Sunteți pe pagina 1din 81

FIZIOLOGIA BACTERIILOR.

METABOLISMUL MICROBIAN.
NUTRIIA I RESPIRAIA
BACTERIILOR
Fiziologia bacterian studiaz viaa i activitile
bacteriilor nutriia, respiraia, creterea i
multiplicarea, condiiile de cultivare a bacteriilor.
Metabolismul bacterian reprezint ansamblul de
reacii biochimice care au loc n celula vie.
- Catabolism reacii chimice de descompunere a
substanelor complexe n elemente simple, nsoit de
degajarea energiei (metabolism energetic)
- Anabolism reacii chimice de sintez a substanelor
complexe din elemente simple, necesit energie
(metabolism constructiv, de sintez)
n toate aceste reacii intervin catalizatori proteici
specifici - enzimele
Particularitile metabolismului bacterian:
1. Toate procesele metabolice se deruleaz intr-
o singur celul
2. Metabolismul nu este compartimentat
3. Este foarte flexibil, realizndu-se prin diverse
ci metabolice (bacteriile se adapteaz rapid
la condiiile mediului)
4. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)
Enzimele bacteriene. Caractere generale:
- Substane proteice
- Active n limite largi de temperaturi (0-65 C)
i de pH (2-9)
- Specificitate de substrat i de aciune
(reacioneaz cu un substrat cataliznd un tip
de reacie)
- Specificitatea este determinat de centrul
activ al enzimei, complementar cu receptorul
de pe substrat
- Nu se modific n cursul reaciei
Clasificarea enzimelor
I. Constitutive, permanente
II. Inductive, adaptive, se sintetizeaz n prezena
substratului (ex.: lactaza)
III. Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n
exces a prosusului reaciei catalizate
Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)
Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze,
hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
Dup impactul asupra ma/o
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificri
patologice ale esuturilor, celulelor ma/o :
hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza,
hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc.
Importana practic a studierii enzimelor
1. Rol n identificarea i clasificarea bacteriilor
(enzimele determin activitatea biochimic
specific a bacteriilor)
2. Unele substane chimice, antibiotice
interfereaz cu activitatea unor enzime,
inhibnd creterea bacteriilor (tratament)
3. Determinarea mecanismelor patogenezei
infeciilor (unele enzimele sunt responsabile
de producerea leziunilor n esutul gazdei)
4. Aplicarea industrial a enzimelor

NUTRIIA BACTERIAN
Nutriia modalitile prin care bacteriile
asimileaz din mediu substanele necesare
pentru metabolism.
Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv.
Nutrieni substane, soluiile crora pot traversa
MCP pentru a fi antrenate n metabolismul celulei.
Se obin din alimente prin solvire (sruri minerale,
CO
2
, O
2
) sau dup o digestie prealabil (proteine,
polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelular (n spaiul
periplasmic la bacteriile G-)
Nutrienii servesc ca material de
construcie i surs de energie pentru
sinteza compuilor i meninerea vieii
bacteriei.
Transportul transmembranar
1. Difuzie simpl (conform gradientului de
concentraie, fr utilizarea energiei): O
2
,
CO
2
, acizi grai, nutrieni liposolubili
2. Difuzie facilitat (conform gradientului de
concentraie) permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport
specifice - permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de
concentraie, necesit energie). Particip
permeazele i proteine de transport
specifice. Nutrienii nu suport modificri.
4. Translocaie substratul este modificat
(fosforilat) n timpul transportului
membranar; necesit energie
Substanele care au ptruns n citoplasm
sunt catabolizate de ctre enzimele
bacteriene conform cilor metabolice
proprii fiecrei specii bacteriene (Embden-
Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine
energie i precursori care vor fi antrenai n
biosintez (anabolism).
Excreia metaboliilor difuzie, proteine de
transport, liza bacteriei
Necesitile nutritive ale bacteriilor
- Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n
cantiti importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K n
cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo
- Necesiti specifice unele bacterii (auxotrofe)
solicit suplimentar compui organici
preformai, care nu pot fi sintetizai de celul
factori de cretere (ex.: AA, baze purinice,
pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de
cultur este indispensabil creterii acestor
bacterii. Bacteriile prototrofe sunt capabile a-i
realiza integral sinteza metaboliilor eseniali.
Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon
Bacterii autotrofe utilizeaz CO
2
ca unic surs de
carbon (nepatogene)
Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din
compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc)
patogene
- Bacteriile care utilizeaz materia organic moart
saprofite (reciclarea materiei organice)
- Bacterii parazite traiesc pe contul organismelor vii,
aducndu-le prejudicii (obligate, facultative).
- Agent patogen parazitul care afecteaz grav
gazda, provocnd maladie sau moarte.

