Feb

Mai 2014
Cursul
Cursul
3
3
Etape Etape
Iniiere
Elongare
Terminare
Preiniiere
Preiniiere
RegiuneaundencepereplicareamoleculeideADN=origineareplicrii
OmoleculADNpoateavea:
1regiuneori Cromozombacterian
Plasmidebacteriene
ori

C
ori

V
Cromozomulbacterianesteunrepliconunic
INIIEREAREPLICRIIADN
maimulteregiuniori Cromozomidelaeucariote
Cromozomiidetipeucariotsuntstructurimultirepliconice
INIIEREAREPLICRIIADN
Formarea unei bifurca Formarea unei bifurca ii de replicare necesit separarea celor ii de replicare necesit separarea celor 2 catene parentale 2 catene parentale
Replicarea unei molecule de ADN NU Replicarea unei molecule de ADN NU ncepe ncepe n orice punct al moleculei, n orice punct al moleculei,
ci ci n anumite situsuri = n anumite situsuri = origini de replicare origini de replicare

( (ori ori ) )
Replicon Replicon

= fragment de ADN replicat de la 1 origine de replicare = fragment de ADN replicat de la 1 origine de replicare
Cromozomul de Cromozomul de E.coli E.coli are 1 are 1 ori ori cromozom unirepliconic (replicon unic) cromozom unirepliconic (replicon unic)
Majoritatea bacteriilor au cromozomi unirepliconici Majoritatea bacteriilor au cromozomi unirepliconici
Fiecare cromozom de la eucariote are mai multe regiuni Fiecare cromozom de la eucariote are mai multe regiuni ori ori cromozomi multirepliconici cromozomi multirepliconici
Sistemul de ini Sistemul de ini iere a replicrii ADN este format din iere a replicrii ADN este format din 2 componente: 2 componente:
replicator replicator i i t t regiunea ori, denumi regiunea ori, denumi = = Componenta ADN Componenta ADN
are o anumit secven are o anumit secven de nucleotide de nucleotide
iator , PRIMOSOM iator , PRIMOSOM ini ini i i iere, denumite iere, denumite = proteine de ini = proteine de ini Componenta proteic Componenta proteic
se ata se ata eaz la eaz la ori ori (replicator) (replicator)
Majoritatea secven Majoritatea secven elor replicator de la diverse organisme con elor replicator de la diverse organisme con in: in:
- -

o regiune de legare a proteinelor de ini o regiune de legare a proteinelor de ini iere iere
- - o regiune bogat o regiune bogat n A/T n A/T



u u or de desfcut legturile de H or de desfcut legturile de H de ctre proteinele ini de ctre proteinele ini iator iator
Situsul oriC este Situsul oriC este n afara acestei regiuni n afara acestei regiuni
5 cutii dna A (9) 5 cutii dna A (9)
= regiuni 9 = regiuni 9- -merice merice
aici se ata aici se ata eaz proteina Dna A eaz proteina Dna A
3 regiuni 13 3 regiuni 13- -merice (13) merice (13)
bogate bogate n A/T n A/T
aici se desface dublul helix aici se desface dublul helix
E.coli E.coli
SV40 SV40
4 situsuri P 4 situsuri P
= regiuni 5 = regiuni 5- -merice merice
aici se ata aici se ata eaz proteina ini eaz proteina ini iator iator


antigenul T antigenul T
2 regiuni EP 2 regiuni EP (Early Palindrome (Early Palindrome) )
= 20 pb = 20 pb
aici se desface dublul helix aici se desface dublul helix
S.cerevisiae S.cerevisiae
2 regiuni A, B1 2 regiuni A, B1
aici se ata aici se ata eaz proteina ORC eaz proteina ORC
1 regiune B2 1 regiune B2
aici se ata aici se ata eaz helicaza eaz helicaza
aici se desface dublul helix aici se desface dublul helix
proteine ini proteine ini iator iator
3 13-mers Dna A 5 dna A, 9-mers E.coli
2 EP (20pb) antigenul T 4 P, 5-mers SV40
1 B2 ORC 2 A, B1 S.cerevisiae
situsuri de ata situsuri de ata are are situsuri de desfacere situsuri de desfacere
Proteinele ini Proteinele ini iator: iator:
- -

se ata se ata eaz la replicator eaz la replicator, situs , situs- -specific: specific: E.coli E.coli

