Sunteți pe pagina 1din 108

MONICA IPO

NDRUMTOR
PENTRU
LUCRRILE PRACTICE DE
CITOLOGIE

EDITURA UNIVERSITII DIN ORADEA

- 2004 -

Refereni tiinifici:

Prof. univ. dr. Mihai TRIFU


Conf. univ. dr. Sabin BURC

Tehnoredactor:

ing. Julieta-Emilia ROMOCEA

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei


IPO, Monica
ndrumtor pentru lucrrile practice de citologie /
Monica ipo, - Oradea : Editura Universitii din Oradea,
2004
Bibliogr.
Index
ISBN 973 613 735 X
576.3

PREFA
Lucrrile practice din cadrul acestui ndrumtor au fost scrise pentru
studenii anului I de la seciile de Biologie i Biologie-Chimie, cu detalierea
modului de lucru, pentru ca studenii s poat efectua i singuri lucrrile
prezentate, dndu-le totodat

posibilitatea de a acumula deprinderi practice,

paralel cu nsuirile teoretice primite la curs. Este bine cunoscut faptul c, nsuirea
n cele mai bune condiii a cunotinelor teoretice se poate realiza numai dac
acestea sunt nsoite de demonstraii practice.
n concordan cu programa analitic a cursului de Citologie general,
lucrrile practice se refer la unele aspecte structurale ale celulelor, privind
comparativ celulele eucariote animale i celulele eucariote vegetale, ntre care
exist att asemnri ct i diferene majore de structur.
Lund n considerare faptul c studenii au acces, n special, la
microscoapele optice, la care pot lucra individual, majoritatea lucrrilor se bazeaz
pe microscopia optic.
n sperana c acest ndrumtor va fi de un real folos celor care l vor utiliza,
mulumesc referenilor tiinifici, d-lui prof. univ. dr. Mihai Trifu i d-lui conf.
univ. dr. Sabin Burc, precum i d-nei prof. univ. dr. Dorina Cachi-Cosma pentru
preioasele sugestii i ajutorul primit n elaborarea lui.
Totodat, in s-i mulumesc colegei mele, d-oarei ing. Julieta Romocea,
pentru sprijinul acordat n ceea ce privete partea de tehnoredactare.

CUPRINS
PREFA______________________________________________________________________
1. TEHNICA DE LABORATOR______________________________________________6
1.1. Aparatur, ustensile i substane chimice necesare_________________________6
1.2. Metode de investigare a universului celular_______________________________29
2. TIPURI DE CELULE, FORMA I DIMENSIUNILE LOR___________________46
2.1. Celula procariot_____________________________________________________46
2.1.1. Frotiuri cu bacilul fnului (Bacillus subtilis)______________________________46
2.1.2. Alge albastre verzi (cianobacterii): Oscillatoria i Spirulina________________48
2.1.3. Obinerea sferoplatilor cianobacterieni prin tratare cu lizozim_______________49
2.2. Celula eucariot_____________________________________________________50
2.2.1. Celula epidermic din tunica bulbului de ceap (Allium cepa)________________50
2.3. Forma, dimensiunile i viabilitatea celulelor______________________________53
2.3.1. Seciune transversal prin tulpina de pipirig (Juncus sp.)____________________55
2.3.2. Seciune transversal prin mduva de soc (Sambucus nigra)_________________55
2.3.3. Evidenierea periorilor absorbani ai rdcinilor i a celulelor suculente din
endocarpul fructelor de citrice______________________________________________56
2.3.4. Frotiu sanguin pentru evidenierea hematiilor i a leucocitelor_______________57
2.3.5. Viabilitatea polenului________________________________________________59
3. UNELE ASPECTE STRUCTURALE COMUNE CELULELOR EUCARIOTE
ANIMALE I VEGETALE_________________________________________________60
3.1. Membrana plasmatic (plasmalema)____________________________________60
3.1.1. Izolarea membranelor plasmatice eritrocitare_____________________________60
3.1.2. Evidenierea indirect a plasmalemei prin plasmoliz______________________61
3.2. Matricea citoplasmatic ( hialoplasma, citosolul )__________________________62
3.2.1. Cloroplastele antrenate n cicloz, n celulele frunzelor de Elodea canadensis
(ciuma apelor)__________________________________________________________62
3.3. Mitocondriile (condriozomii)___________________________________________63
3.3.1. Evidenierea mitocondriilor n leucocite prin coloraie vital cu verde Janus B___64
3.3.2. Evidenierea mitocondriilor n celula vegetal prin coloraie vital cu verde
Janus B________________________________________________________________64
3.3.3. Metode de determinare citochimic a unor enzime mitocondriale
(succinatdehidrogenaza, citocromoxidaza, ATP-aza dependent de Mg2+)____________65
3.4. Aparatul Golgi_______________________________________________________68
3.4.1. Impregnarea argentic a aparatului Golgi prin metoda Cajal - Da Fano________68
3.5. Reticulul endoplasmatic_______________________________________________69
3.5.1. Glucozo-6-fosfataza, enzim marker pentru reticulul endoplasmatic___________69
3.6. Lizozomii___________________________________________________________70
3.6.1. Evidenierea fagozomilor n leucocite___________________________________70
3.6.2. Fosfataza acid, enzim prezent la nivelul sistemului lizozomal_____________71
3.7. Cilii i flagelii________________________________________________________72
3.7.1. Preparate microscopice din suspensii de Euglena viridis i Chlamydomonas____73
3.7.2. Preparate microscopice din spematozoizi de bovine conservai n azot lichid
(-196)________________________________________________________________73
3.8. Nucleul i diviziunea celular__________________________________________73
3.8.1. Izolarea nucleilor hepatici____________________________________________73
3.8.2. Evidenierea firului de ADN__________________________________________75
3.8.3. Pregtirea preparatelor pentru evidenierea mitozei prin metoda rapid carminacetic________________________________________________________________76