Surse de azot
- AA sau acizi nucleici
- Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic

Surse de substane minerale:
- S - din AA, sulfuri, sulfai;
- P - din fosfai,
- K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale;
- Zn, Cu, Mn, Mo din ap
Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie
Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar
Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din
reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un
substrat donor de hidrogen (e
-
i H
+
) i un substrat
acceptor de hidrogen. n transfer particip
transportori intermediari de electroni (lanul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
- Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o
substan anorganic
- Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o
substan organic (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe
Mecanismele de obinere a energiei la
chemoorganotrofe n funcie de acceptorul
final de H :
Respiraie aerob. Acceptorul final este
oxigenul gazos. Implic lanul respirator de
transport al electronilor asociat MCP. Produs
final H
2
O.
Respiraie anaerob. Acceptori finali
compui anorganici (nitrat, sulfat) sau organici
(fumarat). Transportul de electroni prin lanul
respirator. Produse finale nitritul, amoniacul,
N, sulfura (in prezenta O H
2
O
2
).
Fermentarea. Substratul organic este
metabolizat fr intervenia unui agent
oxidant extern. Acceptorul final este de
asemenea un produs organic, catabolit
intermediar al degradrii substratului donor
(ex.: fermentare lactic, fermentare alcoolic,
acid mixt, etc).
In procesele de respiraie se elimin mai
mult energie dect din fermentare (1 mol
glucoza - 38 molecule ATP/2 ATP). n procese
de fermentare se formeaz deeuri rejetate
de ctre celul.

Energia eliberat poate fi utilizat direct
sub form de energie electro-chimic
(fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor,
transport transmembranar) sau stocat n
compui chimici macroergici bogai n
energie: ATP (sintetizat prin fosforilare
oxidativ sau fosforilare de substrat),
fosfoenol-piruvat, acetilfosfat i acetil-
CoA.
Clasificarea bacteriilor dup sursele de
energie i carbon
I. Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO
2
)
II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org)
III. Bacterii chemoautotrofe
(chemolitoautotrofe,
chemoorganoautotrofe)
IV. Bacterii chemoheterotrofe
(chemolitoheterotrofe,
chemoorganoheterotrofe)

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR
Creterea mrirea coordonat a masei
structurilor bacteriene ca rezultat al sintezei
Multiplicarea creterea numrului de celule
pe o unitate de suprafa sau de volum
- Divizine binar
- nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)
Perioada dintre 2 diviziuni timpul (perioada)
de generaie.
Durata T
G
depinde de specie i de condiiile
de cretere (condiii optime vitez maxim)
Bacteria T
G
in vitro
(min)
T
G
in vivo
(ore)
Escherichia coli 20-40 5
Staphylococcus
aureus
40 3-5
Vibrio cholerae 10 2-3
Mycobacterium
tuberculosis
120-240 24-48
Ciclul celular procesele care au loc de
la formarea celulei pina la urmatoarea
diviziune
1. Faza C replicarea ADN
2. Faza G de laten, segregarea
cromozomilor
3. Faza D de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critic a
celulei, iar separarea cromozomilor i
diviziunea intervin in momentul cnd
celula atinge o lungime-limit
A nu-i ine cuvntul cnd nu-i vine-
ndemn,
A dezbrca pe-acela ce i s-a dat pe mn,
A nela mulimea cu mii fgduini,
Cnd ai minit odat s te mai pui s mini,
A urgisi pe-acela care i-a fcut bine,
A mple a lui nume de pete de ruine
Aceasta nu e nobil.

