BAB I

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam pemanfaatan
makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup
(enzim,alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi
secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi.
Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan
menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut.
Genetika adalah ilmu yang mempelajari sifat-sifat keturunan (hereditas) serta segala sluk
beluknya selama ilmiah. Genetika disebut juga ilmu keturunan, ilmu ini mempelajari
berbagai aspek yang menyangkut pearisan sifat, bagaimana sifat keturunan ilmu itu
diturunkan dari generasi kegenerasi serta variasi-variasi yang mungkin timbul didalamnya
atau yang menyertainya. Pewarisan sifat tersebut dapat terjadi melalui proses seksual.
Genetika berusaha membawakan material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan
genetik), bagaimana informasi tersebut di ekspresikan ekspresi genetic dan bagaimana
informasi tersebut dipindahkan dari individu satu ke individu lain. PCR adalah suatu metode
in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua
primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target
DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang
diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
1. B. Rumusan masalah
Apa pengertian dari PCR ?
Apa komponen-komponen dari PCR ?
Bagaimana proses PCR ?
Bagaimana aplikasi dari PCR ?
C. Tujuan
Untuk mengetahui pengertian dari PCR
Untuk menjelaskan komponen-komponen dari PCR
Untuk menjelaskan proses PCR
Untuk mengetahui aplikasi dari PCR
BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian PCR
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida
tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada
tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi
dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk
melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat
digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.
Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan
jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n
kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan
bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi
urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam
jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5g,
oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam
volume 50-100 l. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu
sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam
genom bakteri.
PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang
dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda
DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan
dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan
kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin
thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan
bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.
PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)
DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat
dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai
teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983
dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan
PCR banyak dilakukan di bidangbiokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan
hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi
berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens
tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita
yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat
kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas
penggunaannya.
Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan
dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat
dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu
sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi
berantai polimerasi.
B. Komponen Komponen PCR
Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:
1. 1. DNA cetakan
DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di
dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang
sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA
apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA
template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah
menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan
panas selama 1 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan
menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer
akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer
dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada
dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu
yang lebih rendah.
1. 2. Oligonukleotida primer
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 25 basa nukleotida)
yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR
ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai
DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen
pada ujung 3OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama
1 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu
inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan
melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada
DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan
hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan
hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi
selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA
yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi
berikutnya.
Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 30 klai (siklus)
sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru
hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan
yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di
dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin
sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung,
misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA
polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 30 siklus amplikasi.
1. 3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP
adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-
masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan
merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan
reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.
1. 4. DNA Polimerase
Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen
Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989).
Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5
3)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak
tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara
terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA
polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek
primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu
perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida
tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.
1. a. Taq DNA Polimerase
Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain
yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu
rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai
kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas
eksonuklease 3 5. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas
optimumnya sekitar 750C 800C.
Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi
yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini
maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus
dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand
dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya
yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen
Klenow.
Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 5
0 C. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 50 nukleotida
per detik per molekul enzim. aktu paruh (half-time) aq DNA polymerase pada suhu 95 C
adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat
digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang
juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin,
gliserol, dan ammonium sulfat.
Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai
potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada
kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan
kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti
misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi
30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen -globin (14990 nukleotida).
Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X
kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.
Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan
satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3 fragmen DNA hasil polimerasi meskipun
tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode
PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada
kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA
hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu
tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA
hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended
ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul
dengan menggunakan aktivitas polymerase 5 3 fragmen Klenow.
Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq
DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi
dNTP yang digunakan adalah 0,7 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan
menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini
juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.
1. b. Tth DNA polimerse
Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth
DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8.
Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas
eksonuklease 3 5. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25)
dan suhu sekitar . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas
transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion
mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas
serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada
Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang
dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan
radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.
Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi
pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul
akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat
digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang
diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan
menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk
melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.
1. c. Pwo DNA polymerase
Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei.
Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini
mempunyai prosesivitas polimerasi 5 3 yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease ,
dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease . Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas
thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim
ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu
paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3 5 (aktivitas proof-reading dalam
proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan
(fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang
dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk
mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih
56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika
enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk
amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in
vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat
penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.
Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung
pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul
secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh
karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:
1) Cloning produk PCR
2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual
3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan
4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal
5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur
1. d. Pfu dan Tli DNA polymerase
DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli
DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat
molekul 92 kD, aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini
diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA
polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul
DNA dengan ujung tumpul.
Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap
panas, aktivitas optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu .
Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease .
1. 5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM
MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer
dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk
PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl
2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena
kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA
template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat
rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi
chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg
2+
yang bebas bila terlalu
rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila
terlalu banyak ion Mg
2+
yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.
1. C. Tahapan Proses PCR
PCR merupakan tehnik amplifikasi DNA selektif in vitro yang meniru fenommena replikasi
DNA in vivo. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA
sebagai cetakan, primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri akhiran sekuens
cetakan DNA yang sudah ditentukan), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dan enzim
TAQ polimerase yaitu enzim dari bakteri Termovilus aquatikus.
Sejak ditemukannya struktur DNA untai ganda, kita mulai memahami prinsip replikasi DNA
terutama kaitannya dengan mekanisme transfer materi genetik. Seperti yang telah dijelaskan
dalam materi Asam Nukleat dalam struktur DNA untai ganda tersebut, basa A dan T , juga C
dan G , memiliki ikatan hidgrogen yang mudah dirusak dan mudah dibentuk kembali. Untuk
melakukan replikasi, mula-mula ikatan hidrogen tersebut harus dirusak dahulu agar DNA
untai ganda berubah menjadi untai tunggal. Kemudian karena A selalu berpasangan dengan
T, dan C selalu berpasangan dengan G, maka jika kita memiliki satu untai DNA dengan
sequens ACTAG, misalnya, maka kita dapat mencetak untai komplementernya, yaitu
TGATC, begitu juga sebaliknya.
Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) membutuhkan tiga tahap :
1. 1. Denaturasi
Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi
DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 95
o
C. Denaturasi awal dilakukan selama 1
3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai
tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA
terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim
polimerase.
1. 2. Annealing
Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap
terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan
mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang
mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu
rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan
suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi. Kenaikan suhu setelah tahap
annealing hingga mencapai 7074
o
C bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA
polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu
72
o
C, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu
dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-
ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah.
Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin
banyak.
1. 3. Elongasi
Elongasi merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA,
enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap
untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus
selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.
Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus
berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus.
Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan
menjadi milyaran amplifikasi DNA target.
Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus
pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada
siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan
sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya
akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan
disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan
seterusnya. Pada akhir siklus, DNA cetakan akan digandakan secara eksponensial sehingga
dihasilkan DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam waktu yang relatif singkat
sekitar 3-4 jam.
1. D. Aplikasi PCR
Aplikasi PCR utama dibidang klinis adalah untuk diagnosis, dan kloning. Yang paling sering
dipakai di bidang klinis saat ini adalah untuk diagnosis, yaitu untuk deteksi patogen infeksius
dan identifikasi mutasi pada gen yang berkaitan dengan faktor resiko penyakit.
Untuk aplikasi PCR dibidang klinis tersebut, telah dikembangkan berbagai macam teknis
berbasis PCR, antara lain :
1. RFLP-PCR (restriction fragment lenght polymorphisms)
Pada prinsipnya, teknik ini dimanfaatkan untuk deteksi polimorfisme. Secara umum teknik
ini menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui adanya polimorfisme (RFLP), dan produk
hasil digesti tersebut diamplifikasi dengan PCR (RFLP-PCR).
Teknik PCR yang mirip dengan teknik diatas AFLP-PCR (amplification fragment lenght
polymorphisme) yang digunakan untuk membedakan isolat atau spesies yang berbeda
berdasarkan daerah enzim restriksi (polimorfisme daerah restriksi)
1. VNTR-PCR (variable number of tandem repeat sequence), dan STR-PCR (short
tandem repeats). Teknik ini sering digunakan untuk tujuan forensi. Dengan
menggunakan primer yang tepat, variasi sekuens pengulangan berurutan yang terdapat
pada DNA sampel dapat diketahui.
2. Skreening / deteksi mutasi berbasis PCR
Dahulu, skreening/ deteksi mutasi dapat dilakukan dengan PCR konvensional (misalnya
dengan BESS-T-Scan (Base Excision Sequence Scanning)) untuk mendeteksi mutasi T/A
atau T / A, atau Amplification refractory mutation system (ARMS) untuk mendeteksi point
mutation melalui priming oligonukleotida kompetitif.
1. PCR kuantitatif
Untuk keperluan diagnosis dan penilaian kemajuan tetapi kadang membutuhkan pemeriksaan
yang bersifat kuantitatif.
PCR konvensional dapat digunakan untuk mendapatkan data kuantitatif tersebut dengan
menggunakan kompetitor (internal exogenous standard) atau dengan housekeeping
gene(internal endogenous standard). Namun saat ini, penggunaan PCR konvensional untuk
PCR kuantitatif telah digantikan real-time PCR.
PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian
biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai
macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah
membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang
ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk
diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh
virus yang sulit terdeteksi seperti HIV.
Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan
modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi
praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning
hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit
genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka
ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.
Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996)
yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia.
Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur
yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction)
melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping,
subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak
pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat
ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang
terbukti sangat akurat.
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
1. a. Isolasi Gen
DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia panjangnya sekitar 3
miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana fungsi utama DNA
adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA
ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai
asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan
protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA,
DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi
gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Contoh, sebelumnya
mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat
diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin
dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa
genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu
menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin
juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan
sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah
ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi
gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa
nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR
menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
1. b. DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang
umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah
dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi
PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa
menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.
Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak
diketahui bisa ditentukan.
1. c. Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak
mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil
dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-
bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik
bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki
pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat
tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Konon banyak kalangan tertentu
yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang
anak jika sang orang tua merasa ragu.
1. d. Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,
bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa
yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini
memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena
PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A
(H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas
terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:
1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.
2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan
sebelum dilahirkan.
5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi,
variasi dan mutasi dari gen.
6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana
spesies tersebut berasal.
7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print
1. E. Kelebihan dan Kelemahan PCR
Kelebihan
1. Memiliki spesifisitas tinggi
2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
5. Mudah di set up
Kelemahan
1. Sangat mudah terkontaminasi
2. Biaya peralatan dan reagen mahal
3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi
(misalnya infeksi pasif atau laten)
4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk
melakukannya.
BAB III
PENUTUP
Kesimpulan
1. Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens
nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik atau metode
perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
2. Adapun komponen dari PCR yaitu DNA cetakan, Oligonukleutida primer, DNA
polymerase, Larutan Buffer, dan Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
3. Prinsip dasar dari proses PCR yaitu Tahap pertama Denaturasi. Tahap 2 penempelan.
Tahap 3 elongasi. Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus
amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi
2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing
akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA
untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial,
dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi
1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya
4. Contoh aplikasi PCR antara lain yaitu proses Isolasi Gen, DNA Sequencing, Forensik
dan Diagnosa penyakit.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan
mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk
berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja
panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu
apaan ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai
panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA
kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian
panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya
tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum
diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk
diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi
atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal
serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan
insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari
DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri
dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya
insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin
tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara
konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang
memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat
dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang
umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah
dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi
PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa
menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent.
Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak
diketahui bisa ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak
mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil
dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-
bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik
bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki
pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat
tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang
tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini,
bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa
yang cepat dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa
dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah
tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh
virus atau makhluk lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel
menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya
9 tahun setelah penemuannya (1993).
Polymerase Chain Reaction (PCR
Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan
suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode
PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci
utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
B. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:
1. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal.
2. Penempelan primer
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang
komplemen dengan urutan primer.
3. Reaksi polimerisasi (Extension)
Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan
penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.
Gambar 01. Proses Amplikasi Secara Eksponensial.
Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
1. Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot- start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih
dahulu).
2. Final elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70 oC -72oC) selama 5-15 menit untuk
memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna.
Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
Gambar 02. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)
C. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain
(Mahmuddin, 2010):
1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM
(ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10
mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
5. Minyak mineral ringan
6. Akrilamida (grade elektroforesis)
. N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)
8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
9. EMED (N, N, NN etramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)
D. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR) Mahmuddin (2010),
menyampaikan beberapa komponen-komponen PCR antara lain:
1. Enzim DNA polymerase
2. Primer
3. Reagen lainnya
E. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)
1. Alel-spesifik PCR atau kloning teknik diagnostic
2. Polymerase Cycling Assembly (PCA)
3. Asymmetric PCR
4. Amplifikasi tergantung helikase
5. Hot Start PCR
6. PCR spesifik Intersequence (ISSR)
7. Inverse PCR
8. Mediated PCR Ligasi
9. PCR spesifik Metilasi (MSP)
10. Miniprimer PCR
11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA)
12. Multiplex-PCR
13. Nested PCR
14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN)
15. Kuantitatif PCR (Q-PCR)
16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR)
17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR )
18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR)
F. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)
Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
1. Isolasi gen
2. DNA sequencing
3. Identifikasi forensic
4. Diagnosa penyakit
BAB III PENUTUPA.
Simpulan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan untuk
mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Tahapan-Tahapan
Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer,
dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Komponen-Komponen Polymerase Chain
Reaction (PCR), Enzim DNA Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki
keaktifan pada suhu tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang
mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer
berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan
buffer yang mengandung MgCl2. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) seperti:
Alel-spesifik PCR, Polymerase Cycling Assembly, Asymmetric PCR, Hot Start PCR, PCR
spesifik Intersequence, Inverse PCR, Mediated PCR Ligasi, dll. Manfaat Polymerase Chain
Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida
suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang
dengan membandingkan DNA finger print.