5 cutii dnaA 5 cutii dnaA
- -

interac interac ioneaz cu alte proteine pe care le ioneaz cu alte proteine pe care le aduc aduc

la replicator la replicator
- -

unele desfac dublul helix unele desfac dublul helix n reginile adiacente situsului de legare n reginile adiacente situsului de legare
E.coli E.coli ierii replicrii cromozomului ierii replicrii cromozomului Principalele etape ale ini Principalele etape ale ini
(a) (a) Mai multe exemplare de protein DnaA Mai multe exemplare de protein DnaA- -ATP ATP

situsurile dnaA situsurile dnaA
(b) Desfacerea dublului helix (b) Desfacerea dublului helix n zona situsurilor 9 n zona situsurilor 9- -mers mers
(c) Ata (c) Ata area helicazei bacteriene area helicazei bacteriene Dna B Dna B, a , adus de ctre Dna C dus de ctre Dna C
(complexul Dna B (complexul Dna B

Dna C) Dna C)
(d) Deplasarea helicazei (d) Deplasarea helicazei ndeprteaz proteinele Dna A ndeprteaz proteinele Dna A
https://highered.mcgraw https://highered.mcgraw- -hill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation17.html hill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation17.html
Cromozomii de la EK se replic o singur dat per ciclu celular Cromozomii de la EK se replic o singur dat per ciclu celular
Replicarea ADN cromozomal Replicarea ADN cromozomal

numai numai n faza S a ciclului celular n faza S a ciclului celular
toat cantitatea de ADN cromozomal toat cantitatea de ADN cromozomal i doar o singur dat i doar o singur dat o dat o dat n faza S este replicat n faza S este replicat
Originile de replicare de pe cromozomii EK sunt separate de Originile de replicare de pe cromozomii EK sunt separate de ~ ~

30 kpb 30 kpb : : crz EK mici au crz EK mici au > >

10 10 ori ori
crz crz umani mari umani mari au au mii de mii de ori ori
Ptr ca fiecare cr Ptr ca fiecare crt t

EK EK s fie replicat integral s fie replicat integral n timpul fiecrei faze S n timpul fiecrei faze S, t , trebuie activat un numr suficient de mare de rebuie activat un numr suficient de mare de ori ori
(nu (nu neaprat toate neaprat toate ori ori , d , dar dac sunt prea pu ar dac sunt prea pu ine, at ine, atunci anumite regiuni din genom vor rmne ne unci anumite regiuni din genom vor rmne ne- -replicate) replicate)
n mod normal, nici un n mod normal, nici un ori ori nu poate ini nu poate ini ia 2 runde de replicare ia 2 runde de replicare n aceea n aceea i faz S i faz S; ; deci, est deci, este inactivat pn la urmtoarea S e inactivat pn la urmtoarea S
Un crz EK cu 5 secven Un crz EK cu 5 secven e replicator e replicator
- -

mai mai nti sunt activate secven nti sunt activate secven ele 3 ele 3 i 5 i 5
- - se formeaz se formeaz 2 bucle de replicare 2 bucle de replicare

4 bifurca 4 bifurca ii de ii de
replicare bidirec replicare bidirec ional ional
- -

secven secven ele ele ori ori de pe moleculele fiice sunt blocate de pe moleculele fiice sunt blocate
pn la urmtoarea rund pn la urmtoarea rund ( (X X) )
- -

elongarea bifurca elongarea bifurca iilor de replicare dep iilor de replicare dep e e te te
replicatorii 2 replicatorii 2 i 4 i 4 nainte ca ace nainte ca ace tia s se activeze tia s se activeze
- -

ca urmare, 2 ca urmare, 2 i 4 i 4 nu se mai activeaz nu se mai activeaz, iar refginile , iar refginile
respective sunt replicate respective sunt replicate n mod n mod pasiv pasiv
- -

