REPLICAREA

= procesul de duplicare al unei molecule de ADN, realizat prin sintetizarea unei catene
complementare fiecarei catene din cadrul moleculei de ADN initiala
- se copiaza si se transmite info genetica de la celula-mama la celulele-fiice, de la parinti la copii
Caracteristici :
1 - model semi-conservativ - fiecare catena de adn d.c. este matrita pentru formarea unei noi
molecule adn dc
2 - replicarea incepe de la un situs specific numit originea replicarii
3 - se desfasoara in directia 5'-3' : sinteza celor doua molecule se desf simultan, dar in directii
opuse pe cele doua catene
4 - este semi-discontinua : catena noua 5-3' ce foloseste ca matrita catena 3'-5' (catena leading)
este sintetizata continuu in directia furcii de replicare; catena noua 3'-5' ce foloseste ca matrita
catena 5'-3'(catena lagging) este sintetizata discontinuu, in opusul directiei furcii de replicare -
se formeaza scurte segmente prin sinteze discontinue, numite fragmente Okazaki
Principalele etape ale replicarii sunt :
1 - initierea - recunoasterea regiunii de la care se incepe replicarea
2 - elongatia - procesul efectiv de duplicare
3 - terminarea - etapa de sfarsit, dupa sintetizarea catenelor complementare - secvente ter
PK
Componente pt PK :
1 - matrita ADN
2 - substrat nucleotide
3 - enzime si alte proteine :
1. Topoizomeraze I fara ATP, incizii monocatenare, induce relaxare actionand
asupra suprarasucirilor positive
II ; Giraza incizii dublucatenare : fara atp relaxare; cu atp -
suprarasuciri
2. Complex primozom - actioneaza la nivelul originii:
DNA A ATP-aza
DNA B helicaza (asociata cu C si A) despiralizeaza helixul formeaza
2 catene
DNA C
DNA G primaza sintetizeaza primeri ce repr situs de pornire a
sintezei mediate de AND polimeraza
3. Proteine ssb (single-strand binding) previn reasocierea catenelor prin atasarea
la scheletul pentozofosfat
4. ADN-polimeraze :
Tip Gena Actiune
I poIA - Polimerizatoare -
667/min
- Exonucleazica :
1 proofreading 3-5;
2 -reparatorie

II poIB - Polimerizatoare
- Proofreading
III poIC - Polimerizatoare 60
000 -100 000/s
- Proofreading
5. ADN-ligaza uneste fragmentele Okazaki prin refacerea legaturilor
fosfodiesterice
ADN polimeraza III :
- Actioneaza ca un dimer, fiecare monomer pe cate o catena
- Este o holoenzima formata din 10 subunitati
Denumirea
subunitatii
(litere mici
grecesti)
Masa
moleculara
Functii Subansamblu
(alpha) 130 ADN polimeraza
Exonucleaza 5->3

Miezul
enzimei(Core) (epsilon) 27 Exonucleaza 3->5
(theta) 10 Rol structural
(tau) 71 Dimerizarea miezului enzimei Complexul
(gamma) 47

ATPaze
Complexul (clamp
loader)
Favorizeaza
tranferul
(delta) 35
' (delta) 33
(chi) 15
(phi) 12 subunitatii la
matrita ADN

(beta) 40 Leaga miezul enzimei la ADN
si il recicleaza
Complexul
(cleme)

