Sunteți pe pagina 1din 41

REACIILE

SEROLOGICE II
Reacia de floculare (tehnica
Ramon)
Se efectueaz diluia succesiv a
serului imun (Ac) la care se adaoga o
cantitate egal de Ag. Se ntroduc
probele n termostat i periodic se
examineaz pentru depistarea
tubului n care apare precipitatul
iniial (zona de echivalen).
Utilizare: pentru determinarea
cantitii de toxin, antitoxin sau
anatoxin.

Precipitarea n mediu solid (n
gel)
n aceste reacii Ag i Ac difuzeaz
unul spre altul prin geloz i
precipitatul se produce n zona de
concentraie optim a acestor dou
reactive. Dac exist mai multe
sisteme Ag-Ac se vor forma zone de
precipitare distincte. Poate fi utilizat
n analiza calitativ a unui melanj de
Ag ntr-o soluie.
Imunodifuzia simpl radial
(tehnica Mancini)
Se efectueaz pe o plac acoperit cu
geloz, n care sunt ncorporai Ac
specifici. Ag este depus n godeurile
din stratul de geloz. Ag difuzeaz
radial n geloz pe parcursul a 48 ore.
Dac Ag corespunde Ac, atunci are loc
formarea de discuri de precipitare, cu
suprafaa proporional concentraiei
Ag din godeu. Se utilizez pentru
depistarea i cuantificarea Ig,
hormonilor, enzimelor, etc.
Imunodifuzie dubl
(tehnicile Ouchterlony i Elek)
Se acoper cu geloz o plac de sticl sau
se toarn n cutia Petri. n tehnica
Ouchterlony Ag i Ac difuzeaz din
godeurile situate la o distan de 15 mm
unul de altul. n tehnica Elek cele 2 reactive
difuzeaz din benzile de hrtie plasate pe
suprafaa gelozei. Moleculele difuzeaz n
gel n funcie de greutatea lor i formeaz
linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-
Ac ce corespund n zona lor de echivalen.
Dac dou Ag sunt identice, liniile lor se
unesc, dac sunt diferite se intersecteaz.
Utilizarea determinarea toxinelor,
antitoxinelor, Ag proteice

Contraimunoelectroforeza (CIEF)
Este util la examinarea amestecurilor
antigenice complexe. n prealabil are loc
separarea electroforetic a proteinelor.
Geloza este turnat pe o plac de sticl, Ag
i Ac sunt dispui n rezervoare circulare de 2
mm diametru, la o distan de 10 mm. n
timpul EF Ag, ncrcat negativ, migreaz
spre polul pozitiv, ntlnind Ac care migreaz
spre catod. n 90 min are loc formarea liniei
de precipitare la interaciunea Ag i Ac
omologi. CIEF servete la examinarea
componentelor Ag din lichide biologice: LCR,
urin, lichid pleural, ascit, etc.
Reacia COOMBS
Unii Ac (monovaleni) nu sunt
aglutinani n condiii normale (ex.:
anticorpii anti-Rh, responsabili de
incompatibilitatea materno-fetal n
sistemul Rh). Ei pot fi depistai graie
testelor Coombs.
Sunt posibile 2 tehnici, n funcie de
prelevat: snge de la nou-nscut sau
de la femeia gravid.

- Tehnica Coombs direct. La un nou-
nscut se caut prezena Ac materni anti-
Rh fixai pe hematii, dac mama este Rh-.
La aceste hematii suspecte se adaog un ser
anti-Ig uman. Acest ser nu aglutineaz
hematiile normale, din contra, el provoac
aglutinarea hematiilor pe care sunt fixai Ac
anti-Rh.
- Tehnica Coombs indirect. La o femeie
gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezeni n ser.
Iniial la acest ser se agaog hematii Rh+
(pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi
se aplic serul anti-Ig.
Reacii de citoliz imun (cu
participarea complementului)
Activarea fraciilor complementului
(C) duce la liza particulei purttoare
de Ag (hematii, bacterii, diverse
celule...)
Activarea complementului
- Calea clasic
- Calea alternativ