n contrast, replicatorul 1 se ini n contrast, replicatorul 1 se ini iaz iaz nainte ca nainte ca
replicarea s ajung replicarea s ajung n regiunea lui n regiunea lui
Prezen Prezen a pe un crz a mai multor replicatori dect ar fi a pe un crz a mai multor replicatori dect ar fi
necesar este o redundan necesar este o redundan , d , dar asigur replicarea ar asigur replicarea
complet a fiecrui crz complet a fiecrui crz. .
ncrcarea helicazei ncrcarea helicazei Prima etap Prima etap n ini n ini ierea replicrii la EK ierea replicrii la EK
La EK, etapele ini La EK, etapele ini ierii replicrii ADN se desf ierii replicrii ADN se desf oar oar n faze distincte ale ciclului celular n faze distincte ale ciclului celular i i n ordine diferit fa n ordine diferit fa de PK de PK
ncrcarea helicazei la to ncrcarea helicazei la to i replicatorii i replicatorii

n n G1 G1

( ( nainte de S) nainte de S)
Activarea replicatorilor (inclusiv activarea helicazei) Activarea replicatorilor (inclusiv activarea helicazei)
Asamblarea replisomului Asamblarea replisomului
n n S S
ncrcarea helicazei pe crz EK ncrcarea helicazei pe crz EK
- -

proteina ORC proteina ORC~ATP ~ATP

se ata se ata eaz la replicator eaz la replicator
- -

se ata se ata eaz proteina Cdc eaz proteina Cdc6 6
- - helicaza helicaza (Mcm2 (Mcm2- -7) 7) este adus de Cdt este adus de Cdt1 1
- -

helicaza este helicaza este ncrcat pe ADN ncrcat pe ADN (ca dimer) (ca dimer)
- -

sunt eliberate Cdc6 sunt eliberate Cdc6 i Cdt1 i Cdt1
Cdc6, Cdt1 sunt similare cu DnaC de la PK Cdc6, Cdt1 sunt similare cu DnaC de la PK
Helicazele Helicazele ncrcate sunt activate de ncrcate sunt activate de 2 protein 2 protein- -kinaze: kinaze: CDK (cyclin CDK (cyclin- -dependent dependent- -kinase) kinase) DDK (Dbf4 DDK (Dbf4- -dependent dependent- -kinase), kinase),
[ [ Protein Protein- -kinaze = proteine care ata kinaze = proteine care ata eaz eaz, c , covalent, gru ovalent, grupri fosfat la alte proteine pri fosfat la alte proteine, , int int

] ]
ce sunt activate la intrarea ce sunt activate la intrarea n faza S n faza S
Aceste 2 protein Aceste 2 protein- -kinaze sunt activate la inrarea in faza S kinaze sunt activate la inrarea in faza S
si, fie direct, fie prin intermediul altor proteine si, fie direct, fie prin intermediul altor proteine: :
- -

d desfac helicaza in monomer esfac helicaza in monomer
- -

a ataseaza cate un monomer de helicaza taseaza cate un monomer de helicaza
pe cate o monocatena ADN pe cate o monocatena ADN
- -

In final are loc asamblarea replisomului = complex proteic In final are loc asamblarea replisomului = complex proteic
Primaza (ADN pol Primaza (ADN pol o o) )
ADN pol ADN pol c c
ADN pol ADN pol o o
Clamp Clamp, clamp loader , clamp loader
Helicaza Helicaza
G1
G1
S
S
+ ORC
Incarcarea helicazei pe ADN
Activarea helicazei
Deschiderea dublului helix
Formarea replisomului
TERMINAREA REPLICRII MOLECULELOR ADN TERMINAREA REPLICRII MOLECULELOR ADN
Necesit un set de evenimente specifice Necesit un set de evenimente specifice
Difer de la molecule ADN Difer de la molecule ADN CIRCULARE CIRCULARE

la molecule ADN la molecule ADN LINEARE LINEARE
Terminarea replicrii ADN circular Terminarea replicrii ADN circular


cromozomul cromozomul E.coli E.coli
La terminarea replicrii, cele 2 molecule fiice ramn
legate una de alta ntr-o structur de tip catenan catenan
Catenan = structur format din 2 cercuri interconectate


