i pasiv), cu timpi diferii fiecare;
- timpi diferii pentru etapele de izoelectrofocusare.
Fluxul de analiz pentru control (esut peritumoral), respectiv probe (esut tumoral) a fost
descris mai sus la capitolul de materiale i medode.
Editarea imaginilor este urmat de generarea unui experiment, ceea ce presupune
definirea grupurilor de analiza (control, probe, control versus probe). Dup introducerea
imaginilor corespunztoare are loc selecia celui mai mare i celui mai mic spot, urmat de
detecia automat a tuturor spoturilor i generarea unui master gel.
Dupa detecia i editarea spoturilor are loc compararea spoturilor ntre geluri (Match
sets). Matchsets Master este o imagine sintetic ce conine toate spoturile din toate gelurile
analizate. Mai multe master geluri din diferite MatchSets sunt grupate i pstrate pentru analize
viitoare.
Instrumentele de analiz review-ul spoturilor, scatter plot, normalizarea parametrilor,
identificarea masei moleculare i a pI pentru toate spoturile de interes, etc. Crearea automat a
seturilor de analiz i generarea raportului de analiz. La compararea master gelurilor provenite
de la cele 2 grupuri (tumoral versus peritumoral) a fost generat un raport de analiza.
La Spot review au fost observate mai multe posilibiliti:
- spoturi de aceeasi intensitate n toate gelurile (prob/gliom i control);
- spoturi identificate doar n glioame;
- spoturi sub-exprimate n glioame fa de control;
- spoturi supra-exprimate n glioame fa de control.
Au fost evideniate n medie 300 de spoturi per fiecare gel. n urma analizei de date
realizat cu softul PDQuest au fost selectate 6 spoturi, ce au prezentat diferene semnificative.
Mai multe detalii despre aceste spoturi (pI/greutate moleculara) pot fi aflate din teza.
41
CAPITOLUL VII - Discutii
DISCUII
Proteomica este un domeniu important n diagnosticul i studiul cancerului prin faptul c
poate realiza descoperirea de noi biomarkeri / identificarea unor molecule biomarker sau seturi
de biomarkeri, utili pentru diagnosticul precoce, monitorizarea i/sau optimizarea terapiilor antitumorale.
Acest deziderat se poate realiza prin utilizarea unor tehnologii state-of-the-art, aplicate
nc de la prepararea probelor, continund cu studiul probelor biologice complexe i finaliznd
cu partea de bioinformatic necesar analizei datelor generate i integrarea rezultatelor n context
clinic.
n vederea realizrii analizei proteomice i a identificrii de noi biomarkeri utilizabili
pentru diagnosticul ori monitorizarea tumorilor intracraniene, am folosit o combinaie de tehnici
proteomice, bazate pe spectrometrie de mas, electroforez bidimensional i analiza de tip
multiplex xMAP. Astfel de abordri pentru identificarea de biomarkeri n diverse patologii
reprezinta o noutate chiar i n cercetrile pe plan internaional.
Abordarea studiului pe probe biologice de tipul ser / plasm, ca alternativ la abordrile
de tipul biopsiilor este de maxim interes, datorit beneficiilor oferite: posibilitatea de prelevare
minim invaziv, repetabilitatea prelevrii, combinaia cu instrumente de cercetare de tip highthroughput, cum sunt tehnologiile SELDI-ToF-MS, 2D i xMAP. Acestea pot oferi o soluie de
identificare precoce a subiecilor cu risc ridicat pentru o anumit patologie tumoral, detecia
timpurie, implicit abordarea terapeutic n faze incipiente.
Pe de alt parte, studiul direct pe biopsii (esut tumoral/peritumoral) poate conduce ctre
identificarea precis a anumitor proteine/biomarkeri, care nu pot depi bariera hematoencefalic
i care nu pot fi astfel identificai n biofluide. Din acest motiv, n aceasta tez am ales o
abordare complex prin analiza proteomic, att la nivel tisular ct i la nivel seric.
Scopul acestei teze a fost analiza profilului proteic i identificarea de noi biomarkeri
la nivelul tumorilor intracraniene prin tehnici nalt performante de proteomic.
Studiul de proteomic a demarat prin determinarea unor factorii angiogenici, factori ce
sunt de un real folos n determinarea agresivitii i invazivitii tumorale. VEGF i bFGF au fost
analizai prin tehnicile: imunohistochimie, ELISA i xMAP. n literatura de specialitate sunt
citate tot mai multe studii referitoare la markerii VEGF i bFGF i implicarea lor ca factori cheie
n procesele de angiogenez i progresie tumoral.
Fenomenul de angiogenez a fost abordat n cadrul tezei pe cazuri de tumori
intracraniene att benigne (tumorile hipofizare) ct i maligne (glioblastoamele) n scopul
relevrii unor diferene de comportament.
Analiza imunohistochimic, a relevat expresia VEGF i bFGF n majoritatea
adenoamelor hipofizare studiate, n special la cele invazive i recidivate, acest fapt fiind n
concordan cu indexul de proliferare Ki67, respectiv potenialul de invazivitate. S-a remarcat
o imunoreacie pozitiv mai pronunat n cazul VEGF comparativ cu bFGF n majoritatea
cazurilor. De asemenea, s-a remarcat prezena acestor markeri att n celulele tumorale ct i n
42
endoteliul vascular la nivelul tumorilor invazive prin comparaie cu adenoamele hipofizare