3.8.4. Obinerea preparatelor prin tehnica Feulgen______________________________76


3.8.5. Diviziunea celular prin nmugurire la drojdia de bere (Saccharomyces
cerevisiae)_____________________________________________________________80
3.8.6. Meioza n anterele staminelor florii de crin (Lilium candidum)_______________81
4. ASPECTE STRUCTURALE PRIVIND CELULELE EUCARIOTE VEGETALE__86
4.1. Peretele celular, punctuaiuni i plasmodesme_____________________________86
4.1.1. Digestia peretelui celular primar i obinerea de protoplati din mezofilul
frunzelor de mazre (Pisum sativum)________________________________________86
4.1.2..Modificri chimice secundare ale pereilor celulari. Izolarea cuticulei frunzelor
______________________________________________________________________87
4.1.3.Suberul de la exteriorul tuberculilor de cartof ( Solanum tuberosum)___________87
4.1.4.Colenchimul angular i sclerenchimul scleros n seciune transversal prin tulpina
de dovleac (Cucurbita pepo)_______________________________________________88
4.1.5. Punctuaiuni i plasmodesme n endospermul secundar al seminelor de curmal
(Phoenix dactylifera)_____________________________________________________88
4.2. Cloroplastele________________________________________________________89
4.2.1. Forme de cromatofori la alge_________________________________________90
4.2.2. Cloroplastele frunzei de ciuma apelor (Elodea canadensis) i amidonul de
asimilaie prezent n interiorul lor.__________________________________________91
4.2.3. Metoda spectrofotometric de determinare a pigmenilor fotoreceptori (clorofila
a i b, caroten i xantofil), dup Lichtenthaler i Wellburn, 1983._________________92
4.3. Alte tipuri de plastide_________________________________________________92
4.3.1. Gruncioarele de amidon (amiloplastele) din parenchimul de rezerv al
tuberculului de cartof, (Solanum tuberosum)__________________________________92
4.3.2 Gruncioarele de amidon din endospermul secundar al cariopsei de gru
(Triticum aestivum)______________________________________________________94
4.3.3. Gruncioarele de amidon i aleurona n parenchimul cotiledonar al embrionului
seminei de fasole (Phaseolus vulgaris)______________________________________94
4.3.4. Evidenierea activitii amilazelor din cariopsele de gru (Triticum aestivum) n
timpul germinaiei_______________________________________________________95
4.3.5. Gruncioarele de amidon din endospermul secundar al cariopsei de ovz (Avena
sativa)________________________________________________________________95
4.3.6. Cromoplastele n celulele fructului de roie (Lycopersicon esculentum)________96
4.3.7. Cromoplastele n celulele fructului de ardei (Capsicum annuum)_____________97
4.3.8. Leucoplastele n celulele epidermei inferioare a frunzelor de telegraf (Zebrina
pendula)_______________________________________________________________98
4.4. Vacuolele___________________________________________________________99
4.4.1. Evidenierea tonoplastului____________________________________________99
4.4.2. Analiza inulinei din sucul vacuolar_____________________________________99
4.4.3. Analiza aleuronei i a lipidelor_______________________________________100
4.4.4. Metoda spectofotometric de determinare a activitii peroxidazice, dup Hans
Lck.________________________________________________________________101
4.4.5. Evidenierea cristalelor de oxalat de calciu______________________________103
4.4.6. Formarea de lipozomi n sucul vacuolar al vacuolelor celulelor epidermale ale
petalelor de trandafir ( Rosa sp.)___________________________________________104
BIBLIOGRAFIE SELECTIV_________________________________________________107

1. TEHNICA DE LABORATOR
1.1. Aparatur, ustensile i substane chimice necesare
Microscopul optic (fotonic) de laborator se compune din 3 pri:
- partea mecanic;
- partea optic;
- aparatul de transmis lumin.

Figura 1 Componentele microscopului optic ML 4:


1 talpa; 2 piciorul vertical; 3 dispozitivul de iluminare artificial; 4 uruburi
anterioare; 5 urub dinat; 6 coloana; 7 viza macrometric; 8 viza micrometric; 9
msua (platina); 10 urub superior; 11 urub inferior; 12 dispozitiv cu in cu cei doi
cavaleri; 13 tuburile cu ocularele; 14 revolverul; 15 obiectivele; 16 diafragma; 17
condensatorul; 18 urub lateral; T - transformator (dup G. Benga, 1997, modificat).

Partea mecanic cuprinde mai multe componente precum suportul (baza sau
talpa microscopului) (1), care are o form dreptunghiular, scobit la interior i are
rolul de a oferi o bun stabilitate aparatului. De pe talpa microscopului pleac un
picior vertical (2) pe care sunt angrenate toate celelalte pri ale microscopului. La
partea posterioar talpa prezint un orificiu prin care se introduce dispozitivul de
iluminare artificial (un bec de 5-6V i 15W) (3). n interiorul tlpii se gsete o
armtur metalic ce cuprinde un sistem de lentile, care transmit lumina spre
oglinda proiectoare, a crei unghi de reflexie se poate regla cu ajutorul a dou
uruburi situate n partea anterioar a tlpii (4). Lateral, talpa mai prezint un urub
dinat (5), care permite plasarea sau scoaterea unui geam mat din dreptul becului
cu incandescen. Coloana (6) microscopului se prinde la partea posterioar a
piciorului vertical. Ea este mobil pe vertical, datorit unui angrenaj dinat,
putndu-se ridica sau cobor cu ajutorul urubului (sau vizei) macrometrice (7), cu
pas mare sau a urubului (sau vizei) micrometrice (8), cu un pas foarte mic.
Msua sau platina microscopului (9), are o form ptrat i se prinde de
partea anterioar a piciorului. Msua are n partea central un orificiu, de form
oval, prin care trece fascicolul de lumin de la condensator spre preparat i
obiectiv. Aceast msu este format din dou plci, dintre care numai cea
superioar este mobil, putndu-se deplasa nainte i napoi cu ajutorul unui urub
ce este situat vertical, n partea dreapt-jos a msuei (urubul superior) (10).
Deplasarea se poate msura n zecimi de mm cu ajutorul unui vernier situat n
partea stng-fa a msuei. ntr-un an posterior al msuei se gsete un
dispozitiv cu in, n care se inser cei doi cavaleri (12) prin suporii lor. Fixarea
cavalerilor se face cu ajutorul unor uruburi. Distana dintre cavaleri se fixeaz
astfel ca ntre ei s poat fi introdus cu uurin o lam microscopic ce are
lungimea de 7,5 cm. Rolul cavalerilor este de a fixa lama cu preparatul pe msua
microscopului. Cavalerul din stnga este un cavaler cu arc (mobil), ce trebuie
manipulat n cazul introducerii sau extragerii praparatului de pe msu, iar cel din
dreapta este cavalerul fix. Dispozitivul n care sunt montai cavalerii poate fi
deplasat i odat cu el i preparatul, spre stnga i dreapta, cu ajutorul urubului