(2 zale dintr-un lan)
Separarea celor 2 cromozomi = segregare Separarea celor 2 cromozomi = segregare
Ptr c cei Ptr c cei 2 crz sunt circulari: segregarea = decatenare 2 crz sunt circulari: segregarea = decatenare
Topoizomeraze de clas II Topoizomeraze de clas II
-

taie una din cele 2 molecule (ambele catene)
-

trage molecula ntreag (netiat) prin tietur
- reface molecula tiat
Replicarea avanseaz pe cele 2 bifurcaii


(replicare bidirecional)
Molecula ia forma literei greceti THETA
replicare pe model THETA

u u
Topoizomeraz II Topoizomeraz II
Topoisomerase 1 and 2.flv Topoisomerase 1 and 2.flv
Terminarea replicrii ADN linear Terminarea replicrii ADN linear
- -

cromozomii de la eucariote cromozomii de la eucariote
Topoizomeraze de clas II Topoizomeraze de clas II
1.

Dei cromozomii d ela EK sunt molecule ADN lineare,
datorit dimensiunii mari, la terminarea replicrii cele
2 molecule fiice sunt nfurate una n jurul celeilalte
2. 2.

Replicarea catenei Replicarea catenei ntrziate ridic probleme ntrziate ridic probleme n n
regiunile terminale ale cromozomilor (telomere) regiunile terminale ale cromozomilor (telomere)
-

ultimul primer se gsete exact la captul 3

al catenei parentale
-

dup ndeprtarea acestui primer de ctre RNaza H,
molecula rmne cu o caten mai lung

capul 3
- dac procesul s-ar opri aici, atunci la fiecare rund de replicare,
cromozomii s-ar scurta semnificativ, n final cu pierdere de gene
Telomeraza Telomeraza
TELOMERAZA = o ADN po TELOMERAZA = o ADN pol ce nu necesit primer l ce nu necesit primer separat separat
Capetele cromozomilor eucariotici = TELOMERE Capetele cromozomilor eucariotici = TELOMERE
Repeti Repeti ii ii cap cap- -coad coad

ale unei secven ale unei secven e bogate e bogate n TG n TG
d de ex., telomerele cromozomilor umani = repeti e ex., telomerele cromozomilor umani = repeti ii ale secven ii ale secven ei ei 5 5



TTAGGG TTAGGG

3 3
Majoritatea acestor repeti Majoritatea acestor repeti ii sunt ii sunt

d.c., dar capul 3 d.c., dar capul 3 al fiecrui cromozom se prelunge al fiecrui cromozom se prelunge te monocatenar te monocatenar
Aceast structur ac Aceast structur ac ioneaz ca o nou origine de replicare pentru o ADN polimeraz s ioneaz ca o nou origine de replicare pentru o ADN polimeraz special pecial - -

TELOMERAZA TELOMERAZA
TELOMERAZA TELOMERAZA = r = ribonucleoprotein ibonucleoprotein = =
Complex de proteine, una din ele = Complex de proteine, una din ele = reverstranscriptaz telomerazic TERT reverstranscriptaz telomerazic TERT
- -

ca ca i alte ADN pol, extinde capul 3 i alte ADN pol, extinde capul 3

al unui primer al unui primer
- -

pe post de primer, folose pe post de primer, folose te capul 3 te capul 3 - -OH al catenei parentale OH al catenei parentale
- - include o scurt regiune complementar cu repeti include o scurt regiune complementar cu repeti ia telomeric ia telomeric
La om: La om:

5 5

AAUCCCAAUC AAUCCCAAUC

3 3
O molecul de ARN O molecul de ARN = = ARN telomerazic ARN telomerazic

TER TER
- - pe post de caten matri pe post de caten matri folose folose te ARN te ARN- -ul propriu ul propriu
- -

astfel, extinde capul 3 astfel, extinde capul 3

al catenei ADN parentale al catenei ADN parentale
- - telomeraza se desprinde de pe catena ADN telomeraza se desprinde de pe catena ADN, ,
se deplaseaz spre capul se deplaseaz spre capul 3 3

i se rea i se rea eaz eaz
Procesul se reia de multe ori Procesul se reia de multe ori
Capul 3 Capul 3 - -OH este prelungit OH este prelungit
cu multe repeti cu multe repeti ii TTAGGG ii TTAGGG
Apoi telomeraza se desprinde complet Apoi telomeraza se desprinde complet
ADN pol ADN pol obi obi nuit nuit

prelunge prelunge te capul 5 te capul 5
n final, la EK cromozomii au capul 3 n final, la EK cromozomii au capul 3

extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
MBOG 8 MBOG 8

Action of telomerase Action of telomerase
Ordinea evenimentelor Ordinea evenimentelor n replicarea telomerelor n replicarea telomerelor
- -

