Trifan

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE
I MEDICIN VETERINAR,
CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE HORTICULTUR

Biolog Trifan Daniela Silvia (Briciu)

STUDIUL POLIMORFISMULUI LA STRUGURII
DE MAS I CARACTERIZAREA GENETIC A
MUSTURILOR
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CLUJ-NAPOCA
2011
Conductor tiinific:
Prof. univ. dr. Doru Pamfil
Trifan Daniela Silvia- Rezumat tez de doctorat

I
CUPRINS

INTRODUCERE ............................................................................................................................. 6
CAPITOLUL I ................................................................................................................................ 7
CONSIDERAII PRIVIND VIA DE VIE ................................................................................... 7
1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANIC A VIEI DE VIE ................................... 7
1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS ....................................................................................... 7
1.3 IMPORTANA VIEI DE VIE ........................................................................................... 7
CAPITOLUL II ............................................................................................................................... 8
CONTROLUL I PREVENIREA FRAUDELOR ......................................................................... 8
2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAIE DE-A LUNGUL TIMPULUI ......................................... 8
2.2 MIJLOACE I METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI ............................................... 8
2.3 METODELE I MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE AUTENTIFICAREA
VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI ....................................................................................... 8
2.3.1 Analiza senzorial .......................................................................................................... 8
2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticitii soiurilor ................................... 9
CAPITOLUL III .............................................................................................................................. 9
GENERALITI PRIVIND MARKERII MOLECULARI ........................................................... 9
3.1 GENERALITI PRIVIND MARKERII MOLECULARI ................................................. 9
3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAI N PREZENTA TEZ DE
DOCTORAT ............................................................................................................................... 9
3.3 UTILIZAREA AMPRENTRII GENETICE N DETERMINAREA
POLIMORFISMULUI LA VIA DE VIE ............................................................................... 10
CAPITOLUL IV ........................................................................................................................... 11
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA ............................. 11
4.1 SCOPUL CERCETRII ..................................................................................................... 11
4.2 OBIECTIVELE URMRITE N CERCETRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT
................................................................................................................................................... 12
4.3 MATERIALUL BIOLOGIC ............................................................................................... 12
4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI .................. 13
4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE N AMPLIFICAREA ADN-ULUI ................................. 13
4.6 TEHNICI I METODE CERCETARE .............................................................................. 14
4.6.1 Extracia ADN-ului n vederea realizrii analizelor RAPD i SSR pentru determinarea
polimorfismului la via de vie ............................................................................................... 14
4.6.2 Tehnici i metode de cercetare utilizate n vederea obinerii ADN-ului din must ....... 14
4.6.2.1 Obinerea mustului ........................................................................................ 14
4.6.2.2 Pstrarea mustului ........................................................................................ 14
4.6.2.3 Extracia ADN-ului din must n vederea realizrii analizelor SSR .............. 15
4.6.3 Cuantificarea ADN-ului ............................................................................................... 15
4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD ......................... 15
4.7.1 Componentele amestecului de reacie RAPD .............................................................. 15
4.7.2 Amplificarea PCR ........................................................................................................ 16
4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR ............................. 16
4.8.1 Componentele amestecului de reacie PCR ................................................................. 16
4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR .......................................................................................... 18
CAPITOLUL V ............................................................................................................................. 18
REZULTATE I DISCUII ......................................................................................................... 18
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACIA ADN-ULUI I ESTIMAREA CANTITII I
CALITII ACESTUIA .......................................................................................................... 18

II
5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA I ELECTROFOREZA PRODUILOR DE
REACIE RAPD ...................................................................................................................... 19
5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR I INTERPRETAREA DATELOR
OBINUTE CU AMORSELE RAPD ...................................................................................... 19
5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA I INTERPRETAREA DATELOR OBINUTE CU
AMORSELE SSR ..................................................................................................................... 20
5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACIA ADN-ULUI DIN MUST I ESTIMAREA
CANTITII I CALITII ACESTUIA .............................................................................. 24
5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE SSR .. 26
CONCLUZII ................................................................................................................................. 29
BIBLIOGRAFIE SELECTIV .................................................................................................... 30
THESIS RESUME.....33


III
TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION...6
CHAPTER I.....7
CONSIDERATIONS REGARDING THE VINE...7
1.1 THE SYSTEMATIC BOTANICAL CLASSIFICATION OF VINE...................7
1.2 VITIS GENDER SYSTEMATICS...........7
1.3 THE IMPORTANCE OF VINE7
CHAPTER II8
FRAUD PREVENTION AND CONTROL8
2.1 WINE MAKING FRAUDS OVER TIME.8
2.2 MEANS AND METHODS OF WINE VARIETY FALSIFICATION.....8
2.3 METHODS AND MEANS BY WHICH AUTHENTICATION CAN BE DONE FOR A
WINE VARIETY.....8
2.3.1 Sensory analysis..8
2.3.2 Molecular methods applied to determine the authenticity of varieties..9
CHAPTER III......9
METHODS OF GENETIC FINGERPRINTING...9
3.1 GENERAL INFORMATION REGARDING MOLECULAR MARKERS.9
3.2 DIFFERENT TYPES OF MOLECULAR MARKERS USED IN THIS THESIS..9
3.3 GENETIC FINGERPRINTING USED IN DETERMINING THE VINE
POLYMORPHISMS..10
CHAPTER IV....11
RESEARCH OBJECTIVES AND PURPOSE, MATERIAL AND METHOD...11
4.1 RESEARCH PURPOSE...11
4.2 OBJECTIVES PURSUED IN THE PHD THESIS RESEARCH WORK...12
4.3 BIOLOGICAL MATERIAL12
4.4 RAPD PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION13
4.5 SSR PRIMERS USED FOR DNA AMPLIFICATION...........................................13
4.6 RESEARCH METHODS AND TECHNIQUES.14
4.6.1 Using DNA extraction to achieve RAPD and SSR analysis for determining the vine
polymorphism....14
4.6.2 Research techniques and methods used to obtain DNA from
must....14
4.6.2.1 Obtaining the grape must...14
4.6.2.2 Must preservation.......14
4.6.2.3 Extraction of DNA from must in order to achieve SSR analysis...15
4.6.3 DNA quantification...15
4.7 DNA AMPLIFICATION WITH RAPD PRIMERS...15
4.7.1 RAPD reaction mixture components....15
4.7.2 Amplificarea PCR.....16
4.8 DNA AMPLIFICATION USING SSR PRIMERS..16
4.8.1 PCR reaction mixture components...16
4.9 IMAGE ANALYSIS18
CHAPTER V.18
RESULTS AND DISCUSSION........18
5.1 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION AND ESTIMATION OF THE DNA
QUANTITY AND QUALITY...18
5.2 RESULTS REGARDING THE AMPLIFICATION AND ELECTROPHORESIS OF
RAPD REACTION PRODUCTS...19

IV
5.3 RESULTS REGARDING THE IMAGE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF
DATA OBTAINED WITH RAPD PRIMERS.......................................................................19
5.4 RESULTS REGARDING THE ANALYSIS AND INTERPRETATION OF DATA
OBTAINED WITH SSR PRIMERS..20
5.5 RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION FROM MUST AND ESTIMATION
OF QUANTITY AND QUALITY.....24
5.6 VARIETY ANALYSIS USING SSR MICROSATELLITE PRIMERS26
CONCLUSIONS...29
SELECTIVE BIBLIOGRAPHY...................................................................................................30
THESIS RESUME.....33

6
INTRODUCERE

Via de vie este una dintre cele mai rspndite culturi horticole, de mare importan
economic. Soiurile de Vitis vinifera, mpreun cu alte specii ale genului Vitis sunt n studiu
permanent, n sectoarele de cercetare din ameliorare, protecie a plantelor i, de curnd, din
industria farmaceutic.
Problemele care apar continuu n pstrarea puritii soiurilor, combaterea ecologic a
bolilor i a duntorilor, obinerea de soiuri rezistente n condiii grele de clim i pedologice,
necesit o foarte bun cunoatere a bazelor genetice ale acestor caractere fenotipice de
importan economic.
Identificarea cultivarelor de vi de vie se face n mod tradiional pe baza caracterelor
morfologice. n prezent, markerii moleculari s-au dovedit a fi o alternativ n identificarea
soiurilor de vi de vie i pot fi folosii n investigarea relaiilor taxonomice dintre speciile de
Vitis.
Markerii moleculari sunt direct legai de genotip i independeni de fenotip, fapt ce i
face s fie utilizai n identificarea cultivarelor. Ei pot fi folosii n programele de ameliorare i
mapare a genomului, deoarece sunt linkai cu unele gene de interes.
Cercetrile de genetic molecular la via de vie sunt orientate n general, spre
identificarea polimorfismului existent n cadrul speciilor de Vitis i spre stabilirea originii
filogenetice a unor specii sau soiuri.
Via de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorit
principalelor caracteristici i anume: durata lung a generaiilor, grad nalt de heterozigoie,
depresia ridicat la consangvinizare.
Tehnologia markerilor moleculari folosete secvena de ADN, ce este uor detectat i a
crei succesiune poate fi uor monitorizat. Utilizarea markerilor moleculari se bazeaz pe
ADN-ul polimorfic. Aceast tehnic este utilizat pe scar larg n ultimii ani n studii genetice
i identificarea de soiuri. Identificarea soiurilor de vi de vie se face cu markeri moleculari,
avnd la baz reacia PCR i folosind ca tehnici moleculare RFLP-ul, RAPD-ul, AFLP-ul i
SSR-ul.
O alt problem important aprut este autentificarea vinurilor. Vinul, acest copil
teribil obinut din relaia viei de vie cu soarele este o adevrat binecuvntare a naturii. Prin
multitudinea componentelor i a numeroaselor sale principii nutritive, existente ntr-o
armonioas cumpnire, vinul, consumat raional, este o surs de energie, care poate conferi
omului bun dispoziie, ncntare, nelepciune i extaz. Un strop de vin poate constitui un strop
de via adevrat ce poate amplifica bucuria de a tri. (Cotea, 1995).
Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de important att pentru
producatorii de vin ct i pentru ageniile de control guvernamental sau ale proteciei
consumatorului avnd n vedere c peste 30 % din vinurile autohtone sunt greit etichetate. La
ora actual tehnicile de biologie molecular (RFLP, RAPD, SSR) sunt folosite pe scar larg
pentru caracterizarea genetic a soiurilor de vi de vie. Aceste tehnici se pot extrapola i la
detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de
laboratoare s pun la punct diverse metode de amprentare. Din pcate aceste metode nu au fost
pn n prezent publicate sau patentate.
Dei extracia ADN-ului din esuturile vegetale este o tehnic bine cunoscut, n cazul
musturilor i a vinurilor tinere exist puine referine bibliografice n acest sens. Principalele
constrngeri sunt legate de dificultatea obinerii unui ADN de nalt calitate pretabil pentru
amplificare, datorit probabil, interferenei polizaharidelor, taninilor i polifenolilor din aceste
mixturi, sau degradrii ADN-ului ca urmare a aciunii enzimatice i biochimice din procesul
tehnologic de fabricare a vinului.