vertical situat n partea dreapt-jos a msuei (urubul inferior) (11). i aceast


deplasare poate fi msurat cu ajutorul unui vernier situat n partea posterioar a
msuei. Cele dou verniere reprezint un sistem de coordonate pentru localizarea
unor detalii n preparatul microscopic.
Tuburile microscopului se prind la partea superioar a coloanei i se
angreneaz ntr-un dispozitiv circular, unde se fixeaz cu ajutorul unui urub. Prin
slbirea acestui urub tuburile i ocularele se pot roti, fcnd astfel posibil
observarea din mai multe poziii, fr a se schimba poziia microscopului, sau chiar
fixarea lui spre partea anterioar, ce permite o observare mai comod. Tuburile
microscopului au o lungime de 16 cm i sunt vopsite n negru att n exterior ct i
n interior. La captul superior al tuburilor se fixeaz ocularele microscopului (13).
Revolverul (14), este un dispozitiv situat la partea terminal i inferioar a
coloanei i la partea inferioar a tuburilor microscopice. Are rolul de a permite
schimbarea rapid i uoar a obiectivelor. Acest dispozitiv este format din dou
plci metalice, rotunde, unite printr-un ax comun. Partea superioar a revolverului,
de culoare neagr este fix, pe cnd cea inferioar, cromat, este mobil n jurul
axului su i este prevzut cu orificii filetate n care se nurubeaz obiectivele
(15). Fiecare din obiective poate fi adus n axul optic al microscopului prin simpla
nvrtire a prii mobile a revolverului. Atunci cnd unul dintre obiective se gsete
n axul optic, cursa revolverului este blocat de o clem cu dinte, care intr ntr-o
scobitur de pe marginea plcii mobile, moment marcat de un mic pocnet.
Dispozitivele de punere la punct ale microscopului, servesc la plasarea
lentilei frontale a obiectivelor, n vederea formrii imaginii. Aceast plasare se face
prin ridicarea sau coborrea tuburilor microscopului cu ajutorul a dou sisteme de
uruburi, situate n piciorul vertical al tlpii microscopului, dintre care unul
imprim o curs rapid, cu pas mare i poart numele de urub sau viz
macrometric, iar cellalt o micare lent i redus abia la 2 mm, numindu-se
urub sau viz micrometric. Cursa acestuia se poate determina n m, cu ajutorul
diviziunilor nscrise pe tamburul su, n acest fel se poate msura adncimea sau
grosimea detaliilor de studiat.

Partea optic a microscopului sau sistemele optice sunt reprezentate de


sistemele oculare i sistemele obiective.
Ocularele sunt formate dintr-un sistem de lentile cuprinse ntr-o armtur
metalic, tubular, care se introduc la partea superioar a tuburilor microscopului.
Ele reprezint partea la care se privete cu ochii n microscop. Pe partea metalic
se nscrie puterea de mrire a ocularului respectiv, adic de cte ori mrete acel
ocular imaginea dat de ctre obiectiv (ex. 5x, 10x, 15x.).
Obiectivele reprezint partea cea mai important a microscopului. Ele sunt
formate dintr-un sistem de lentile cuprinse ntr-o armtur metalic ce se
nurubeaz ntr-unul din orificiile plcii inferioare a revolverului. Lentila
inferioar a obiectivului poart denumirea de lentila frontal iar distana dintre
aceasta i obiectul de cercetat poart numele de distan frontal. Aceast distan
este cu att mai mic cu ct puterea de mrire a obiectivului este mai mare. Pe
obiectiv este marcat seria, puterea de mrire (4x, 6x, 10x, 20x, 40x, 100x) i
apertura numeric.
Puterea de mrire a microscopului (K) este dat de produsul dintre puterea
de mrire a obiectivului (n.ob.) i puterea de mrire a ocularului (n.oc.)
K = n.ob x n.oc.
(de exemplu, la un obiectiv de 40x i un ocular de 15x, puterea de mrire a
microscopului va fi de 600 de ori).
Aparatul de transmis lumina este situat sub msua microscopului i este
format din oglind, condensator i diafragm.
Oglinda are o form rotund i este mobil n jurul a dou axe (vertical i
orizontal). Oglinda se fixeaz ntr-un orificiu circular din talpa microscopului
printr-un disc. Oglinda prezint o fa plan i una concav. Faa plan se folosete
cnd sursa de lumin este de intensitate mare, iar faa concav, cnd sursa de
lumin este de intensitate sczut.
Diafragma (16) este compus din mai multe plcue metalice, semilunare,
care circumscriu un orificiu al crui diametru poate s fie mrit sau micorat cu
ajutorul unei mici mante situat lateral, care apropie sau ndeprteaz plcuele

semilunare ntre ele i totodat, mrete sau micoreaz diametrul fascicolului


luminos ce ptrunde spre condensator i, de aici, spre preparat i obiectiv.
Condensatorul (17) este un dispozitiv special, care are rolul de a concentra
fascicolul de lumin transmis de oglind asupra preparatului. Este format dintr-un
sistem de lentile cuprinse ntr-o armtur metalic. Distana focal a lentilei
superioare este astfel calculat nct s se afle la nivelul materialului bilogic de
studiat, atunci cnd lentila este ridicat la nivelul msuei.
Condensatorul mpreun cu diafragma se introduc ntr-un dispozitiv special,
circular, n care se fixeaz cu ajutorul unui urub situat n partea stng-fa a
piciorului. Prin ridicarea condensatorului intensitatea luminii n cmpul
microscopic crete, iar prin coborrea lui intensitatea luminii scade. Manevrarea lui
se impune la schimbarea obiectivelor, a preparatului, a intensitii luminii i se
realizeaz cu ajutorul unui urub lateral (18).
Becul cu incandescen este prevzut cu un nur a crui fi se introduce n
priza unui transformator (T) alimentat de la priza unei reele electrice de 110-220V.
Transformatorul prezint trei prize, de jos n sus corespunznd la 5, 6 i respectiv
7V. ntotdeauna fia se va introduce n priza care corespunde voltajului nscris pe
bec. Becul fixat n dispozitivul su se va introduce prin orificiul din partea
posterioar a tlpii microscopului. Pe timpul ct nu se face observarea la
microscop se va scoate transformatorul din priz.
Manipularea microscopului se face n felul urmtor. Se aduce n axul optic al
microscopului obiectivul cu puterea de mrire cea mai mic (ob. 4x, 6x sau 10x),
se privete prin oculare i se regleaz intensitatea luminii, folosindu-ne de
condensator, diafragm i de uruburile oglinzii, uruburi plasate n partea
anterioar a tlpii.
Se introduce apoi lama cu preparatul de studiat, urmrindu-se ca preparatul
(seciunea) s fie situat n centrul lentilei superioare a condensatorului. Pentru
introducerea lamei se slbete cavalerul cu arc din partea stng, apoi, dup fixarea
preparatului, se folosesc cele dou uruburi ale msuei din dreapta-spate, uruburi