E.Aplikasi PCR
PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian
biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai
macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah
membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang
ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk
diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh
virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395).
Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan
modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi
praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning
hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit
genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik (tersangka kriminal, tersangka
ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.
Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996)
yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia.
Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur
yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction)
melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping,
subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak
pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat
ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang
terbukti sangat akurat.
Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas
terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:
1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.
2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi
4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan
sebelum dilahirkan.
5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi,
variasi dan mutasi dari gen.
6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana
spesies tersebut berasal.
7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan finger print"
F. Kelebihan dan Kelemahan PCR
1. Kelebihan
1. Memiliki spesifisitas tinggi
2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
5. Mudah di set up
2. Kelemahan
Sangat mudah terkontaminasi
Biaya peralatan dan reagen mahal
Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi
(misalnya infeksi pasif atau laten)
Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk
melakukannya.
Saat ini proses analisis DNA banyak dilakukan dengan menggunakan teknik PCR
(polymerase chain reaction). Teknik PCR inilah yang memungkinkan proses analisis
DNA menjadi lebih cepat dibandingkan dengan melakukan tes DNA dengan cara
konvensional. Dengan PCR, urutan DNA dapat digandakan hanya dalam waktu
beberapa jam sampai kuantitasnya cukup untuk sebuah proses analisis. Suatu teknik
yang sangat menolong tentunya setelah dilakukan prosedur yang cukup rumit untuk
mendapatkan urutan DNA yang cukup.