neinvazive.
Aceste date sunt n concordan cu studiile internaionale care au demonstrat c
angiogeneza se coreleaz cu comportamentul biologic tumoral, capacitatea de metastazare, de
recidiv, prognosticul, i rspunsul slab la tratament n diferite tipuri tumorale solide (de la Torre
NG., 2005; Salehi F., 2010)236, 237. Microvascularizaia intratumoral este raportat a fi corelat
cu comportamentul tumoral sau secreia hormonal n diferite tumori endocrine (Stepien H.M.,
2002)80.
n cazul adenoamele hipofizare angiogeneza prezint unele particulariti, legate de
circulaia sangvin la acest nivel i capacitatea secretorie att a unor factori angiogenici, ct i a
unor inhibitori ai acestora (Turner H.E., 2000; Liekens N., 2001)82,67.
Rezultatele privind angiogeneza n tumorile hipofizare sunt nc subiect de controvers
tiinific, unele lucrri raportnd relaii pozitive ntre factorii angiogenezei i dimensiune,
statusul endocrin sau potenialul agresiv al tumorii (Yamada S., 2003)79, n timp ce alte studii
susin inexistena sau slaba corelaie ntre factorii mentionai (Lee E.J., 2001; McCabe C.J.,
2002)83,84.
Carcinoame hipofizare sunt nominalizate ca avnd o expresie a VEGF mai crescut dect
adenoame. Exist de asemenea date care susin o corelare pozitiv ntre Ki67 i VEGF (Iuchi et
al, 2000)85 aceasta sugernd posibilul rol al VEGF n creterea i proliferarea celulelor
adenomatoase, dei expresia receptorilor VEGF n celulele tumorale este nc enigmatic.
Referitor la studiul factorilor angiogenici n tumorile maligne intracraniene
(glioblastoamele) analiza imunohistochimic a relevat o reacie imunopozitiv intens,
comparabil pentru VEGF i bFGF. Cei doi markeri angiogenici au fost identificai att la
nivelul celulele endoteliale vasculare ct i tumorale, n concordan cu gradul de agresivitate
tumoral.
Aceste rezultate sunt susinute i n literatura de specialitate; neovascularizaia i invazia
tumoral sunt procese eseniale pentru dezvoltarea i creterea glioamelor (Bello L, 2004)48. Mai
muli autori susin importana neovascularizaiei n creterea i progresia glioblastomului malign;
proliferarea i hiperplazia componentelor celulare ale vaselor sangvine fiind utilizate ca
indicatori ai gradul de malignitate. Neovascularizaia crescut reprezint o int important n
terapia anti-angiogenic (Louis DN, 2007)49.
Dei glioamele sunt printre cele mai vascularizate tumori este surprinztor faptul c
terapiile anti-angiogenice au avut un succes relativ pn n prezent. Pentru a mbunti aceast
situaie este necesar cutarea unor obiective specifice terapeutice n vascularizarea gliomului.
Analiza factorilor angiogenici serici, realizat n acest studiu la nivelul glioblastoamelor
i tumorilor hipofizare a evideniat o diferen neta ntre lotul de pacienii cu patologie tumoral
intracranian i lotul martor, att n cazul VEGF ct i bFGF.
Astfel, media nivelului seric pentru VEGF la pacieni cu tumori hipofizare a fost de
crescuta fata de lotul martor (p<0,01). Comparaia realizat ntre loturile de pacieni cu tumori
hipofizare invazive/neinvazive, respectiv loturile de pacieni cu tumori invazive n sinusul
cavernos/neinvazive n sinusul cavernos (p<0,05) a evideniat diferene semnificative ntre cele 2
categorii de loturi.
43
Analiza seric a factorului angiogenic bFGF a relevat diferene ntre media obinut
pentru lotul pacienilor cu tumori hipofizare si lotul martor (p<0,05). Rezultatele pentru bFGF au
fost similare ca trend cu cele obinute cu VEGF, astfel bFGF a prezentat un nivel semnificativ
crescut n cazul tumorilor invazive i cu precdere n cele invazive n sinusul cavernos (p<0,05).
Evaluarea factorilor angiogenici la nivel seric n cazul tumorilor maligne glioblastoame
a prezentat diferene semnificativ statistice fa de lotul martor, att n cazul VEGF (p<0,05), ct
i n cazul bFGF (p<0,05).
O atenie deosebit se acord n ultimii ani factorului VEGF datorit implicrii sale n
angiogeneza asociat progresiei tumorale, precum i datorit potenialului su ca int n terapia
cancerului. Numeroase studii au demonstrat ca VEGF sau receptorii si sunt supraexprimai n
mai multe forme de cancer uman. Scderea expresiei VEGF a dus la reducerea progresiei
tumorale n modelele experimentale de cancer. Suplimentar, rezultate similare au fost obinute i
cu alte metode i anume: utilizarea de antagoniti VEGF, oligonucleotide antisens, inhibitori
tirozin-kinazici selectivi, medicamente sau toxine intite asupra receptorilor VEGF. ncercrile
clinice sunt n curs de a stabili eficacitatea modulrii sistemului VEGF n terapia cancerului la
om (Cristina C., 2010)238.
De asemenea, activitatea biologic a bFGF s-a fost demonstrat a fi mediat printr-un
sistem de receptori duali, tirozin kinazici de nalt afinitate, ARN mesager i proteina bFGF fiind
exprimate i secretate att de ctre hipofiza normal ct i de toate tipurile de adenoame
hipofizare. bFGF poate aciona ca modulator al funciei hipofizare, al creterii i diferenierii ct
i ca factor paracrin al angiogenezei. bFGF i VEGF au probabil efecte sinergice, cel mai
probabil bFGF moduleaz expresia VEGF n celulele endoteliale prin mecanisme de aciune
auto- i paracrine. Recent a fost propus o cascad complex de factori hipofizari angiogenici i
mitogeni: estrogenul induce expresia PTTG (pituitary tumor transforming gene), aceasta