7
CAPITOLUL I
CONSIDERAII PRIVIND VIA DE VIE

1.1 CALASIFICAREA SISEMATICO-BOTANIC A VIEI DE VIE
Via de vie face parte din familia Vitaceae (Lindl) - Ampelidaceae (Kunth), familie cu
mare numr de taxoni i soiuri, cu mare arie de rspndire i valen ecologic.
Principalele specii ale genului Vitis s-au format n cadrul ecologic a trei arii geografice
diferite, care au imprimat caracteristici morfologice i productive diferite.
Vitaceaele sunt reprezentate prin 12 genuri, dup cei mai muli autori, iar dup unii, prin
14 sau chiar 18 genuri i cca 1100 specii, rspndite pe un areal geografic foarte larg. Dintre
acestea genul Vitis este cel mai important, deoarece cuprinde speciile de vi de vie care se
cultiv pentru producia de struguri i cele care se folosesc pentru portaltoi. Se cunosc 108 specii,
rspndite n zonele temperate, subtropicale i tropicale din Europa, Asia, America de Nord,
America Central, America de Sud. Din cele 108 specii, numai 60 sunt bine identificate: 33
specii americane, 27 specii asiatice, n care se include specia Vitis vinifera (Pop, 2003b).

1.2 SISTEMATICA GENULUI VITIS
Genul Vitis cuprinde aproximativ 60 de specii dioice distribuite aproape uniform ntre
America i Asia, acestea reprezentnd o resurs considerabil de gene pentru rezistena la
patogeni. (Mullins i colab., 1992).
Genul Vitis a fost subdivizat de ctre Planchon n 1887 n dou subgenuri sau secii:
- subgenul Muscadinia, cuprinde speciile de vie rspndite n regiunile tropicale i
subtropicale ale Americii de Nord. Strugurii sunt mici, cu gust foxat i cu boabe puine,
care se matureaz succesiv; boabele slab suculente acumuleaz cantiti mici n zaharuri;
seminele aproape rotunde cu chalaz oval i ncreit. Numrul de cromozomi este
2n=38
- Subgenul Euvitis (Vitis) cuprinde speciile de vi adevrate, din zonele temperate ale
Europei i Asiei, Americii de Nord, Centrale i de Sud. Strugurii sunt mari cu boabe
numeroase, care se menin pe ciorchine i dup maturarea lor. Bobul este crnos sau
zemos, n care se acumueaz multe zaharuri, semine piriforme cu rostru lung. Numrul
de cromozomi de baz este n=19 i se cunosc soiuri triploide cu 2n=57, tetraploide
2n=76, considerate ca mutaii, pentaploide 2n=95, hiperploide 2n=40 (Constantinescu,
1971).

1.3 IMPORTANA VIEI DE VIE
Dintre fructele comestibile, strugurii sunt foarte mult cutai i apreciai. Aspectul lor
atrgtor, gustul placut, dar mai ales valoarea alimentar deosebit, le creeaz un regim
preferenial de consum, intrnd astfel n categoria fructelor de elit de tip delicatese. Au o
stuctur complex i cu implicaie direct n organismul uman, sub aspect energetic,
reconfortant, vitaminizant, mineralizant, reactivant, la care se adaug nsuirile dietetice i
terapeutice. Valoare alimentar prezint nu numai strugurii ca atare, ci i mustul i vinul
consumat raional.
Strugurii au o compoziie chimic foarte complex: pe lng ap care se gsete n cea
mai mare proporie n compoziia bobului, zaharurile ocup locul al doilea. La maturitatea
deplin, coninutul strugurilor n zaharuri variaz ntre 14-35% sau 140-350g/l must. Zaharurile
aflate n struguri i must se gsesc sub form simpl - monozaharide. Zaharurile simple sunt
asimilate direct n organism, trec n snge, i apoi furnizez organismului energia cheltuit (100g
struguri proaspei furnizeaz ntre 60-116 calorii sau 1kg struguri, 700-1200 calorii)
Vinurile de struguri conin cantiti minime de vitamine, care nu pot satisface pe deplin
cerinele organismului. ns diversitatea i aciunea complex a vitaminelor determin

8
importana lor. Vitaminele B1, B2, B6, B12, PP i acidul pantotenic sunt prezente n cantiti ce
satisfac aproximativ 10% din necesitile zilnice ale omului. Biotina i acidul folic se gsesc ntr-
o msur mai mic, iar mezoinozitul- n cantiti ce corespund aproximativ necesarului zilnic al
omului.

CAPITOLUL II
CONTROLUL I PREVENIREA FRAUDELOR

2.1 FRAUDELE DIN VINIFICAIE DE-A LUNGUL TIMPULUI
Trim ntr-o vreme cnd procesul de globalizare, care a inclus numeroase industrii, tinde
s acapareze i domeniul vitivinicol, cnd vinuri de pe tot globul se vnd pe tot globul, iar
consumatorul modern, mereu n criz de timp, i dorete s se delecteze n sigran cu butura
zeilor, nemuritorul vin. Totodat, profitndu-se parc de beneficiile i de posibilitile
prezentului, se gsesc persoane dornice de mbogire prin neltorie, eludnd legile i regulile
vitivinicole (Nmloanu, I i colab.2005).
Printre practicile des ntlnite se numr la loc de cinste botezarea vinului cu ap,
adugarea de sulfat de potasiu. Progresele fcute de chimia de sintez s-au fcut simite puternic
si n domeniul contrafacerii vinurilor. Astfel, aciditatea vinului este mbuntit cu acid sulfuric,
acidul salicilic poate netini sau opri total fermentaia, sulfatul de fier servete la ameliorarea
gustului etc. (rdea, 2003).
Alte tipuri de fraude se refer la autenticitatea soiului i mai ales la arealul de producere.
Consumatorul este dus n eroare asupra anului de recolt, soiului, categoria de calitate a vinului,
arealului de provenien i chiar modificarea caracteristicilor de compoziie i organoleptice.
Aceste falsificri se refer mai mult la vinurile de consum curent, uneori i la cele de calitate
superioar i n secial la vinurile aromate.
Viorel Stoian (2001) analizeaz mecanismul prin care un vin dintr-un soi binecunoscut
Galben de Odobeti, a ajuns s se gseasc pe pia n cantiti de 3-4 ori mai mari dect se
pot obine din producia autohton de struguri din acest soi. Adugarea n reeta vinului de
struguri din alte soiuri, precum i apariia unor sticle clonate cu etichete stranii precum Galbena
Golden sunt consecina dorinei unora de a exploata faima dobndit- mai mult sau mai puin
meritat- de acest soi n ochii consumatorilor.

2.2 MIJLOACE I METODE DE FALSIFICARE A SOIULUI
Falsificarea soiului se face cu mult uurin. Distingem dou situaii diferite:
- un vin corect, produs dintr-un anumit soi de struguri, sau un amestec de asemenea vinuri,
este pur i simplu comercializat sub denumirea altui soi, care este mai cerut pe pia, sau
aduce un profit mai mare (se vinde la un pre mai bun)
- un aa-zis vin falsificat din alte puncte de vedere este vndut ca vin, ba mai mult este
vndut sub denumirea unui soi cunoscut.
La acestea se adaug i cazurile de amestecare a vinurilor n diverse proporii, dup cum
are nevoie comerciantul, fr s respecte cerinele de a avea minimum 85% dint-un soi atunci
cnd trecem soiul pe etichet, minimum 85% vin dintr-un anumit an de producie, atunci cnd
trecem anul pe etichet sau ca vinurile s fie din aceeai zon pentru a putea purta denumire de
origine (Antoce, 2005).

2.3 METODELE I MIJLOACELE PRIN CARE SE POATE FACE
AUTENTIFICAREA VINULUI DINTR-UN ANUMIT SOI
2.3.1 Analiza senzorial
Dei analiza senzorial este subiectiv, ea este uneori mai semnificativ dect analizele
chimice obiective. Un degusttor bine instruit va putea, n majoritatea cazurilor s diferenieze

9
un Cabernet Sauvingnion veritabil de un vin de duzin vndut sub acelai nume. Dar, exist i
unele inconveninnte, n sensul c un falsificator are la dispoziie mijloace performante, de la
arome sintetice identic naturale, pn la aparate de analiz i control de ultim generaie, cu
ajutorul crora atinge performana de a pcli chiar unii degusttori calificai. Cu alte cuvinte,
exist i posibilitatea unor erori n sensul declarrii drept autentice a unor vinuri falsificate cu
mult grij.

2.3.2 Metode moleculare aplicate la stabilirea autenticitii soiurilor
Pentru a mai echilibra puin lucrurile, cercettorii au propus o nou metod de lucru,
bazat pe caracterizarea ADN-ului dintr-o prob de vin brut, netratat, provenit dintr-un singur
soi de vi de vie. Deja aceast informaie este disponibil pentru un numr de peste 600 de
soiuri de vi de vie. Analiza ADN-ului dintr-un vin oarecare permite, apoi identificarea soiurilor
de vi din care a fost obinut acesta. Se ntrevd totui unele dificulti n acest sens, deoarece
vinul pus n consum este, de obicei purificat i stabilizat printr-o multitudine de tratamente
fizico-chimice, care afecteaz ADN-ul coninut n acesta. Cteva zile de fermentaie a mustului
sunt suficiente pentru ca ADN-ul din must s fie degradat ntr-o asemenea msur nct,
extragerea ADN-ului sa fie dificil. (Nmloanu i colab, 2005).

CAPITOLUL III
GENERALITI PRIVIND MARKERII MOLECULARI

3.1 GENERALITI PRIVIND MARKERII MOLECULARI
Pentru conservarea eficient a resurselor genetice vegetale este necesar stabilirea ct mai
exact a variabilitii genetice a acestora, ce poate fi determinat la dou nivele, fenotipic i
genotipic. Variabilitatea fenotipic se bazeaz pe analiza morfologiei plantelor, cea genetic pe
markerii moleculari.
Markerii genetici sunt de trei tipuri: markeri morfologici, markeri proteici i markeri
moleculari. ( Vicente i colab, 2004)
Markerii morfologici sunt uor de utilizat, nu necesit echipamente costisitoare, putndu-
se efectua o evaluare rapid a fenotipului cu ajutorul lor. Ca dezavantaje prezint urmtoarele: se
gsesc n numr limitat, sunt influenai de condiiile de mediu i de stadiul de dezvoltare al
plantei i necesit evaluarea de ctre experi n cunoaterea speciei respective.
Markerii biochimici (proteici) se bazeaz pe proprietatea proteinelor de a fi separate n
urma electroforezei. Tipuri de markeri biochimici sunt proteinele rezultate n urma stocrii
seminelor, izoenzimele
Markerii ADN (moleculari) evideniaz polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear i
citoplasmatic. Markerii moleculari nu sunt influenai de condiiile de mediu, fiind o msur
obiectiv a variabilitii, exist n numr nelimitat, acoperind ntregul genom, dar necesit
echipamente complexe de analiz.
Markerii ideali ar fi caracterizai de urmtoarele proprieti: polimorfism ridicat,
reproductibilitate mare, codominan, distribuie uniform n genom, distinctivitate (s
evidenieze diferenele ntre indivizi nrudii), neinfluenai de condiiile de mediu, neutri (alela
prezent la locusul markerului s fie independent, fr efect asupra presiunii de selecie aplicat
individului), necostisitori, uor de utilizat. (Vicente i colab, 2004)

3.2 TIPURI DE MARKERI MOLECULARI UTILIZAI N PREZENTA TEZ DE
DOCTORAT
Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN
amplificate aleator) sunt rezultai prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN
genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams i colab., 1990). Produii de