Ditemukannya PCR atau reaksi rantai polimerase ini jelas merupakan sebuah angin
segar bagi kalangan ilmuwan yang bergerak di bidang genetika molekuler. Berkat
PCR-lah, mereka lebih mudah mendiagnosis suatu penyakit maupun melakukan
analisis forensik. Bahkan studi DNA dari suatu fosil yang ditemukan oleh para
arkeolog akan lebih mudah dilakukan dengan bantuan PCR ini.

Untuk lebih jelasnya, berikut ini penerapan PCR yang telah meliputi berbagai bidang
kehidupan manusia dan membuka peluang baru untuk studi tentang gen.

Pertama, PCR digunakan untuk amplifikasi urutan DNA yang khas bagi manusia
sehingga DNA manusia dapat dilacak dan diisolasi dari DNA yang lain.

Kedua, deteksi mutasi dengan amplifikasi PCR. Mutasi biasanya terjadi pada kanker
dan kelainan bawaan. Pengetahuan sifat mutasi pada pasien sangat penting untuk
diagnosis dan terapi. PCR dapat digunakan untuk mengikuti perkembangan sel kanker
setelah terapi. Berbagai kelainan bawaan juga telah berhasil didiagnosis dengan cara
PCR. Kemampuan untuk melacak lesi yang khas untuk sel tumor merupakan hal yang
sangat bernilai bagi ahli dalam mencoba untuk menentukan apakah seorang pasien
yang telah diobati terhadap leukemia sudah bebas dari sel malignan atau belum.

Ketiga, PCR juga dapat diterapkan dalam melacak infeksi virus dan bakteri.
Diagnosis konvensional didasarkan pada kemampuan untuk menumbuhkan agen pada
biakan atau untuk melacak keberadaan mereka pada pasien dengan antibodi. Uji
seperti itu dapat memerlukan waktu beberapa minggu sebelum diagnosis dapat
ditegakkan, sementara uji yang kedua relatif kurang peka. Hal tersebut juga
merupakan masalah penting untuk diagnosis AIDS atau untuk studi epidemiologi
infeksi HIV.

Contoh lain, seperti pada kasus flu burung adalah mendeteksi keberadaan virus H5N1
pada penderita suspect flu burung. Seperti pada terapi kanker, tujuan utama diagnosis
adalah melacak sel-sel terinfeksi, yang biasanya terdapat dalam jumlah yang kecil dari
suatu cuplikan jaringan atau darah. Penyakit bekteri juga dapat didiagnosis dengan
PCR. Salah satu yang penting misalnya tuberkulosis (TBC). Penyakit yang
disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis ini sering sulit didiagnosis karena hanya
sedikit mikroorganisme yang ada dalam material dari pasien untuk penegakan
diagnosis secara histologis. Untuk itu, patogen harus diidentifikasi setelah
ditumbuhkan pada biakan dan pengujian kepekaan antibiotika. Prosedur seperti itu
dapat memerlukan waktu sampai dua minggu. PCR telah terbukti dapat mengatasi
permasalahan tersebut.