(M. Eminescu, Urt i nobil)
Creterea bacteriilor n laborator cultivare.
Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din
medii naturale (prelevate patologice,
alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. Testatea sensibilitii lor fa de antibiotice
3. Obinerea unor produi de biosintez
(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni
steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,
etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...
Pentru cretere bacteriile au nevoie de
condiii fizico-chimice adecvate.
Condiiile (principiile) de cultivare
- Surs nutritiv adecvat
- Surs de energie
- Ap
- Temperatura potrivit
- pH
- Concentraia oxigenului (aerarea)
- Presiune osmotic adecvat
Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime
de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu
temperatura optim deosebim:
1. Bacterii psichrofile t optim 20 C. Cresc
i la 0 C.
2. Bacterii mezofile optimum 30-37 C
(limite 15-45 C)
3. Bacterii termofile optimum 50-60 C
(pn la 95 C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 C)
pH
1. Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele
patogene) pH 6-7,5
2. Bacterii acidofile pH 2-6 (Lactobacillus)
3. Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas,
Vibrio)
Presiunea osmotic
1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) prefer
concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu
mediul intern al gazdei) mi/o patogene
2. Bacterii halofile concentraii mari de NaCl (1-
30%) stafilococi, vibrioni (V.
parahaemolyticus)
Oxigenul
1. Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O
2
.
Obin energia prin respiraie aerob (CO
2
i ap)
2. Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse
de O
2
(2-10%). Obin energia prin respiraie aerob
3. Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O
2
.
Obin energia prin fermentare sau respiraie
anaerob. Toxicitatea O
2
formarea H
2
O
2
sau a
radicalilor superoxizi O
2
-
, pe care anaerobii nu le
pot descompune (absena superoxid dismutazei,
catalazei, peroxidazei) Clostridium, Bacteroides
4. Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n
prezena O
2
, obin energia prin fermentaie, posed
peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)
5. Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii,
obin energia prin respiraie sau fermentare
Mediile de cultur soluii sau substrate solide care
asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare
cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru creterea
bacteriilor, stocarea sau transportul lor.
Cerinele fa de mediile de cultur
- S asigure necesitile nutritive i energetice
- Umiditate optimal
- pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)
- Potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi -rH
2
<5,
aerobi rH
2
>10)
- S fie izotonice (0,5% NaCl)
- S fie sterile i transparente
CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR
Dup compoziia chimic
1. Empirice, naturale compoziia chimic
nu poate fi controlat. Au la baz produse
de origine animal sau vegetal (snge,
ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne,
cord, creier, ficat, pete, etc)
2. Sintetice includ ingrediente chimic pure,
compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate
3. Semisintetice
Dup consisten
1. Medii lichide (bulion) utilizate pentru
obinerea biomasei bacteriene i a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. Medii solide conin 10-15% gelatin sau
2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge
roii), t topire 80-100C, solidificare
42C. Placa de geloz n cutii Petri
izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n
pant) pentru acumularea culturilor pure
3. Medii semisolide 0,2 0,5 % agar-agar.
Se utilizeaz pentru studierea activitii
biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

