Sunteți pe pagina 1din 4

Westernblotting

Southernblotting
Teste de functionalitate celulara (citotoxicitate, proliferare)
Southern Blot
Metoda utilizata in biologia moleculara pentru detectia unor secvente ADN specifice.
Principiu: fragmentele de ADN dintr-un amestec sunt separate prin electroforeza intr-un gel,
unde se dispun in functie de greutatea moleculara. Aceste fragmente sunt apoi transferate pe o
membrana care, incubata ulterior cu o solutie continand secvente de ADN.
Metoda este denumita astfel dupa inventatorul ei, biologul Edwin Soutern !"#$%&
'rin e(tensie, tenici care se bazeaza pe acelasi principiu au fost denumite similar:
-)estern blot !detectie de proteine&
-Nortern blot !detectie de ARN&
-Eastern blot !detectia modificarilor posttranslationale la nivelul proteinelor&
"
Western Blot
Metoda utilizata in biologia moleculara pentru detectia unor secvente proteine specifice.
Principiu: proteinele dintr-un amestec sunt separate prin electroforeza intr-un gel, unde se dispun in
functie de greutatea moleculara. Aceste fragmente sunt apoi transferate pe o membrana care este
ulterior *developata+ prin intermediul anticorpilor monoclonali con,ugati cu enzime.
Western Blot aplicatie practica
Testul HIV
". test E-.SA din ser !detectie anticorpi anti-/.0&
1. daca rezultatul este negativ, testul trebuie repetat peste 2 luni
2. daca rezultatul este pozitiv, aceasta nu inseamna neaparat ca persoana testata este infectata cu /.0
!pot aparea rezultate fals pozitive in lupus, sifilis, infectie cu 3orrelia&
4. din acest motiv este necesar un test )estern blot
%. daca rezultatul )3 este pozitiv, infectia se considera confirmata
5. daca rezultatul )3 este negativ, se considera ca rezultatul E-.SA a fost fals pozitiv
Teste de proliferare celulara
6estele de evaluare a proliferarii limfocitelor sunt teste functionale.
1
Masoara capacitatea acestor celule de a se activa si a prolifera in urma unei culturi de scurta
durata cu
-o molecula straina7 un antigen
-un activator policlonal !mitogen&
8aspunsul proliferativ specific pentru un antigen !e(: un antigen microbian& are loc doar daca
pacientul a fost imunizat in prealabil !!accin& sau daca tocmai se reface dupa o infectie cu un
microorganism care contine antigenul testat.
8aspunsul proliferativ nespecific, declansat de mitogeni !fitoemaglutinina 9 '/A ,
concanavalina A 9 :onA sau anticorpi monoclonali anti-:D2, :D1;& nu depinde de o stimulare
prealabila si are loc in cazul tututror limfocitelor.
6estele de evaluare a proliferarii limfocitelor sunt teste functionale.
"etode
#$ .dentificarea celulelor proliferante pe baza capacitatii lor de sinteza a AND si de incorporare a
nucleotidelor marcate radioactiv (testul de proliferare pe ba%a incorporarii ti&idinei tritiate sau a
bro& deoxi uridinei)
'$ .dentificarea celulelor proliferante pe baza capacitatii lor de a distribui in mod egal, la celulele fiice,
continutul citoplasmatic (testul de proliferare pe ba%a detectiei distributiei proteinei fluorescente
()S* + carboxi fluorescein succini&idil diacetat ester)

Testul de proliferare pe baza detectiei proteinei fluorescente CFSE
Principiu$ Determinarea prolifer<rii celulare ca m<sur< a activ<rii celulelor la diver=i stimuli bazata
pe cito&etrie ,n flux$
2
:>SE permite identificarea a ; p?n< la "@ generaAii celulare discrete, ca urmare a faptului c<
este reparti%at ,n &od egal -i extre& de precis celulelor fiice$
:>SE are capacitatea de a traversa membrana plasmatic<. Dup< ce difuzeaz< Bn mediul intra-
celular, esterazele endogene Bl transforma Bntr-o molecul< puternic fluorescent. =i lipsit< de capacitatea
de a traversa membrana celular< =i de a se Bntoarce Bn mediul e(tra-celular.
6estul de proliferare limfocitar< reprezint< una dintre cele mai uzuale metode pentru evaluarea
reactivit<Aii imune la variaAi stimuli infectio=i.
Aceast< tenic<, spre deosebire de metodele ce utilizeaz<, ca masur< a prolifer<rii, incorporarea
de baze azotate marcate cu izotopi radioactivi, ofer< avata,ul de a fi nefocalizare a analizei la nivelul
anumitor subseturi celulare, Bn cazul de faA<, limfocite 6 !:D2 pozitive&.
.n acest scop, celulele mononucleate sanguine !'3M: 9 peripheral blood mononuclear cells&
sunt marcate cu :>SE =i cultivate timp de p?n< la "" zile Bn prezenAa sau absenAa antigenelor de interes.
'e masur< ce limfocitele se transform< blastic, ca urmare a stimularii lor specifice, intensitatea
fluorescenAei emise de :>SE diminueaz< treptat.
Testul de citotoxicitate metoda masurarii emisiei de crom radioacti
4