10
amplificare sunt migrai ntr-un gel de agaroz i vizualizai prin colorare cu bromur de etidiu
(fluorescent n lumin ultraviolet) sau azotat de argint. Diversitatea genetic i relaiile de
nrudire dintre indivizi se evalueaz pe baza prezenei sau absenei benzilor, rezultnd o
amprent genetic specific.
n urma amplificrii cu amorsa decamer aleatoare rezult un numr mare de fragmente
de dimensiuni variabile (300-2000 pb), ns acestea pot prezenta problema co-migrrii
(fragmentele cu aceeai greutate molecular pot avea structuri diferite, astfel presupunerea lipsei
polimorfismului pentru banda respectiv fiind eronat). Fiind o metod simpl, necostisitoare i
care nu necesit cunoaterea secvenei de ADN int, RAPD se utilizeaz i astzi n analizele
genetice, dei markerii sunt dominani iar reproductibilitatea ntre laboratoare e sczut. (Karp,
A. i colab, 1997).
Microsateliii (ADN nalt repetitiv) cunoscui ca i SSRs (Simple Sequence Repeats) sau
STRs (Short Tandem Repeats) au fost descrii pentru prima dat de Hamada i colab. (1984) ca
i secvene scurte de ADN constituite din 1 pn la 6 nucleotide repetitive n tandem. Aceast
clas de secvene simple de ADN se regsete sub form abundent i uniform n genomurile
organismelor eucariote. Aceste secvene nu se transcriu n ARN i, ntre ampla varietate de
funcionare care se atribuie se include i reglarea genetic (Hamada i colab. 1984) i de a
aciona ca semnale pentru conversia genetic i recombinare (Jeffers i colab. 1985). Reprezint
secvene scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repet n tandem, gsindu-se n
proporie mai mare la nivelul centromerului i telomerelor (ADN non-informaional) (Gupta PK
i colab, 1996). Pentru a putea fi utilizai ca markeri trebuie cunoscut localizarea lor n genom.
Polimorfismul apare datorit variaiei n numr a repetiiilor n tandem n urma amplificrii PCR
cu amorse complementare secvenelor ce flancheaz ADN-ul microsatelit (secvene conservate
n cadrul speciei, uneori i a genului). Produii de amplificare (benzi de 200-300 pb, ce difer
ntre ele ca mrime prin cel puin 10-20 pb) sunt migrai n gel de agaroz i vizualizai prin
colorare cu BrEt. Produii n general sunt migrai n gel de poliacrilamid i vizualizai prin
colorare cu azotat de argint sau cu ajutorul izotopilor radioactivi. Produii se pot secvenializa
pentru o analiz foarte clar a rezultatelor.
Numrul de repetiii este variabil i, n general, gradul de polimorfism crete cu
longitudinea total a microsatelitului (Weber,1990) care nu poate fi mai mare de 0.1Kb.

3.3 UTILIZAREA AMPRENTRII GENETICE N DETERMINAREA
POLIMORFISMULUI LA VIA DE VIE
Via de vie este o specie dificil de analizat din punct de vedere genetic datorit
principalelor caracteristici i anume: durata lung a generaiilor, grad nalt de heterozigoie,
depresia ridicat la consangvinizare.
Perfecionarea metodelor de analiz a ADN-ului, cum ar fi RAPD, AFLP i SSR au
deschis noi posibiliti de caracterizare i comparare a genotipurilor, independent de fenotip i,
respectiv, de exprimarea genelor n funcie de condiiile de mediu. Utilizarea tehnicilor de
analiz bazate pe PCR au permis detectarea polimorfismului ADN n loci dispui randomizat
(RAPD, AFLP) sau specific (SSR) n genom. Utilizarea markerilor ADN a crescut enorm
potenialul pentru caracterizarea soiurilor cultivate i a descendenilor acestora.
Markerii moleculari ca AFLP, RAPD, i SSR au fost utilizai n studii genetice la via de
vie. Aceste studii au dus la nelegerea relaiei dintre soiuri din aceeai regiune sau din regiuni
diferite. Nivelul nalt de heterozigoie prezent la via de vie multiplicat vegetativ permite
diferenierea ntre cele mai importante soiuri aproape prin orice tehnic molecular.
Ca urmare a perfecionrii tehnologiei PCR, a fost dezvoltat tehnica RAPD. Aceasta
este ieftin, rapid i uoar i a fost aplicat pentru detectarea diferenelor genetice ntre diferite
varieti, specii de vi de vie i portaltoi. Marele dezavantaj al acestei metode este dependena
rezultatelor de condiiile stricte de lucru. Diferite aparate PCR, Taq polimeraze, concentraii

11
diferite ale amorselor i ale ADN-ului, precum i persoana care realizeaz experimentul
influeneaz rezultatele. Stabilitatea rezultatelor poate fi obinut numai prin respectarea strict a
condiiilor standard de realizare a experimentului.
Markerii microsatelitici sunt utilizai, ncepnd cu mijlocul anilor 90, pentru
caracterizarea genetic a diferitelor soiuri de vi de vie cultivate n diverse ri cu tradiie
viticol. Aceasta, deoarece locii microsatelitici ofer un profil genetic unic pentru fiecare soi,
permind caracterizarea fr echivoc a oricrei varieti (Di Gaspero i colab, 2000). Thomas i
colab., 1993 au aplicat pentru prima dat tehnica SSR pentru identificarea varietilor de vi de
vie. Acetia au demonstrat c secvenele microsatelitice sunt abundente n genomul viei de vie i
sunt nalt informative pentru identificarea varietilor de Vitis vinifera. Prin analiza pedigree s-a
demonstrat c acest tip de markeri moleculari este transmis la descendeni dup legile
mendeliene ale ereditii codominant, confirmnd faptul c sunt adecvai pentru cartarea genetic
i investigarea gradului de nrudire genetic.
Determinarea amprentei genetice la vin este deosebit de important att pentru
producatorii de vin ct i pentru ageniile de control guvernamental sau ale proteciei
consumatorului avnd n vedere c peste 30 % din vinurile autohtone sunt greit etichetate. La
ora actual tehnicile de biologie molecular (RFLP, RAPD, Microsatelii) sunt folosite pe scar
larg pentru caracterizarea genetic a soiurilor de vi de vie. Aceste tehnici se pot extrapola i la
detectarea ADN-lui rezidual din vin. Interesul major pentru acest domeniu a facut ca o serie de
laboratoare s pun la punct diverse metode de amprentare. Din pcate aceste metode nu au fost
pn n prezent publicate sau patentate.
Dei extracia ADN-ului din esuturile vegetale este o tehnic bine cunoscut, n cazul
musturilor i a vinurilor tinere exist puine referine bibliografice n acest sens. Pn n prezent
nici un autor nu a raportat reuita extraciei ADN-ului din vinuri vechi. Principalele constrngeri
sunt legate de dificultatea obinerii unui ADN de nalt calitate pretabil pentru amplificare,
datorit probabil, interferenei polizaharidelor, taninilor i polifenolilor din aceste mixturi, sau
degradrii ADN-ului ca urmare a aciunii enzimatice i biochimice din procesul tehnologic de
fabricare a vinului.
Baleiras-Couto i Eiras-Dias (2006) au perfecionat o metoda eficient de extracie pentru
ADN rezidual din must i vinuri, de calitate adecvat pentru amplificarea cu microsatelii.
Markerii microsatelitici din genomul cloroplastelor au fost utilizai pentru caracterizarea ADN-
ului din must i vinuri n vederea certificrii acestuia din vi de vie. Un studiu recent a
demonstrat c ADN-ul rezidual de la via de vie i de la Saccharomyces cerevisae sunt prezente
n musturi i vinuri vechi de pn la 2 ani, iar acest ADN poate fi utilizat pentru amplificare cu
microsatelii i cuantificare la RT-PCR (Savazzini i colab., 2006).
n cazul musturilor multivarietale, markerii microsatelitici sunt cei care permit
autentificarea vinului prin relaia dintre proporia fiecrei varieti i intensitatea semnalului
alelelor specifice fiecrui soi. n plus, se poate cuantifica proporia fiecrui soi introdus n
procesul de vinificaie.

CAPITOLUL IV
SCOPUL I OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA

4.1 SCOPUL CERCETRII
n cadrul prezentului studiu scopul propus a fost analizarea la nivel molecular a
polimorfismul genetic la 10 soiuri de vi de vie pentru strugurii de mas, prin metoda RAPD i
cea a markerilor microsatelitici (SSR- Simple Sequence Repeats). Pentru fiecare soi de vi de
vie luat n studiu, vor fi identificai loci microsatelitici care pot fi utilizai pentru caracterizarea
genetic a acestor soiuri. Majoritatea markerilor SSR sunt constituii din repetiii dinucleotidice
[(AC)n, (AG)n i (AT)n]. Repetiiile dinucleotidice (AT)n sunt relativ abundente la plante i

12
prezint un grad ridicat de polimorfism. Polimorfismul apare datorit variaiei n numr a
repetiiilor n tandem n urma amplificrii PCR cu amorse complementare secvenelor ce
flancheaz ADN-ul microsatelit (secvene conservate n cadrul speciei, uneori i a genului).
Un alt scop propus n cadrul acestei teze a fost stabilirea unei metode eficiente de
extracie a ADN-ului din musturi i vinuri tinere. S-a urmrit de asemenea i compararea
profilelor genetice a soiurilor de vi de vie din musturi monovarietale cu profilele genetice din
frunzele aceluiai soi.
Elaborarea de vinuri monovarietale ce prezint caracteristici conferite de struguri are o
mare relevan la nivel mondial. Aceste soiuri sunt reprezentative pentru zonele vitivinicole,
prezentnd Denumire de Origine. Acest lucru face s existe un control strict pentru a garanta
autenticitatea lor. De aceea, cutarea metodelor de identificare a soiurilor n vinuri au o mare
importan n obinerea unui produs final de nalt calitate.

4.2 OBIECTIVELE URMRITE N CERCETRILE AFERENTE TEZEI DE
DOCTORAT
Cercetrile din experimentele realizate n prezenta tez de doctorat au vizat atingerea
urmtoarelor obiective:
1. Identificarea amorselor RAPD capabile s genereze polimorfisme la nivel molecular ntre
soiurile studiate
2. Alegerea amorselor SSR capabile s discrimineze soiurile analizate
3. Stabilirea distanelor genetice aprute ntre soiurile luate n studiu
4. Extracia ADN-ului din frunze de vi de vie i evidenierea profilului alelic al soiurilor
analizate. Profilul alelic obinut va permite identificarea precis i discriminarea ntre
soiurile testate. Pe baza acestui profil va fi analizat ADN-ul extras din must i vinuri.
5. Stabilirea unui protocol pentru extracia ADN-ului din must i vinuri tinere.
6. Realizarea unui studiu privind degradarea ADN-ului pe parcursul procesului de
fermentaie a mustului i dup terminarea acestuia.
7. Amprentarea genetic a soiurilor luate n studiu cu ajutorul amorselor SSR.
Caracterizarea musturilor i vinurilor tinere se va realiza prin amplificarea cu markeri
microsatelitici pentru a se evidenia profilul alelic. Rezultatele obinute vor permite verificarea
autenticitii acestora prin compararea ADN-ului extras din must i vinuri cu ADN-ul obinut din
frunze al soiurilor de vin utilizate. Acest lucru este de importan major pentru controlul calitii
i protecia consumatorului, oferind o garanie ce contribuie la meninerea valorii soiurilor
folosite i evitarea utilizrii abuzive a numelor prestigioase pe produse false.

4.3 MATERIALUL BIOLOGIC
Materialul biologic utilizat pentru stabilirea polimorfismului la strugurii de mas a fost
constituit din zece soiuri de vi de vie provenite din dou locaii viticole din Romnia respectiv,
de la Staiunea Didactic Experimental USAMV Cluj - Napoca i Staiunea Didactic
Experimental USAMV Iai. Recoltarea frunzelor s-a fcut n primvar, n fenofaza de cretere
a lstarilor. Au fost recoltate frunze tinere care au fost pstrate n congelator la o temperatur de
-80
0
C. Ulterior din aceste frunze a fost extras ADN-ul, care a fost folosit n reaciile PCR.
Cercetrile experimentale au fost efectuate n cadrul Laboratorului de Biotehnologii
Vegetale al Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj.
n ceea ce privesc analizele efectuate pentru extracia ADN-ului din must, materialul
biologic utilizat n experien a fost format din zece soiuri de struguri pentru vin provenite de la
Staiunea Didactic Experimental USAMV Cluj-Napoca. n primvara anului 2008 am recoltat
frunze tinere de la cele 10 soiuri (minim 5g de frunze/soi). Fiecare buta de pe care au fost
recoltate frunzele a fost marcat, urmnd ca n toamn de pe acelai buta s se recolteze strugurii.