Dup destinaie (complexitate)
A. Medii uzuale (universale, simple)
1. Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5%
NaCl)
2. Bulion peptonat (extract apos din carne +
1% pepton+0,5% NaCl)
3. Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
4. Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor
nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min
B. Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu
adaos de componente care permit creterea
mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion
glucozat, geloz-snge streptococi,
neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de
componente sau cu condiii fizico-chimice
particulare care stimuleaz creterea unor
specii i inhib creterea altor specii (geloza
salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni,
mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de mbogire reprezint medii selective
lichide, utilizate pentru mbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-
un prelevat (ex: materii fecale)
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO
3
+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (Muller+bil+verde de
briliant) Salmonella
- Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
- Ap peptonat alcalin (pH8)Vibrio cholerae
- Kitt-Tarozzi (BP+0,5% glucoz+buci de
ficat) pentru anaerobi
III. Medii diferenial-diagnostice (DD)
permit diferenierea speciilor bacteriene n
baza activitii lor biochimice (zaharolitice,
proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem:
Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Endo (geloz+lactoza+fucsin+hiposulfit)

Levine(geloz+lactoza+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoza+rou neutru+sruri de
acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (rou pe
Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levine)
Studierea proprietilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K)
pentru Corynebacterium diphtheriae
Colonii negre reducerea metalelor din sruri
Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu leciti-
naz formeaz un halou opac n jurul coloniei
Studierea proprietilor hemolitice
Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat)
n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o
zon clar
Medii DD pentru acumularea culturii pure i
identificare preliminar (multitest)
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H
2
S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (A, AG) duce la modificarea pH
i virajul culorii mediului din rou n galben.
n pant lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-
glucoza (fermentare).
Producerea H
2
S innegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea culturii pure
- irul pestri Hiss (lichid sau semi-solid) un ir de
tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i
indicator.
Aprecierea dup modificarea culorii (A) i apariia
bulelor de gaz (AG)
- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori
IV. Medii speciale pentru izolarea unor anumite
bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen
pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi)

V. Medii de transport destinate
transportrii sau stocrii unui material
(prelevat), care va fi examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, fara a favoriza
multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerin 30%
- Soluie tampon-fosfat
- Soluie NaCl 3%
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat
de Na, albastru de metilen) pentru
anaerobi, neisserii, etc
Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate
mic de material ce conine bacterii
(inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de
cultur (nsmnare, inoculare), care
ulterior va fi incubat n termostat (pentru
asigurarea temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore)
bacteriile cresc i se divid, formnd o
cultur bacterian.
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore
Cultur pur format din bacterii de
aceeasi specie (indispensabil identificrii)
Cultur mixt compus din bacterii de
specii diferite
Tulpin populaie microbian constituit
din descendenii unei singure izolri n
cultur pur, care va fi studiat ulterior
Clon populaie care rezult din
multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creterii i multiplicrii
bacteriilor n mediu lichid
- Turbiditate uniform
- Formarea unei pelicule la suprafaa mediului
(vibrioni, yersinia - agentul pestei)
- Formarea unui sediment la fundul tubului sau
pe perei (streptococi, Bacillus anthracis)
n mediu solid formarea coloniilor
Colonie o aglomerare de bacterii care se
dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de
celule (UFC) pe suprafaa unui mediu solid
Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice
(caracter util n identificare)
Caracteristica coloniilor
Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm),
mari (2-3mm)
Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc
Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc
Form punctiform, circular, filamentoas,
neregulat
Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc
Densitate opac, transparent, etc
Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid


Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) rotunde, netede,
umede, lucioase
Colonii R (rough) margini neregulate,
suprafaa uscat, rugoas

Caracterele de cultur ale bacteriilor
reprezint exigenele nutritive (medii,
temperatur, pH, aerare, etc), viteza i
manifestarea creterii pe medii lichide i
solide
Stejarul nu crete pretutindenea;
buruienele, n tot locul

Adaptibilitatea cu un mediu
nesntos, nedemn, nu nseamn
superioritate organic

M. Eminescu
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor
bacteriene se disting:
- Culturi discontinue
- Culturi continue
- Culturi sincrone