Keempat, PCR digunakan untuk penentuan jenis kelamin pada sel prenatal.
Prosedur ini sekarang telah digunakan pada klinik bagi keluarga yang mempunyai
risiko kelainan genetik turunan yang terpaut pada kromosom X, dengan implantasi
embrio yang telah dibiopsi pada ibu-ibu. PCR memungkinkan biopsi, penentuan
kelamin, dan transfer janin ke rahim para ibu dapat dilakukan pada status reproduksi
yang sama. Jenis kelamin dari janin diperiksa dengan analisis karyologis dari sel-sel
vilus korionik.

Kelima, PCR digunakan dalam studi evolusi molekuler. Informasi genetika molekuler
telah semakin sering digunakan dalam studi evolusi untuk menentukan tingkat
kekerabatan antarspesies. Metode studi evolusi konvensional sering mengalami
hambatan, karena memerlukan spesies yang masih hidup sebagai sumber DNA.
Dengan sumber tersebut, hubungan antarspesies yang masih hidup dapat diamati
secara langsung. Akan tetapi, hubungan dari organisme hidup dengan yang telah
punah sulit dilakukan. Cuplikan jaringan dari spesies yang sudah punah atau yang
populasinya jarang, yang tersimpan di museum di seluruh dunia adalah sumber DNA
yang baik. DNA dapat disolasi dari sumber-sumber secara beragam, seperti kulit,
mumi manusia, tanaman kering, bahkan jaringan lunak yang disimpan dalam
pengawet. Hanya, molekul DNA dari sumber seperti itu umumnya tinggal sebagai
fragmen-fragmen yang pendek akibat degradasi, rusak akibat mutagen dari
lingkungan seperti sinar ultra violet, serta tercemar hebat oleh DNA bakteri. DNA
yang seperti itu tidak dapat digunakan untuk studi dengan teknik pengklonan
konvensional. PCR telah mengubah situasi tersebut secara dramatis. Teknik ini dapat
mengamplifikasi secara efisien fragmen DNA yang kecil yang masih tetap utuh dalam
terok sekalipun fragmen yang utuh tersebut terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit
sekali

Keenam, penggunaan PCR dalam bidang kehakiman. Potensi penggunaan sumber
DNA untuk meyakinkan identitas seseorang dalam ilmu kehakiman adalah bukti
akurat yang telah diakui secara nyata dan telah banyak digunakan. Hal inilah yang
dilakukan dalam mengidentifikasi kelompok teroris Dr. Azahari dalam pengungkapan
identitas mayat terkena bom di Batu Malang.

DNA dapat diisolasi dari tetesan darah kering atau dari sperma dalam usapan kapas
vagina yang telah tersimpan sampai selama dua tahun. Pertimbangan utama dalam
penerapan PCR dalam forensik adalah cemaran dari contoh barang bukti oleh DNA
lain dari tempat kejadian kriminal maupun dari DNA lain yang telah pernah
diamplifikasi di laboratorium yang sama.***
Virus adalah makhluk hidup yang paling sederhana sebab hanya memiliki gen
penyandi protein terpenting untuk hidupnya saja. Sebagaimana perilaku parasit,
protein selebihnya dipinjam dari 'tuan rumah' yang diserangnya.Pada umumnya virus
adalah patogen/organisme penyebab penyakit yang paling sulit pengobatannya. Hal
ini disebabkan oleh dua hal.

