Sunteți pe pagina 1din 67

Metode

Metode
Spectrometrice
Spectrometrice
Moderne
Moderne
Analiza Probelor Biologice-Curs 4
Spectrometria
Spectrometria
Studiaza Studiaza interactiile interactiile dintre dintre radiatia radiatia
electromagmetica electromagmetica cu cu materia materia
Pentru Pentru aplicatii aplicatii curente curente in in laboratoare laboratoare, se face , se face
apel apel la la radiatia radiatia din din regiunea regiunea spectrala spectrala din din
ultraviolet ultraviolet si/sau si/sau vizibil vizibil, IR, , IR, masa masa, raze X, , raze X,
fluorescenta fluorescenta, RMN , RMN
Absorbanta Absorbanta radiatiei radiatiei electromagnetice electromagnetice poate poate fi fi
calitativa calitativa si si cantitativa cantitativa. .
Aplica
Aplica

ii ale
ii ale
spectrelor
spectrelor
Spectrul
Spectrul
Electromagnetic
Electromagnetic
x-ray
UVVizibil IR Rf
10
-11
10
-9
10
-6
10
-5
10
-4
10
-2
10
2
Lungimea de unda ( i, cm)
Frecventa (v, Hz)
10
8
10
12
10
14
10
15
10
16
10
19
10
21
Nuclear
Electroni
interiori
Electroni
exteriori
Molecular
vibratie
Molecular
rotatie
Nuclear
Spin
Spectrul
Spectrul
vizibil
vizibil
390 780 450 520 590 620
Lungimea de unda (nm)
IR UV
Cresterea Energiei
Cresterea lungimii de unda
Rosu-Portocaliu-Galben-Verde-Albastru-Violet
Energia
Energia
Orbitalilor
Orbitalilor
Moleculari
Moleculari
sau t
orbital molecular
s sau p
orbital
atomic
o
*
sau t
*
orbital
molecular
orbital ne-legatura
on
tn
no
*
n t
*
oo
*
tt
*
E
n
e
r
g
i
a
Tranzitiile
Tranzitiile
electronilor
electronilor
pe
pe
nivele
nivele
moleculare
moleculare
de
de
energie
energie
E
0
E
4
E
3
E
2
E
1
Singlet
Triplet
A
VR
F
IC
P
10
-6
-10
-9
sec
10
-4
-10 sec
Absorb
Absorb

ia
ia

i
i
emisia
emisia
luminii
luminii
A Atomii tomii care nu au nici un electron care nu au nici un electron n niveluri mai mari n niveluri mai mari
de energie de energie - - sunt sunt n stare n stare fundamental fundamental
Atomii care au un electron pe un nivel mai mare Atomii care au un electron pe un nivel mai mare
energetic energetic - - sunt sunt n stare excitat n stare excitat
Cnd Cnd radiatia radiatia electromagnetica electromagnetica interactioneaza interactioneaza cu cu un un
atom atom i provoac un electron s ajung pe un nivel cu i provoac un electron s ajung pe un nivel cu
energie energie superioara superioara, , energia energia radiatiei radiatiei devine devine parte a parte a
energiei electronului energiei electronului i mai departe i mai departe dispare dispare . Este . Este
absorbi absorbi ia ia. .
Atomi
Atomi
, molecule,
, molecule,
ioni
ioni
complecsi
complecsi

Energi
Energi
e
e
orbital
orbital

mar
mar
e
e

energi
energi
e
e
orbital
orbital

mic
mic

EMISIE
EMISIE

Energie
Energie
orbital
orbital

mic
mic

energie
energie
orbital
orbital

mare
mare

ABSORB
ABSORB

IE
IE

E
E
atom atom
=
=
E
E
electronica electronica

E
E
molecule molecule
=
=
E
E
electronica electronica
+
+
E
E
vibratie vibratie
+
+
E
E
rotatie rotatie

E
E
ion ion complex complex
=
=
E
E
electronica electronica
+
+
E
E
vibratie vibratie
+
+
E
E
rotatie rotatie
Clasificarea spectrelor
Clasificarea spectrelor
Spectrul
Spectrul
de absorb
de absorb

ie/emisie
ie/emisie
Absorb Absorb ia ia = msoar
mrimea energiei radiate
de o surs extern care
este absorbit de analit
(spectru continuu)
E Emisie/ luminescen misie/ luminescen - -
msoar caracteristicile
energiei radiate de o
surs extern care este
mpratiat, difuzat de
analit
Radiatia
Radiatia
electromagnetica
electromagnetica
E
H
A
Lungimea de unda (i)
Viteza luminii = c