10

aflate n poziie vertical (urubul superior i cel inferior), pentru a se aduce


materialul biologic n centrul lentilei superioare a condensatorului.
Folosind viza macrometric i privind din lateral, se coboar apoi tuburile
microscopului, pn ce lentila frontal a obiectivului ajunge la 0,5 cm de lamela
preparatului. Privim apoi prin oculare i ridicm tuburile microscopului, tot cu
ajutorul vizei macrometrice, pn ce ne apare imaginea preparatului n cmpul
microscopic. n momentul n care a aparut imaginea, se va aciona numai cu
urubul micrometric, pe care l nvrtim ntr-un sens sau n altul pn ce imaginea
devine clar. Aceast manevr se numete punerea la punct a microscopului.
Se indic manevrarea continu a vizei micrometrice pentru explorarea
tuturor detaliilor i planurilor preparatului i pentru a evita obosirea ochiului.
n continuare, pentru studiul unor detalii structurale, este necesar o mrire
mai puternic. Pentru aceasta, dup punerea la punct a microscopului, manevr
efectuat cu obiectivul cu puterea de mrire cea mai mic, se rsucete revolverul
i se aduce n axul optic al microscopului obiectivul cu puterea de mrire imediat
superioar (de la 10x se va trece la ob. 20x, apoi la 40x). Punerea la punct a
microscopului, cnd se lucreaz cu obiective care au putere mare de mrire, se face
numai prin simpla manevrare a vizei micrometrice. Manevrarea microscopului cu
viza macrometric ar duce la spargerea preparatului i deteriorarea lentilei frontale
a obiectivelor. Este necesar reglarea intensitii luminii, n funcie de natura
preparatului, transparena acestuia, obiectivul folosit. Acest lucru se face prin
mrirea sau micorarea irisului diafragmei, prin ridicarea sau coborrea
condensatorului.
Observarea la microscopul binocular se face obligatoriu cu ambii ochi, dup
ce ocularele au fost reglate dup distana pupilar a observatorului i, se poate face,
o schi pe o coal de hrtie, plasat n partea dreapt a acestuia.
Microscopul trebuie pstrat n perfect stare de curenie, ferit de praf, de
umiditate, de contactul cu vaporii de acizi, baze, solveni organici. Se recomand
ca pe timpul ct nu este ntrebuinat, s fie pstrat n cutia proprie, sau s fie
acoperit fie cu un clopot de sticl, fie cu o hus din material plastic.

11

Lentilele frontale se vor terge numai cu o pnz moale (finet) sau piele de
cprioar. Se va evita venirea n contact a lentilelor frontale cu suprafaa
preparatului microscopic.
n cazul pstrrii microscopului n cutia sa, nainte de scoaterea acestuia, se
va examina poziia pe care o are, pentru a fi introdus la fel, dup utilizare. Nu se va
fora introducerea microscopului n cutie. Introducerea se va face numai dup ce sa verificat dac msua este adus n poziie normal, dac este adus obiectivul cu
puterea de mrire cea mai mic n axul optic i dac este cobort coloana n
poziia inferioar.
La sfritul observaiei la microscop, dup ce a fost extras preparatul, se vor
terge cu o bucat de finet, eventualele picturi de ap, reactivi, resturi animale sau
vegetale .a., rmase pe platina microscopului.
Ca o regul, pentru scoaterea microscopului din cutie i transportul acestuia
se recomand a se prinde cu mna dreapt de coloan i cu mna stng se sprijin
talpa microscopului. n timpul transportului se va evita lovirea prilor componente
de alte obiecte i se va evita rsturnarea lui. Nu se vor demonta piesele
microscopului i nici nu se vor schimba cu cele de la alte microscoape.
Microscopul cu contrast de faz permite studiul preparatelor microscopice
fr nici un artificiu de culoare. n biologie, cele mai multe preparate microscopice
sunt att de uniform transparente, nct structurile lor rmn invizibile, cu
microscopul optic, dac nu le colorm. innd seama de artefactele de structur
care apar n urma fixrii i colorrii materialului biologic, importana unui
asemenea mijloc de investigaie este evident. ntruct, prin microscopia n
contrast de faz, fixarea prealabil a preparatului nu mai este necesar, se pot
urmri direct, sub obiectivul microscopului, procese vitale n desfurare.
Microscopul cu lumin polarizat permite efectuarea unor cercetri asupra
structurii interne a materiei, reprezentnd o variant a microscopului optic, care n
locul luminii normale utilizeaz lumina polarizat. Fenomenul de polarizare a
luminii se realizeaz cu ajutorul unor dispozitive (cristali de spath de Islanda de
form prismatic), numite nicoli sau polaroide. Unul dintre nicoli, numit