13
Frunzele au fost pstrate la congelator la 80
0
C pn n momentul n care s-a efectuat extracia
de ADN.
Strugurii recoltai n toamn (sfritul lunii septembrie) au fost supui procesului de
microvinificaie, urmnd ca mustul i apoi vinul obinut s fie utilizat n analizele moleculare.

4.4 AMORSELE RAPD UTILIZATE PENTRU AMPLIFICAREA ADN-ULUI
Diversitatea genetic i relaiile de nrudire ntre indivizi se evalueaz pe baza prezenei
sau absenei benzilor, rezultnd o amprent genetic specific. n acest scop, au fost testate un
numr de 30 de amorse RAPD, dintre acestea doar 12 fiind polimorfice. Dup stabilirea
amorselor care au generat polimorfism, acestea au fost utilizate pentru analiza tuturor soiurilor
din ambele regiuni luate n studiu. Pentru c metoda RAPD este influent de factorii externi,
amplificarea probelor din cele dou regiuni s-a realizat n acelai thermocycler. n tabelul 4 sunt
redate secvenele celor 12 amorse care au generat polimorfism.
Au fost realizate cte 2 repetiii pentru fiecare amors, lundu-se n calcul doar benzile
vizibile prezente n cele dou repetiii. Fragmentele rezultate prin amplificare cu amorsele
polimorfice au avut lungimea cuprins ntre 150 i 2000 pb. Notarea benzilor s-a realizat prin
raportare la markerul ADN (100 pb DNA Step Ladder Promega), notndu-se cu 1 prezena
benzilor i cu 0 absena acestora. Pe baza acestor date s-a recurs la ntocmirea dendogramei.

Tabel 1
Secvenele amorselor RAPD care au generat polimorfism
Nr.
Crt.
No.
Amors
Primer
Secvena (5`-3`)
Sequence (5`-3`)
1. OPB 09 TGGGGGACTC
2 OPB 17 AGGGAACGAG
3 OPB 18 CCACAGCAGT
4 OPH 12 ACGCGCATGT
5 OPAB 11 GTGCGCAATG
6 OPC 14 TGCGTGCTTG
7 OPD 16 AGGGCGTAAG
8 OPD 19 CTGGGGACTT
9 OPD 20 ACCCGGTCAC
10 OPE 14 TGCGGCTGAG
11 OPF 16 GGAGTACTGG
12 Mic 07 TGTCTGGGTG

4.5 AMORSELE SSR UTILIZATE N AMPLIFICAREA ADN-ULUI
Pentru amplificarea probelor de ADN n vederea evidenierii polimorfismului genetic la
celor 10 soiuri luate n studiu au fost utilizate un numr de 6 amorse microsatelitice, amorse care
au fost selectate din literatur. Amorsele au fost selectate pe baza a trei criterii: uor de
amplificat, heterozigoia prezent n fiecare locus i intervalul de mrime al alelelor (pb). Aceste
amorse sunt: VVS 2, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG
47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).
Pentru amplificarea ADN-ului extras din must i vin au fost utilizate un numr de 8
amorse, amorse care au fost alese pe baza literaturii de specialitate. Aceste amorse sunt: VVS2,
VVS5, VVS29 (Thomas y Scott,1993), VVMD5, VVMD7 (Bowers et al 1996), ssVrZAG 47,
ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 (Sefc et al 1999).


14
Tabel 2
Secvenele amorselor SSR utilizate n analiza PCR
Amors
Primer
Secvena
Sequence
TM
(
0
C)
Intervalul de
mrime (pb)
Size range (bp)
Referin
Reference
VVS2 f: CAGCCCGTAAATGTATCCATC
r: AAATTCAAAATTCTAATTCAACTGC
52.2
47.7
126-151 Thomas i
colab. 1993
VVS5 f: ATTGATTTATCAAACACCTTCTACAT
r: TAGAAAGATGGAAGGAATGGTGAT
19.9
52.1
90 148 Thomas i
colab. 1993
VVS29 f: CCCCAAGGCTCTGAAAACAAT
r: TGCAAAGCAAATAAAGCTTCCA
52.2
49.1
168-189 Thomas i
colab. 1994
VVMD5 f: CTAGAGCTACGCCAATCCA
r: TATACCAAAAATCATATTCCTAAA
51.6
45.3
226 246 Bowers i
colab. 1996
VVMD7 f: AGAGTTGCGGAGAACAGGAT
r: CGAACCTTCACACGCTTGAT
51.6
51.6
233 263 Bowers i
colab. 1996
ssVrZAG
47
f: GGTCTGAATACATCCGTAAGTATAT
r: ACGGTGTGCTCTCATTGTCATTGAC
52.6
57.5
149-172 Sefc i colab.
1999
ssVrZAG
62
f: GGTGAAATGGGVCACCGAACACACGC
r: CCATGTCTCTCCTCAGTTCTCAGT
62.4
60.8
185-203 Sefc i colab.
1999
ssVrZAG
79
f: AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCG
r: TGCCCATTTTCAAACTCCCTTCC
59.2
29.2
236 260 Sefc i colab.
1999

4.6 TEHNICI I METODE CERCETARE
4.6.1 Extracia ADN-ului n vederea realizrii analizelor RAPD i SSR pentru
determinarea polimorfismului la via de vie
Att n cercetrile de genetic molecular, ct i n cele de inginerie genetic, extracia
ADN-ului reprezint un prim pas extrem de important. Izolarea acizilor nucleici din diferite
esuturi vegetale, este obligatorie n majoritatea metodelor moleculare utilizate n biologia
molecular.
Metodele de izolare a ADN-ului au ca i criterii de baz puritatea, integritatea i
cantitatea de ADN obinut. S-a demonstrat c puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai
importani factori n reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriei de ADN cu o
puritatea mare asigur reproductibilitate prin metoda RAPD. Amprente RAPD vor fi identice n
repetiii numai dac ADN-ul are o calitate adecvat.
Pentru extracia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi i colab.
(1994), modificat de Pop i colab (2003b).

4.6.2 Tehnici i metode de cercetare utilizate n vederea obinerii ADN-ului din must
4.6.2.1 Obinerea mustului
Pentru analizele efectuate n prezentul studiu vinul a fost obinut printr-un proces de
microvinificaie. Dup recoltarea strugurilor, acetia au fost zdrobii, iar mustul a fost pus n
sticle pentru fermentaie. S-a avut n vedere evitarea contaminrii soiurilor, schimbndu-se la
fiecare soi mnuile. Dup obinerea mustului (aproximativ 2 l pentru fiecare soi), acesta a fost
pus la fermentat la o temperatur de aproximativ 20
0
C.

4.6.2.2 Pstrarea mustului
Dup obinerea mustului, aproximativ 20 ml a fost pstrat la -20
0
C, pn n momentul n
care a fost analizat. Acesta a fost mprit n recipiente de 2 ml pentru a facilita decongelarea.
Restul mustului a fost supus procesului de fermentare.
Pentru a urmri influena procesului de fermentaie asupra ADN-ului, pe parcursul
perioadei de fermentaie s-au efectuat mai multe extracii de ADN. Astfel, s-au realizat extracii
n prima zi de fermentaie i apoi tot la patru zile de la nceperea fermentaiei. De asemenea, s-au
efectuat extracii i la sfritul fermentaiei (aproximativ la o lun i jumtate de la nceperea

15
fermentaiei), precum i din vin, vin care a fost supus procesului de limpezire timp de trei
sptmni.

4.6.2.3 Extracia ADN-ului din must n vederea realizrii analizelor SSR
Metodele de izolare a ADN-ului au ca i criterii de baz puritatea, integritatea i
cantitatea de ADN obinut. S-a urmrit de asemenea, eliminarea polifenolilor i a
polizaharidelor care mpiedic obinerea unui ADN de bun calitate, ce poate fi folosit n reacia
PCR. Deoarece se tie faptul c extracia ADN-ului din must i vinuri ridic probleme din cauza
degradrii acestuia pe parcursul perioadei de fermentaie, au fost testate mai multe metode.
Astfel, pentru extracia ADN-ului din frunze s-a utilizat protocolul descris de Lodhi i colab.
1994, modificat de Pop i colab. 2003b, iar pentru extracia ADN-ului din must s-au utilizat 3
metode de izolare, cu fiecare metod fiind realizate cte trei extracii pentru fiecare soi n parte.
Protocoalele utilizate sunt:
a) protocolul descris de Faria i colab. (2000),
b) protocolul descris de Lodhi i colab.(1994) modificat de Pop i colab. (2003),
c ) protocolul descris de Sambrook i colab. (1989) modificat de Baileras-Couto i Eiras Dias
(2006).

4.6.3 Cuantificarea ADN-ului
ADN-ul este considerat suficient de pur, dac puritatea este cuprins ntre 1,7 i 2,0.
Valorile mai mici de 1,7 indic impurificri cu proteine, iar cele mai mari de 2,0 indic
impurificri cu ali contaminani. Banda de absorie a moleculelor biologice n UV este ntre 200
i 400 nm, de exemplu proteinele, care constituie contaminantul major al soluiilor de ADN, au
un maxim de absorie la 280 nm. Densitatea optic a fost msurat la rata de absorie A
260
nm i
A
280
nm, fcndu-se raportul dintre cele dou rate de absorie.
Dup extracie, cantitatea i calitatea ADN-ului a fost msurat cu ajutorul aparatului
Spectofotometru ND-1000 utiliznd programul NanoDrop. Acest aparat efectueaz msurtori
de absorbie la lungimile de und de =260 nm, =280 nm i =230 nm, fiind capabil s afieze
nu doar extensiile absorbiilor, ci i concentraia ADN-ului din proba analizat.
De asemenea, s-a realizat o cuantificare a ADN-ului i n gel de agaroz 0.8%. Calitatea,
ct i gradul de degradare a ADN-ului au fost evaluate n funcie de prezena unei benzi de
dimensiuni normale, intense. n cazul n care banda nu era intens, iar degradarea se putea
observa prin prezena unor urme, s-a recurs la repetarea extraciei.

4.7 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR RAPD
Unul dintre cei mai importani factori n reproductibilitatea metodei RAPD este puritatea
ADN-ului. Utilizarea matriei de ADN cu o puritate mare asigur reproductibilitate prin metoda
RAPD. Amprentele RAPD vor fi identice n repetiii numai dac ADN-ul are o puritate adecvat.

4.7.1 Componentele amestecului de reacie RAPD
Pentru a realiza o tehnic PCR, au fost necesare urmtoarele elemente, care formeaz
amestecul de reacie:
ADN-ul care conine secvena ce urmeaz a fi amplificat
Amorsele
Cele patru feluri de nucleozide trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
ADN polimeraza
Soluia tampon n care toate aceste componente sunt amestecate.
Pentru amestecul de reacie s-a utilizat Go Taq Green Master Mix PCR (Promega) care
are urmtoarea compoziie:
- 0,05 uniti/l Taq DNA polymerase

16
- 4 mM MgCl
2

- 0,4 mM dATP, 04 mM dCTP, 0,4 mM dGTP, 0,4 mM dTTP
Amestecul de reacie a avut un volum final de 25l/tub: 12,5 l PCR Mastermix, 2,5 l
amors, 2l ADN i 8 l Nuclease free water (furnizat mpreun cu mastermixul PCR).