Culturile discontinue se obin la cultivarea
bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel
de culturi sunt utilizate n laboratorul
microbiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue
I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile
mediului, bacteriile sunt active metabolic,
cresc n dimensiuni, dar nu se divid.
Durata este variabil (2-4 ore); depinde de
starea bacteriei, condiiile mediului, etc
II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid
cu vitez maximal constant, curba
evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte
sensibile la ageni antimicrobieni (utile pentru
testarea sensibilitii la antibiotice).
Durata 8-10 ore
III. Faza staionar rata celulelor care se
multiplic scade treptat, numrul celulelor vii
rmne constant mai multe ore.
Cauza consumarea nutrienilor, acumularea
metaboliilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru
identificare). Sensibilitatea la ageni
antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor
progresiv


Culturi continue se realizeaz cnd mediul
de cultur este continuu rennoit i
mbogit cu oxigen cu evacuarea unei
cantiti de cultur. Se realizeaz n
chemostate sau turbidostate, cultura
aflndu-se permanent n faza
exponenial. Se utilizeaz n microbiologia
industrial.
n intestin culturi continue.
Culturi sincrone culturi n care bacteriile se
divid n acelasi timp

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Examenul bacteriologic const n
examinarea prelevatelor pe medii de
cultur pentru izolarea culturilor pure
(tulpinilor) care vor fi ulterior identificate,
testate vis-a-vis de antibiotice, eventual
conservate.
Examenul bacteriologic const din cteva
etape succesive, de la prelevarea
(recoltarea) probelor biologice pn la
remiterea rezultatelor.
Faza preanalitic (responsabilitatea
medicului)
Prescrierea investigaiei (n funcie de datele
examenului clinic i paraclinic). n ordonan
se fixeaz identitatea medicului, a
pacientului, scopul analizei, manifestrile
patologice, locul, data apariiei, alte date:
imunosupresie, AB, graviditate, etc.
Prelevarea probelor
- Alegerea prelevatului (de la poarta de
intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de
eliminare a agentului patogen)
Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni:
- Secreii rino-faringiene
- Sput
- Puroi
- Exsudate
- Snge
- LCR
- Urin
- Mase fecale
- Bioptate
- Material cadaveric
Materiale de examinat din mediul extern:
- Ap
- Alimente
- Sol
- Aer
- Lavaje
- Vectori, etc
Modul de prelevare (recoltare)
- n recipiente sterile
- Respectnd regulile de autoprotecie
- La debutul bolii
- Pn la administrarea antibioticelor
Transportarea
- Imediat sau utiliznd medii de transport, cu
respectarea condiiilor speciale dup necesitate.
- n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- n fia de nsoire s fie indicat identitatea
pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data,
ora prelevrii, scopul investigaiei)
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU
CULTURILE AEROBE
- Prelevatul este supus examenului
macroscopic (modificarea aspectului, a
mirosului, etc)- orientare n diagnostic
- Dup necesitate, probele sunt supuse
pregtirii pentru investigaie (diluare,
omogenizare, centrifugare, etc)
- Examinarea microscopic (preparate
native, Gram, Z-N, Burri-Hins...)
prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-.
I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE
Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un
melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs
patologic. O colonie separat constitue o cultur
pur.
Tehnici utilizate:
1. Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din
cutia Petri (nsmnare n striuri paralele,
nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe
trei cutii).
2. Metoda diluiilor logaritmice n geloz topit i
rcit la 50 C (10
-1
, 10
-2
,...), apoi turnate n cutii
Petri.

Metode speciale de izolare n culturi pure:
- A bacteriilor sporulate (nclzirea prealabil a
prelevatului - 80 C 20 min)
- A bacteriilor acido-rezistente (tratarea prealabil cu
acid a prelevatului)
- A bacteriilor din asociaii cu numr minim de mi/o
patogene (mbogirea prealabil a florei patogene
utiliznd medii de mbogire)
- A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la
cultivare (inocularea animalelor de laborator
sensibile)
Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie de
T
G
).