coincide cu inducerea expresiei bFGF i a angiogenezei hipofizare (Cohen AB., 2009)239.
Inhibitorii angiogenezei, acionez prin mecanisme complexe, influennd procesele de
transcripie a factorilor de cretere a celulelor canceroase, ca i transferul de semnal n celulele
endoteliale. Ei pot influena migrarea celulelor endoteliale, sugernd posibilitatea utilizrii lor n
terapie. Terapia antiangiogenic are potenial de terapie anti-tumoral deoarece angiogeneza este
un proces cheie n comportamentul tumoral (Yamada S., 2003, Cohen AB., 2009)79,239.
Studii relativ recente raporteaz importana determinrii unui panel de citokine i a unor
factori de cretere n tumorile solide. Investigarea acestora n patologia tumoral intracranian a
fost mai puin abordat, motiv pentru care am continuat studiu proteomic cu analiza multiplex a
unui larg panel de citokinelor, alturi de factori de cretere/angiogenici.
Analiza multiplex a citokinelor i factorilor de cretere serici a evideniat supraexpresia
GM-CSF, IFNg, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF, VEGF i bFGF la pacienii cu glioame n
comparaie cu lotul martor. n cazul pacienilor cu tumori hipofizare s-a pstrat tendina de
cretere a acestor citokine fa de martor, dar diferena dintre loturi a fost mai mic n comparaie
cu diferena dintre lotul de martori i cel de glioame. Pentru IL-4 i IL-12 analiza multiplex a
relevat o scdere a expresiei acestora la nivelul glioamelor fa de tumorile hipofizare i fa de
martor.
Observaiile noastre sunt n acord cu cele din literatura de specialitate care menioneaz
faptul c la nivel cerebral, citokine neuroinflamatorii afecteaz creterea i diferenierea att a
44
celulelor gliale normale, ct i a celule maligne (Fuertes M., 2010)240. Paugh BS. n 2009 a
dovedit ca IL-1 este secretat de majoritatea celulelor din glioblastoame, nivelul acestei
citokine fiind crescut n aceast patologie108.
De asemenea, Loeffler S. n 2005 a constatat c citokina IL-6 este sintetizat la nivelul
glioamelor i expresia ei crescut este corelat cu comportamentul malign al acestor tumori. IL-6
induce activarea transcripiei pentru VEGF i regleaz activitatea promotorului pentru VEGF
prin intermediul interaciunii directe cu STAT390. Sasaki A. i colaboratorii n 2001 au ajuns la
concluzia c proteina IL-6 produs n esutul tumoral poate fi implicat n progresia tumoral n
glioamele cu grad nalt de invazivitate, dar nu n cele cu grad sczut, i c expresia genic pentru
IL-6 este strns corelat cu expresia IL-1 la nivelul biopsiilor, xenogrefelor ct i n culturi de
glioame umane122.
Studiul de fa a relevat o expresie crescut a IL-8 seric, la nivelul glioamelor i tumorilor
hipofizare, fapt ce este n concordan cu studiile realizate de Brat DJ, 2005 i Salmaggi, A.,
2003. Astfel, Brat DJ. n 2005 a demonstrat c IL-8 este o citokin produs la nivelul
glioblastoamelor i c expresia ei crescut (mRNA i expresia proteica) este corelat cu
comportamentul malign al acestor tumori124. Salmaggi, A. n 2003 a constatat ca secreia de IL8, este stimulat de IL-1, TNF i IL-17 i poate fi un factor-cheie implicat n determinarea
infiltratelor limfoide observate n tumorile cerebrale. n plus, a demonstrat c nivelurile
intracavitare crescute de IL-8 sunt corelate cu un timp mai scurt de supravieuire125.
Observaiile din literatur semnaleaz de asemenea faptul c IL-6, IL-1, IL-10 i TNF
sunt crescute n patologia tumoral, ceea ce este n concordan cu studiul nostru (Egler RA.,
2008; Fuertes M., 2010)110, 240.
Unii dintre membri familiei de interleukine au fost gsii responsabili pentru inhibarea
angiogenezei. In vivo IL-4 reduce neovascularizaia indus de bFGF i blocheaz migrarea
celulelor endoteliale in vitro (Volpert OV, 1998)126. n plus, IL-12 suprim expresia ARNm
pentru VEGF, bFGF i MMP-9 (Duda DG, 2000; Oshikawa K, 2001)127,128. Aceste date se
coreleaz cu rezultatele obinute n studiul de fa, n care valorile IL-4 i IL-12 au fost gsite
sczute, deci neovascularizaia indus de bFGF i migrarea celulelor endoteliale au determinat
scparea de sub control a procesului angiogenic.
n concluzie, analiza de tip multiplex a detectat o puternic supraexpersie pentru IL-6, IL1, IL-10 i TNF (> 3 ori la pacienii cu glioame; > 2 ori la pacienii cu tumori hipofizare). O
supraregalare semnificativ a fost gsit i pentru VEGF, bFGF, IL-8, IL-2 i GM-CSF. Expresia
citokinelor a fost semnificativ crescut i puternic corelat cu gradul tumoral, markerii de
proliferare i agresivitatea clinic att n glioame ct i n tumorile hipofizare invazive.
S-a putut observa c rezultatele n ceea ce privete analiza multiplex pentru VEGF i
FGF2 sunt n concordan cu cele obinute prin analiza imunohistochimic i ELISA.
Mecanismele care stau la baza patologiei tumorale sunt destul de complicate, implicnd
mai multe proteine supra- sau sub-exprimate. Acesta este motivul pentru care ipoteze recente
sugereaz faptul c detectarea unor seturi de biomarkeri poate oferi sensibiliti i specificiti
mai mari pentru diagnosticarea cancerului, dect biomarkeri unici. Modificrile din structura,
abundena, sau funcia proteinelor acioneaz ca un indicator util, nainte de apariia simptomelor
clinice i, ca atare, pot fi biomarkeri n diagnostic i prognostic.
45
Toate aceste argumente au constituit motive pentru aprofundarea studiului proteomic,