Telomeraza (T) se a Telomeraza (T) se a eaz cu ARN eaz cu ARN- -ul propriu (TER) ul propriu (TER) n zona de complementariatte a monocatenei ADN de la capul 3 n zona de complementariatte a monocatenei ADN de la capul 3 - -OH OH
- - extinde aceast monocaten ADN extinde aceast monocaten ADN, folosind drept primer capul 3 , folosind drept primer capul 3 - -OH al acesteia OH al acesteia
drept matri drept matri

propriul ARN propriul ARN
- - T repet de multe ori acest ciclu T repet de multe ori acest ciclu Extinde capul 3 Extinde capul 3

cu multe repeti cu multe repeti ii [ TTAGGG ] ii [ TTAGGG ]
- -

apoi T se desprinde complet apoi T se desprinde complet
- -

capul 5 capul 5

este prelungit, pe modelul unei catene este prelungit, pe modelul unei catene ntrziate, de ntrziate, de ctre o ADN pol ctre o ADN pol obi obi nuit nuit
n final, la EK cromozomii au capul 3 n final, la EK cromozomii au capul 3

extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
REPLICAREA ADN
REPLICAREA ADN
I. INI I. INI IEREA IEREA
ori ori
1 1 ori ori pe crz bacterian pe crz bacterian

crz unirepliconic crz unirepliconic
n n ori ori pe crz EK pe crz EK

crz multirepliconici crz multirepliconici
Replicon = secven Replicon = secven ADN replicat de la un ADN replicat de la un ori ori
Secven Secven ele ADN din ele ADN din ori ori au func au func ie de ie de replicator replicator
+ +
Proteine ini Proteine ini iator = iator = PRIMOSOM PRIMOSOM situsuri de legare a proteinelor ini situsuri de legare a proteinelor ini iator iator
regiunile A/T regiunile A/T, , u u or de desfcut or de desfcut Aici se formeaz bucla de replicare Aici se formeaz bucla de replicare
PK PK PK PK
Complexul proteic primosom Complexul proteic primosom
Proteina Proteina DnaA DnaA

se ata se ata eaz la cutiile dnaA eaz la cutiile dnaA
Distorsionarea ADN Distorsionarea ADN n zona de legare n zona de legare
Desfacerea dublului helix Desfacerea dublului helix n regiunile A/T n regiunile A/T
ncrcarea ncrcarea helicazei helicazei

( (DnaB DnaB) p ) pe ADN de ctre e ADN de ctre DnaC DnaC
Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurca Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurca ii ii
Asamblarea replisomului Asamblarea replisomului
Proteina ORC Proteina ORC~ATP ~ATP

se ata se ata eaz la replicator eaz la replicator
Complexul proteic de ini Complexul proteic de ini iere iere
+ proteine CDC ( + proteine CDC ( - -

DnaC) DnaC)
ncrcarea ncrcarea helicazei helicazei

( (MCM MCM) pe ADN ) pe ADN G1 G1
+ proteine CDK + proteine CDK
Activarea helicazei Activarea helicazei S S
Desfacerea dublului helix Desfacerea dublului helix
Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurca Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurca ii ii
Asamblarea replisomului Asamblarea replisomului
recapitulare recapitulare
II. ELONGAREA II. ELONGAREA
REPLISOM REPLISOM
Primaz Primaz
Helicaz Helicaz
ADN polimeraz ADN polimeraz
Proteine ajuttoare Proteine ajuttoare Sliding Clamp Sliding Clamp, C , Clamp loader lamp loader
RNaz RNaz
Ligaz Ligaz
PK PK
ADN pol III holoenzima ADN pol III holoenzima
3 copii ADN pol III miez 3 copii ADN pol III miez
1 sliding clamp 1 sliding clamp
1 clamp loader 1 clamp loader
Catena ADN nou este sintetizat Catena ADN nou este sintetizat n direc n direc ie 5 ie 5