12

polarizator, se aeaz n susintorul diafragmului i condensatorului iar cellalt,


numit analizator, ntre obiectiv i ocular. Lumina polarizat se deosebete de
lumina normal prin faptul c vibraiile sale se efectueaz ntr-un singur plan, fa
de prima la care vibraiile se propag sub form de unde transversale n toate
direciile. Cu ajutorul acestui microscop s-au obinut date foarte preioase despre
constituenii cloroplastelor, despre structura cristalin a granulelor de amidon, a
fusului de diviziune, a proteinelor fibrilare. Constituenii celulari birefrigeni
(cristalizai) devin strlucitori, ceea ce indic faptul c ei au fost polarizai de
lumina care i traverseaz.
Microscopul cu fluorescen se bazeaz pe proprietatea pe care o au o serie
de substane de a deveni luminoase (luminescente) n cazul n care sunt traversate
de un flux de raze invizibile, cu lungimea de und scurt (violete, ultraviolete,
rntgen). La nceput s-a observat doar fluorescena proprie, la raze ultraviolete, a
anumitor esuturi animale i vegetale. Ulterior, s-au utilizat lichide florescente
numite fluorocromi, pentru colorarea preparatelor i studiul lor n ultraviolet. Cei
mai buni fluorocromi s-au dovedit a fi substanele naturale, clorofila, berberina,
chinina. Coloranii fluorocromici se fixeaz selectiv pe diverse structuri celulare
fa de care au afinitate i sub aciunea radiaiilor ultraviolete devin fluoresceni,
evideniind structurile pe care se fixeaz. De exemplu, galbenul de tiazol G
coloreaz citoplasma, sulfatul de berberin nucleii, colorantul acridin-orange d
ligninei din pereii celulari o fluorescen roie, acidului ribonucleic din citoplasm
i

nucleolului

fluorescen

de

culoare

roz-crmizie

iar

acidului

dezoxiribonucleic din nucleu una galben-verzuie. Preparatele la microscopul cu


fluorescen apar luminescente pe un fond ntunecat.
Microscopul electronic utilizeaz fascicule de electroni dirijate de un
sistem de lentile electromagnetice, ca mijloc de iluminare a preparatului, spre
deosebire de cel optic care folosete fotoni (radiaii luminoase vizibile). Cele mai
performante microscoape electronice au o putere de mrire de 800 000 ori.
Asemenea performane au permis biologilor s studieze materia la nivel celular,
molecular i atomic, dezvoltndu-se tot mai mult Biologia celular i molecular.

13

Centrifuga este un aparat indispensabil oricrui laborator, fiind utilizat la


separarea diferitelor componente biologice (snge, urin, extract vegetal etc.). n
laboratoare se folosesc mai multe tipuri de centrifugi: centrifuga electric obinuit
care poate ajunge pn la 3000-6000 rotaii/minut, centrifuga cu rcire, ajunge
pn la 15000 r/m (pentru fracionarea celular, la aceast turaie, se depun n
sediment, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), ultracentrifuga care are turaii de
peste 24000 r/m.i care este utilizat pentru separarea altor fracii subcelulare (se
depun n sediment membrane plasmatice, ribozomi). Indiferent de gradul de
perfecionare a centrifugii, nainte de utilizare trebuie s fie echilibrate cuvele.
Centrifuga se pune n micare numai dup o verificare strict a nchiderii corpului
cu eprubete, mrind progresiv viteza ei de rotaie. Dup terminarea centrifugrii se
ateapt oprirea definitiv, pentru evitarea accidentelor posibile.
Fora centrifug relativ (g), care exprim de cte ori este depit gravitaia,
se calculeaz dup formula:
g = 1,118 x 10-5 x R x N
R = raza centrifugei n cm ( distana de la centrul axului la vrful tubului de
centrifug)
N = numrul de rotaii/minut
Balanele sunt utilizate pentru cntrirea materialului biologic i a
substanelor chimice necesare pentru prepararea coloranilor i reactivilor. Dup
sensibilitate, se mpart n: balane farmaceutice i balane analitice.
Balana farmaceutic este format dintr-o prghie, suspendat la mijloc pe
un arc fixat ntr-un suport de lemn, are un dispozitiv automat de oprire i un ac
indicator care oscileaz n faa unui cadran gradat, ac care se oprete n mijlocul
cadranului atunci cnd balana este echilibrat. La capetele prghiei sunt
suspendate dou talere. Manevrnd dispozitivul automat, balana se pune n
funciune sau se oprete, punerea n funciune fiind o operaie care se execut
numai dup ncrcarea unui taler cu greuti i a celuilalt cu substana de cntrit.
Echilibrarea se realizeaz prin adugare sau luare de substan, dar ntotdeauna
oprind nainte balana, utiliznd dispozitivul automat, apoi repunnd-o n

14

funciune. Pentru cntriri se utilizeaz greuti inute n trusa original; greutile


se manipuleaz cu ajutorul unei pense.
Balana analitic are o sensibilitate care ajunge pn la 0,01 mg i se
utilizeaz la cntriri foarte, foarte precise. Trebuie s fie protejat de vibraii,
lumin solar direct, gaze i de vaporii care se degaj n laborator. Cntrirea la
balana analitic se realizeaz cu ajutorul sticlelor de ceas i a fiolelor de cntrire,
crora n prealabil li se stabilete greutatea.
Etuva este un aparat care se poate regla pentru obinerea unor temperaturi
dorite. n interiorul ei temperatura se menine constant datorit pereilor dubli cu
izolare adecvat. Poate fi utilizat

pentru sterilizarea instrumentarului i a

sticlriei, pentru uscarea materialului biologic dar i pentru incubare, la unele


analize.
Frigiderul, aparat foarte util pentru laboratoare, este necesar pstrrii
materialului biologic i a unor reactivi la temperaturi de +4C sau de congelare,
sub 0C. Trebuie ngrijit cu atenie, nelsndu-se ua deschis mai mult dect este
necesar i curndu-se cel puin o dat pe lun.
Agitatorul, mecanic, electric sau magnetic, este un aparat utilizat pentru
agitarea unor cantiti ce variaz pn la circa 500 ml de amestec. Aparatul este
alctuit dintr-o plit i din vasul cu material biologic, care conine unul sau mai
multe agitatoare.
Colorimetrul i spectrofotometrul sunt aparate la care funcionarea se
bazeaz pe transformarea fluxului luminos n radiaii monocromatice, prin
intermediul unei prisme sau a unei reele de difracie. Sensibilitatea determinrilor
colorimetrice se mrete cu ajutorul unor filtre de lumin, care las s treac prin
ele numai radiaiile de o anumit lungime de und.
pH-metrul este un aparat electronic de precizie, folosit pentru determinarea
pH-ului soluiilor n laboratoare, determinare efectuat cu ajutorul unor electrozi
de sticl. Electrodul de sticl face parte din clasa electrozilor cu membran. Se
utilizeaz la msurarea pH-ului pentru c potenialul care apare la interfaa soluiemembran de sticl este n funcie de activitatea ionilor de hidrogen din soluie.