II etap ACUMULAREA CULTURII PURE
- Examinarea macroscopic a coloniilor
crescute (form, culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte, confirmarea puritii
culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloza n
pant (nclinat) pentru acumularea CP
- Termostat, 37 C, 18-24 ore
III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE
- Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)
- Identificarea CP const n evidenierea unor
caractere specifice ale CP pentru a o include ntr-o
familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultur
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice

STUDIEREA ACTIVITII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR
1. Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea
laptelui)
2. Activitatea proteolitic
- Degradarea proteinelor native (lichefierea
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui)
- Evidenierea enzimelor specifice (ureaz,
decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin
detectarea produsele finale ale reaciilor: H
2
S,
NH
3
, indol
Depistarea producerii H
2
S (formarea sulfurii de fier
de culoare neagr n mediile multitest Kligler,
Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de
filtru mbibate cu acetat de Pb deasupra BP n care
crete cultura studiat formarea sulfurii de Pb
nnegrete hrtia)
Depistarea indolului (produs al metabolizrii
triptofanului) identic, indicator acid oxalic. n
prezena indolului indicatorul vireaz n roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol
se coloreaz n albastru.
Depistarea catalazei (H
2
O
2
.... H
2
O + O
2
)
(cultura se amestec cu o pictur de ap
oxigenat apariia bulelor de gaz)
Depistarea oxidazei (detectarea prezenei
citocromoxidazei din lanul respirator)
Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin
(benzi sau rondele de hrtie mbibate cu
reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu
de ou 10% - formarea unui halou opac n
jurul coloniilor
Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1%
halou opac n jurul coloniilor (precipitarea
acizilor grai)
Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-
10% - zon clar n jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h
Identificarea rapid
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde
(economie de timp, spaiu, material)
Sistemul API o galerie din plastic format
din numeroase alveole care conin fiecare
un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,
etc). Alveolele sunt inoculate cu o
suspensie bacterian testat i incubate.
Ulterior la necesitate se adaug reactive
pentru detectarea metaboliilor particulari.
Lectura conform unui cod de cifre sau
computerizat
IV etap EVALUAREA REZULTATELOR,
DELIVRAREA RSPUNSULUI
- Compararea rezultatelor obinute cu
caracterele speciilor bacteriene cunoscute
pentru a gasi asemnri.
- Exemplu de rspuns: Din proba examinat a
fost izolat tulpina de Corynebacterium
diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la
...., rezistent la .....
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI
ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)
Condiia principal absena oxigenului
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarozzi regenerat
- 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin,
nsmnarea n geloz n coloan)
2. Crearea condiiilor de anaerobioz
- Metoda fizic utilizarea anaerostatului
- Metoda chimic n exicator se ntroduc substane
ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea
gaz-pachetelor
- Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent
a aerobilor i anaerobilor
Recoltarea cu precauie, evitnd contactul
cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale)
I etap MBOGIREA ANAEROBILOR
- nsmnarea prelevatului n 2 tuburi cu
mediul Kitt-Tarozzi regenerat
- nclzirea unui tub la 80 C, 20 min
distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc
nmulirea anaerobilor)

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE
DE ANAEROBI
- Studierea caracterelor de cultur tulburarea
mediului, descompunerea bucilor de ficat,
etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin
metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din
mediul K-T pe 3 cutii cu geloz-snge
glucozat consecutiv). Incubarea n
anaerostat/exicator/gas-pack, 24 h
- Metoda Weinberg diluii succesive a
culturii n geloz glucozat lichefiat i
aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise
ermetic. Incubarea n termostat, 24 h
III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopic a coloniilor
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte
- Repicarea n mediul K-T regenerat pentru
acumularea culturii pure
- Incubarea n termostat, 24 h
IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE
DE ANAEROBI
- Verificarea puritii CP (frotiu Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate
(cu respectarea condiiilor de anaerobioz)
V etap - EVALUAREA REZULTATELOR,
FORMULAREA I ELIBERAREA
RSPUNSULUI