Sunteți pe pagina 1din 5

Spectrofotometria de absorbie n ultraviolet i vizibil

I. Noiuni teoretice
n aceast lucrare ncercm s prezentm aplicaiile spectro-fotometriei n ultraviolet i vizibil
pentru substane n stare lichid, lichide pure, amestecuri i n special soluii. Spectrele urmrite sunt
spectre moleculere electronice la care structura de rotaie nu mai apare iar cea de vibraie se manifest
numai n anumite cazuri printr-o structurare a benzilor de absorbie care, n general, sunt largi i
nerezolvate n linii.
Benzile de absorbie din aceste domenii spectrale corespund tranziiilor de pe nivelul electronic
fndamental pe cele mai joase nivele electronice excitate, pentru care tranziiile sunt permise conform
legilor de selecie. n aceste condiii tranziiile electronice implic cele mai mari variaii de energie, iar
frecvenele cuantelor absorbite se situeaz att n domeniul vizibil ct i de ultraviolet al spectrului.
La aceste tranziii electronice particip electronii unor anumite grupri structurale ale moleculelor
numite cromofori. n cazul substan-elor organice asemenea grupri structurale sunt reprezentate de
legtura simpl, dubl i tripl, gruparea bazic, etc.
Interacia cromoforilor ntre ei sau cu alte grupri atomice provoac importante modificari ale
spectru1ui de absorbie atribuit cromoforului singur. n aceste condiii pot apare urmtoarele efecte:
- efectul batocromic - de deplasare a maximului de absorbie spre lungimi de und mai mari
(deplasarea spre rosu),
- efectul hipsocromic - de deplasare a maximului de absorbie spre lungimi de und mai mici
(deplasarea spre albastru),
- efectul hipercromic - de cretere a intensitii de absorbie,
- efectul hipocromic - de descretere a intensitii de absorbie.
Proprietile de absorbie ale mediului pot fi caracterizate prin mrimile: absorban, trasmitan,
extincie, coeficient de extincie.
Legea Bouguer-Lambert exprim relaia cantitativ dintre inten-sitatea I, a luminii emergente,
intensitatea I
0
, a luminii incidente, grosimea x a substanei absorbante i natura substanei.

Figura 6.1. Reprezentarea grafic a legii Bouguer-Lambert
(X
1/2
grosimea de njumtire).

Expresia legii Bouguer-Lambert se poate scrie:
kx
0
e I ) x ( I

=
Prin definiie transmitana (T), sau coeficientul de transmisie al unei substane este dat de
formula:
100
I
I
(%) T
0
=
iar extincia natural E
n
, este dat de relaia:
x k
I
I
ln
T
1
ln E
n
0
n
= = =
unde k
n
reprezint coeficientul natural de extincie. Se poate arta uor c 0sE
n
s.
Avantajul folosirii extinciei este acela al proprietii de aditivitate pe care o are aceast mrime:
un amestec de mai multe soluii diluate avnd extinciile E
1
,...,E
n
se comport ca o singur soluie cu
extincia global E, dat de relaia:
n 1
E ... E E + + =
Prin absorban (A), sau coeficient de absorbie se nelege:
100
I
I I
(%) A
0
0

=
n practic, deoarece logaritmii naturali sunt mai puin comozi se folosete o relaie asemntoare
n care intervin, ns logaritmii zecimali:
E
0
kx
0
e I 10 I I

= =
unde k reprezint coeficientul zecimal de extincie iar E extincia zecimal sau densitatea optic.
Lege Beer este valabil numai pentru soluii diluate i stabilete o legtur matematic ntre
extincia E, concentraia C a substanei i coeficientul molar de extincie care depinde de natura substanei
i de lungimea de und.
x C ) ( ) x , ( E c =
unde C se msoar n mol/dm
3
.
n aceste condiii legea Bouguer-Lambert-Beer se poate scrie:
x C ) (
0
10 I ) x , ( I
c
=
Curbele care dau dependen E=f(), T=f(), A=f(), c=f() sau f(v), sunt cunoscute sub numele
de spectre de absorbie.Un exemplu de astfel de spectru este reprezentat n figura 6.2.

Figura 6.2. Spectrul de absorbie de tipul A=f().