hc
h E = =
E = energia
h = constanta lui Plank
v = frecventa
c = viteza luminii
i = lungimea de unda
Absorptia
Absorptia
radiatiatiei
radiatiatiei
electromagnetice
electromagnetice
I
0
(intensitatea radianta) I (intensitatea transmisa)
abc A bc k T kN
I
I
dn k
I
dI
kI
dn
dI
I
I
N
= ' = = = =
} }
; log ; ln ; ;
0 0
0
0
Absorban
Absorban

a,
a,
transmitan
transmitan

a
a
Absorban Absorban a a este este important important pentru pentru analiz analize e
cantitative cantitative ( ( n n spectrometrie spectrometrie se se mai mai nume nume te te i i
densitatea densitatea luminii luminii) )
Absorban Absorban a a este des utilizat este des utilizat; este direct ; este direct
propor propor ional cu grosimea probei ional cu grosimea probei i concentra i concentra ia ia
speciilor absorbite speciilor absorbite n prob n prob. .
Transmitan Transmitan a a variaz logaritmic cu grosimea variaz logaritmic cu grosimea i i
concentra concentra ia probei. ia probei.
Transmitan Transmitan a a unui fascicul de lumin ce unui fascicul de lumin ce
trece printr trece printr- -o cuv cu lungimea l o cuv cu lungimea l. .
Legea
Legea
lui
lui
Lambert
Lambert
-
-
Beer
Beer
Aceast lege reprezint legea de baz folosit n
analizele i determinrile spectrofotometrice.
Radiaia incident monocromatic, I
o
cade pe o celula
ce conine proba, celula are lungimea l , concentraia
substanei ce absoarbe lumina, C.
A = -log T
T = I/I
0
A= abc
Relatia
Relatia
dintre
dintre
%T
%T
si
si
A
A
%T A
1 2
50 0.301
90 0.046
100 0
%T mica = A mare
%T mica = A mare
Absorbanta Absorbanta
E
r
o
a
r
e
E
r
o
a
r
e
( (
d
A
d
A
/
A
)
/
A
)

0.0 2.0
eroarea
eroarea
in
in
aplicarea
aplicarea
legii
legii
Lambert
Lambert
-
-
Beer
Beer
0.434
I
0
= 10,000 I = 5,000
5 . 0
10000
5000
0
= = =
I
I
T
-b-
Exemplul
Exemplul
1
1
A = -log T = -log (0.5) = 0.3010
I
0
= 10,000 I = 2,500
25 . 0
10000
2500
0
= = =
I
I
T
--2b--
Exemplul
Exemplul
2
2
A = -log T = -log (0.25) = 0.6021
A = e1bc1 + e2bc2 + e3bc3 + enbcn
Analiza
Analiza
amestecurilor
amestecurilor
Principiul Principiul aditivitatii aditivitatii
A(amestec A(amestec
)
)
i i1 1
= A(1)
= A(1)
i i1 1
+ A(2)
+ A(2)
i i1 1
+
+

..
..
, nm
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

1

2
B B
A A
Dezvoltarea
Dezvoltarea
de
de
metode
metode
spectrometrice
spectrometrice
Analitul Analitul trebuie trebuie sa sa absoarba absoarba la o la o lungime lungime de de
unda unda unica unica ( (rar rar intalnita intalnita) )
Analitul Analitul tebuie tebuie sa sa reactioneze reactioneze cu un cu un reactiv reactiv
producand producand un un aduct aduct care care absoarbe absoarbe la o la o
lungime lungime de de unda unda specifica specifica (un (un cromofor cromofor) )
Analitul Analitul sa sa fie fie implicat implicat intr intr- -o o reactie reactie prin prin care care
rezulta rezulta un un cromofor cromofor
Spectrometria UV-Viz
Spectrometrul cu un singur facicol
Spectrometrul cu doua facicole

Multi
Multi
compusi
compusi
organici
organici
absorb in
absorb in
regiunea
regiunea
UV
UV
a
a
spectrului
spectrului
Multe Multe metale metale libere libere si si
complexi complexi anorganici anorganici ai ai
acestora acestora absorb in absorb in
regiunea regiunea Viz Viz din din spectru spectru
Multi Multi complexi complexi anorganici anorganici
si si organici organici formeaza formeaza
complexi complexi cu transfer de cu transfer de
sarcina sarcina
Exista Exista in complex o in complex o
grupare grupare donoare donoare si si o o
grupare grupare acceptoare acceptoare de de
electroni electroni
Complexul Complexul cu transfer de cu transfer de
sarcina sarcina are o are o banda banda de de
absorptie absorptie specifica specifica in in
regiunea regiunea vizibila vizibila a a
spectrului spectrului utilizabila utilizabila
analitic analitic
Exemplu
Exemplu
de complex cu
de complex cu
tansfer
tansfer
de
de
sarcina
sarcina
Nitritul Nitritul poate poate fi fi
determinat determinat analitic analitic cu cu
ajutorul ajutorul unui unui reactiv reactiv cu cu
care care formeaza formeaza un un compex compex
cu transfer de cu transfer de sarcina sarcina. .
Complexul Complexul arata arata o o
absorbtie absorbtie de de banda banda in in Viz Viz
cu o cu o lungime lungime de de unda unda
( ( max max) care ) care poate poate fi fi
determinata determinata
Determinarile Determinarile vor vor fi fi
facute facute la la aceasta aceasta max max