Pertama, protein virus yang menjadi target obat jumlahnya sedikit.
Kedua tabiat mutasi yang secara alamiah terjadi pada seluruh organisme, muncul
lebih sering karena kesederhanaan sifat genetiknya itu, sehingga virus paling mudah
berubah bentuk menjadi tak dikenali lagi oleh obat yang ada. Untuk itu, cara ampuh
memerangi virus tiada lain adalah dengan mencegah terjadinya 'pertautan ciuman
maut' tersebut.
Tonjolan pada virus influenza terdiri dari dua protein yaitu protein hemagglutinin
(disingkat HA) dan protein neuraminidase (NA). Protein HA mengenali molekul
sialic acid (SA) di permukaan sel target, selanjutnya protein NA memotong SA agar
virus dapat masuk ke dalam sel.
Ketika keluar dari sel pun, protein NA bertugas memotong SA yang banyak terdapat
di permukaan sel agar virus tidak 'tertambat' di situ saja sehingga dapat bergerak
bebas menyerang sel lainnya. Apabila umumnya virus memiliki sepotong genom
(baik dalam bentuk DNA atau RNA), virus influenza memiliki 8 potong genom. Hal
ini menyebabkan virus influenza sangat sering berganti rupa melalui kombinasi
potongan genom itu
Para peneliti dari Australia yaitu Laver dan Coleman berhasil memecahkan struktur
protein NA sampai tingkat atom pada tahun 1983. Informasi detail wajah protein NA
ini memberikan petunjuk penting bahwa bagian yang melakukan 'ciuman maut' itu
tidak pernah berubah walaupun bagian lainnya seringkali berganti.
Hal ini memberikan inspirasi pada Von Itzstein, juga dari Australia, untuk mensintesa
senyawa organik yang dapat menghambat pertautan protein NA dengan SA pada
tahun 1993. Senyawa organik yang menjadi obat influenza ini disebut Zanamivir yang
menunjukkan khasiatnya dengan meniru SA berinteraksi dengan protein NA.
Virus influensa pada umumnya baik pada manusia atau pada unggas adalah dari
kelompok famili orthomyxoviridae. Ada beberapa tipe virus influenza pada manusia
dan binatang yaitu virus influenza tipe A, B, dan C. Pada manusia Virus A dan B
dapat menjadi penyebab wabah flu yang cukup luas. Sementara virus C menyebar
secara periodik, ringan dan tidak menyebakan wabah. Pada permukaan virus A ada 2
glikoprotein, Yaitu : hemaglutinin (H), dan neuraminidase (N), untuk
mengkasifikasikannya secara rinci, masing-masing tipe virus tersebut dabagi menjadi
subtipe berdasarkan kelompok H dan N, klasifikasinya adalah : H1-H15. dan N1-N9.
Perbedaan H merupakan dasar subtipe. Influenza pada manusia sejauh ini disebabkan
oleh virus H1N1, H2N2 dan H3N2 serta virus avian H5N1, H9N2 dan H7N7.
Sementara itu ada sekitar 15 subtipe virus influenza yang dapat terjadi pada unggas,
seperti H7N7, H9N2, dll. Subtipe infeksi virus ini menimbulkan berbagai gejala pada
unggas mulai dari yang ringan sampai yang fatal dan menyebabkan epidemi luas (
Highly pathogenic avian influenza) dengan angka kematian pada unggas mencapai
100%. Kasus fluburung yang kini banyak dibicarakan disebabkan oleh virus influenza
tipe A subtipe H5N1.Laporan yang menyatakan bahwa virus H5N1 yang sekarang ada
ternyata berbeda dengan virus H5N1 yang pernah menyerang manusia dan unggas,
artinya virus tersebut telah bermutasi dan bukan tidak mungkin akan bermutasi
kembali di masa depan.
Dengue dapat didiagnosis dengan isolasi virus, dengan tes serologis, atau dengan metode
molekuler. Diagnosis infeksi dengue akut (on-going) atau baru dapat dibentuk dengan
menguji sampel serum selama 5 hari pertama gejala dan / atau fase penyembuhan awal
(lebih dari 5 hari gejala). Infeksi akut dengan virus dengue dikonfirmasi ketika virus terisolasi
dari spesimen jaringan serum atau otopsi, atau genom virus dengue yang spesifik
diidentifikasi dengan reaksi sebaliknya transkripsi-polymerase chain (RT-PCR) dari serum
atau plasma, cairan serebrospinal, atau jaringan otopsi spesimen selama penyakit demam
akut. Metode seperti satu langkah, real time RT-PCR atau RT-PCR bersarang sekarang banyak
digunakan untuk mendeteksi gen virus dengue dalam sampel serum fase akut. Deteksi ini
bertepatan dengan viremia dan fase demam onset penyakit. Infeksi akut juga dapat
dikonfirmasi oleh laboratorium identifikasi antigen virus dengue atau RNA di otopsi
spesimen jaringan dengan analisis imunofluoresensi atau imunohistokimia, atau
serokonversi dari negatif ke antibodi IgM positif DBD atau demonstrasi peningkatan empat
kali lipat atau lebih dalam titer IgG antibodi dipasangkan spesimen (akut dan sembuh)
serum.
MERS disebabkan oleh virus dari genus coronavirus, genus coronavirus termasuk virus
visrus yang menyerang binatang. Pada manusia coronavirus biasanya menyebabkab flu, dan
SARS yang menghebokan China tahun 2003 lalu. Meskipun begitu, MERS-CoV adalah virus
korona yang berbeda dari SARS-Cov. Tidak adala laporan satupun mengenai MERS-CoV
sebelum tahun 2012. Meskipun belum dipastikan, MERS-CoV diduga berasal dari kelalawar
yang menular pada manusia dan cara penyebaran belum diketahui.
MERS-CoV menyebar dari manusia ke manusia dengan cara terpapar langsung ingus atau
kotoran lain dari pernafasan dari manusia yang telah terinfeksi MERS-CoV.MERS sering
menjangkiti orang yang merawat individu yang mengidap Mers.

