Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure
LP5


-1-

Reacii antigen anticorp

Componentele structurale ale virusurilor joac rol de antigen, provoac rspuns imun din
partea organismului infectat, ceea ce rezult n producere de anticorpi.
Reacia antigen anticorp este specific, antigenul poate fi legat numai de anticorpul ce
s-a produs ca rspuns la stimulul antigenic respectiv.



Aceste reacii pot fi folosite pentru:
- detectarea unui antigen necunoscut cu ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de
diagnostic directe)
- detectarea anticorpilor din serul bolnavilor cu antigene cunoscute (serodiagnostic, metode
de diagnostic indirecte).






n cazul n care antigenul corespunde anticorpului, se formeaz complexul imun antigen-
anticorp.
n funcie de cum se vizualizeaz/detecteaz formarea complexului imun exist mai multe
metode bazate pe reacii antigen-anticorp:
- reacii de precipitare: complexele imune formeaz precipitat
- reacii de aglutinare: complexele imune formeaz aglutinat
- RFC se detecteaz consumarea complementului (acesta se leag de complexele imune)
- reacii n care elementul cunoscut este marcat se detecteaz elementul marcat din
complexul imun format



ag-ac ag + ac
ag? + ac ag-ac
ag + ac? ag-ac
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-2-

1. Reacii de precipitare
Pot avea loc n medii lichide (metode folosite n bacteriologie) sau n medii solide (metode
folosite n virusologie)
Reacii de precipitare n mediu lichid
Reactii de precipitare n amestec (n toat masa lichidului)
- testul Ramon titrarea toxinei difterice
o se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie
titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut
o cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist echivalen ntre
titruri
o cunoscnd titrul Ac, se poate afla titrul toxinei
- testul VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin) + n
diagnosticul sifilisului
Reactii de precipitare n inel
- reactia Ascoli diagnosticul retrospectiv al infeciei crbunoase
o se pun n contact suspensia preparat din fragmentul de organ (conine Ag) cu
serul anticrbunos (conine Ac), n aa fel nct s nu se amestece
o precipitatul se formeaz la zona de contact dintre cele 2 coloane de lichid
- stabilirea grupelor Lancefield la streptococi beta hemolitici
2. Reacii de aglutinare
Antigenele: de natur corpuscular, aglutinogene, Anticorpii: aglutinine
Antigenele corespund cu anticorpii + sunt prezente n cantiti echivalente: se formeaz
aglutinatul (reea tridimensional de complexe imune), vizibil cu ochiul liber sub forma de
grunji.

Reacii de aglutinare pe lam
- se aplic pentru stabilirea structurii antigenice a speciei bacteriene izolate, includerea
acesteia n serogrupe, serotipuri
- se folosesc seruri aglutinante specifice



Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-3-

- pe o lam de microscop curat i degresat se pun:
o la o extremitate a lamei o picatur de ser fiziologic steril, n care suspensionm
o cantitate mic din colonia de cercetat; va rezulta o suspensie omogen
o la cealalt extremitate o pictur de ser aglutinant (conine Ac cunoscut)
reacie pozitiv n pictur vor aprea grunji
reacie negativ pictura rmne omogen

Reacii de aglutinare pe suport
Elementul cunoscut al reaciei imune este ataat de un suport:
- hematie hemaglutinare pasiv (hematia nu particip direct n reacia ag-ac)
- particul latex - latexaglutinare
- proteina A extras din tulpina de stafilococ Cowan coaglutinare

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-4-

3. Reacia de fixare a complementului (RFC)
Complementul:
se leag de complexul imun
lizeaz hematiile din complexul imun









Reacie pozitiv: lipsa hemolizei hematiile se depun la fundul eprubetei









Reacie negativ: hemoliz







ac?
ag
complement
sistem hemolitic (eritrocit + ac = CI)
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-5-

4. Metode imunoenzimatice (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este posibil determinare cantitativ.
La reacii particip:
un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid (plci cu godeuri, lame, baghete).
Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A)
un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabil
spectrofotometric (determinare cantitativ)
substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici)
Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate.
ntre reacii splare cu soluii tampon










Detectarea anticorpilor








Detectarea antigenelor
anticorpi specifici
anticorpi marcai enzimatic
antigen?
substrat cromogen
stoparea reaciei
anticorp antiglobulinic marcat
anticorp?
antigen cunoscut
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-6-

5. Reacia de imunofluorescen (RIF)
Fluorocromii:
se leag covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat
emit fluorescen dac se expun la raze UV
izotiocianatul de fluorescein (galben-verzui), rodamina (portocalie)
nu sunt stabili n timp

Metoda direct
Preparatul de examinat se monteaz pe lam. Se adaug conjugatele. n cazul n care se
gsesc ag corespunztoare anticorpilor marcai, se formeaz complexele imune. Prin splare se
ndeprteaz conjugatele nelegate. Preparatul se examineaz la microscopul cu fluorescen.
Puncte fluorescente pe fond ntunecat: n preparatul examinat au fost prezente antigenele cutate
(rezultat pozitiv).
Absena punctelor fluorescente: n preparat nu au fost prezente antigenele cutate
(rezultat negativ).