max max
Determinarea
Determinarea
proteinei
proteinei
totale
totale
Toate Toate proteinele proteinele sunt sunt compuse compuse din 20 din 20 resturi resturi
de amino de amino acidzi acidzi
Exista Exista mai mai multe multe metode metode analitice analitice de de
determinare determinare a a proteinelor proteinelor: :
Kjeldahl Kjeldahl metoda metoda de de referinta referinta
Spectrometrie Spectrometrie directa directa
Metoda Metoda cu cu reactivul reactivul Folin Folin- -Ciocalteu Ciocalteu (Lowery) (Lowery)
Metode Metode de de legare legare cu cu coloranti coloranti specifici specifici ( (Amido Amido
black; black; Coomassie Coomassie Brilliant Blue; Silver) Brilliant Blue; Silver)
Precipitarea Precipitarea cu acid cu acid sulfosalicilic sulfosalicilic sau sau acid acid
tricloracetic tricloracetic (TCA) (TCA)
Metoda Metoda Biuret Biuret
Spectrometrie
Spectrometrie
Directa
Directa
Absorptia Absorptia la 200 la 200 225 nm 225 nmpoate poate fi fi utilizata utilizata
( (i i
max max
pentru pentru legaturile legaturile peptidice peptidice) )
Tyr , Tyr , Trp Trp, uric acid , uric acid si si bilirubina bilirubina interfera interfera la la
280 nm 280 nm
C
NH
2
H
2
C COOH
H
OH
C
NH
2
H
2
C COOH
H
HN
CH
Tyrosine Tryptophan

max
= 280 nm
Metoda
Metoda
Biuret
Biuret

Tartrat
Tartrat
de Na, K
de Na, K
adaugat
adaugat
la complex
la complex
pentru
pentru
a
a
stabiliza
stabiliza
ionii
ionii
de Cu
de Cu
++ ++
(cupric)
(cupric)

Iodul
Iodul
adugat
adugat
ca antioxidant
ca antioxidant
H
2
N
H
N NH
2
O O
H
C
C N
H
C
O
H
N
O
or . . .
Cu
++
OH
-
Blue adduct ( = 540 nm)
Metoda
Metoda
Folin
Folin
-
-
Ciocalteu
Ciocalteu
(Lowry)
(Lowry)
De 100 De 100 ori ori mai mai sensibila sensibila decat decat metoda metoda Biuret Biuret
Necesita Necesita purificari purificari datorita datorita interferentelor interferentelor mari mari
forma redusa (bleu)
Acid fosfotungstic/
Acid fosfomolibdenic
Proteina Proteina
(Tyr, (Tyr, Trp Trp) )
Detrminarea
Detrminarea
Proteinelor
Proteinelor
Metoda
Domeniul, g
Proteina Totala
Biuret 1000 - 5000
UV Absorption @ 280 nm 200 - 2000
Lowry 5 - 40
Bradford (Coomassie
Brilliant Blue)
0.1 - 10
Determinarea
Determinarea
creatininei
creatininei

Reactia
Reactia
creatininei
creatininei
cu
cu
picratul
picratul
alcalin
alcalin
rezulta
rezulta
un complex
un complex
ce
ce
absoarbe
absoarbe
in
in
vizibil
vizibil

Multi
Multi
compusi
compusi
reactioneaza
reactioneaza
de
de
asemenea
asemenea
cu
cu
picratul
picratul
NH
NH
H
3
C
O
O
-
NO
2
O
2
N
NO
2
OH
-
-
O
O
2
N
O
2
N
NO
2
H
N
NH
CH
3
-
O
+
Creatinine Picric acid
Janovski complex

max
= 485 nm
N
H
N
O
CH
3
NH
N
CH
3
NH
NH
2
COOH
H
3
C
H
N COOH
O
2
H
2
O
2
H
2
N
C
H
2
COOH
+ CH
2
O
H
3
C
H
N COOH
Creatinine
Creatinine
amidohydrolase
Creatine
Urea
Sarcosine
Sarcosine
Sarcosine
oxidase
Glycine
Creatine
amidohydrolase
Determinarea
Determinarea
enzimatica
enzimatica
a
a
creatininei
creatininei
H
2
O
2
este determinata prin metode
conventionale peroxidare/colorant