15

Electrodul de sticl este format dintr-o membran de sticl cu o compoziie


special iar n interior o soluie tampon cu pH constant i un electrod de referin.
Dup natura materialului din care sunt confecionate, ustensilele se pot
mpri n: de fier, de lemn, de sticl, de porelan, de mase plastice i diverse. n
laboratorul de citologie sunt necesare urmtoarele ustensile: foarfece, bricege,
bisturie, pense, linguri, spatule, ace ascuite i spatulate, pipete, cutii Petri, sticle de
ceas, cristalizoare, eprubete simple, gradate, de centrifug, plnii de sticl de
diferite mrimi, baghete de sticl, pahare Berzelius, baloane cu fund plat i rotund,
balon cotat, pahare Erlenmeyer, cilindrii gradai, biurete, sticle pentru reactivi,
mojare cu pistil, germinatoare, capsule i creuzete de porelan, site de azbest,
becuri de gaz, stative de metal, cleme pentru stativele metalice, trepiede, stative
pentru eprubete, perii pentru splat. De asemenea, de strict necesitate sunt
termometrele, cronometrele, ceasurile de laborator, distilatorul etc.
Substanele chimice utilizate n timpul lucrrilor practice de citologie sunt
extrem de variate.
Fixatorii
Dintre fixatorii utilizai frecvent n laborator i care pot fi uor procurai,
menionm:
Acidul acetic
Este foarte frecvent utilizat n amestec cu alcoolul etilic, rou carmin, .a.
Acidul acetic se folosete de obicei sub urmtoarele forme: acid acetic glacial
(100%), acid acetic concentrat (96%), acid acetic diluat (1%), alcool-acid acetic
1:1, .a.
Alcoolul etilic
i bazeaz aciunea sa fixatoare pe deshidratarea esuturilor. Pentru fixare se
utilizeaz mai ales alcoolul anhidru (alcool absolut).
Fixri bune se obin numai cu material mai subire de 5 mm. Difuziunea
alcoolului etilic este rapid. Prelungirea fixrii n alcool etilic este contraindicat,
deoarece materialul devine rigid i uor casant. Materialul fixat n alcool etilic
absolut se poate pstra apoi n alcool 70-80%.

16

-bromonaftalenul
Se folosete ca prefixator n tehnica Feulgen, dup urmtoarea reet:
ap distilat ..75 ml
-bromonaftalen ..25 g.
Se agit bine cele dou cele dou substane ntr-un borcan cu dop rodat, se
las apoi s se decanteze. Dup aceea, cu ajutorul unei pipete se scot 2-3 ml de
soluie i se pun n fiole de sticl (5 cm/10 mm). n aceste fiole cu soluie de bromonaftalen se introduc vrfurile vegetative meristematice ale rdcinilor i se
las 3-5 ore.
Formolul
Reprezint o soluie de 30-40% formaldehid n ap. n mod obinuit soluia
conine cantiti mici de acid formic. Se recomand pstrarea formolului n sticle
de culoare nchis, la o temperatur de peste 9C, deoarece la temperaturi sczute
precipit. Formolul se ntrebuineaz la conservarea unor organe animale, a
organelor vegetale sau o unor plante ntregi n proporie de 1:9 (o parte formol de
30-40% i 9 pri ap), precum i la prepararea unor fixatori.
Fixatorul Carnoy
Se utilizeaz n dou variante, dup urmtoarele reete:
a) acid acetic glacial 5 ml
alcool etilic absolut 15 ml.
b) alcool etilic absolut .6 ml
acid acetic glacial 1 ml
cloroform 3 ml.
Fixatorul Navain
Este destul de frecvent folosit n cariologie i embriologie. Reprezint, de
fapt, un amestec de dou soluii (A+B).
Soluia A
acid cromic ...2 g
acid acetic glacial 20 ml

17

ap distilat 130 ml.


Soluia B
aldehid formic ..37 ml
ap distilat 113 ml.
Soluiile A i B se pstreaz n sticle de culoare brun i se amestec n
momentul folosirii n proporie de 1:1.
Colorani i reactivi
Coloranii sunt substane care transmit culoarea lor specific diferiilor
constitueni ai celulelor, pe baza afinitii lor de adsorbie, iar reactivii sunt
substane chimice care au proprietatea de a reaciona n mod specific n contact cu
materialul biologic. Pentru prepararea reactivilor se vor folosi substane chimice
pure, care se vor dizolva numai n ap distilat. Reactivii care nu se altereaz se
vor pregti n prealabil n cantitate suficient i se vor psta n flacoane bine
nchise, la ntuneric i dup caz, la frigider.
Colorani, reactivi i reetele dup care se prepar:
Albastru de metilen
Poate fi folosit ca un colorant nuclear n soluie apoas 1%. Colorarea
dureaz 1 minut. Nucleele se coloreaz n albastru. Albastru de metilen se
utilizeaz n special n coloraiile vitale. Se prepar dup urmtoarea reet:
albastru de metilen .1 g
alaun de potasiu 10 g
ap distilat .100 ml.
Carminul acetic
Este folosit la evidenierea cromozomilor, care se coloreaz n rou, dup o
fixare prealabil n Carnoy:
acid acetic glacial 45 ml
ap distilat .55 ml
carmin ..0,5 g.

18

Se fierb toate componentele, timp de 40-60 minute, la flacr mic, ntr-un


balon cu sistem de rcire, dup care se filtreaz i se pstreaz n sticle cu dop
rodat.
Clorura de zinc iodat
Se prepar o soluie galben-brun, ordinea n care se dizolv substanele este
urmtoarea:
Var. I

Var. II

clorur de zinc ..50 g

2g

iodur de potasiu ..16 g

6g

iod metalic cristale .3 g

1,3 g

ap distilat .17 ml

10,5 ml.