Factorii care pot influena spectrul de absorbie al unei substane:
a) natura solventului nivelele energetice electronice ale molecu-lelor n stare condensat pot fi
modificate prin prezena moleculelor solventului datorit interaciilor ce apar.
b) concentraia soluiei i temperatura cu creterea concentraiei apar asocieri moleculare care dau
un spectru distinct de cel al monomerului substanei de studiat, temperatura favorizeaz
deplasarea echilibrului dintre concentraiile de monomer i dimer iar temperaturile ridicate pot
produce chiar transformri ireversibile ale spectrelor de absorbie.
c) valoarea pH-ului soluiei la valori diferite de pH, punctul izosbestic aprut n spectru indic
prezena n amestec a unor specii moleculaare ce se transform una ntr-alta ntr-o proporie
depinznd de pH.
d) iradierea substanelor iradierea optic a probei poate conduce la polimerizarea unei specii
moleculare i de aici modificri n spectrul de absorbie.
e) formarea de compleci cationii prezeni n solvent pot duce la formarea complecilor i deci
influenarea spectrului probei.
f) fluorescena datorit fenomenului de fluorescen, intensitatea radiaiei reemise va duce la o
valoare aparent mai mic a absorbiei probei dect cea real.
g) fenomene de oxidare
h) probele nu sunt dizolvate total sau precipit ulterior
i) fenomene de hidroliz

Descrierea instalaiei spectrofotometrice
Un spectrofotometru conine o parte optic i una electric. Componentele de baz ale prii
optice sunt: sursa, monocromatorul, compartimentul probelor i detectorul mpreun cu sistemul de
nregistrare (figura 6.3).

Figura 6.3. Principalele componente ale unui spectrofotometru.

Spectrofotometrele se pot clasifica att dup sistemul dispersiv ct i dup sistemul constructiv.
Astfel, n funcie de primul criteriu exist spectrofotometre cu prism, spectrofotometre cu reea, spectro-
fotometre mixte, iar n funcie de al doilea criteriu spectrofotometre cu monofascicul i cu dublu fascicul.
Spectrofotometrul Camspec M330 are ca element dispersiv o reea de difracie cu 1200 linii/mm
i este de tipul monofascicul. M330 poate trasa spectre UV-VIS n intervalul de lungimi de und cuprins
ntre 190-900nm, cu o acuratee de 1nm. n absorbie poate balea pe intervalul -0.3 la 2.5Abs, iar n
transmisie de la 0 la 200%. M330 poate fi accesat fie direct utiliznd tastatura acestuia, fie prin
intermediul unui calculator.

II. Parte experimental
Trasarea spectrelor de absorbie ale diferitelor tipuri de Hb
(A) Pentru obinerea hemoglobinei:
- se centrifugheaz sngele uman la 5000 rot/min
- se ndeprteaz supernatantul
- se suspend celulele roii n tampon izoton 0.9% NaCl.
- se centrifugheaz 10 min la 5000 rot/min (supernatantul trebuie s fie ct mai limpede)
- se lizeaz globulele roii astfel: se adaug la un volum de eritrocite 1.5 volume de ap i 0.5
volume cloroform
- se ndeprteaz cloroformul
- se folosete soluia de hemoglobin pentru citire la spectro-fotometru.
(B) Pentru obinerea methemoglobinei (de culoare brun):
- se trateaz o parte din soluia de hemoglobin cu soluie de fericianur de potasiu 3%
(C) Pentru obinerea hemoglobinei reduse:
- se adaug la soluia iniial de hemoglobin ditionit de sodiu n exces pn la observarea culorii
violete.

Mod de lucru: O posibilitate simpl i rapid de trasare a unui spectru este utilizarea programului
n varianta de lucru Immediate mod. Acest mod permite scanarea probei ntre dou lungimi de und,
mrirea i micorarea unor zone prestabilite, deplasare cursorului n zonele dorite obinndu-se valorile
de absorbie i de lungime de und, afiarea datelor sub form de tabel, derivatele 1-4 ale spectrului,
salvare i printare a graficului.
Primul pas l constituie selectarea tipului de grafic dorit absorbie sau transmisie; acest lucru
fcndu-se foarte uor prin selectarea cu ajutorul mouse-lui a butoanelor Abs sau %T.
Se selecteaz apoi Scan , pe ecran aprnd o fereastr Enter scan wavelengths pentru
selectarea intervalului de lungimi de und. Dup introducerea datelor se apas OK. Se ateapt cteva
secunde pn spectofotometrul i atinge lungimea de und de start. Fr prob n compartimentul cuvelor
sau de preferat cu o cuv coninnd numai solventul n care a fost preparat soluia, se traseaz zeroul prin
apsarea butonului Set Zero.
Dup obinerea zeroului i primirea mesajului de confirmare se trece la trasarea spectrului
propriu-zis prin apsarea butonului Start. Folosind butonul ID se poate face o fi de identitate a probei
iar apsnd butonul Disk graficul poate fi salvat pe disk n zona dorit. Butonul Data permite listarea
valorilor obinute, Zoom(+-) mrire i micorare a unor zone prestabilite iar Deriv trasarea derivatelor
spectrului.
Se traseaz spectrele de absorbie ale diferitelor tipuri de hemo-globin (A), (B), (C) preparate i
se compar cu datele din literatur.

Figura 6.4. Spectrele de absorbie ale diferitelor tipuri de hemoglobin.

S-ar putea să vă placă și