H
H
2 2
O
O
2 2
este
este
determinata
determinata
prin
prin
metode
metode
conventionale
conventionale
peroxidare
peroxidare
/colorant
/colorant
Determinarea
Determinarea
ureei
ureei
(
(
metoda
metoda
directa
directa
)
)

metoda
metoda
directa
directa
masoara
masoara
absorbanta
absorbanta
cromoganeului
cromoganeului
produs
produs
direct din
direct din
uree
uree

metoda
metoda
indirecta
indirecta
masoara
masoara
amoniacul
amoniacul
produs
produs
din
din
uree
uree
H
3
C
CH
3
O
NOH
H
+
H
3
C
CH
3
O
O
H
2
N NH
2
O
N N
H
3
C CH
3
O
+
H
+
,
Diacetyl monoxime Diacetyl Urea Diazone

max
= 540 nm
Determinarea
Determinarea
ureei
ureei
(
(
metoda
metoda
indirecta
indirecta
)
)
H
2
N NH
2
O
Urease
2 NH
4
+
+
OH
OH
-
N
-
O O
Urea Phenol Indophenol

max
= 560 nm
Determinarea
Determinarea
acidului
acidului
uric
uric
Tungsten blue Tungsten blue absoarbe absoarbe la la i i = 650 = 650- -700 nm 700 nm
enzima enzima Uricase Uricase catalizeaza catalizeaza aceeasi aceeasi reactie reactie mult mult mai mai
specific specific
Absorbanta Absorbanta acidului acidului uric la uric la i i ~ ~ 585 nm 585 nmeste este monitorizata monitorizata
Metoda Metoda se se bazeaza bazeaza pe pe masurarea masurarea H H
2 2
O O
2 2
HN
N
H
N
H
N
O
O
O
-
O
2
H
2
O
2
N
H
H
N
N
H
H
2
N
O
O
O
Phosphotungstic acid Tungsten blue
Uric Acid Allantoin
Determinarea
Determinarea
Ca total
Ca total
Probele Probele sunt sunt acidifiate acidifiate pentru pentru eliberarea eliberarea Ca Ca
++ ++
din din
proteine proteine, , dar dar complexul complexul CPC CPC- -Ca Ca
++ ++
se se formeaza formeaza la la
pH pH alkalin alkalin
N
N N
N
AsO
3
H
2
OH OH
H
2
O
3
As
SO
3
- -
O
3
S
O
CH
3
HO
CH
3
OH
N
O
-
O
N
-
O O O
-
O
O
O
-
O
Arsenazo III

max
= 650 nm
o-Cresolphthalein complexone

max
= 570 - 580 nm
Determinarea
Determinarea
Mg
Mg
complex complex colorat colorat cu Mg cu Mg

27 27
Mg Mg activare activare cu cu neutroni neutroni sau sau AAS AAS metode metode de de
referinta referinta
N
N
H
3
C
OH
HO
SO
3
-
SO
3
-
CH
3
HO
H
3
C CH
3
H
3
C CH
3
O
N
O
O
-
O
-
O
CH
3
N
O
-
O
O O
-
Calmagite

max
= 530 - 550 nm
Methylthymol blue

max
= 600 nm
Determinarea
Determinarea
Fe
Fe

Probele
Probele
sunt
sunt
acidificate
acidificate
pentru
pentru
ca Fe
ca Fe
sa
sa
fie
fie
eliberat
eliberat
de
de
transferina
transferina
si
si
redus
redus
de la Fe
de la Fe
3+ 3+
la Fe
la Fe
2+ 2+
(ion
(ion
feros
feros
)
)
N N N N
SO
3
H
SO
3
Na
Bathophenanthroline Ferrozine
Fe
++