prin tehnologii de ultim generaie. Cele mai multe tumori intracraniene sunt diagnosticate i
clasificate pe baza metodelor histologice i sunt evideniate prin scheme de clasificare OMS.
Datorit inconsecvenei ntlnite n cadrul acestor proceduri de diagnostic, rezultate n parte din
heterogenitatea tumoral, n ultimul timp au fost demarate studii ample pentru rezolvarea acestei
necunoscute. n acest scop se ncearc identificarea biomarkerilor moleculari cu capacitatea de
anticipare, n special pentru a ajuta dezvoltarea i utilizarea tratamentelor specifice.
Sunt necesare eforturi mrite n cercetarea neuro-oncologic pentru a atinge progrese n
eficacitatea tratamentului glioblastoamelor. Biomarkerii serici/plasmatici au potenialul de a
mbuntii procesul de diagnostic, prognostic i monitorizare a rspunsului la tratament.
Proteinele coninute la nivelul serului pot include: proteine secretate de tumorile solide, factori
de cretere, citokine, hormoni peptidici/proteici. Pe de alt parte, analiza proteomic la nivel
tisular este esenial n identificarea de biomarkeri n cazul tumorilor intracraniene, n special
datorit faptului c multe proteine/poteniali biomarkeri nu pot depi bariera hematoencefalic
i nu pot fi regsite astfel la nivelul biofluidelor. Astfel, un studiu proteomic complex presupune
att o abordare la nivel seric, ct i tisular. Prin studiul de fa am incercat realizarea studiului
proteomic al glioamelor / analiza proteomului la nivelul biopsiilor (esutului tumoral i
peritumoral) cat i la nivelul biofluidelor (ser).
Datorita agresivitii, diagnosticului rezervat i perioadei scurte de supravieuire dup
diagnosticare pe care o au glioblastoamele am ales aceast patologie pentru realizarea profilul
proteomic la nivel tisular i seric prin spectrometrie de mas SELDI-TOF-MS i la nivel tisular
prin electroforeza bidimensional.
Pentru screeningul biomarkerilor serici i tisulari la pacienii cu glioblastoame a fost
aplicat n primul rnd tehnologia SELDI-ToF-MS. Din totalitatea datelor analizate au fost
selectate 9 clustere exprimate difereniat n ser i 6 clustere exprimate difereniat n esut, acestea
putnd discrimina ntre grupul de pacieni i cel martor, avnd fiecare o nalt sensibilitate i
specificitate (detaliile despre raportul m/z sunt prezentate in teza de doctorat).
Identificarea biomarkerilor cu sensibilitate i specificitate crescut este necesar nu
numai pentru mbuntirea diagnosticului precoce, al prognosticului ct i pentru orientarea
eficienei terapeutice.
Din moment ce nu exist un marker tumoral specific pentru diagnosticarea
glioblastoamelor, ideal este s se creeze studii extinse de proteomic cu scopul de a gsi noi
biomarkeri candidai. Dei au fost identificai o serie de biomarkeri moleculari, necesitatea
stabilirii unor paneluri rmne cercetrii avansate pentru diagnosticul cancerului, prognostic i
monitorizarea terapiei. Scopul studiului de fa a fost de a identifica candidaii posibili pentru
biomarkeri, fie solubili sau tisulari, care pot contribui la mbuntirea diagnosticului/prognozei
i monitorizrii terapiei.
Liu J. i colaboratorii n 2005 au realizat screeningul i evaluatea biomarkerilor pentru
detectarea glioblastoamelor fa de control i fa de pacieni cu alte tumori cerebrale benigne,
prin SELDI-TOF-MS (Liu J., 2005)212. Atunci cnd au fost comparate probele provenind de la
pacieni cu astrocitoame i de la lotul martor au fost selectai din 15 picuri (m/z 8214,77;
8926,76; 4815,11; 8612,23; 2082,19; 4299,87; 2103,55; 7764,82; 2368,19; 3226,97; 2389,55;
46
2021,78; 4469,09; 6457,054; 8702,416) doar 2 biomarkeri cu raportul m/z 8214,8 i 2368,2
pentru a servi ca biomarkeri finali discriminatorii. Studiul a comparat i lotul pacienilor cu
astrocitoame cu un lot de pacieni cu tumori cerebrale benigne. Dei iniial au fost identificate 22
de picuri n final doar 2 picuri (raportul m/z 4155,3 i 14047,8) au fost selectate ca fiind posibili
biomarkeri.
Concluzia studiului au fost ca analiza SELDI-TOF-MS combinat cu instrumente
bioinformatice, ar putea facilita semnificativ descoperirea de noi biomarkeri.
n 2007, Zhang H. i colaboratorii au luat n studiu seruri ce proveneau de la pacieni cu
astrocitoame, seruri de control i seruri de la pacieni cu alte tumori cerebrale (Zhang H.,
2007)216. Analiza proteomic s-a realizat cu ajutorul tehnologiei SELDI-TOF-MS, utiliznd
chipuri WCX (weak cation exchange). n final au fost identificai 7 biomarkerilor serici 4
supraexprimai i 3 subexprimai n mod semnificativ n grupul pacienilor cu astrocitoame
comparativ cu grupul de control. Pe baza acestor 7 biomarkeri s-a dezvoltat o clasificare de tip
decision tree i s-a obinut o sensibilitate de 84,6% i o selectivitate de 84,6% n discriminarea
astrocitoamelor de control, pe baza acestora. n plus, a fost observat o corelare a acestor
markeri cu malignitate astrocitomului. Astfel, tehnologia SELDI-TOF-MS ar putea facilita n
mare msur descoperirea biomarkerilor serici n astrocitoame.
n 2008 grupul condus de Petrik V. i-a propus s identifice biomerkeri serici care s
poata prezice supravieuirea pacienilor diagnosticai cu glioblastoame (Petrik V., 2008)217. n
acest scop, n prima faza (descoperirea de biomarkeri) au realizat analiza prin SELDI-TOF-MS a
200 de seruri provenite de la martori, pacieni cu astrocitoame de gradul II, pacieni cu
astrocitoame anaplazice i pacieni cu glioblastoame. Pentru a identifica potenialii biomarkeri pe
chipurile CM10 s-au cutat peak-urile peptidice care s-au schimbat progresiv odat cu creterea
n malignitate. Un peak, la 2740 kDa, identificat ca fiind lanul-B al glicoproteinei alfa 2Heremans-Schmid (AHSG), a fost mai puin proeminent/crescut odat cu cretere gradului
tumoral; astfel acesta a fost studiat ca un predictor de supravieuire n glioblastom. Ei au msurat
nivelul seric al AHSG prin turbidimetrie i au determinat indicii de malignitate, inclusiv
proliferarea tumoral - Ki67 i necroz. n faza 2 (validare), puterea de biomarker de prognostic
a AHSG a fost validat ntr-un grup independent de 72 pacieni cu glioblastom (Petrik V.,
2008)217. n concluzie, concentraia seric a AHSG, msurat naintea nceperii tratamentului a
avut valoare prognostic pentru supravieuirea pacientului.
n concluzie, abordrile proteomice, cu SELDI-TOF-MS ar putea contribui n mare
msur la descoperirea de noi biomarkerilor serici n patologia abordat.
Analiza proteomica a continuat pe cele mai reprezentative 10 cazuri (esut tumoral versus
peritumoral) prin electroforeza bidimensional. Au fost evideniate n medie 300 de spoturi per
fiecare gel. n urma analizei de date realizate cu softuri specializate au fost selectate 6 spoturi,
exprimate ca mas molecular/punct izoelectric - (kDa)/pI (aceste detalii sunt prezentate pe larg
in teza).
Aceste rezultate au fost n acord cu cele citate n literatura de specialitate. Astfel, Park
CK i colaboratorii n 2009 pentru a investiga diversitatea intratumoral a glioblastoamelor au
realizat profile moleculare la nivelul acestor tumori, comparnd mostre din regiuni cu grade
histologice diferite. Folosind 2DE i spectrometria de mas, au comparat probe de esut colectate
47
prospectiv din arii tumorale cu grade histologice diferite, de la 3 pacieni cu glioblastom (Park
CK., 2009)234. Rezultate au demonstrat existena mai multor proteine, dintre care unele cu
acceai greutate molecular ca i cele identificate n acest studiu. n final au fost validate prin
western blot i imunohistochimie 2 proteine: ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (Da/pI 25151/5,33) i transthyretina (Da/pI - 12671/5,26).
Studiul de fa este n acord cu articolul publicat de Chumbalkar VC n 2005 care a
studiat profilurile proteice pentru 27 de astrocitoame, folosind analiza 2DE i MALDI-TOF n
vederea identificrii proteinelor exprimate difereniat, proteine ce pot fi considerate indicatori
moleculari utili pentru nelegerea mecanismelor ce stau la baza dezvoltrii tumorale
(Chumbalkar VC., 2005)222. n urma examinarii profilelor proteomice au fost relevate 72 de