Pereii celulari celulozici se coloreaz n albastru-violet sau n violet-lila iar


cei lignificai, suberificai i cutinizai se coloreaz n galben-brun.
Floroglucina
Este specific pentru pereii celulari lignificai, pe care i coloreaz n rouviiniu. Se utilizeaz dup urmtoarea reet:
floroglucin ..2 g
alcool etilic 96-100% ..100 ml.
Fluoroglucina astfel pregtit, nainte de a se pune peste seciuni, se
amestec cu acid clorhidric, n pri egale sau peste seciuni se pun 1-2 picturi de
floroglucin, se las n contact 1-5 minute, dup care se adaug 1-2 picturi de acid
clorhidric.
Fuxina diamant (fuxin bazic)
1 g fuxin diamant se dizolv n
100 ml ap clocotit. Dup rcire se adaug
10 g NaOH. Nu se filtreaz.
Se utilizeaz att pentru colorarea pereilor celulari, ct i n cadrul coloraiei
gram, bacteriile gram negative colorndu-se n rou.

19

Iod n iodur de potasiu (IIK) sau soluia Lugol


Este un colorant specific pentru amidon, pe care l coloreaz n diferite
nuane de albastru-violet.
Se prepar dup urmtoarele 5 reete, n funcie de ct de concentrat o
dorim:
I

II

III

IV

iodura de K 1 g

1g

4g

3g

6g

iod metalic crist..1 g

0,25 g.

1g

1g

4g

ap distilat 100 ml

100 ml

100 ml

100 ml

100ml

Se dizolv iodura de potasiu n civa ml de ap distilat, n aceasta se


dizolv apoi i iodul metalic. Dup completa dizolvare, se adaug apa distilat
conform reetelor. Se pstreaz n sticle brune, la ntuneric.
Reactivul Schiff
Este o soluie apoas de fuxina bazic, utilizat n reacia Feulgen, reacie
prin care se urmrete evidenierea nucleelor i a cromozomilor, care se coloreaz
n rou-violet. Se utilizeaz dup urmtoarele reete:
a)

Se dizolv la cald, 1 g fuxin bazic, n 100 ml ap distilat. Soluia


cldu se filtreaz ntr-un flacon brun cu dop lefuit. Dup rcire se
adaug 20 ml HCl normal (HCl se obine adugnd 8,3 ml HCl
concentrat cu densitatea de 1,19 n 100 ml ap distilat; respectiv 82,5
ml HCl concentrat n 1000 ml ap distilat) i 1 g metabisulfit de Na
(pirosulfat de Na), pentru analiz. Se ine 24 de ore la temperatura
camerei, la ntuneric, timp n care devine glbuie. Pentru decolorare se
adaug 0,5 g carbon vegetal, dup care se filtreaz. Dac soluia are
culoare roz, se mai adaug 1-2 g metabisulfit de Na sau se face o nou
soluie. Reeta este urmtoarea:
fuxin bazic .1 g
ap distilat 100 ml
HCl normal ..20 ml

20

metabisulfit de sodiu ..1 g.


b)

Se ia 1 g de fuxin bazic cristale, se transform n pudr i se pune


ntr-un Erlenmeyer. Peste fuxin se toarn 200 ml ap distilat la
100C, se amestec bine i se las s se rceasc pn la aproximativ
50C. Amestecul se filtreaz, dup care se adaug 30 ml acid
clorhidric normal i 3 g de metabisulfit de K (K2S2O5) sub form de
cristale (plci incolore). Soluia se trece ntr-un flacon bine nchis i se
las s se rceasc la ntuneric i la rece, timp de 24 de ore. Reeta
este urmtoarea:
fuxin bazic 1 g
ap distilat la 100C ..200 ml
HCl normal 30 ml
metabisulfit de potasiu crist. .3 g.

Ca i n cazul precedent, soluia are o culoare glbuie. Pentru decolorarea


soluiei se adaug 0,5 g crbune activ, dup care se filtreaz. Reactivul Schiff se
pstreaz la ntuneric i la rece n sticle brune, cu dop lefuit.
Roul de Congo i crizoidina (reactivul Genevez)
Este unul dintre coloranii cel mai des folosit pentru colorarea pereilor
celulari celulozici. Roul de Congo i crizoidina acioneaz simultan asupra
esuturilor vegetale, dar pot fi utilizai i separat.
Se prepar dup urmtoarea reet:
I.

a) rou de Congo ..3 g

ap distilat ..100 ml.

b) rou de Congo ..5 g

II.

ap distilat ..100 ml

amoniac 5 ml

a) crizoidin 0,10 g

alcool de 96% 10 ml

b) crizoidin ..0,5 g

21

ap distilat ..100 ml.

Soluiile I i II se fac separat. Se las n repaus 1-2 zile la temperatura


camerei pentru dizolvarea complet a substanelor. Apoi ambele soluii se amestec
n proporii egale. Dup 2-3 zile se filtreaz; colorantul obinut se pstreaz n
sticle brune.
Rou de ruteniu
Utilizat pentru colorarea n roz/rou-carmin a nveliului gelatinos la
cianobacterii i a substanelor pectice. Se utilizeaz n soluie apoas, care nu este
stabil i trebuie preparat proaspt de fiecare dat, dup urmtoarea reet:

rou de ruteniu .0,01- 0,2 g

ap distilat .100 ml, la care se mai

adaug cteva picturi de amoniac.


Rou neutru
Colorant vital des folosit n lucrrile practice. Se acumuleaz n vacuole
indicnd pH-ul sucului vacuolar, astfel:
la pH 6,6-7 d culoarea roie vie
la pH 7,2 d culoarea roiatic
la pH 7,6 d culoarea portocalie
la pH mai mare de 7,6 d culoarea galben
Se prepar soluie stoc 1 dup urmtoarea reet:
rou neutru..0,1 g
ap de robinet la 30C100 ml
nainte de utilizare se prepar soluia diluat de lucru 1/10.000 (10 ml din
soluia 1 n 90 ml ap de robinet). Materialul vegetal se introduce pentru 5
minute n aceast diluie, dup care se analizeaz la microscop ntr-o pictur din
diluia folosit.
Safranina

22

Este un colorant folosit pentru cromatina nuclear, pe care o coloreaz n


rou rubiniu. Se utilizeaz n soluie apoas sau alcoolic (alcool etilic), dup
urmtoarele reete:
a) safranin 1 g

ap distilat 100 ml.

b) safranin G. extra .10 g

ap distilat 145 ml

alcool 95% .155 ml.