3 3
Catena ADN matri Catena ADN matri este citit este citit n direc n direc ie invers ie invers
Catena ADN nou este sintetizat prin complementaritate cu cea v Catena ADN nou este sintetizat prin complementaritate cu cea veche eche
La o bifurca La o bifurca ie de replicare ie de replicare
Una din catenele noi = c Una din catenele noi = catena conductoare atena conductoare, in direc , in direc ia de deplasare a bifurca ia de deplasare a bifurca iei iei
Cealalt caten nou Cealalt caten nou = catena = catena ntrziat ntrziat, , n direc n direc ie invers ie invers
Eucariote Eucariote Procariote Procariote Func Func ii ii
ORC DnaA Principala protein de iniiere a replicrii
MCM DnaB Desfacerea legturilor de H - Helicaz
RPA Ssb Stabilizarea monocatenelor ADN
ADN pol o
DnaG Sintez de primeri Primaz = o ARN polimeraz
special
PCNA
Sliding Clamp (|-Clamp)
Menine ADN pol pe ADN i i crete procesivitatea
RFC
Clamp Loader
(subuniti: o o

t)
ncarc sliding clamp pe ADN
ADN pol o pe catena ntrziat
ADN pol c pe cat.conductoare
ADN pol III miez ADN polimeraza replicativ
RNaza H RNaza H
Procesarea fragmentelor Okazaki
(a) Eliminarea primerilor
Dna2, FEN1 ADN pol I (b) Umplerea golurilor prin sintez ADN
ADN ligaza I ADN ligaza H (c) Ligarea fragmentelor Okazaki
Topoizomeraz de clas I
Topoizomeraz de clas II
Topoizomeraz de clas I
Topoizomeraz de clas II
(ADN giraz)
Dersucirea ADN parental n faa buclei de replicare
Topo cls I, Topo cls II Topo cls I, Topo cls II Dersucirea moleculelor d.c. fiice
Topoizomeraz cls II
Terminarea replicrii
PK

segregarea celor 2 crz bacterieni
Telomeraza EK terminarea replicrii la telomere
III. TERMINAREA III. TERMINAREA
PK PK
PK PK
Cromozomul bacterian = ADN dc CIRCULAR Cromozomul bacterian = ADN dc CIRCULAR Cromozomii eucariotelor = ADN dc LINEAR Cromozomii eucariotelor = ADN dc LINEAR
Terminarea replicrii Terminarea replicrii

2 molecule ADN dc circulare 2 molecule ADN dc circulare
interconectate interconectate
Desfacerea celor 2 molecule Desfacerea celor 2 molecule

TOPO cls II TOPO cls II
Terminarea replicrii Terminarea replicrii

capul 3 capul 3

al moleculei parentale este extins al moleculei parentale este extins
TELOMERAZA TELOMERAZA
(a) Prelunge (a) Prelunge te capul 3 te capul 3

cu multe repeti cu multe repeti ii TTAGGG ii TTAGGG
- -

Primer = capul 3 Primer = capul 3

al catenei vechi al catenei vechi
- -

Matri Matri = ARN telomerazic (TER) = ARN telomerazic (TER)
Acest proces de reverstranscriere se repet de multe ori Acest proces de reverstranscriere se repet de multe ori
(b) Se desprinde complet de pe ADN (b) Se desprinde complet de pe ADN
(c) ADN pol (c) ADN pol o o

prelunge prelunge te capul 5 te capul 5
(sinte (sintez prin fragmente Okazaki z prin fragmente Okazaki) )
n final, cromozomii au capul 3 n final, cromozomii au capul 3

extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
Alfabet grecesc Alfabet grecesc
Se citete Liter mic Liter mare Se citete Liter mic Liter mare
niu
v N
alfa
o A
ksi

beta
| B
omicron
o O
gama
I
pi
t H
delta
o A
rho (ro)
P
epsilon
c E
sigma
o E
zeta
, Z
tau
t T
eta
q H
ipsilon
u Y
theta
u O
phi (fi)
| u
iota
i I
chi (hi)
_ X
kappa
k K
psi
+
lambda
A
omega
e O
miu
M