MERS-CoV didiagnosa dengan menggunakan PCR test (transcriptase polymerase chain
reaction)
MERS COV terdeteksi menggunakan reverse transcriptase polymerase chain reaction (
PCR) . Pada tanggal 5 Juni 2013, FDA (BPOM nya amerika) mengeluarkan emergency use
authorization ( EUA ) untuk CDC Novel Coronavirus 2012 Real-time RT PCR Assay . Tes
ini mendeteksi MERS COV , sebelumnya dikenal sebagai coronavirus baru 2012 atau NCV
-2012 , pada pasien dengan tanda dan gejala MERS dan faktor risiko yang tepat . Assay ini
disebarluaskan oleh CDC untuk laboratorium yang berkualitas . PCR dilakukan pada sampel
sekresi pernapasan atau darah.
Tes-tes lain mungkin abnormal , tetapi mereka tidak spesifik untuk SARS atau MERS . Dada
X ray menunjukkan pneumonia , yang mungkin terlihat tambal sulam pada awalnya .
Biasanya , infiltrat mungkin terlihat seperti kaca tanah pada C scan namun dapat
berlanjut ke putih keluar penampilan . Biasanya , limfosit dan jumlah trombosit yang
menurun sedangkan kreatinin fosfokinase ( CPK ) dan serum laktat dehidrogenase ( LDH )
tingkat dapat ditingkatkan .
MERS harus dicurigai pada orang dengan gejala yang sesuai, terutama bila seseorang yang
barus saja kembali dari timur tengah.

PROSEDUR PCR
Vivantis DNA amplification kit
1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70%
2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih
(seringlah mengganti sarung tangan)
3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT
4. Penyiapan primer
a. Proses pengenceran primer


RNAse

Dipipeting supaya homogen dan divortex
b. Proses aliquot primer
Diambil 10 L masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan
dilabel
5. Labeli 200 L PCR tube sesuai jumlah sampel
Label 1 = K14P label 2 = K24P
Label 3 = K34P label 4 = K42P
Label 5 = K54P label 6 = K64P
Label 7 = K74P label 8 = K84P
Label 9 = K94P
Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer Jagged dan tinta hitam
_actin (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut)
6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi
Ikutilah prosedur pada table dibawah ini
Prosedure PCR Reaction
Tabel 1. Mix Reaksi

Catatan :
a. Untuk menentukan x reaksi:
1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya
(Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,
2. kemudian kalikan dengan jumlah sampel ditambah 3 atau 4, contoh 12 x reaksi =
9
sampel + 3
b. untuk Taq DNA polymerase harus segera di aliquot 20 L pada beberapa ependdof,
labellah dan segera disimpan dalam -20
o
C
7. Siapkan/masukkan 6,943 L Mix reaksi PCR kedalam masing tube eppendorf (v 200 L)
sampel yg telah disiapkan (no. 5)
8. Pipetlah 0,2 L DNA template atau DNa Sampel
9. Campurlah dengan mix reaksi PCR yang sidah siap dalam tube eppendorf dengan
cara
dipepeting (jangan divortex) kemudian spin down
10. Bawalah tube pada mecin PCR dan gunakan mengikuti kondisi siklus pada table 2