max
= 534nm
Fe
++

max
= 562 nm
Determinarea
Determinarea
bilirubinei
bilirubinei
Colorantii Colorantii diazo diazo reactioneaza reactioneaza cu cu bilirubina bilirubina
Izomerii Izomerii Azobilirubinei Azobilirubinei absorb la 600 nm absorb la 600 nm
N
H
O
N
H
HO
O
N
H
O
OH
N
H
HO
3
S N N
+
Cl
-
N
H
O
OH
N
H
HO
3
S N N
N
H
O
N
H
HO
O
SO
3
H N N
Diazotized sulfanilic acid
Bilirubin (unconjugated)
Azobilirubin (Isomer II)
Azobilirubin (Isomer I)
Determinari
Determinari
cu
cu
enzime
enzime
O O reactie reactie catalizata catalizata de o de o enzima enzima poate poate fi fi
urmarita urmarita prin prin determinarea determinarea urmatoarelor urmatoarelor: :
Dispartitia Dispartitia substratului substratului
Aparitia Aparitia produsului produsului
Conversion Conversion cofactorului cofactorului
Substrate Product
Enzyme
Cofactor Cofactor*
Spectrul
Spectrul
de
de
absorptie
absorptie
in UV al
in UV al
cofactorilor
cofactorilor
NAD
NAD
si
si
NADH
NADH
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

250 300 350 400


(nm)
NAD
+
NADH

max
= 340 nm
Determinarea
Determinarea
fosfatazei
fosfatazei
alkaline
alkaline

substratul
substratul
natural
natural
pentru
pentru
ALKP nu
ALKP nu
este
este
cunoscut
cunoscut
N
+
O O
-
O
P
O
-
O O
H
2
O P
I
N
+
O O
-
O
-
N
+
-
O O
-
O
p-Nitrophenol
phosphate
Alkaline phosphatase
pH 10.3, Mg
++
p-Nitrophenoxide
Benzoid
(colorless)
Quinonoid
(
max
= 404 nm)
SPECTROMETRIA DE
SPECTROMETRIA DE
FLUORESCENTA
FLUORESCENTA
Culoarea corpurilor Culoarea corpurilor s si culoarea absorbit i culoarea absorbit
pentru regiunea vizibil pentru regiunea vizibil
Albastru verde Rosu 650 780
Verde albastru Oranj 595 650
Albastru Galben 575 595
Violet Galben verde 560 575
Purpuriu Verde 500 560
Rosu Albastru verde 490 500
Oranj Verde albastru 480 490
Galben Albastru 435 480
Galben verde Violet 385 435
Culoarea complementar
(culoarea
observat/transmis)
Culoarea luminii
absorbite
Domeniul spectral al
luminii absorbite (nm)
Diagrama energiilor par Diagrama energiilor par iale pentru un sistem iale pentru un sistem
fotoluminiscent fotoluminiscent
E Emisia luminii de la orice stare de excitare a misia luminii de la orice stare de excitare a
moleculei este cunoscut sub denumirea moleculei este cunoscut sub denumirea
general de general de luminiscen luminiscen
Aceasta Aceasta cuprinde fenomenele de cuprinde fenomenele de fluorescen fluorescen i i
fosforescen fosforescen
Nivele energetice Nivele energetice
Emisia fluorescen Emisia fluorescen ei este un ei este un
proces de durat scurt proces de durat scurt, , ntre ntre
10 10
- -9 9
10 10
- -6 6
s, pe cnd, s, pe cnd, n cazul n cazul
fenomenului de fenomenului de
fosforescen fosforescen , d , durata de urata de
emisie a luminii este mai emisie a luminii este mai
lung lung, f , fiind cuprins iind cuprins ntre 10 ntre 10
- -3 3
i cteva secunde. i cteva secunde.
Prin defini Prin defini ie, ie, fluorescen fluorescen a a poate fi enun poate fi enun at at
ca energia emis cnd o substan ca energia emis cnd o substan revine de revine de
la o stare de excitare (sau de la o stare de la o stare de excitare (sau de la o stare de
energie energie nalt nalt), ), la o stare fundamental la o stare fundamental (sau (sau
la o energie mai joas la o energie mai joas). ).
Fosforescen Fosforescen a a reprezint capacitatea unei reprezint capacitatea unei
molecule de a suferi fenomenul de emisie molecule de a suferi fenomenul de emisie
ntrziat de pe un nivel inferior al strii ntrziat de pe un nivel inferior al strii
electronice de excitare, pe un niv electronice de excitare, pe un nivel al strii el al strii
fundamentale, trecnd pri fundamentale, trecnd printr ntr- -o stare o stare
metastabil de triplet metastabil de triplet. .
Excitarea moleculelor nu se face numai prin Excitarea moleculelor nu se face numai prin
absorb absorb ia radia ia radia iei de lumin iei de lumin, ci , ci i prin absorb i prin absorb ia ia
energiei chimice ce rezult energiei chimice ce rezult n urma unei reac n urma unei reac ii ii
chimice. Emisia de fotoni de la produsul reac chimice. Emisia de fotoni de la produsul reac iei iei
chimice poart numele de chimice poart numele de chemiluminiscen chemiluminiscen . .
Acest fenomen are loc pe msur ce speciile aflate Acest fenomen are loc pe msur ce speciile aflate n stare n stare
excitat se relaxeaz la starea fundamental excitat se relaxeaz la starea fundamental. E . Emisia de misia de
lumin lumin n chemiluminiscen n chemiluminiscen respect legea lui Planck respect legea lui Planck. .
A+B C
*
C+hv
Spectrul de emisie ca imagine Spectrul de emisie ca imagine n oglind a n oglind a
spectrului de excitare spectrului de excitare
Spectrul de absorb Spectrul de absorbt tie ie
s si de emisie ideal i de emisie ideal
Varia Variat tia fluorescen ia fluorescent tei ei n func n funct tie ie
de concentra de concentrat tia analitului ia analitului
Curba de calibrare Curba de calibrare
msurat la maximul de fluorescen msurat la maximul de fluorescent t
Randamentul cuantic
Randamentul cuantic
Randamentul cuantic Randamentul cuantic reflect probabilitatea ca reflect probabilitatea ca
varia varia ia proceselor fotochimice sau fotofizice s ia proceselor fotochimice sau fotofizice s
conduc la dezactivarea radiativ sau neradiativ a conduc la dezactivarea radiativ sau neradiativ a
strii excitate strii excitate. .
Randamentul cuantic poate lua valori Randamentul cuantic poate lua valori ntre 0 ntre 0 i i
1. Cnd ia valoarea 1 (maxim), toate moleculele care 1. Cnd ia valoarea 1 (maxim), toate moleculele care
absorb lumin emit total la toate lungimile de und absorb lumin emit total la toate lungimile de und, ,
ele fiind puternic fluorescente. D ele fiind puternic fluorescente. Dac ac, , n caz contrar, n caz contrar,
randamentul cuantic ia randamentul cuantic ia valori mai mici dect 1, p valori mai mici dect 1, pn n
aproape de 0 aproape de 0, atunci , atunci compu compu ii ii vor fi considera vor fi considera i i slab slab
fluorescen fluorescen i (sau chiar nefluorescen i (sau chiar nefluorescen i, i, dac dac = 0). = 0).
Ie / Ia =
Ie / Ia =