Initierea la PK :
Presupune - recunoasterea regiunii de la care se incepe replicarea, regiune numita origine de
replicare (oriC). Sunt situsuri cromozomiale specifice, continand unitati repetitive scurte,
bogate in A-T, recunoscute de proteine multimere "origin-binding proteins".
Secventa oriC a molecule de ADN de la E.Coli prezinta 3 secvente repetitive de 13 pb si 4
secvente de 9 pb. ~ 20 molecule DNA-A, fiecare legand cate o molecula de ATP, se atasaza celor
4 secvente, ce determina denaturarea celor 3 secvente. Apoi, hexameri DNA-B helicazei, cu
ajutorul DNA-C, se atasazeaza secventei oriC si desface legaturile dintre cele doua catene.
Elongatia la PK
ADN helicazele implicate in furca de replicare de la E. coli se deplaseaza in directia 5'---
>3' direction. Holoenzima ADN Pol III interactioneaza cu ADN helicaza prin intermediul
subunitatii (tau) care se leaga la ambele core ADN polimeraze. Una dintre core ADN Pol III
replica catena directa in timp ce cealata catena inversa. SSB acopera regiunile monocatenare ale
ADN ( pentru simplificare SSB de pe catena intarziata/antisens sunt prezentate numai partial
Avem cele doua catene : pe Leading se atasaza proteinele ssb pentru a preveni
reanelarea. Periodic, ADN primaza se asociaza cu ADN helicaza si sintetizeaza un nou primer pe
catena matrita inversa/intarziata . intervine apoi ADN-polimeraza III care continua sinteza noii
catene pornind de la capatul 3OH liber al ultimei nucleotide din structura primerului. Dup
ncorporarea unui nou dNTP este eliberat a grupare PPi care funcioneaz ca donor de energie.
Pasul urmator este realizat de ADN polim I care realizeaza proofreading.
Pe Lagging analog ssb si DNA-G primaza. Sinteza ADN continua cu ajutorul ADN polim III pana
ce fragmentele extinse ajung la nivelul primerului anterior (al fragmentului Okazaki anterior). )
In momentul in care ADN polimeraza finalizeaza un fragment Okazaki, de pe catena intarziata, aceasta
este eliberata prin alunecarea ea este eliberata prin alunecarea clemei (clamp) la nivelul ADN.Primerul
recent amorsat de pe catena intarziata devine tinta pentru clema (clamp) care se pozitioneaza la nivelul
primerului asambland un nou complex care realizeaza sinteza unui nou fragment Okasaki. In fata, un
nou primer este sintetizat si procesul continua. Pentru unirea fragmentelor intervin ADN polimeraza
I cu functia exonucleazica 3-5 (proofreading) si 5-3 care degradeaza primerii, si cu functia
polimerazica se extinde noua catena, de la o taietura leg fosfodiester. rupta, proces numit
translatia taieturii. Aceasta taietura este translatata pana cand and polim I disociaza. Ea este
sudata ulterior de AND ligaza.
Terminarea : - in dreptul secventelor Ter, la nivelul carora helicaza este blocata de
activitatea proteinei Tus.
EK
Caracteristici :
- Are loc in faza S a ciclului celular (6-8 h la mamifere)
- Exista mai multe furci de replicare cromozomi multirepliconi
- ADN polimeraza nu actioneaza si la nivelul telomerelor cromozomilor. La acest nivel
intervine o enzima specifica, numita telomeraza.
-
Componente pt EK:
1 - matrita ADN
2 - substrat - deoxinucleotide
3 - enzime sau alte tipuri de proteine :
a complexul ORC(echivalent DNA-A) - se leaga de originea de replicare, initiind
replicarea
b - complexul Mcm2-7 (echivalent DNA B helicaza-) desface catenele la nivelul furcii de
replicare
c RF-A (echivalent protein ssb) - se atasaza la scheletul pentozofosfat ale fiecarei
catene ADN pentru a preveni recuplarea
d - ADN-giraza - este topoizomeraza II - merge inainte de furca de replicare, inducand
suprarasuciri negative pentru inlaturarea superrasucirilor pozitive, ce relaxeaza molecula
e - ADN-polimeraza alfa - sintizeaza scurti primeri ARN pentru a oferi secventa cu
capatul 3'OH liber pentru atasarea nucleotidelor
f - ADN-polimeraza delta sau epsilon - continua sinteza noii catene, atasand nucleotide
la gruparea 3'OH libera oferita de primer
g - ADN-polimeraza beta - indeparteaza primerii ARN si ii inlocuieste cu ADN
h - ADN-ligaza - uneste fragmentele Okazaki prin refacearea legaturilor fosfodiesterice
ADN polimerazele
SINTEZA REPLICATIVA A ADN:
- implica intreaga molecula de ADN
- realizata in vederea reduplicarii genetice si continuitatii ereditare.
SINTEZA REPARATORIE A ADN:
- se realizeaza la nivelul unor regiuni scurte
- are loc destramarea catenei afectate
Clasificare :
ADN polimeraza (echivalent DNA G primaza)- initierea replicarii ADN
- 4 subunitati distincte:
cea mai mare 180 KDa
cea mai mica ~ 50-60 KDa
- primaza capabila sa sintetizeze mici transcripti de ARN
ce servesc ca primeri pt elongarea catenei ADN,
asigurata de subunitatea catalitica.
< 100 nucleotide / eveniment de legare nu e inalt procesiva
ADN polimeraza (echivalent polimeraza I)- repararea leziunilor ADN si recombinare
ADN polimeraza - replicarea ADN mitocondrial
ADN polimeraza (echivalent adn polimeraza III) - replicaza nucleara - pe leading
in prezenta PCNA (antigenul nuclear din celulele proliferative)
devine mai procesiva (>1000 nucleotide / eveniment de legare)
ADN polimeraza (echivalent polimeraza III)- repararea leziunilor ADN
- activitate exonucleozica 3`-5`
- active polim pe lagging
Initierea :
Secventele ori la eucariote sunt grupate in unitati replicative. Acestea grupeaza
secventele ori care vor fi activate in acelasi timp. Echivalentul functional al proteinei dnaA este
complexul ORC. Se formeaza complexul pre-replicativ compus din : proteina ORC, la care se
atasaza cel putin 2 proteine aditionale si o helicaza mcm2-7. Activarea acestui complex duce la
formarea furcii de replicare.
Este activat prin fosforilarea proteinelor de catre cdk si ddk, fapt ce determina
recrutarea multiplilor factori de replicare, printre care si ADN polimeraza alfa ce incepe sinteza
primerilor.
Elongatia
Dupa ce primerii au fost sintetizati, intervine adn polim delta sau epsilon. DNA Pol
recunoaste primerii si incepe sinteza catenei directe. Dupa o perioada de relaxare a ADN, ADN
pol alfa sintetizeaza alti primeri, care permit initierea catenei intarziate si sinteza ADN la nivelul
acestei catene prin interactionea ADN Pol si a altor polimeraze.
Terminarea
La nivelul telomerelor, cu ajutorul enzimei telomeraza, specifica acestui nivel.


Comparatie replicare PK cu EK :
1 - pk - CRS unireplicon - o singura secventa de la care incepe replicarea
ek - CRS multireplicon - mai multe secvente de la care se incepe replicarea
2 PK CRS circular
EK CRS linear
3 viteza : 1000pb/s la PK rata de mutatii mai mare
50 pb/s la EK -> procese de incetinire pentru a castiga acuratete :
4 rata de mutatii : mai mare la PK
5 marimea fragm okazaki : pk 1000 pb; ek 100 pb
6 prezenta telomerelor la ek
7 echivalenti : DNA A > complexul ORC
DNA G- primaza -> ADN polimeraza alfa
ADN polimeraza I -> AND polimeraza beta
ADN polimeraza III -> ADN polimeraze delta, epsilon