11. Setelah proses PCR sampel bisa disimpan dalam 4
o
C, atau langsung di
elektroforesis Horisontal/DNA.


Penyakit
LEPTOSPIROSIS
Penyakit leptospirosis disebabkan oleh bakteri Leptospira dan tersebar di seluruh dunia
terutama di negara tropis dengan kelembaban yang tinggi. Ada berbagai teknik
laboratorium yang dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit leptospirosis
diantaranya, (1) mendeteksi Leptospira secara langsung menggunakan mikroskop lapangan
gelap atau mendeteksi bakteri Leptospira dengan membiakkan; (2) mendeteksi gen spesifik
Leptospira menggunakan PCR; (3) mendeteksi antibodi terhadap Leptospira secara serologis
menggunakan metode MAT, ELISA, RIA, IHA, dll. Semua metode ini mempunyai kelebihan
dan kekurangan
3.a. Teknologi PCR
Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode amplifikasi segmen DNA Leptospirayang
terdapat di dalam sampel klinik. Jadi, adanya Leptospiradipastikan dengan menemukan
segmen DNA Leptospirayang spesifik. Metode ini sangat berguna untuk mendiagnosis
leptospirosis terutama pada fase permulaan penyakit. Alat ini dapat mendeteksi
Leptospirabeberapa hari setelah munculnya gejala penyakit. Akan tetapi, alat ini belum
tersedia secara luas terutama di negara yang sedang berkembang.
Untuk mendeteksi DNA Leptospira, teknologi PCR membutuhkan sepasang primer
dengan sasaran gen spesifik, seperti gen rRNA 16S dan 23S, atau elemen
pengulangan. Di samping itu, ada juga yang disusun dari pustaka genom. Umumnya
teknologi ini sangat jarang dipakai untuk memeriksa spesimen klinik.
Dari hasil penelitian penderita yang sudah didiagnosis leptospirosis secara pasti, ternyata
yang menunjukkan hasil biakan positif sekitar 48%, sementara PCR 62%, sedangkan
pemeriksaan serologis 97%. Pada keadaan tertentu pemeriksaan PCR lebih
menguntungkan. Sebagai contoh, pemeriksaan ini dapat memberikan hasil positif pada 2
penderita yang meninggal sebelum terjadi serokonversi, dan juga memberi hasil positif
pada 18% penderita seronegatif pada permulaan fase akut.
Merien dkk. (1992) membuat sepasang primeryang dapat mengamplifikasi fragmen yang
panjangnya 331 pasang basa dari gen rrs (rRNA 16S) Leptospirapatogen dan non-patogen
oidengan harapan agar dapat mendeteksi seluruh serovar patogen. Gravekamp dkk.
(1993) membuat G1 dan G2. Primer ini mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat
mengamplifikasi serovar L. kirschneri. Kedua pasang primer ini sudah digunakan secara
luas untuk studi klinik.Keterbatasan PCR adalah tidak mampu untuk mendeteksi jenis
serovar yang menginfeksi. Walaupun demikian PCR bermanfaat untuk epidemiologi dan
kesehatan masyarakat. Agar lebih bermanfaat, maka hasil yang diperoleh dicerna dengan
enzim endonuclease restriksi, kemudian amplicon yang diperoleh disikuens langsung, atau
dianalisis dengan metode konformasi untai tunggal.
Keuntungan pemeriksaan PCR adalah, bila bakteri ada maka diagnosis dapat dipastikan
dengan cepat terutama pada fase dini penyakit sebelum titer antibodi dapat dideteksi.
Kelemahannya, memerlukan peralatan dan tenaga ahli yang khusus. Disamping itu,
PCR dapat memberikan hasil positif palsu, apabila terkontaminasi oleh DNA asing.
Dia juga dapat memberi hasil negatif palsu, karena spesimen klinik yang diperiksa sering
mengandung inhibitor seperti heparin dan saponin.
TUBERCuLOSIS
Salah satu faktor yang menghambat program pemberantasan tuberkulosis paru
adalah belum tersedianya alat diagnosis cepat yang dapat menentukan adanya
bakteri Mycobacterium tuberculosis dalam sputum. Diagnosis cepat dan tepat
sangat penting untuk menentukan pengobatan dan memutus rantai penularan. PCR
(Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip
kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis. Tehnik
PCR telah dikembangkan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi, seperti
Hepatitis, HIV, Human Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M.tuberculosis.
Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan validitas PCR sebagai perangkat
diagnosis pada tersangka penderita tuberkulosis. Hasil penelitian ini diharapkan
dapat memberi manfaat bagi program pemberantasan tuberkulosis terutama
sebagai informasi tentang validitas diagnosis dan kemungkinan penggunaan PCR
sebagai alat diagnosis.
Sebanyak 70 sampel sputum diambil dari tersangka penderita tuberkulosis,
diperiksa menggunakan 3 jenis pemeriksaan: mikroskopis bakteri tahan asam
(BTA), uji PCR dan metode biakan yang berfungsi sebagai baku emas (gold
standard). Validitas diagnosis ditentukan dengan menghitung sensitifitas,
spesifisitas, nilai duga positif dan negatif, rasio kecenderungan positif dan negatif,
akurasi dari masing masing hasil diagnosis (mikroskopis BTA dan PCR).
Sensitifitas dan spesifisitas pemeriksaan mikroskopis BTA adalah 77,2% (CI =
95%; 0,7837- 0,7603) dan 95,8% (CI = 95%; 0,96361- 0,9523) dengan nilai duga
positif dan negatif 89,4% dan 90,1% dengan rasio kecenderungan (LR +) = 18,8
dan (LR -) = 0,23. Hasil uji PCR menunjukkan sensitifitas dan spesifisitas
pemeriksaan sebesar 90% (CI = 95%; 0,90705 - 0,89295) dan 79% (CI = 95%;
0,7995 - 0,78043) dengan nilai duga positif dan negatif 66% dan 95% dengan rasio
kecenderungan (LR +) = 3,18 dan (LR -) = 0,11.
Sebagai perangkat diagnosis TB paru, PCR valid dapat membedakan penderita TB
paru dan bukan penderita TB paru, akan tetapi kurang reliabel dibanding hasil
pemeriksaan mikroskopis BTA.