Activarea C pe cale clasic
Activatorul n constituie complexe Ag-Ac
(IgG, IgM)
Consecutivitatea activrii C: Ag-Ac fixeaz
fracia C1qrs, care se activeaz, cptnd
activitate esterazic (n prezena
obligatorie a Ca
++
). C1 activeaz C4, cu
formarea complexului AgAcC1C4. Este
apoi activat C2 (AgAcC1C4C2) cu
activitate de tip convertaz ce acioneaz
asupra C3, clivndu-l n C3a
(anafilotoxin) i C3b, care se unete de
complex (AgAcC1C4C2C3b).
Urmeaz fixarea simultan a C5,6,7. C5 este
clivat n C5a (anafilatoxin) i C5b. La final
se fixeaz C8, apoi C9, formnd complexul
de atac membranar. Fixarea lor produce
leziuni ireversibile liza celulei.
Calea alternativ de activare a C
Activatori: endotoxine, celule infectate cu
virus, levuri, parazii, venin de cobr,
agreagte de IgA sau IgE. C1,4 i 2 nu
intervin i reacia ncepe cu C3. Properdina,
factorul B i ionii de Mg
++
sunt obligatorii n
procesul de activare pe cale alternativ.

Componentele reaciilor de liz:
- Ag (celule bacteriene, hematii, etc)
- Ac (lizine - IgG i IgM)
- Complement ser proaspt de cobai
sau ser de cobai liofilizat
Reacia de bacterioliz (RBL)
- Ag suspensie bacterian vie
(vibrioni, leptospire...)
- Ac serul imun sau serul bolnavului
- Complement
RBL in vitro
- Se efectueaz diluia succesiv a serului
- Se adaog suspensie microbian vie
- Se adaog complement
(martor: Ag+ser fiziologic+C)
- Incubare 2 h la 37C
- Rensmnare pe cutii cu geloz cte 0,1 ml
din fiecare diluie (24h 37 C)
- Lectura se compar nr coloniilor crescute
din martor i probele studiate
- Titrul cea mai mare diluie a serului n care
au fost lizate cel puin 50% din celule