4.7.2 Amplificarea PCR
Amplificarea s-a realizat n aparatul thermocycler (Corbett Research) dup urmtorul
program:
3 minute la 95
0
C- predenaturare
1 minut la 93
0
C- denaturare
1 minut la 34
0
C- fixarea primerilor
1 minut la 72
0
C- extensie
10 minute la 72
0
C- extensia final

4.8 AMPLIFICAREA ADN-ULUI CU AJUTORUL AMORSELOR SSR
4.8.1 Componentele amestecului de reacie PCR
Amestecul de reacie SSR a avut un volum de 25 l/tub eppendorf, cu urmtoarea
compoziie:
- 50 ng ADN
- 200 M amestec dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Promega)
- 0,5 l amors forward
- 0,5 l amors reverse
- 2,5 mM MgCl2
- 2,5 mM 10 x buffer
- 1 U Taq DNA Polymerase (Promega)
- 2% PVP (Sigma)
- ap bidistilat steril
n cazul markerilor microsatelitici temperatura de fixare a primerilor poate fi diferit n
funcie de amors. Pentru stabilirea acesteia s-a trecut la amplificarea unei probe de ADN n
gradient de temperatur cu fiecare din primerii SSR. S-au testat temperaturi cuprinse intre 55-
59
0
C. n urma testrii au fost stabilite urmtoarele programe de amplificare:

- pentru amorsele VVS2, VVMD7:
Predenaturare -95
0
C timp de 2 minute
Denaturare -94
0
C timp de 30 de secunde
Fixarea primerilor -56
0
C timp de 45 secunde 30 de cicluri
Extensia -72
0
C timp de un minut
Extensia final -72
0
C timp de 7 minute.

- pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79:
Predenaturare -95
0
C timp de 2 minute
Denaturare -94
0
C 30 de secunde
Fixarea primerilor -57
0
C timp de 45 secunde 30 de cicluri
Extensia -72
0
C timp de un minut
Extensia final -72
0
C timp de 7 minute.
n ceea ce privete ADN-ul obinut din must, acesta a fost amplificat cu opt amorse
microsatelitice. De asemenea, amplificarea PCR s-a realizat cu ajutorul aparatului 96 Well
Gradient Palm-Cycler CG1-96 (Corbett Reserch).
Pentru amplificarea probelor cu cele 8 amorse s-au utilizat trei programe de amplifcare,
diferena ntre cele trei programe fiind temperatura de a fixare a amorselor.
45 de cicluri

17
Pentru amorsele VVS 2, VVMD 7 s-a folosit urmtorul program de amplificare:

Pentru amorsele ssVrZAG 47, ssVrZAG 62, ssVrZAG 79 s-a folosit urmtorul program
de amlpificare:

n cazul amorselor VVS 5 i VVMD 5, VVS 29 programul de amplificare a fost
urmtorul:

Migrarea electroforetic
Dup stabilirea programelor de amplificare s-a trecut la amplificarea tuturor probelor cu
cele 8 amorse microsatelitice.
Produii de amplificare obinui cu amorsele RAPD au fost migrai n gel de agaroz
1,4%. Sursa de putere a fost programat la tensiunea de 80V, respectiv 200 mA iar durata de
migrare a fost de 1 or i 30 de minute. Metoda electroforetic se bazeaz pe separarea diferitelor
specii de particule ncrcate electric, prin migrarea difereniat sub influena unui cmp electric.
Produii PCR obinui n urma amplificrii cu amorsele SSR, au fost migrai n gel de
agaroz 4%. Soluia tampon, utilizat n electroforez, a fost Tris-acetatul (TAE 1x). n gel au
fost ncrcai 12 l produs PCR. Deoarece bufferul a fost colorat, nu a mai fost necesar
adugarea unui alt tip de colorant. Sursa de putere a fost programat la tensiunea de 100V,
respectiv 200 mA iar durata de migrare a fost de 2 ore.
Deoarece gelul de agaroz nu are o putere de rezoluie aa de ridicat, el nefiind capabil
s separe fragmente de ADN care difer printr-o singur pereche de baze, ulterior produii de
amplificare au fost migrai n gel de poliacrilamid, gel cu o putere de rezoluie mult mai
ridicat.
Predenaturare 95
0
C timp de 2 minute
Denaturare la 95
0
C - 30 de secunde
Fixarea amorselor la 56
0
C - 45 de secunde
Extensia la 72
0
C 1 minut
Extensia final 72
0
C 7 minute
30 de cicluri
Predenaturare 95
0
C timp de 2 minute
Denaturare la 95
0
C - 30 de secunde
0
C - 45 de secunde
Extensia la 72
0
C 1 minut
Extensia final 72
0
C 7 minute
30 de cicluri
Predenaturare 95
0
C timp de 2 minute
Denaturare la 95
0
C - 30 de secunde
0
C - 45 de secunde
Extensia la 72
0
C 1 minut
Extensia final 72
0
C 7 minute
30 de cicluri

18
4.9 ANALIZAREA IMAGINILOR
n analizarea statistic a imaginilor au fost luate n considerare doar benzile cu o
intensitate luminoas mare. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.
Cu ajutorul acestui program se stabilee mrimea fragmentelor de ADN prin compararea
acestora cu un ADN standard (Lader ADN 100pb).
n urma comparrii cu ADN-ul standard s-a stabilit mrimea fiecrui fragment amplificat.
Matricea binar a fost utilizat ulterior pentru calcularea distanelor genetice, pe baza crora s-a
realizat ntocmirea dendogramei. Calcularea distanelor genetice i ntocmirea dendogramei s-a
realizat cu ajutorul programului FreeTree 0.9.1.50, utiliznd coeficientul Nei Li/Dice pentru
distanele genetice, respectiv metoda UPGMA pentru dendogram. Programul FreeTree 0.9.1.50
permite optimizarea structurii arborelui i totodat testarea robusteii acestuia prin calcularea
valorilor de coeficien Bootstrap i/sau Jackknifing. Prezentarea grafic a dendrogramei s-a
realizat cu programul TreeView.

CAPITOLUL V
REZULTATE I DISCUII

5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACIA ADN-ULUI I ESTIMAREA CANTITII
I CALITII ACESTUIA
n urma extraciei de ADN de la cele 10 soiuri de vi de vie recoltate de la Staiunea de
Cercetri Experimentale Cluj-Napoca, utiliznd metoda descis de Lodhi i colab. (1994) i
modificat de Pop i colab. (2003b) s-au obinut cantiti cuprinse ntre 145 ng/l i 1121,79
ng/l, cu o puritate care a variat ntre 1,82 i 2. Au fost realizate cte dou citiri pentru fiecare
prob n parte. Cea mai mic cantitate s-a obinut la soiul Muscat Perla de Csaba (145,33), iar
cea mai mare s-a obinut la soiul Coarn neagr (1121,79). Cantitatea a fost corespunztoare
avnd n vedere c pentru amplifacare s-au utilizat 50 ng. Astfel, ADN-ul extras a fost diluat cu
ap ultrapur pn la concentraia final de 50ng/l (tab 7).
n ceea ce privete cantitile obinute n urma extraciei ADN-ului din probele recoltate
de la SDE Iai, cea mai mic cantitate s-a obinut la soiul Napoca i anume 484,67 ng/l iar cea
mai mare cantitate a fost de 743,85 ng/l la soiul Coarn alb. De asemena puritile obinute n
urma efecturii extraciilor la cele 10 soiuri au variat ntre 1,82 i 2.
De asemenea calitatea ADN-ului a fost verificat i n gel de agaroz 0,8%. Astfel, dac
banda a avut o intensitate luminoas ridicat s-a considerat c extracia ADN-ului din proba
respectiv a fost reuit. n figura 1 sunt prezentate imaginile obinute n urma cuantificrii
ADN-ului n fel de agaroz. Dup cum se poate observa, toate probele au prezentat band de
intensitate luminoas ridicat. Prin urmare, cantitatea i calitatea ADN-ului sunt suficiente pentru
efectuarea urmtoarelor analize.

Fig 1. Verificarea concentraiei de ADN a probelor analizate de la SDE Iai i SDE Cluj

Banda de
ADN
L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD

19
5.2 REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA I ELECTROFOREZA PRODUILOR
DE REACIE RAPD
Amplificarea probelor s-a fcut n dou repetiii pentru fiecare amors. De asemenea,
aceeai amors a fost folosit pentru amplificarea tuturor probelor din fiecare staiune n parte,
obinndu-se de fiecare dat acelai profil electroforetic. Repetarea amplificrilor, n cazul
metodei RAPD, cel puin de dou ori, este de o importan fundamental datorit sensibilitii
evidente a metodei. Din totalul celor 30 de amorse utilizate iniial, s-au obinut polimorfisme cu
un numr de 12 amorse.
Fragmentele rezultate prin amplificarea cu amorsele polimorfice au avut lungimea
cuprins ntre 150 i 2000 pb, majoritatea avnd ntre 300 i 1500 pb.
Pentru a evidenia posibilele diferene ntre aceleai soiuri, dar provenite de la staiuni
diferite, fiecare amors a fost amplificat cu probele provenite de la aceleai soiuri dar din
staiuni diferite. Din analiza gelurilor se observ c nu exist diferene ntre provenienele
aceluiai soi. Acest lucru se poate explica prin faptul c via de vie se nmulete cel mai adesea
vegetativ, prin altoire, soiurile fiind nmulite n staiuni sau centre de cercetare unde este
controlat riguros proveniena acestora.

a b
Fig. 2 Produii de amplificare obinui cu primerul Mic 07 la cele 10 soiuri de vi de vie de la
SDE Cluj (a) i Iai (b)

5.3 REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR I INTERPRETAREA
DATELOR OBINUTE CU AMORSELE RAPD
Un numr total de 114 fragmente de ADN de mrimi diferite au fost vizualizate. Au fost
marcate i luate n studiu doar benzile clare de ADN amplificate. Din punct de vedere analitic au
fost selectate ca i prezente doar benzile reproductibile din fiecare gel analizat.
Din totalul de 114 benzi cu mrime cuprins ntre 150 pb 2000 pb, 97 de benzi au fost
polimorfice i 17 monomorfice cu un indice al polimorfismului de 85,08%. Numrul de
fragmente polimorfice detectate de o amors variaz de la 2 (amorsa OPA 09) la 14 (OPD 19). n
ceea ce privete procentul de polimorfism, acesta a variat ntre 100% n cazul amorselor OPAB
11, OPC 14, OPD 16 i 50 % n cazul amorsei OPA 09.
Polimorfismul obinut cu amorsele RAPD este mare, reflectnd diversitatea accesiunilor.
Distanele genetice calculate sunt prezentate n tabelul 3. Cu ct valorile distanelor
genetice sunt mai mici cu att speciile sunt mai nrudite ntre ele.
Tabel 3
Distanele genetice calculate pentru cele zece soiuri luate n studiu

Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD
Ca 0.000
CN 0,236 0.000
V 0,159 0,319 0.000
TC 0,183 0,271 0,284 0.000
PC 0,250 0,385 0,244 0,263 0.000
500 pb
1000 pb
500 pb
1000 pb

20
Tabel 3- continuare
CA 0,301 0,279 0,341 0,244 0,341 0.000
Ce 0,205 0,297 0,111 0,263 0,244 0,341 0.000
N 0,341 0,386 0,218 0,413 0,356 0,463 0,195 0.000
MH 0,405 0,377 0,474 0,407 0,447 0,352 0,500 0,425 0.000
CD 0,470 0,395 0,365 0,444 0,341 0,375 0,341 0,317 0,465 0.000

