Localizarea antigenelor

a. spatii extracelulare: sange, umori, l.c.r., secretii, excretii, lichid-

vezicule/pustule:
- componente a v. = ser (AgHBs/AgBbe VHB; prot. P24 HIV)
- particule intregi = sange (togav., picornav.), materii fecale (rotav.,
enterov.), urina (v.urlian), saliva (CMV), secretii nazale (rhinov.), secretii
vaginale/lapte (HIV), l.c.r (arbov.), pustule/vezicule (v.vaccinia, v.herpetic)
b. celule si tesuturi (tropism):
- la suprafata membranei celulare :
- antigene virale de suprafata:glicoproteine (hemaglutinine) la v.
invelite (ortho, paramyxov., togav., rhabdov., herpes v., poxv.) si
proteine capsidare la v. neinvelite (hexoni la adenov.)
- intracelular: atg. interne asociate cu nucleocapsida sau proteina
M: limfocite B (v. Epstein Barr); limfocite T (HIV, v. rujeolos);
neuroni (v.rabic); tesut reticulo-endotelial (v.denga); epiteliu
intestinal (enterovirusuri)
c. celule transformate malign:
- atg. pe suprafata celulara
- atg. i. celulare (citoplasma si nc.): tumorale (T) la adenov. si papovav.
CURS 9
DI AGNOSTI CUL de LABORATOR