M Moleculele cu randament cuantic de fluorescen oleculele cu randament cuantic de fluorescen


intens prezint urmatoarele particularita intens prezint urmatoarele particularita i i n n
structura lor structura lor

un numar mare de duble legturi
un numar mare de duble legturi
conjugate de tipul C = C, C = O, C = N;
conjugate de tipul C = C, C = O, C = N;

un numar mare de grupe de tipul
un numar mare de grupe de tipul

NH
NH
2 2
,
,

OH,
OH,

OCH
OCH
3 3
(donoare de electroni);
(donoare de electroni);

o
o

nalta stabilitate datorat rezonan


nalta stabilitate datorat rezonan

ei;
ei;

o absorbtivitate molar pronun
o absorbtivitate molar pronun

at
at
;
;

o structur rigid
o structur rigid
.
.
Fluoresceina Fluoresceina Fenolftaleina Fenolftaleina
O
HO OH
C = O
O
HO
C
C =O
O
OH
Randamentul cuantic poate fi influen
Randamentul cuantic poate fi influen

at,
at,

n
n
sensul scderii sale
sensul scderii sale
, de mai mul
, de mai mul

i factori
i factori
:
:
de ciocnirile dintre moleculele excitate de ciocnirile dintre moleculele excitate i cele ale i cele ale
solventului, care duc l solventului, care duc la dezactivri a dezactivri; ;
de prezen de prezen a impurit a impurit ilor puternic absorbante din ilor puternic absorbante din
proba de analizat (duc proba de analizat (duc la o scdere a intensit la o scdere a intensit ii ii
de emisie a radia de emisie a radia iei prin fluorescen iei prin fluorescen ); );
de asemenea, prezen de asemenea, prezen a unor grupe de tipul a unor grupe de tipul - - I, I,
- - Br, Br, - - NO NO
2 2
n structura compu n structura compu ilor duce la ilor duce la
inhibarea fluorescen inhibarea fluorescen ei; ei;
energia consumata prin ruperea legaturii energia consumata prin ruperea legaturii. .
Caracteristicile analitice ale
Caracteristicile analitice ale
determinrilor prin fluorescen
determinrilor prin fluorescen