Datele din interiorul tabelului 3 arat c cea mai mic valoare a distanei genetice
(0,4421) s-a nregistrat ntre soiurile Victoria i Cetuia, ceea ce denot o strns nrudire ntre
ele, fapt confirmat i n dendrograma din figura 36. Din puntul de vedere al distanei genetice
considerm c cele mai ndeprtate soiuri analizate sunt Cetuia i Muscat de Hamburg,
valoarea distanei genetice fiind de 0,500.
Apropierea genetic ntre cele zece soiuri de vi de vie analizate, stabilit pe baza
matricei distanelor genetice i a algoritmului Neighbor Joining Tree sunt prezentate n figura 3
sub forma unei dendrograme.
n cadrul dendogramei s-au evideniat dou grupuri principale:
Primul grup (A) cuprinde soiurile Coarn alb i Coarn neagr, aceste soiuri situndu-se
n acelai grup i din punct de vedere ampelografic, avnd caractere fenotipice asemntoare. De
asemenea, ambele soiuri au origine comun (Turcia).
Grupul B cuprinde soiurile Victoria, Cardinal, Cetuia, Timpuriu de Cluj, Musat Perla
de Csaba, Napoca. Soiul Victoria provine din ncruciarea soiurilor Cardinal i Afuz Ali, soiurile
Timpuriu de Cluj i Cetuia au un printe comun, deci situarea lor n acelai grup confirm acest
lucru. La o distan mai mare se afl soiurile Chasselas dore i Muscat de Hamburg. Grupul A
cuprinde la rndul lui alte subgrupuri cum ar fi cel care cuprinde soiurile Victoria i Cetuia.
MH
CD
N
PC
TC
Ca
Ce
V
81
35
12
18
18
CA
CN
25
28
58
100

Fig. 3 Dendrograma obinut la cele zece soiuri de vi de vie analizate

5.4 REZULTATE PRIVIND ANALIZA I INTERPRETAREA DATELOR OBINUTE
CU AMORSELE SSR
Variabilitatea genetic a celor zece soiuri de vi de vie a fost analizat la nivelul a
6 loci microsatelitici. Toate amorsele utilizate au generat produi de amplificare i s-au
dovedit a fi multialelice. Electroforeza produilor de amplificare s-a realizat n gel de
agaroz de concentraie 4%.

21

Fig. 4 Profilul electroforetic obinut cu amorsele VVMD7 i ZAG 47

Dup migrarea produilor PCR obinui cu cele ase amorse n gel de agaroz, acetia au
fost migrai i n gel de poliacrilamid. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total
Lab TL 100. Cu ajutorul acestui program se stabilee mrimea fragmentelor de ADN prin
compararea acestora cu un ADN standard.
Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic la soiurile analizate sunt
prezentate n tabelul 4.
Tabel 4
Profilele genetice ale celor 10 soiuri de vi de vie analizate cu cei 6 loci microsatelitici
(dimensiunea alelelor este exprimat n pb)

Amors
Soi
VVS 2 ZAG 79 ZAG 62 ZAG 47 VVMD 7 VVS 29
Cardinal 162
162
249
249
196
186
166
166
245
238
265
265
Coarn Neagr 167
156
245
245
202
192
174
166
245
235
268
268
Victoria 160
160
238
238
197
187
166
166
245
234
270
270
Timpuiu de Cluj 160
160
238
238
196
186
172
164
243
233
280
281
Muscat Perla de
Csaba
168
158
251
251
186
186
162
162
233
233
280
280
Caoarn Alb 181
158
273
251
200
182
168
162
239
239
279
276
Cetuia 181
157
278
254
190
182
169
162
240
231
278
278
Napoca 159
159
239
239
186
186
164
164
241
231
278
276
Chasselas dore 156
156
266
245
201
192
164
159
247
240
278
278
Muscat de Hamburg 155
155
269
249
192
182
163
159
259
239
280
282
Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un numr de 10 variante alelice.
Dimensiunea alelelor este cuprins ntre 155-181 pb. Se remarc predominana soiurilor
homozigote (60%) i faptul c dimensiunile alelelor detectate depesc intervalul de mrime citat
de literatur. Frecvena alelelor este cuprins ntre 0,0714 i 0,1428.
Pentru locusul microsatelitic ZAG 79 au fost detectate tot un numr de 10 variante
alelice. Dimensiunea acestora a fost cuprins ntre 238-278 pb. Dintre soiurile analizate 40%
dintre acestea au fost heterozigote. i n cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate
depesc intervalul de mrime citat de literatur.
100 pb
300 pb
100 pb
300 pb
L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD L Ca CN V TC PC CA Ce N MH CD

22
Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate 10 variante alelice cu dimensiuni
cuprinse ntre 182 pb i 202 pb. Se remarc n cazul acestui locus un grad mare de heterozigoie,
80% dintre indivizi fiind heterozigoi. Dimensiunile alelelor detectate se ncadreaz n intervalul
citat de literatur i anume: 185-203 pb. Frecvena alelelor este cuprins ntre 0,0555 i 0,1666.
n cazul locusului microsatelitic ZAG 47 au fost detectate 9 variante alelice cu
dimensiunile cuprinse ntre 159 pb i 174 pb. Se observ predominana indivizilor heterozigoi,
acetia fiind prezeni n procent de 60%. Toate valorile alelice obinute se ncadreaz n
intervalul citat de literatur i anume 149 pb-172 pb. Frecvena alelelor este cuprins ntre
0,0625 i 0,1875.
n cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 12 variante alelice cu
intervalul citat de literatur i anume 233 pb-263 pb. n cazul acestui locus frecvena aleleor este
cuprins ntre 0,0588 i 0,1176.
Pentru locusul microsatelitic VVS 29 au fost detectate 9 variante alelice diferite, cu
dimensiuni cuprinse ntre 265 pb i 282 pb. n cadrul acestui locus microsatelitic predominani
sunt indivizii homozigoi, acetia aprnd n procent de 60%.
Dup cum reiese din datele prezentate mai sus, s-a obinut un numr total de 60 de alele,
ntre 9 i 12 alele/locus, numrul mediu de alele obinute/locus fiind de 10.
Tabel 5
Parametrii genetici obinui cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de vi de vie studiate

Locus
Locus
Nr. de
soiuri
No. of
varieties
Nr. de alele
detectate
No. of alleles
detected
Heterozigoia
ateptat
Expected
heterozygosity
Heterozigoia
observat
Observed
heterozygosity
VVS 2 10 10 0,926 0,400
ZAG 79 10 10 0,947 0,400
ZAG 62 10 10 0,884 0,800
ZAG 47 10 9 0,879 0,600
VVMD 7 10 12 0,942 0,800
VVS 29 10 9 0,895 0,400
Valoare medie 10 0,912 0,566
Datele obinute cu amorsele SSR au fost prelucrate ntr-o matrice binar, pe baza creia
au fost calculate distanele genetice ntre accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetic
Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl i colab., 2001).
Tabel 6
Distanele genetice obinute n urma amplificrii celor 10 probe cu amorsele SSR

Ca CN V TC PC CA Ce N CD MH
Ca 0.000
CN 0.625 0.000
V 0.625 0.625 0.000
TC 0.666 0.666 0.583 0.000
PC 0.791 0.791 0.875 0.541 0.000
CA 0.708 0.625 0.708 0.625 0.541 0.000
Ce 0.708 0.625 0.708 0.625 0.666 0.458 0.000
N 0.75 0.75 0.833 0.583 0.708 0.666 0.583 0.000
CD 0.75 0.458 0.75 0.625 0.791 0.625 0.416 0.583 0.000
MH 0.708 0.583 0.708 0.583 0.666 0.458 0.541 0.708 0.541 0.000


23
Datele tabelare arat c cea mai mic valoare a distanei genetice este 0,416 i se observ
ntre soiurile Chaseelas dore i Cetuia. Aceast apropiere este confirmat i prin dendograma
din fig 5. Aceste dou soiuri sunt considerate ca fiind cele mai apropiate din punct de vedere
genetic, deoarece cu ct valoarea dintre dou soiuri este mai muc, cu att soiurile sunt mai
apropiate din punct de vedere genetic. Cea mai mare distan se afl ntre soiurile Muscat Perla
de Csaba i Victoria (0,875).
Apropierea genetic ntre cele 10 soiuri din genul Vitis analizate, stabilit pe baza
matricei distanelor genetice i a algoritmului UPGMA este prezentat n figura 5 sub forma unei
dendrograme.
Din fig 5 se poate observa c soiurile au fost grupate n dou grupuri principale: A i B.
Grupul A este format la rndul su din alte subgrupuri: subgrupul A1 care cuprinde soiurile
Cardinal i Victoria. Aceste soiuri sunt foarte apropiate i din punct de vedere ampelografic,
deoarece, soiul Victoria provine din ncruciarea soiurilor Cardinal i Afuz Ali, deci situarea lor
pe aceeai ramur confirm acest lucru. Subgrupul A2 cuprinde soiurile Carn alb i Coarn
neagr. Situarea lor n acelai subgrup se poate explica prin faptul c aceste soiuri fac parte din
punct de vedere ampelografic din acelai sortogrup de soiuri cu caractere fenotipice
asemntoare alturi de Coarn roie i Coarn neagr selecionat.
Din grupul B fac parte soiurile Muscat Perla de Csaba, Timpuriu de Cluj i Napoca.
Situarea soiurilor Timpuriu de Cluj i Napoca n acelai grup s-ar putea explica prin originea
geografic comun a celor dou soiuri. Soiurile Muscat de Hamburg i Timpuriu de Cluj se
gsesc pe aceeai ramur n dendogram, ele fcnd parte i din aceeai grup, cea a soiurilor cu
maturare extratimpurie i timpurie, fiind apreciai mai ales pentru timpurietate.
Cardinal
Victoria
44
Coarna Neagra
Coarna Alba
Muscat de Hamburg
39
Cetatuia
Chasselas Dore
43
7
4
9
Napoca
Timpuriiu de Cluj
Muscat Perla de Csaba
32
19
5

Fig. 5 Dendrograma obinut la cele zece soiuri de vi de vie analizate cu amorsele SSR

24
5.5 REZULTATE PRIVIND EXTRACIA ADN-ULUI DIN MUST I ESTIMAREA
CANTITII I CALITII ACESTUIA
Dup extracia ADN-ului, cantitatea i puritatea acestuia au fost msurate cu ajutorul
aparatului Spectofotometru ND-1000 utiliznd programul NanoDrop. n urma citirii cantitilor
de ADN obinute obinute dup extracia efectuat din must, cea mai mic cantitate de ADN s-a
obinut la soiul Riesling italian (123,33 ng/l) utiliznd protocolul al treilea de extracie i anume
cel descris de Sambrook i colab.(1989), iar cea mai mare cantitate de ADN s-a obinut la soiul
Muscat Ottonel (1432.65 ng/l) atunci cnd s-a aplicat protocolul descris de Faria i coalb.
(2000). Cantitile de ADN obinute prin cele trei metode de extracie dup prima zi de
fermentaie sunt prezentate n tabelul 7.