proteine distincte, exprimate difereniat i aparinnd diferitelor grupuri funcionale, cum ar fi
citoscheletului i proteine filamentare intermediare, heat shock proteins/proteinelor de oc termic
(HSP), enzime i proteine de reglare. Bazat pe compatibilitatea de exprimare diferenial, 29
proteine distincte ar putea fi menionate i pot avea un rol n patologia astrocitoamelor. Unele sau dovedit a fi exprimate difereniat att n astrocitoame de gradul III i IV, n timp ce altele au
fost asociate cu un anumit grad. Chumbalkar VC a remarcat printre alte proteine i GFAP (glial
fibrillary acidic protein) (Da/pI - 49533/5,84) ca fiind proteina major exprimat n aceast
patologie.
n acelai sens, cercetri mult mai recente realizate de ctre Collet B. n 2011 au
confirmat c proteine precum GFAP (Da/pI - 49533/5,84), ubiquitin carboxyl-terminal esterase
L1 (Da/pI - 25151/5,33), apolipoproteina A (Da/pI - 28061/5,27), i variante ale transtiretinei
(Da/pI - 13806/5,57) sunt supra-exprimate n glioblastoame (Collet B., 2011)241.
Analiza proteomica prin SELDI-ToF-MS i 2D a relevat astfel existenta la nivel tisular a
3 posibili biomarkeri la 12 kDa, 15 kDa, 22 kDa identificati prin ambele tehnologii.
Nevoia urgent de a identifica noi inte terapeutice la nivelul tumorilor intracraniene
maligne glioame sau benigne tumori hipofizare, cutarea de biomarkeri la nivelul acestora i
identificarea profilului proteic va oferi o contribuie att de necesar n vederea optimizrii
diagnosticul, prognosticul, a deciziei de tratament i de evaluare a rspunsului la tratament.
48
CAPITOLUL VIII - Concluzii
CONCLUZII
Studiul a fost efectuat pe 66 de cazuri de tumori hipofizare, 40 de glioblastoame
selecionate din cazuistica de patologie a Clinicii de Neurochirurgie a Spitalului Bagdasar
Arseni Spitalului de Urgenta ELIAS sau din cazuistica de rutin a Institutului Naional Victor
Babe, n perioada 2004-2010.
Materialul folosit a fost reprezentat de fragmente de esut tumoral / peritumoral provenit
de la tumori intracraniene, fragmente obinute prin intervenie chirurgical i repartizate imediat
dupa recoltare n tampoane specifice fiecrei tehnici de lucru. De asemenea, o parte din studii au
fost realizate pe ser provenit de la respectivii pacieni sau de la martori. Toi pacienii/martorii
luai n studiu au semnat fia de consimmnt informat n ceea ce privete prelevarea i analiza
probele biologice (consimmnt semnat de comisiile de etic din spitalele respective).
Metodele de investigare folosite au fost reprezentate de examene imunohistochimice
(factorii angiogenici), analiza ELISA i xMAP (profilul citokinelor, factorilor de cretere i
factorilor angiogenici) precum i tehnici proteomice SELDI-TOF-MS i electroforeza
bidimensional (profilul proteomic/identificarea de biomarkeri).
Din analiza clinicostatistic a lotului de pacieni cu tumori hipofizare luat n studiu reiese
uoar preponderen a sexului feminin i vrsta de depistare a formaiunii tumorale ntre 18 i
73 de ani. Repartiia pe grupe de vrst a evideniat preponderena cazurilor n decadele III, IV i
V. Lotul de pacieni cu glioblastoame luat n studiu a relevat o uoar preponderen a sexului
masculin i vrsta de depistare a formaiunii tumorale ntre 20 i 80 de ani. Repartiia cazurilor
pe grupe de vrst evideniaz preponderena pentru decadele IV i V.
Analiza imunohistochimic prin antigene de difereniere a relevat n cazul tumorilor
hipofizare expresia att pentru VEGF, ct i pentru bFGF n majoritatea tumorilor analizate, cu
preponderen n adenoamele invazive i recidivate, ceea ce concord cu potenialul de
proliferare Ki67. S-a remarcat o reacie imunopozitiv mai pronunat pentru VEGF fa de
bFGF, n majoritatea cazurilor, att n ceea ce privete intensitatea reaciei ct i numrul de
celule imunoreactive. n tumorile invazive, VEGF a prezentat o reacie intens pozitiv, difuz,
att n celulele tumorale ct i n endoteliul vascular.
n cazul glioblastoamelor, analiza imunohistochimic a relevat o imunoreacie pentru
VEGF observat att la nivelul celulele endoteliale ct i n cele tumorale, n procent mai ridicat
n cele cu grad nalt de agresivitate. bFGF a prezentat o imunoreacie mai pronunat dect
VEGF n celulele tumorale, n concordan cu gradul de agresivitate tumoral.
Analiza seric a factorilor angiogenici, la nivelul tumorilor intracraniene, efectuat prin
metoda enzimatic sandwich ELISA a evideniat o diferen neta ntre lotul de pacienii cu
aceasta patologie i lotul martor, att n cazul VEGF ct i bFGF.
Nivelurile serice ale VEGF la pacieni cu tumori hipofizare au variat n comparatie lotul
martor (p<0,01). De asemenea, au existat diferene ntre lotul de pacieni cu tumori hipofizare
invazive i lotul de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive. Cnd a fost comparat lotul de
pacieni cu tumori hipofizare neinvazive n sinus cu cel cu tumori hipofizare invazive n sinus au
fost obinute, de asemenea, diferene statistice semnificative p<0,05.
49
Au variat si nivelurile serice ale bFGF la pacieni cu tumori hipofizare fata de lotul
martor (p<0.05). Au fost nregistrate diferene statistic semnificative ntre lotul de pacieni cu
tumori hipofizare invazive i cel de pacieni cu tumori hipofizare neinvazive ct i ntre lotul
pacienilor cu tumori hipofizare neinvazive n sinus i al celor cu tumori hipofizare invazive n
sinus (p<0,05).
La pacienii cu glioblastoame, analiza seric a factorilor angiogenici, a variat atat n cazul
VEGF cat si al bFGF ntre pacienti si lot martor (p<0,05).
n urma analizei xMAP (profilul citokinelor i al factorilor de cretere) s-a detectat o
puternic supraexpersie pentru IL-6, IL-1, IL-10 i TNF (> 3 ori la pacienii cu glioame; > 2
ori la pacienii cu tumori hipofizare). O supraregalare semnificativ a fost gsit i pentru VEGF,
FGF2, IL-8, IL-2 i GM-CSF. Expresia citokinelor a fost semnificativ crescut i puternic
corelat cu gradul tumoral, markerii de proliferare i agresivitatea clinic att n glioame ct i n
tumorile hipofizare.
Datorit agresivitii, diagnosticului rezervat i perioadei scurte de supravieuire dup
diagnosticare pe care o au glioblastoamele s-a realizat profilul proteomic la nivel tisular i seric
prin SELDI-TOF-MS i la nivel tisular prin electroforeza bidimensional.
Analiza proteomic prin SELDI-TOF-MS a fost realizat:
- la nivel seric pe un lot de 24 de cazuri (pacieni versus control);
- la nivel tisular pe un lot de 12 cazuri (esut tumoral versus esut peritumoral).
La nivel seric, datorit sensibilitii ridicate a deteciei picurilor proteice - s-au detectat
110 picuri distincte pe intervalul de mas molecular 0-30.000 Da, cu diferene semnificative
ntre lotul de pacieni cu glioblastoame i controale, cu valori ROC cuprinse 0,843-0.930 i p<
0,0001. n final au fost selectate 9 clustere cu diferene statistice semnificative.
La nivel tisular au fost detectate peste 130 de picuri proteice, pe intervalul de mas
molecular 0-35.000 Da, cu diferene semnificative ntre lotul de pacieni cu glioblastoame i cel
martor. Valorile ROC au fost cuprinse ntre 0,25-0,65 i p < 0,05. n urma analizei datelor au fost
identicate 87 clustere din care 6 au prezentat diferene semnificative din punct de vedere statistic.
Analiza proteomica prin electroforeza bidimensional (2D) a fost realizat pe 10 cazuri
(esut tumoral versus peritumoral), evideniindu-se n medie 300 de spoturi per gel. n urma
analizei de date au fost selectate 6 spoturi.
Analiza proteomic prin SELDI-ToF-MS i 2D a relevat astfel existena la nivel tisular a
3 posibili biomarkeri la 12 kDa, 15 kDa, 22 kDa identificai prin ambele tehnologii.
Analiza proteomic a relevat poteniali biomarkeri, caracterizai fie din punct de vedere al
m/z, fie din punct de vedere al greutii moleculare i al punctului izoelectric (pI) i sunt
necesare studii viitoare de confirmare a biomarkerilor identificai pe un numr mai mare de
cazuri, i prin alte tehnici proteomice - protein microarray, ct i validarea biomarkerilor
identificai.
50
S-a evideniat o corelaie ntre cele 2 modaliti de exprimare a profilului proteomic n