Metode:
1. Multiplicarea si identificarea virusului in cultura
celulara
2. Identificarea microscopica directa in produsele
patologice
3. Serologie: detectia conversiei in anticorpi (crestere x
4 a titrului) sau a IgM
4. Detectia antigenelor virale in produsele patologice
5. Detectia acidului nucleic in produsele patologice
1. Multiplicarea si identificarea
in cultura celulara
a. efect citopatic:
sincitii (celule multinucleate gigante prin fuziune): paramyxov.
aglomerari de celule: aspect ciorchine (adenov.)
celule mari rotunde refringente: v. polio
b. fara efect citopatic:
HAD (hemadsorbtie): atasare cu fixare a hematiilor (cobai) pe suprafata
celulelor infectate la virusul cu hemaglutinina (v.urlian, v. paragripale,
v.gripale)
HA (hemaglutinare): aglutinarea hematiilor (pasare, om-grup OI, cobai,
curcan) de v. cu hemaglutinina din mediul de cultura
interferenta: obtinerea unui e.p.c. (efect citopatic) prin al doilea virus (v.
rubella la coinfectie cu v. echo sau coxsackie)
descresterea productiei de acid la infectarea sau moartea celulara: alcalinizare
cu pastrarea culorii rosii a indicatorului (rosu fenol)
c. identificare prin anticorpi specifici:
RFC (reactia de fixare a complementului)
HAI (inhibarea hemaglutinarii)
RSN (reactia de seroneutralizare)
I F (imunofluorescenta)
RI A (radio immuno assay)
I ME (immunelectron microscopy)
ELI SA (enzyme linked immunosorbent assay)
I. REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
(RFC)
- reactie care foloseste doua sisteme si complement (C):
complex virus (antigen viral)atc fixator omolog
sistem martor: ser hemolitic antihematie (oaie)
hematie (oaie)
ser cobai cu cantitate mare de complement
- principiu: fixarea C pe sistemul atg v. atc. omolog
impiedica aparitia hemolizei in sistemul martor
- utilizare:
detectie virusuri (atg v. necunoscute) in cultura
celulara cu atc specifici (cunoscuti)
dg. serologic: seruri duble (acut si convalescent);
complex imun = atg.v cunoscute seruri bolnav;
conversie semnificativa = crestere titruri x 4
II. REACTIA DE INHIBARE A HEMAGLUTINARII
(RHAI)
- reactie care foloseste:
complex virus (atg viral hemaglutinant = gp de suprafata,
atg capsidal) atc omolog
hematii: gaina, cobai, porumbel, maimuta, om grup OI
- principiu: complexul atg-atc inhiba hemaglutinarea virala
- utilizare:
identificarea v. izolate (necunoscute) in cultura celulara
cu atc specifici (cunoscuti)
dg. serologic: seruri duble (acut si convalescent);
complex imun = atg v cunoscute seruri bolnav;
conversie semnificativa = crestere titruri x 4
III. TEST RAPID - DIRECTIGEN
- reactie care foloseste:
produse patologice cu virusuri (necunoscute):
secretii, excretii, sange
benzi (stripsuri) impregnate cu atc specifici
(cunoscuti) cuplati cu enzime
- principiu: complex virus (necunoscut) atc
specific elibereaza enzima care modifica culoarea
substrat
- utilizare:
detectie rapida virusuri; screening pentru
identificare ulterioara
IV. IMUNOFLUORESCENTA (IF)
- reactie care foloseste:
complex virus (atg. viral) atc specific omolog (cuplat cu
substanta fluorescenta)
microscop cu UV
- principiu:
complexul atg viral anticorp specific cuplat cu fluoresceina se
vizualizeaza in celule infectate (tesuturi , produse patologice,
culturi celulare) in nc. sau citoplasma
- variante:
IF D (directa): complex virus atc specific cuplat
IF I (indirecta): complex virus atc specific atc monoclonal anti
specie cuplat cu fluoresceina
- utilizare:
detectie virus (atg. virale) in: produse patologice, tesuturi, organe,
culturi celulare
V. REACTIA DE NEUTRALIZARE (RSN)
- principiu:
1. atc specifici impiedica aparitia e.p.c prin
blocarea penetrarii v. in celula;
2. reactie de neutralizare a unui virus cunoscut cu
seruri de bolnav
- utilizare:
detectie virus: cultura celulara
serologie: seruri duble (acut si convalescent)
inoculare pe cultura celulara infectata cu un
virus cunoscut
VI. ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
variante:
a. detectie virusuri (tg. virale ) in: produse patologice, culturi celulare
b. detectie atc in: ser
principii:
a. complex: atc specific (godeu imbracat) - virus (atg viral) atc
specific cuplat cu enzima (peroxidaza, fosfataza alcalina) sau atc
specific (godeu imbracat) virus (atg. viral) atc. specific atc
monoclonal antispecie cuplat cu enzima; eliberare enzima la
corespondenta cu modificare substrat (colorimetric) si citire
spectrofotometrica
b. complex: atg. viral (cunoscut) ser bolnav (atc IgM/IgG necunoscuti)
atc anti IgM sau anti IgG (monoclonali) cuplati cu enzima;
eliberare enzima la corespondenta cu modificare substrat si citire
spectrofotometrica
utilizare:
- detectie v. (atg.virale): produse patologice, culturi celulare
- serologie: ser unic (faza acuta) = IgM ; seruri duble (acut si
convalescent) = IgG in dinamica
2. I DENTI FI CARE - MI CROSCOPI CA
- virusurile pot fi identificate in produse patologice
(inclusiv material bioptic/necroptic sau leziuni
catenate)
microscopul optic: incluzii sau celule gigante
multinucleate , microscopul cu UV: evidentirea
celulelor infectate cu vims prin anticorpi cuplati cu o
substanta fluorescenta
ME (microscopic electronica). Detectia particulelor
virale (caracterizare prin forma si marime)
IME (immun electron microscopic): complex virus -
ate specific vizualizat
3. SEROLOGI E:
evidentierea conversiei (cresterii) ate specifici prin
testarea titrului unui ser recoltat in faza acuta si a
altuia recoltat la 2 saptamini (convalescenta)
semnificativ: cresterea de eel putin 4 ori reactii pe
seruri duble (diagnostic retrospectiv): RFC, HAI,
ELISA reactii pentru infectie recenta: detectie IgM
prin ELISA (rujeola, hepatita B atc. la atg core,
rubeola, parotidita epidemica, hepatita A si C) pe ser
unic reactii pe ser unic: infectie anterioara sau
vaccinare reactii nespecifice: atc. heterofili
(mononucleoza infectioasa)
4. DETECTI A VI RUSURI LOR
sau a ANTI GENELOR VI RALE

produse patologice (inclusiv sange/fluide ale
coipului)
teste: IF, ELISA, Directigen
ELISA: atg p24 (HIV), atg HBs (hepatite cu
virus B)
5. DETECTI A ACI ZI LOR
NUCLEI CI VI RALI

genom sau ARNrn pot fi detectate in sange sau
tesuturi cu ADNc sau ARNc ca probe
la cantitati mici de acizilor nucleici: tehnici de
arnplificare (PCR/RT-PCR)