Tabel 7
Cantitatea de ADN obinut prin cele trei metode de extracie

SOIUL
VARIETY
CANTITATEA DE ADN NG/L
DNA QUANTITY NG/L
Protocol A Protocol B Protocol C
Burgund mare 512.79
536.75
543.28
932.84
942.25
925.23
202.41
225.8
197.32
Merlot 569.39
538.25
570.03
697.42
604.5
682.13
146.34
139.5
180.21
Cabernet Sauvignon 607.18
634.15
600.00
856.52
849.34
832.18
287.7
250.41
267.13
Riesling de Rhin 423.67
450.43
413.16
738.86
759.52
736.5
182.59
174.32
187.18
Sauvignon blanc 577.82
596.88
574.18
862.42
867.83
843.24
168.11
161.43
139.52
Riesling italian 384.99
375.25
394.47
540.98
532.83
580.72
123.33
138.45
175.75
Aligote 346.71
338.25
352.18
624.53
625.8
672.84
157.18
185.2
132.63
Muscat Ottonel 519.79
532.24
525.42
1432.65
1282.9
1025.23
342.71
234.85
217.2
Saint Emilion 445.85
460.32
450.54
705.8
775.64
726.3
252.74
225.8
202.34
Pinot gris 623.67
614.18
640.32
877.58
820.25
868.6
311.5
273.63
250.15

n urma analizelor efectuate, recomandm aplicarea protocolului B de extracie a ADN-
ului, protocol prin care pe media soiurilor s-au obinut cantitile cele mai mari de ADN i
nivelul cel mai nalt de puritate al acestuia.

25
Pentru a stabili dac procesul de fermentaie are vreo influen asupra cantitii i calitii
ADN-ului, s-au efectuat extracii n diferite perioade ale procesului de fermentaie. Pentru
extracii s-au luat probe de must din diferite perioade de fermentaie care s-au pstrat la frigider
pn la efectuarea extraciei. Deoarece, cele mai bune rezultate s-au obinut prin metoda descris
de Faria i colab (2000), s-a continuat doar cu aceast metod.
n general, extracia ADN-ului din must, a dat rezultate bune pentru probele de must din
orice perioad a procesului de fermentaie. Acest fapt s-a putut observa att n urma analizei
spectofotometrice ct i n urma migrrii n gel de agaroz.
Cantitile de ADN au nceput s scad drastic la sfritul perioadei de fermentaie i
dup ce vinul s-a limpezit iar depunerile au fost nlturate. Acest lucru se poate explica prin
faptul c n must se afl resturi de tescovin (pieli, pulp, etc). Primul pas n extracia ADN-
ului este centrifugarea lichidului care se dorete a fi analizat, pentru a obine resturile celulare
aflate n suspensie i eliminarea supernatantului. Peste resturile obinute n urma centrifugrii se
adug un tampon de extracie care faciliteaz ruperea membranelor celulare i nucleare. n acest
fel se obine o cantitate de ADN adecvat efecturii viitoarelor analize.
Dac din contr, n mediu nu se afl particule n suspensie cum este n cazul unui must
limpezit sau a unui vin filtrat, cum sunt vinurile comerciale, extracia de ADN prin aceast
metod nu este posibil.
Sinteza cantitilor de ADN obinuite pe parcursul perioadei de fermentaie, precum i
din vin este prezentat n tabelul 8. Se observ la fiecare soi cum cantitile de ADN scad pe
parcursul perioadei de fermentaie, ajungndu-se ca n urma exteciei din vin s nu se mai obin
cantiti de ADN.

Tabel 8
Evoluia cantitii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaie

Ziua
Soiul
1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70
Burgund
mare
932,84 853,14 727,84 868,11 612,79 502,41 325,15 223,19 127,72 68,11 -2.85
Merlot 697,42 524,32 642,56 537,73 569,39 546,34 294,24 174,45 92,17 37,73 -4.16
Cabernet
Sauvignion
856,52 734,18 663,95 725,18 607,18 637,7 432,43 284,67 123,27 25,18 -6.34
Riesling de
Rhin
738,86 575,18 977,78 667,83 623,67 582,59 350,08 227,38 147,47 67,83 -6.84
Sauvignion
blanc
862,42 703,32 754,95 723,33 576,82 668,11 284,19 197,82 95,63 23,33 -1.77
Riesling
italian
540,98 423,18 687,81 619,6 484,99 523,33 250,35 185,54 85,81 19,23 2.79
Aligote 624,53 655,52 777, 9 531,84 646,71 657,18 324,15 212,32 77,22 31,84 3.82
Muscat
Ottonel
1432,7 837,2 961,81 932,65 519,79 642,71 309,23 224,18 71,63 32,65 -3.09
Saint
Emilion
705,8 673,7 548,67 743,23 745,85 552,74 293,88 152,98 84,27 43,23 -7.42
Pinot gris 877,58 705,58 882,59 723,78 623,67 511,5 324,23 224,17 82,35 23,78 -6.62

n figura 6 sunt prezentate dreapta i ecuaia de regresie a cantitii de ADN pe parcursul
perioadei de fermentaie. Din prezentarea grafic se observ c rezultatele reale urmresc destul
de fidel dreapta de regresie, avnd mici abateri la dreapta sau la stnga acesteia.

26
y = -22,556x + 881,73
R
2
= 0,9132
0
200
400
600
800
1000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34
zile
c
a
n
t
i
t
a
t
e
a

d
e

A
D
N

Fig. 6 Dreapta i ecuaia de regresie a cantitii de ADN pe parcursul perioadei de fermentaie

5.6 ANALIZA SOIURILOR CU AJUTORUL AMORSELOR MICROSATELITICE
SSR
n efectuarea anlizelor din prezentul studiu s-au utilizat un numr de opt amorse
microsatelitice. Markerii microsatelitici sunt considerai cei mai informativi markeri ADN, fiind
utilizai, ncepnd cu mijlocul anilor 90, pentru caracterizarea genetic a diferitelor soiuri de vi
de vie cultivate n diverse ri cu tradiie viticol, acetia oferind un profil genetic unic pentru
fiecare soi, ceea ce permite caracterizarea fr echivoc a oricrei varieti.
Toate amorsele utilizate au generat produi de amplificare i s-au dovedit a fi
multialelice. Electroforeza s-a realizat pentru nceput n gel de agaroz 4% iar migrarea s-a
realizat la o putere de 100V. Pentru estimarea dimensiunilor fragmentelor, n gel a fost ncrcat
un marker ADN de 25 pb (Promega), avnd fragmente cuprinse ntre 25 i 300 pb.
Pentru a urmri dac ADN-ul extras pe parcursul perioadei de fermentaie i din vin este
suficient pentru efectuarea reaciilor PCR, acesta a fost amplificat cu amorsa ZAG 79, n cazul
soiului Aligote. Se poate observa din imaginea gelului c s-au obinut benzi n cazul utilizrii
ADN-ului extras pe parcursul perioadei de fermentaie, dar nu s-au mai obinut benzi cu ADN-ul
extras din vin.

Fig. 7 Produii de amplificare obinui n urma migrrii cu amorsa ZAG 79 la soiul
Aligote

Pentru determinarea cu acuratee a dimensiunilor produilor de amplificare, acetia au
fost migrai n gel de poliacilamid, gel care are o putere de rezoluie foarte mare, putnd separa
fragmente de ADN care difer n mrime i printr-o singur pereche de baze.
Dimensiunile alelelor pentru fiecare locus microsatelitic, la cele 10 soiuri luate n studiu
sunt prezentate n talelul 9. Benzile au fost detectate cu ajutorul programului Total Lab TL 100.

L 1 4 8 12 16 20 24 28 32 36 70
100 pb
300 pb

27
Tabel 9
Profilele genetice ale celor 10 soiuri de vi de vie analizate cu cei 8 loci microsatelitici
(dimensiunea alelelor este exprimat n pb)

Pimer
Soi
VVMD 7 VVS 29 ZAG 47 ZAG 79 ZAG 62 VVS5 VVMD5 VVS2
Frunze
Merlot 246
237
178
171
168
159
257
240
187
199
149
149
235
237
132
132
Sauvignon
blanc
250
241
172
172
157
157
251
240
185
187
92
92
233
237
140
140
Riesling
italian
242
142
173
173
158
158
245
240
195
199
92
116
- 136
138
Muscat
Ottonel
253
243
182
174
165
156
261
242
187
203
106
149
231
235
136
136
Pinot gris 253
245
176
176
160
155
269
248
193
203
92
98
235
237
138
140
Riesling de
Rhin
247
247
184
176
164
160
245
238
185
185
98
98
235
239
134
134
Aligote 258
249
184
177
163
153
257
257
199
199
106
116
- 136
136
Saint
Emilion
252
252
184
178
158
158
249
235
193
199
90
92
- 135
135
Burgund
mare
262
251
184
175
160
147
257
257
187
193
98
98
226
231
138
138
Cabenet
Sauvignon
262
254
181
178
163
163
258
258
203
203
98
148
- 140
140
Must monovarietal
Merlot 246
237
178
171
168
159
257
240
187
199
149
149
235
237
132
132
Sauvignon
blanc
250
241
172
172
157
157
251
240
185
187
92
92
233
237
140
140
Riesling
italian
242
142
173
173
158
158
245
240
195
199
92
116
- 136
138
Muscat
Ottonel
253
243
182
174
165
156
261
242
187
203
106
149
231
235
136
136
Pinot gris 253
245
176
176
160
155
269
248
193
203
92
98
235
237
138
140
Riesling de
Rhin
247
247
184
176
164
160
245
238
185
185
98
98
235
239
134
134
Aligote 258
249
184
177
163
153
257
257
199
199
106
116
- 136
136
Saint
Emilion
252
252
184
178
158
158
249
235
193
199
90
92
- 135
135
Burgund
mare
262
251
184
175
160
147
257
257
187
193
98
98
226
231
138
138
Cabenet
Sauvignon
262
254
181
178
163
163
258
258
203
203
98
148
- 140
140
n cazul locusului microsatelitic VVMD 7 au fost detectate 15 variante alelice cu
intervalul citat de literatur i anume 233 pb-263 pb.

28
n cazul locusului microsatelitic VVS 29 au fost detectate 11 variante alelice cu
acetia fiind prezeni n procent de 70%. Dimensiunile alelelor detectate se ncadreaz n
dimensiunile cuprinse ntre 147 pb i 168 pb. n cadrul acestui locus microsatelitic se observ
predominana indivizilor heterozigoi, acetia fiind prezeni n procent de 60%. Toate valorile
alelice obinute se ncadreaz n intervalul citat de literatur i anume 149 pb-172 pb.
acetia fiind prezeni n procent de 70%. Se observ c aproape toate valorile alelice obinute se
ncadreaz n intervalul citat de literatur i anume 236 pb-260 pb.
Pentru locusul microsatelitic ZAG 62 au fost detectate tot un numr de 6 variante alelice.
Dimensiunea acestora a fost cuprins ntre 185-203 pb. Dinte soiurile analizate 70% dintre
acestea au fost heterozigote. i n cazul acestui locus dimensiunile alelelor detectate nu depesc
intervalul de mrime citat de literatur.
n cazul locusului microsatelitic VVS 5 au fost detectate 7 variante alelice cu
Pentru locusul microsatelitic VVMD 5 au fost detectate 6 variante alelice diferite, cu
dimensiuni cuprinse ntre 226 pb i 239 pb. n cadrul acestui locus microsatelitic toi indivizii
care au prezentat band au fost identificai ca fiind heterozigoi. i n cadrul acestui locus
microsatelitic toate valorile alelice obinute se ncadreaz n intervalul citat de literatur i anume
226-246.
Pentru locusul microsatelitic VVS 2 au fost detectate un numr de 6 variante alelice.
Dimensiunea acestora a fost cuprins ntre 132-140 pb. Dinte soiurile analizate 80% dintre
acestea au fost homozigote. i n cazul acestui locus dimensiunile alelelor nu detectate depesc
intervalul de mrime citat de literatur i anume 126-151.
n urma analizelor efectuate, s-au obinut un numr total de 122 de alele cu o medie de
15,25 alele/locus.
Tabel 10
Parametrii genetici obinui cu amorsele SSR la cele 10 soiuri de vi de vie studiate