cadrul glioblastoamelor. Studiul biomarkerilor poate contribui la o mai bun nelegere a
mecanismelor reglatoare care stau la baza progresiei tumorale.
Evaluarea profilului proteomic, a factorilor angiogenici, a citokinelor pro- i antiinflamatoare poate fi folositoare n determinarea susceptibilitii tumorilor intracraniene la
terapie.
Din rezultatele obinute se poate trage concluzia final c, printr-o investigare complex
pe criterii funcionale, imagistice, histopatologice, cu adugarea unor tehnici moderne de
proteomica, se poate obine un diagnostic performant, util n prognosticarea comportamentului
biologic al tumorilor intracraniene.
Prin coroborarea datelor clinice cu cele de proteomic profilul angiogenic, al
citokinelor pro- i anti-inflamatorii, ali factori de cretere i diferii biomarkeri se dorete
realizarea unui diagostic precoce, reducerea costurilor de tratament, creterea speranei de via
i optimizarea strategiile terapeutice medicina personalizat.
Din rezultatele obinute se poate trage concluzia final c, printr-o investigare complex
cu ajutorul unor tehnologii hightroughtput moderne de analiza proteomic - tehnologia xMAP,
analiz 2D i SELDI-TOF-MS, se pot identifica biomarkeri specifici patologiilor studiate i
astfel se poate obine un diagnostic performant, util n prognosticarea comportamentului biologic
al tumorilor intracraniene.
51
BIBLIOGRAFIE
Bibliografie selectiv:
Tanaka, G., Nakazato, Y., Iri, T., Okada, T. & Abe, M. Indeterminacy n the WHO
classification of tumors: an example of the histopathological diagnosis of brain tumors. Brain
Tumor Pathol (2011).doi:10.1007/s10014-011-0025-5
Kararizou, E.G., Davaki, P.T., Davou, R.G. & Vassilopoulos, D. Morphometric assessments
for the prognostic evaluation of human gliomas. Acta Cytol 55, 203-204 (2011).
Cunliffe, C.H., Fischer, I., Parag, Y. & Fowkes, M.E. State-of-the-art pathology: new WHO
classification, implications, and new developments. Neuroimaging Clin. N. Am 20, 259-271
(2010).
Kim, Y.-H. et al. Molecular classification of low-grade diffuse gliomas. Am. J. Pathol 177,
2708-2714 (2010).
Lpez, J.I., Scheithauer, B.W., Giannini, C. & Torp, S.H. Concurrent solitary fibrous tumor
and low-grade fibrillary astrocytoma of the cerebellum. Clin. Neuropathol 29, 301-306
(2010).
Miyahara, H. et al. Anaplastic astrocytoma with angiocentric ependymal differentiation.
Neuropathology (2010).doi:10.1111/j.1440-1789.2010.01161.x
Tomuleasa, C. et al. Functional and molecular characterization of glioblastoma multiformederived cancer stem cells. J BUON 15, 583-591 (2010).
Bommakanti, K. et al. Optic chiasmatic-hypothalamic gliomas: is tissue diagnosis essential?
Neurol India 58, 833-840 (2010).
Kurwale, N.S. et al. Predictive factors for early symptomatic recurrence n pilocytic
astrocytoma: Does angiogenesis have a role to play? J Clin Neurosci 18, 472-477 (2011).
Rao, A.A.N., Laack, N.N., Giannini, C. & Wetmore, C. Pleomorphic xanthoastrocytoma n
children and adolescents. Pediatr Blood Cancer 55, 290-294 (2010).
Shaw, E.J. et al. Gene expression n oligodendroglial tumors. Anal Cell Pathol (Amst) 33, 8194 (2010).
Klink, B. et al. Glioblastomas with oligodendroglial component - common origin of the
different histological parts and genetic subclassification. Anal Cell Pathol (Amst) 33, 37-54
(2010).
Rizvi, S., Asghar, A.H. & Mehboob, J. Gliosarcoma: a rare variant of glioblastoma
multiforme. J Pak Med Assoc 60, 773-775 (2010).
Huse, J.T., Phillips, H.S. & Brennan, C.W. Molecular subclassification of diffuse gliomas:
Seeing order n the chaos. Glia (2011).doi:10.1002/glia.21165
Tabatabai, G. et al. Molecular diagnostics of gliomas: the clinical perspective. Acta
Neuropathol 120, 585-592 (2010).
Zada, G. et al. Atypical pituitary adenomas: incidence, clinical characteristics, and
implications. J. Neurosurg 114, 336-344 (2011).
Lopes, M.B.S. Growth hormone-secreting adenomas: pathology and cell biology. Neurosurg
Focus 29, E2 (2010).
Sedda, A. & Meyer, P. [Management of prolactinomas: whats new n 2010?]. Rev Med
Suisse 7, 20-24 (2011).
52
BIBLIOGRAFIE
Lv, H., Li, C., Gui, S. & Zhang, Y. Expression of estrogen receptor and growth factors n
human prolactinoma and its correlation with clinical features and gender. J Endocrinol Invest
(2011).doi:10.3275/7607
Colao, A., Grasso, L.F., Pivonello, R. & Lombardi, G. Therapy of aggressive pituitary
tumors. Expert Opin Pharmacother (2011).doi:10.1517/14656566.2011.568478
Messer, C.K. et al. ACTH-producing remnants following apoplexy of an ACTH-secreting
pituitary macroadenoma. Pituitary (2010).doi:10.1007/s11102-010-0247-2
Pawlikowski, M., Kunert-Radek, J. & Radek, M. Plurihormonality of pituitary adenomas n
light of immunohistochemical studies. Endokrynol Pol 61, 63-66 (2010).
Sansur, C.A. & Oldfield, E.H. Pituitary carcinoma. Semin. Oncol 37, 591-593 (2010).
Hata, N. et al. Platelet-derived growth factor BB mediates the tropism of human
mesenchymal stem cells for malignant gliomas. Neurosurgery 66, 144-156; discussion 156157 (2010).