Dintre factorii care pot influen Dintre factorii care pot influen a sensibilitatea cantitativ a sensibilitatea cantitativ a a
determinarilor determinarilor putem enumera: putem enumera:
Nelinearitatea este data de cre Nelinearitatea este data de cre terea concentra terea concentra iei de iei de
compu compu i fluorofori i fluorofori
Efectul pH Efectul pH- -ului ului
Viscozitatea mediului Viscozitatea mediului i, i, implicit, nu implicit, numrul de ciocniri dintre mrul de ciocniri dintre
molecule sunt influen molecule sunt influen ate de temperatur ate de temperatur
Extinc Extinc ia de luminiscen ia de luminiscen este dat de scderea intensit este dat de scderea intensit ii ii
de fluorescen de fluorescen prin interac prin interac ia moleculelor aflate ia moleculelor aflate n stare de n stare de
excitare cu mediul. Ea rep excitare cu mediul. Ea reprezint un indicator al interac rezint un indicator al interac iilor iilor
chimice specifice ce pot avea loc chimice specifice ce pot avea loc
Sursa Sursa de de radia radia ii ii
1) 1) Lamp cu vapori de Hg Lamp cu vapori de Hg- - este specific fluorimetrelor este specific fluorimetrelor. .
Acesata emite multe lini Acesata emite multe lini n UV n UV i VIS. i VIS.
2) 2) Lamp cu Xe Lamp cu Xe- - specfic spectrofluorimetrelor specfic spectrofluorimetrelor
3) 3) Lasari (He Lasari (He- -Cd) Cd)- - nu sunt folosi nu sunt folosi i foarte mult. i foarte mult.
Selectorii Selectorii lungimii lungimii de und de und : filtre : filtre i monocromatori (mai nou i monocromatori (mai nou
policromatori). policromatori).
FLUORIMETRE
FLUORIMETRE

I
I
SPECTROFLUORIMETRE
SPECTROFLUORIMETRE
Schema unui fluorimetru fotoelectric Schema unui fluorimetru fotoelectric
monofascicul cu filtre. monofascicul cu filtre.
1) lamp cu vapori de mercur, 2) i 4)
filtre, 3) celul ce conine proba de
analizat, 5) fotocelul, 6) instrument de
msur
Sistemul optic (instrum
Sistemul optic (instrum
entul de msurare a
entul de msurare a
fluorescen
fluorescen

ei moleculare)
ei moleculare)
Aplica
Aplica

ii analitice ale spectrometriei de


ii analitice ale spectrometriei de
fluorescen
fluorescen

Analitii pot fi Analitii pot fi: :


1. 1. fluorescenti fluorescenti, putand fi detectatii direct cu ajutorul , putand fi detectatii direct cu ajutorul
spectrofluorimetrului (de exemplu hidrocarburile aromatice, spectrofluorimetrului (de exemplu hidrocarburile aromatice,
proteinele, cateva mediamente), proteinele, cateva mediamente),
2. 2. slab fluorescenti sau nefluorescenti slab fluorescenti sau nefluorescenti si metodele indirecte si metodele indirecte
care sunt utilizate in analiza lor sunt urmatoarele: care sunt utilizate in analiza lor sunt urmatoarele:
Derivatizarea Derivatizarea (de exemplu reactia analitului cu un compus (de exemplu reactia analitului cu un compus
fluorescent), este de obicei utilizata in conjunctie cu fluorescent), este de obicei utilizata in conjunctie cu
cromatografia de lichide cu detectie de fluorescenta. Aceasta cromatografia de lichide cu detectie de fluorescenta. Aceasta
metoda este utilizata in mod curent in biochimie si chimia metoda este utilizata in mod curent in biochimie si chimia
clinica. clinica.
Formarea unui complex fluorescent Formarea unui complex fluorescent
Stingerea fluorescentei Stingerea fluorescentei rezulta din rezulta din coliziunea analitului cu coliziunea analitului cu
un compus fluorescent. Aceasta metoda este utilizata la un compus fluorescent. Aceasta metoda este utilizata la
detectia de gaze ca de exemplu oxigenul, SO detectia de gaze ca de exemplu oxigenul, SO
2 2
, H , H
2 2
S, HCl, Cl S, HCl, Cl
2 2
etc. etc.
Aplica Aplicat tii ale ii ale spectrometriei spectrometriei de de fluorescen fluorescenta ta
- -analiza analiza calitativa calitativa si si cantitativa cantitativa a a cationilor cationilor si si anionilor anionilor; ;
- -analiza analiza calitativa calitativa si si cantitativa cantitativa a a unor unor compusi compusi organici organici; ;
- -determinarea determinarea structurii structurii conformationale conformationale a a proteinelor proteinelor; ;
- -analiza analiza ADN ADN- -ului ului; ;
- -studiul studiul cineticii cineticii proceselor proceselor de transfer de transfer prin prin membrane; membrane;
- -studiul studiul cinetic cinetic al al reactiilor reactiilor enzimatice enzimatice; ;
- -metoda metoda de control in de control in ingineria ingineria genetica genetica; ;
- -metode metode imunochimice imunochimice de de analiza analiza si si diagnoza diagnoza; ;
- -studiul studiul proliferarii proliferarii celulelor celulelor i i apoptozei apoptozei; ;
- -etc. etc.
61
Analiza triptofanului
-triptofanul are un maxim de absorbtie la 290 nmsi un maxim de emisie
aproximativ la 345 nm.
-triptofanul este sensibil la mediul inconjurator-maximul de emisie ofera
informatii privind gradul de modificare al proteinelor.
-masurarea spectrului de emisie in domeniul 305450 nmpermite
studiul produsilor fluorescenti rezultati prin reactii Maillard (maxim de
emisie la 440 nm) .
Analiza riboflavinei
-riboflavina se degradeaza in lumina UV la doi noi compusi: lumicrom si
lumiflavina cu maxime de emisie intre 444479 nmsi 516522 nm.
-reducerea intensitatii fluorescentei la circa 525nm reflecta
fotodegradarea riboflavinei.
Analiza vitaminei A
Spectrul de excitatie al vitaminei A inregistrat intre 250 si 350 nm pentru
un maxim de emisie setat la 410 nm da informatii privind dezvoltarea
structurii globulare proteina grasimi (in procesul de coagulare a
laptelui de ex.)