Locus
Locus
Nr. de
soiuri
No. of
varieties
Nr. de
alele
detectate
No. of
alleles
detected
Heterozigoia
ateptat
Expected
heterozygosity
Heterozigoia
observat
Observed
heterozygosity
Homozigoia
ateptat
Expected
homozigosity
Homozigoia
observat
Observed
homozigosity
VVMD7 10 16 0,973 0,700 0,026 0,300
VVS 29 10 16 0,926 0,700 0,073 0,300
ZAG 47 10 16 0,931 0,600 0,068 0,400
ZAG 79 10 17 0,921 0,700 0,078 0,300
ZAG 62 10 17 0,852 0,700 0,147 0,300
VVS 5 10 16 0,842 0,600 0,157 0,400
VVMD5 10 12 0,509 0,600 0,090 0
VVS2 10 12 0,847 0,200 0,152 0,800
Valoarea
medie
15,25 0,850 0,600 0,098 0,35

29
Heterozigoia ateptat (HetExp) i observat (HetObs) i, respectiv, homozigoia
ateptat (HomExp) i observat (HomObs) au fost calculate cu coeficientul de corecie al lui
Levene, cu ajutorul programului Genepop (Raymond i Rousset, 1995).
Valorile heterozigoiei ateptate au variat ntre 0,509 (VVMD 5) i 0,973 (VVMD 7), cu
o medie de 0,850, dup cum reiese din tabelul nr. 40. Valorile heterozigoiei observate au
prezentat o valoare minim de 0,200 (VVS 2) i maxim de 0,700 (ZAG 62, VVMD 7, VVS 29,
ZAG 79), cu o medie de 0,6. Cea mai mare diferen ntre valoarea heterozigoiei ateptate i cea
observat (0,273) s-a nregistrat n cazul locusului VVMD 7.
n cazul a apte loci heterozigoia ateptat a dat valori mai mari dect heterozigoia
observat, iar n cazul locusului VVMD 5 heterozigoia ateptat a dat valori mai mici dect cea
observat.

CONCLUZII

Metoda utilizat n acest studiu, i anume cea descris de Lodhi i colab. 1994,
modificat de Pop i colab 2003b, a permis obinerea unui ADN de nalt calitate.
n urma aprecierii cantitii i calitii ADN-ului la cele 10 soiuri de vi de vie de mas,
s-a observat faptul c aceti doi parametri sunt influenai de genotip.
Din totalul celor 30 de amorse RAPD testate, doar 12 au generat polimorfisme cu
fragmente ce au variat ntre 150 i 2000 pb.
Faptul c nu s-au observat diferene ntre staiunile didactice de unde s-au recoltat probele
se datoreaz nmulirii vegetative ce a fost i este riguros controlat att de centre de
cercetare ct i de staiuni.
n urma analizrii probelor cu cele 12 amorse polimorfice s-a obinut o medie a
procentului de polimorfism de 80%. n urma calculrii distanelor genetice s-a obinut cea
mai mic valoare (0,4421) ntre soiurile Victoria i Cetuia, iar cea mai mare valoare
(0,500) s-a obinut ntre soiurile Cetia i Muscat de Hamburg.
n urma analizelor SSR, dimensiunile alelelor la soiurile analizate s-au ncadrat n
intervalul citat de literatura de specialitate, excepie fcnd markeii VVS 2 i ZAG 79.
n cadrul cercetrilor aferente tezei de doctorat, markerii SSR au fost utilizai cu succes n
studierea polimorfismului genetic la via de vie, profilele genetice ale soiurilor sugernd
o diversitate genetic la nivel molecular.
Utiliznd amorsele SSR am obinut un numr total de 60 de alele, ntre 9 i 12
alele/locus, numrul mediu de alele obinute/locus fiind de 10.
Valorile heterozigoiei ateptate au variat ntre 0,884 (ZAG 62) i 0,947 (ZAG 79), cu o
medie de 0,912. Valorile heterozigoiei observate au prezentat o valoare minim de
0,400 (VVS 2, ZAG 79, VVS 29) i maxim de 0,800 (ZAG 62, VVMD 7), cu o medie
de 0,566.
n urma prelucrrii datelor obinute cu amorsele SSR, cea mai mic valoare a distanei
genetice de 0,416 s-a observat ntre soiurile Chaseelas dore i Cetuia, fapt confirmat i
prin dendogram, iar cea mai mare distan se afl ntre soiurile Muscat Perla de Csaba i
Victoria (0,875).
n urma testrii celor trei metode, metoda descris de Faria i colab (2000) a dat cele mai
bune rezultate, prin aceast metod obinndu-se cele mai mari cantiti de ADN.
Din analiza varianei, aplicat rezultatelor de extracie a ADN, a reieit c cei doi factori
experimentali (soiul i metoda de extracie), au influenat distinct semnificativ cantitatea
i puritatea de ADN obinute.
ntre soiuri exist diferene asigurate statistic n ceea ce privete cantitatea de ADN
obinut, indiferent de metoda de extracie aplicat, ceea ce sugereaz c genotipul, la

30
via de vie, influeneaz n mod hotrtor cantitatea de ADN ce poate fi extras prin
metode curent folosite n acest scop.
Metoda de extracie a avut, de asemenea, o influen semnificativ asupra cantitii i
puritii ADN-ului ce se poate obine, indiferent de localitatea de experimentare.
Procesul de fermentaie a influenat n mod negativ cantitatea i puritatea ADN-ului;
ADN-ul extras din vinul obinut prin microvinificaie nu a putut fi utilizat n analizele
moleculare.
n urma comparrii profilelor genetice obinute din must, s-a constatat c acestea au fost
identice cu cele obinute din frunze.
Cei 8 markeri microsatelitici alei pentru acest studiu s-au dovedit a fi informativi i
eficieni n identificarea corect i analizarea structurii genetice.
n urma prelucrrii datelor, s-au obinut un numr total de 122 de alele cu o medie de
15,25 alele/locus, alele care s-au ncadrat n intervalul citat de literatur.

RECOMANDRI

Datele obinute n studiul de fa se recomand a fi integrate cu datele morfologice,
fenologice i biometrice pentru a identifica cu acuratee cultivarele existente n plantaiile
viticole. De asemenea se recomand utilizarea lor pentru protecia legal a cultivarelor.
Se recomand continuarea cercetrilor n ceea ce privete studierea polimorfismului la
soiurilor de mas, pentru a crete valoarea informaiilor.
Se recomand perfecionarea metodelor de extracie din vin pentru ca ADN-ul extras din
acesta s poat fi utilizat n tehnicile moleculare ce urmresc genotipizarea vinurilor
comerciale.
Metoda SSR poate fi folosit cu succes n laboratoarele acreditate ce urmresc
amprentarea vinurilor comerciale. Acest lucru fiind foarte important pentru productorii
de vin, ageniile de control guvernamental sau ale proteciei consumatorului.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. ANTOCE A.O, 2005, Condiionarea, ambalarea i etichetarea vinurilor. Editura Ceres,
Bucureti
2. BALEIRAS-COUTO M.M., J.E. EIRAS-DIAS, 2006, Detection and identification of
grape varieties in must and wine using nuclear and chloroplast microsatellite markers.
Analytica Chimica Acta 563, pag. 283-291
3. BOWERS J.E, G.E. DANGL, R. VIGNANI, C.P. MEREDITH, 1996, Isolation and
characterization of new polimorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera
L.) Genome 39, 628-633.
4. CONSTANTINESCU, G., 1971, Viticultur general, EDP, Bucureti.
5. COTEA V., 1995, Vinul n existena uman- discurs de recepie. Editura Academiei
Romne.
6. DI GASPERO G., E. PETERLUNGER, R. TESTOLIN, K.J. EDWARDS, G.
CIPRIANI 2000, Conservation of microsatellite loci within the genus vitis.
theoretical& applied genetics 101, pag. 301-308
7. FARIA M. A, R. MAGALHAES, M.A. FERREIRA, C.P. MEREDITH, F. FERRIRA
MONTEIRO, 2000, Vitis vinifera must varietal authentification using microsatellite DNA
Analysis (SSR), Journal of Agriculture Food Chem, 48 (4), 1096-1100

31
8. GUPTA M., Y.S. CHYI, J. ROMERO-SEVERSON, J.L. OWEN, 1996, Amplification of
DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-
sequence repeats. Theor.Appl.Genet.89,998-1006
9. HAMADA H., H. LEIDMAN, B.H. HOWARD, C.M. GORMAN, 1984, Enhanced gene
expression by the poly (dT-dG)-poly(dC-dA) sequence. Mol. Cell. Biol., 4: 2622-2630
10. HAMPL

V., A. PAVLCEK, J. FLEGR, 2001, Construction and bootstrap analysis of
DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree:
Application to trichomonad parasites, International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 51: 731-735.
11. JEFFERS A.J., V. WILSON, S.L. THEIN, 1985, Hypervariable minisatellite regions in
human DNA. Nature 314: 67-73
12. KARP A., S. KRESOVICH, K.V. BHAT, W.G. AYAD, T. HODGKIN, 1997, Molecular
tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI
Technical Bulletin No. 2. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy
13. LODHI M.A., Z.GUANG-NING, F.N.F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1994, A simple and
efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and
Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter 12(1), pag. 6-13.
14. MULLINS M.G., A. BOUQUET, L.E. WILLIAMS, 1992, Biology of the grapevine.
Cambridge University Press, Cambridge
15. NMLOANU I., ARIANA OANA ANTOCE, 2005, Oenologie-controlul i prevenirea
fraudelor, Editura Ceres, Bucureti
16. POP NASTASIA, 2003a, Viticultur general, Editura Academic Press
17. POP RODICA, M., ARDELEAN, D. PAMFIL, IOANA GABOREANU, 2003b, The
efficiency of different DNA isolation and purification protocols in ten cultivars of Vitis
vinifera. Bul. USAMV Cluj, 59, 259-261
18. RAYMOND M., F. ROUSSET, 1995, GENEPOP (version 1.2): A population genetics
software for exact tests and ecumenicism, J. Heredity, 86:248-249.
19. SAMBROOK J., E.F. FRITISH, T. MANIATIS, 1989, Molecular cloning: A Laboratory
manual, 2
nd
ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York USA
20. SAVAZZINI F., L. MARTINELLI, 2006, DNA Analysis in Wines: Development of
Methods for Enhanced Extraction and Real-time Polymerase Chain Reaction
Quantification, Analytica Chimica Acta
21. SEFC K.M, F. REGNER, E. TURETSCHEK, J. GLOSSL, H. STEINKELLNER, 1999,
Identification of microsatellite sequence in Vitis riparia and their applicability for
genotyping of different Vitis species. Genome 42, 367-373.
22. STOIAN V., 2001, Marea carte a degustrii vinurilor: degustarea pe nelesul tuturor. Ed.
Artprint, Bucureti
23. THOMAS M.R., N.S. SCOTT, 1993, Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA
polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (sts). Theor. Appl. genet. 86,
pag. 985-990
24. RDEA C., LILIANA ROTARU, 2003, Ampelografie, vol I i II, Editura Ion Ionescu
De la Brad, Iai
25. VICENTE M.C., C. LPEZ, T. FULTON, 2004, Genetic Diversity Analysis with
Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources
Institute (IPGRI), Rome, Italy.
26. WEBER J.L., 1990, Informativeness of human (dC-dA)n-(dG-dT)n polymorphisms.
Genomics, 7:524-530
27. WILLIAMS J.G.K., A. R. KUBELIK, K. J. LIVAK, J. A. RAFALSKI, S.V. TINGEY,
1990, DNA polymorphoisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nuc. Acids Res. 18(22):6531-6535.

Trifan

Încărcat de

Informații document

Descriere:

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Descriere:

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Trifan

Încărcat de

Descriere:

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE

S-ar putea să vă placă și