Fiorenzo, P. et al. HIF1-positive and HIF1-negative glioblastoma cells compete in vitro but
cooperate n tumor growth in vivo. Int. J. Oncol 36, 785-791 (2010).
Brunckhorst, M.K., Wang, H., Lu, R. & Yu, Q. Angiopoietin-4 promotes glioblastoma
progression by enhancing tumor cell viability and angiogenesis. Cancer Res 70, 7283-7293
(2010).
Onishi, M., Ichikawa, T., Kurozumi, K. & Date, I. Angiogenesis and invasion n glioma.
Brain Tumor Pathol 28, 13-24 (2011).
Calzolari, F. & Malatesta, P. Recent insights into PDGF-induced gliomagenesis. Brain
Pathol 20, 527-538 (2010).
Anido, J. et al. TGF- Receptor Inhibitors Target the CD44(high)/Id1(high) GliomaInitiating Cell Population n Human Glioblastoma. Cancer Cell 18, 655-668 (2010).
Andersson, U. et al. A comprehensive study of the association between the EGFR and
ERBB2 genes and glioma risk. Acta Oncol 49, 767-775 (2010).
Scium, G., Santoni, A. & Bernardini, G. Chemokines and glioma: invasion and more. J.
Neuroimmunol 224, 8-12 (2010).
Kast, R.E. & Focosi, D. Three paths to better tyrosine kinase inhibition behind the bloodbrain barrier n treating chronic myelogenous leukemia and glioblastoma with imatinib.
Transl Oncol 3, 13-15 (2010).
Phuphanich, S. et al. Phase 1 clinical trial of bortezomib n adults with recurrent malignant
glioma. J. Neurooncol 100, 95-103 (2010).
Essock-Burns, E. et al. Assessment of perfusion MRI-derived parameters n evaluating and
predicting response to antiangiogenic therapy n patients with newly diagnosed glioblastoma.
Neuro-oncology 13, 119-131 (2011).
Walbert, T. et al. Combination of 6-thioguanine, capecitabine, and celecoxib with
temozolomide or lomustine for recurrent high-grade glioma. J. Neurooncol 102, 273-280
(2011).
Stupp, R. et al. Phase I/IIa study of cilengitide and temozolomide with concomitant
radiotherapy followed by cilengitide and temozolomide maintenance therapy n patients with
newly diagnosed glioblastoma. J. Clin. Oncol 28, 2712-2718 (2010).
53
BIBLIOGRAFIE
Lottspeich, F., Kellermann, J. & Keidel, E.-M. Molecular biology tools: proteomics
techniques n biomarker discovery. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl 242, 19-22 (2010).
Li, G. et al. Cancer: A proteomic disease. Sci China Life Sci (2011).doi:10.1007/s11427-0114163-0
Rhea, J.M. & Molinaro, R.J. Cancer biomarkers: surviving the journey from bench to
bedside. MLO Med Lab Obs 43, 10-12, 16, 18; quiz 20, 22 (2011).
Martins-de-Souza, D. Is the word biomarker being properly used by proteomics research n
neuroscience? Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 260, 561-562 (2010).
Boja, E. et al. Evolution of clinical proteomics and its role n medicine. J. Proteome Res 10,
66-84 (2011).
Weber, G.F., Lett, G.S. & Haubein, N.C. Categorical meta-analysis of Osteopontin as a
clinical cancer marker. Oncol. Rep 25, 433-441 (2011).
Chiou, S.-H. & Wu, C.-Y. Clinical proteomics: current status, challenges, and future
perspectives. Kaohsiung J. Med. Sci 27, 1-14 (2011).
Oshita, F. et al. Proteomic screening of completely resected tumors n relation to survival n
patients with stage I non-small cell lung cancer. Oncol. Rep 24, 637-645 (2010).
Li, M. et al. A novel function for vimentin: the potential biomarker for predicting melanoma
hematogenous metastasis. J. Exp. Clin. Cancer Res 29, 109 (2010).
Xue, A. et al. Discovery of serum biomarkers for pancreatic adenocarcinoma using
proteomic analysis. Br. J. Cancer 103, 391-400 (2010).
Chen, L. et al. Enhanced detection of early hepatocellular carcinoma by serum SELDI-TOF
proteomic signature combined with alpha-fetoprotein marker. Ann. Surg. Oncol 17, 25182525 (2010).
Li, J. et al. A bioinformatics workflow for variant peptide detection n shotgun proteomics.
Mol Cell Proteomics (2011).doi:10.1074/mcp.M110.006536
Bielow, C., Grpl, C., Kohlbacher, O. & Reinert, K. Bioinformatics for qualitative and
quantitative proteomics. Methods Mol. Biol 719, 331-349 (2011).
Zhang, G.L., Deluca, D.S. & Brusic, V. Database resources for proteomics-based analysis of
cancer. Methods Mol. Biol 723, 349-364 (2011).
Niclou, S.P., Fack, F. & Rajcevic, U. Glioma proteomics: status and perspectives. J
Proteomics 73, 1823-1838 (2010).
Schuhmann, M.U. et al. Peptide screening of cerebrospinal fluid n patients with
glioblastoma multiforme. Eur J Surg Oncol 36, 201-207 (2010).
Deighton, R.F., McGregor, R., Kemp, J., McCulloch, J. & Whittle, I.R. Glioma
pathophysiology: insights emerging from proteomics. Brain Pathol 20, 691-703 (2010).
Salehi, F. et al. Biomarkers of pituitary neoplasms: a review (Part II). Neurosurgery 67,
1790-1798; discussion 1798 (2010).
Cristina, C. et al. VEGF and CD31 association n pituitary adenomas. Endocr. Pathol 21,
154-160 (2010).
Fuertes, M. et al. Cytokines and genes n pituitary tumorigenesis: RSUME role n cell
biology. Front Horm Res 38, 1-6 (2010).
Collet, B. et al. Differential analysis of glioblastoma multiforme proteome by a 2D-DIGE
approach. Proteome Sci 9, 16 (2011).
54