Metoda indirect
La preparatul montat pe lam se adaug anticorpi specifici nemarcai. . n cazul n care
exist antigene corespunztoare anticorpilor, se formeaz complexele imune. Prin splare se
ndeprteaz ac nelegai. Se adaug anticorpi antiglobulinici marcai cu fluorocrom. Dac exist
n preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline. Examinarea: la fel ca la
metoda direct.







anticorp marcat cu fluorocrom

antigen din preparatul montat pe lam

anticorp specific antigenului cutat
n preparat
anticorp antiglobulin marcat cu
fluorocrom
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-7-

Identificarea microorganismelor prin detectarea acizilor
nucleici
Genomul conine secvene specifice pentru fiecare microorganism, detectarea prezenei acestora
ntr-un produs patologic sau n culturi celulare are valoare diagnostic.

1. Metode de hibridizare
Principiu: fragmente monocatenare de oligonucleotide marcate (sonde), avnd secven
cunoscut (caracteristic unui virus) se vor ataa pe baza complementaritii de secvene
complementare situate pe acizii nucleici ale microorganismului de identificat.
Etape de lucru:
- extragerea acizilor nucleici
- denaturarea acizilor nucleici i fixarea acestora pe un suport
- hibridizare: adugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substane
radioactive) i ataarea acestora de secvenele omoloage
- eliminarea sondelor nefixate
- vizualizarea hibridizrii
Vizualizarea se face n funcie de tipul marcajului folosit.






a. FISH (Fluorescent in situ hybridization)
Marcajul folosit este element fluorescent

FISH pentru 16S rRNA bacterian
denaturare
A C G T A
C
G
T A
C
G
T A
C
G
T A
C
G
T
Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-8-

b. Metoda Southern blot
Se detecteaz secvene specifice de nucleotide de ADN.
Etape:
- extragerea ADN-ului
- denaturarea ADN-ului se obin lanuri monocatenare
- fragmentarea lanurilor cu enzime de restricie (acestea acioneaz n locusuri
determinate, rezultnd fragmente de lungime diferit, caracteristice)
- separarea electroforetic a fragmentelor n gel de agaroz (separarea se face n funcie de
mrimea fragmentelor)
- transferarea pe membran de nitroceluloz
- adugarea sondelor marcate cu substane radioactive ataarea de secvenele omoloage
- se ndeprteaz sondele n exces, nelegate
- vizualizare prin autoradiografie

Probele 3,4,8,10 secvene de ADN prezente
Proba 6 secven de ADN prezent, dar clivat de enzima de restricie n 2 componente de
greutate molecular mai mic
Probele 1,2,5 nu prezint secvena de ADN cutat




Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-9-

c. DNA microarray
- Folosete principiul hibridizrii
- Poate detecta expresia a mii de gene simultan
- Aplicabilitate: determinarea nivelelor de expresie a genelor, determinarea secvenelor de
acizi nucleici


Pe principiu similar se bazeaz metodele:
Northern blot se detecteaz ARN, este necesar revers-transcriptaza
Western blot (protein immunoblot) se detecteaz proteine

1 markeri proteici
2-6 probe



Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-10-

2. Reacia n lan a polimerazei (PCR polimerase chain reaction)
Se detecteaz secvene specifice de acid nucleic dup o prealabil amplificare.
Etapele de lucru - detectarea ADN-ului
- extragerea ADN-ului
- amplificare: se realizeaz n aparatul PCR i const din mai multe cicluri identice
- denaturare (94
0
C)
- alinierea primerilor (50
0
C) 2 secvene de oligonucleotide care se leag prin
complementaritate pe cele dou catene la o anumit distan ntre ele.
- sinteza lanurilor complementare (72
0
C ) elongaie; este necesar prezena enzimei
polimeraz (Taq) i a nucleotidelor se formeaz lanurile complementare astfel se
dubleaz cantitatea de ADN
- reluarea ciclului de n ori se obin 2
n
copii ale secvenei de identificat

- vizualizarea produilor de amplificare
- produii de amplificare obinui se separ electroforetic
- colorare cu bromur de etidiu
- vizualizare cu raze UV prelucrare computerizat

Multiplex PCR se amplific mai multe gene odat
Real time PCR
RT-PCR - este necesar revers-transcriptaza

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure
LP5


-11-

3. Metode de tipizare molecular (genotipare)
Metodele sunt folosite pentru diferenierea diferitelor tulpini bacteriene din cadrul
aceleiai specii, avnd utilitate practic de exemplu n stabilirea clonalitii tulpinilor izolate n
context de epidemie i identificarea sursei de infecie (anchet epidemiologic).
Metodele au putere discriminatorie mare.
a. PFGE pulse field gel electrophoresis
- Extracia ADN-ului i nglobarea n gel de agaroz (discuri)
- Digestia ADN-ului cu enzima de restricie
- Electroforeza fragmentelor de macrorestricie n gel de agaroz
- Colorare cu bromur de etidiu
- Vizualizarea fragmentelor n lumin ultraviolet


b. MLST- multilocus sequence typing
- permite tipizarea la nivelul mai multor locusuri genetice odat.
- are putere discriminatorie foarte mare
- permite evidenierea variaiilor genetice la nivel de specie
- baze de date cu evidena geografica a diferitelor tulpini http://www.mlst.net/