RBL in vivo
- Amestecul dintre Ag i Ac se inoculeaz
intra-peritoneal la animale de laborator
sensibile
- Peste fiecare 10 min, timp de o or, se
extrage lichidul peritoneal, se pregtete un
preparat nativ i se examineaz pe fond
negru sau cu contrast de faz.
- Rezultat pozitiv numrul bacteriilor scade
treptat pn la dispariie.
Utilizarea RBL diagnosticul holerei (RVL),
leptospirozelor (RALL)
Reacia de hemoliz (RHL)
- Ag hematii de berbec, suspensie de 3%
- Ac ser imun de iepure anti-hematii de
berbec (serul hemolitic)
- Complement
Principiul reaciei: complexele Ag-Ac
formate fixeaz C i-l activeaz pe cale
clasic, provocnd hemoliza.
Intensitatea hemolizei se apreciaz vizual
(++++) sau prin msurarea densitii
optice a hemoglobinei eliberate.
Utilizarea practic a RHL: pentru dozarea C,
precum i n montarea reaciei de fixare a
complementului.
Reacia de fixare a complementului
(RFC)
Este o reacie complex, constituit din
2 sisteme Ag-Ac i cu participarea C.
n RFC particip Ig capabile s fixeze C
IgM i IgG.
RFC se utilizeaz n serodiagnosticul
virozelor, infeciilor bacteriene,
identificarea virusurilor.
Toate componentele RFC sunt utilizate
n acelai volum fiind titrate n
prealabil pentru aprecierea dozelor de
lucru.
Reacia se efectueaz n 2 etape
utiliznd 2 sisteme.
I etap Sistemul de baz este
constituit din Ag1 (diagnosticuri sau
Ag necunoscute), Ac1 (serul
bolnavului sau serul imun) i
complement n doza de lucru.
Amestecul este incubat 1h la 37 C
sau meninut 16-18 ore la 4 C.
Dac Ac se combin cu Ag omolog va
avea loc i fixarea C (efect frecvent
invizibil).
II etap la sistemul de baz se adaog
sistemul indicator (hemolitic), constituit
din hematii de berbec (Ag2) combinate cu
Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la
37 C reacia este terminat.
Evaluarea rezultatelor dac complementul
a fost fixat de primul sistem Ag-Ac
hemoliza nu se observ (rezultat pozitiv).
Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1,
complementul rmne disponibil pentru
fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2,
provocnd hemoliza (rezultat negativ)
Tehnici serologice cu utilizarea Ac
marcai
n unele cazuri este imposibil de a
detecta o reacie Ag-Ac: unii Ac nu
precipiteaz, alii nici nu precipiteaz,
nici nu aglutineaz, exist complexe
Ag-Ac care nu fixeaz C. n aceste
cazuri pot fi utilizai Ac marcai pentru
a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac
cu marcani nu afecteaz proprietile
lor imunologice.
Aceste reacii se monteaz pe suport
solid (lam, plci din plastic)
Marcanii utilizai uzual:
- Fluorocromi (rodamina, fluoresceina),
care emit respectiv o lumin rou-oranj
sau verde-galben fiind tratate cu raze
UV (Reacia de Imuno-Fluorescen)
- Enzime (fosfataza alcalin,
peroxidaza), capabile s modifice
culoarea unui substrat (Reacia Imuno-
enzimatic)
- Radio-izotopi (
125
J sau
3
H), care emit
respectiv raze gamma i beta (Analiza
Radio-Imun)
Reacia de imunofluorescen (RIF,
reacia COONS)
Metoda direct (numai n scop de
seroidentificare). Din materialul ce conine
Ag (material nativ, cultur pur, biopsie
tisular) se prepar un frotiu, peste care se
aplic serul imun specific cu Ac marcai cu
fluorocrom. Peste 20 min de incubare ntr-o
camer umed preparatul este studiat la
microscopul luminiscent. n caz de reacie
pozitiv se observ luminiscen local.
Inconvenient necesitatea de a avea seruri
imune marcate specifice pentru fiecare Ag.
Metoda indirect. Poate fi utilizat
pentru sero-identificare i sero-
diagnostic.
Pe frotiul ce conine Ag se aplic Ac
corespunztori nemarcai. Peste 20
min se spal minuios preparatul,
apoi se adaog anti-Ig fluorescent,
care se va combina cu Ac din
complex. Acest reactiv poate fi
utilizat n numeroase reacii.
Anti-Ig se obine prin imunizarea
iepurilor cu Ig umane.
Tehnica fondat pe fixarea C:
Markerul fluorescent este un ser
anti-complement care se va lega de
complementul fixat pe complexul Ag-
Ac.
RIF se utilizeaz pentru identificarea
rapid a Ag din biosubstrate sau
pentru serodiagnostic.
Reacia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -
Enzyme Linked Immunosorbent Assays).
- RIE direct (metoda sandwich). Utilizat
doar n sero-identificarea Ag. n godeurile din
placa de polistiren n care sunt fixai Ac
cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut.
Se incubeaz 1h. Dup o splare minuioas a
godeurilor se adaog Ac marcai cu enzime,
care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag
polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se
spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-
Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul
substratului cromogen (substan iniial
incolor, dar care se coloreaz sub aciunea
enzimei).
- RIE indirect. Utilizat n serodiagnostic.
Ag cunoscut este fixat la fundul
godeurilor. Ac (serul testat) se ntroduce
n godeu, dup 1h se spal totul i se
adaog ligandul marcat cu enzim (anti-Ig
sau proteina A cuplate cu enzim). Acest
ligand se fixeaz pe Ac testai. Se adaog
apoi substratul cromogen. Cantitatea de
Ac se msoar dup densitatea optic a
lichidului din godeuri.


- Tehnica imunoblot (western blot)
permite identificarea Ag dintr-un amestec.
I etap electroforeza n gel a probei de Ag
II etap transferul electric al Ag pe
membrana de nitroceluloz
III etap pe membran sunt aplicai
succesiv Ac dirijai contra Ag, apoi
conjugatul marcat cu enzim, care
permite depistarea Ac fixai. Dup o
splare se adaog substratul cromogen.
Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone
colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac
anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...
Analiza radioimun (ARI)
Principiul este identic cu cel al RIE
Ag se fixeaz la fundul godeurilor din
placa de plastic. Se adaog Ac testai
care se vor combina cu Ag omolog.
Dup splarea godeurilor, se adaog
un ligand radiomarcat (anti-Ig).
Dup eliminarea excesului de izotopi
prin splare, se msoar radio-
activitatea: ea este proporional cu
concentraia Ac dozai.
Reacia de neutralizare (RN):
formarea complexelor Ag-Ac duce la
neutralizarea efectului biologic al Ag
(neutralizarea toxinelor, enzimelor,
virusurilor).
Reacia de imobilizare
Unii anticorpi anti-bacterieni pot
provoca imobilizarea bacteriilor
mobile (vibrioni, spirochete)