Rezumat Teza Codrici Elena

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezumat Teza Codrici Elena

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

IDENTIFICAREA DE NOI BIOMARKERI PRIN

CLASIFICAREA TUMORILOR INTRACRANIENE........................... 6

CLASIFICAREA TUMORILOR HIPOFIZARE ................................... 7

INTERLEUKINA 1 (IL-1) ...................................................................... 18

PARTEA PRACTIC ............................................................................. 32

ANALIZA IMUNOHISTOCHIMIC SI SERIC A FACTORILOR

GENERALITI TUMORI INTRACRANIENE

CAPITOLUL II Clasificarea tumorilor intracraniene

CLASIFICAREA TUMORILOR INTRACRANIENE

CAPITOLUL II Clasificarea tumorilor intracraniene

Glioame mixte, precum oligoastrocitoame, conin celule de diferite tipuri.

CLASIFICAREA TUMORILOR HIPOFIZARE

Cu granulaii dense sau rare - adenomul bazofil clasic, celule

CAPITOLUL II Clasificarea tumorilor intracraniene

nuclear i apoptoz posibile

Adenoame Crooke - filamente de citokeratin ce creaz

- celule polare, de dimensiuni mici sau medii; elongaii

- fr markeri ultrastructurali sau imunohistochimici

- efect de masa i hipopituitarism

imunopozitivitate pentru mai multe tipuri de hormoni

- comportament agresiv, invazive,

- fr markeri ultrastructurali sau imunohistochimici

- tumori secretante de PRL i

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

ANGIOGENEZA LA NIVELUL TUMORILOR INTRACRANIENE

Angiogeneza ca un mecanism patogenic al bolilor

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

Figura 3.1. Balana angiogenic.

Factorii angiogenici solubili - posibili markeri la nivelul tumorilor

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

aceast situaie, este necesar s se mreasc specificitatea obiectivelor terapeutice n

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

Angiogeneza n tumorile hipofizare

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

Tumorigeneza pituitar este un proces nc neelucidat, implicnd dereglri ale ciclului

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

VEGF i comportamentul invaziv al adenoamelor somatotrope i prolactinoamelor induse prin

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

produciei de plasminogen activator, colagenaz i MMP-uri n celulele endoteliale (Wonga

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

CAPITOLUL III Angiogeneza la nivelul tumorilor intracraniene

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

PROTEOMICA I BIOMARKERII LA NIVELUL TUMORILOR

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Visul de a avea secvenierea complet a genomului - uman i nu numai - este de mult o

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Figura 4.3. Reprezentare schematic a celor 2 tipuri de abordri proteomice: top-down i

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

screening, diagnostic i prognoz. Biomarkerul se refer la o substan care reprezint un indiciu

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Figura 4.5. Clasificarea biomarkerilor - reprezentare schematic.

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Figura 4.7. Fluxulul de lucru n studiul biomarkerilor.

Capitolul IV Proteomica i biomarkerii

Separarea proteinelor realizeaz msurarea a 3

mase moeculare extreme i pentru

High throughput n ceea ce