Determinarea speciilor anorganice
Determinarea speciilor anorganice
Me
N
CH
2
HOOC
O CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
HOOC
HOOC
HOOC
N
N
O
O
O
COOH
Fura-2pentruCa
+2
0,005
Acid benzoic
V
0,002
2,2-metilen
dibenzotiazol
Zn
0,05
5-metil-1,10-fenantrolin
Ru
0,9
Acid carminic
Mo
0,01
8-hidroxichinolin
Mg
0,01
Triazinil stilbexon
Cr
0,2
Calcein
Ca
0,0005
Dibenzilmetan
B
0,02
Rodamin B
Au
0,0003
Saliciden-o-aminofenol
Al
Sensibilitatea
(ppm)
Reactivul organic Elementul
Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru
unele metale cu reactivi organici unele metale cu reactivi organici
Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru unele Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru unele s specii pecii
anorganice anorganice n prezen n prezen a unor reactivi a unor reactivi organici organici
B, Be, Sb,ioni
colorai
10 Verde - Benzoin
Zn
2+
F
-
, PO
4
3-
,Zr 0,1 470 400 Flavinol
Sn
4+
Mg 0,2 580 370
8-
hidroxichinoli
na
Li
+
NH
3
2 Albastru 365
2-(o-hidroxifenil)-
benzoxazol
Cd
2+
Be, Sb 0,04 450 370 Benzoin
B
4
O
7
2-
Be,Co,Cr,Cu,
Fe, Ni, PO
4
3-
,
Th, Zr
0,001 500 470
Complex al Al cu
alizarina de
Ru
F
-
Be, Co, Cr, Cu,
F
-
, NO
3
-
, Ni,
PO
4
3-
, Th, Zr
0,0007 500 470
Alizarina de
rubiniu
Al
3+
Fluorescen

Absorbie
I nterferene
Sensibilitate
m/ mL
Lungime de und, nm
Reactiv organic
Ion
Aplica
Aplica

ii farmaceutice
ii farmaceutice
Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice a unor Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice a unor m medicamente edicamente
0,020
515 390 pH = 11
Tetraciclin
0,002
450 350 pH = 1
Chinin
0,010
345 275 pH = 11
Procain
0,500
440 265 pH = 11
Fenobarbital
0,100
440 250 Fericianur
Morfin
0,100
546 490 pH = 13
Extrogen
0,100
350 285 pH = 1
Codein
0,001
355 280 CHCl
3
/HOAc
Aspirin
Sensibilitatea
ppm
Lungimea de und
de emisie
nm
Lungimea de und
de excitare
nm
Condiii de
lucru
Substana
Aplica Aplica ii pe probe biologice ii pe probe biologice
- - studiul studiul proteinelor proteinelor
- - determinarea determinarea glucozei glucozei ( (utilizand utilizand
reactivul reactivul tetraciclin tetraciclin europium) europium)
- - determinarea determinarea vitaminelor vitaminelor
Aplica Aplica iile pe produsele alimentare iile pe produsele alimentare
- - determinarea determinarea V V
B1 B1
din din paine paine, , lapte lapte, , cereale cereale
- - determinarea determinarea seleniului seleniului
- - determinarea determinarea sterolilor sterolilor din din macaroane macaroane