Aceast soluie reprezint soluia-mam folosibil mult timp, fiind mai bun
cu ct se nvechete. Pentru colorare se amestec 20 ml din soluia-mam cu 80
cm3 alcool 50%. Seciunile se in n aceast soluie 24 de ore, apoi se spal rapid n
ap distilat, dup care se difereniaz cu alcoolul absolut acidulat 1% cu HCl:
safranin ...0,5 g
alcool absolut 50 ml
dup 2-3 zile se adaug ap dist. ..10 ml.
Oricare ar fi forma de preparare a safraninei, seciunile se in n soluia de
safranin timp de 24 de ore, pn la cteva zile, apoi se spal rapid n ap distilat
i se difereniaz att ct dorim, folosind alcool absolut sau alcool 95%.
Diferenierea se face mai rapid cu alcool acidulat (0,1-0,01 HCl pentru 100 ml
alcool), apoi se deshidrateaz cu alcool absolut, se clarific cu esen de cuioare i
se monteaz cu balsam de Canada. Un rezultat bun d n cazul fixrii materialului
n lichide fixatoare cu crom sau osmiu.
Soluia Giemsa
Realizeaz colorarea n rou a nucleilor celulari. Se poate obine soluie stoc
de la diferite firme specializate sau se poate prepara dup urmtoarea reet:
colorant Giemsa (Azure-Eosine-Methylene blue)....1,52 g
glicerin anhidr, se dizolv prin mojarare ..100 ml
alcool metilic absolut 100 ml

23

Amestecul se las n repaus 24 ore, apoi se filtreaz. Se folosete n


concentraie de 5-10% (preparat proaspt n momentul folosirii) n ap distilat
neutr sau n tampon fosfat neutru (pH 7,2).

Soluia May-Grnwald
Utilizat la prepararea frotiurilor sanguine, reprezint o combinaie de
fixator i colorant, fiind format din soluie saturat de metilene blue-eozinat, n
metanol. Colorantul se prepar conform reetei lui Jenner dup cum urmeaz:
soluie apoas 1,25 % eozin
soluie apoas 1% metilene blue, se amestec n pri egale.
Se filtreaz dup 24 de ore amestecul de soluii, iar pulberea rmas pe filtru
se usuc i se dizolv n 200 ml de alcool metilic absolut.
Sudan III
Se utilizeaz sub form de soluie alcoolic, dup urmtoarele reete:
a) Sudan III 0,2-0,3 g

alcool etilic cald 70-80% ...100 ml.

b) Sudan III ..0,1 g

alcool etilic 70-80% .10 ml

glicerin pur 10 ml.

Substanele se agit de cteva ori, dup care se pun n termostat la 60-65C,


unde se in cteva ore. Dup rcire se filtreaz, apoi soluia se poate folosi la
identificarea pereilor suberificai, a rinei, cutinei, grsimilor, pe care le
coloreaz n rou. Se pstreaz n flacoane nchise.
Verdele de iod
Se folosete n soluie apoas, dup urmtoarea reet:
verde de iod 1 g
acid acetic glacial 3-4 ml

24

ap distilat .100 ml
timol .cteva cristale.
Seciunile se javelizeaz, se spal n ap acidulat, apoi se coloreaz cteva
secunde cu verde de iod, dup care se trec n alcool 90% (pentru oprirea coloraiei
i ndeprtarea excesului de colorant din esuturi). Pereii celulari lignificai se
coloreaz n verde.
Verdele Janus
Colorant vital, care realizeaz colorarea mitocondriilor n verde. Se prepar
dup urmtoarea reet:
Soluia de baz (1)

verde Janus ..0,1 g

ap de robinet ..10ml

Soluia de lucru (1/10.000)

soluia de baz0,1ml

ap de robinet 10 ml

Violetul de genian
Se folosete sub form de soluie apoas. Violetul de genian se poate
dizolva i n alcool etilic sau glicerin. Reeta este urmtoarea:
violet de genian 1 g
ap distilat ..100 ml.
Varianta cu fenol este cunoscut sub denumirea de violet de Geniana fenicat
i se prepar dup urmtoarea reet:
violet de genian 5 g se dizolv n
100 ml alcool 70% i se realizeaz o soluie de baz.
Din soluia de baz se fac soluii de lucru astfel:
10 ml soluie de baz nefiltrat se dilueaz cu
90 ml ap distilat i se adaug apoi
5 g fenol cristalizat. nainte de utilizarea se filtreaz.

25

Leucoplastele se coloreaz n violet intens, pereii celulari i nucleele se


coloreaz n violet slab, iar varianta cu fenol (violet de genian fenicat) se
folosete pentru colorarea bacteriilor, bacteriile gram pozitive colorndu-se n
violet.
Sistemele tampon sunt amestecuri care asigur un anumit pH, care se
menine constant.
Tamponul fosfat dup Srensen, molaritate constant 66,7 mM, pentru pH 5
8,2.
Soluii necesare:
A - fosfat monopotasic 66,7 mM (se usuc fosfatul la 110C, apoi se
cntresc 9,8 g KH2PO4 i se dizolv pn la 1000 ml n ap bidistilat)
B - fosfat disodic 66,7 mM (sarea anhidr se usuc 1-2 ore la 110C, apoi se
cntresc 9,479 g Na2HPO4 i se dizolv n ap bidistilat adus la 1000 ml)
Se amestec din sol. A i B conform tabelului nr. 1
Tabel nr.1
pH
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
7,8
8,0
8,2

Sol. A (ml)
98,8
98,0
96,7
94,8
91,9
87,7
81,5
73,2
62,7
50,8
39,2
28,5
19,6
13,2
8,6
5,5
3,3

26

Sol. B (ml)
1,2
2,0
3,3
5,2
8,1
12,3
18,5
26,8
37,3
49,2
60,8
71,5
80,4
86,0
91,4
94,5
96,7

Tamponul fosfat de Na, molaritate constant 0,2 M, pentru pH 5,3 8, se


prepar conform tabelului nr.2.
Soluii necesare:
A - fosfat disodic 0,2M (sarea anhidr se usuc 1-2 ore la 110C, apoi se
cntresc 5,36g Na2HPO4 i se dizolv n ap bidistilat adus la 1000 ml)
B - fosfat monosodic 0,2M (se usuc fosfatul la 110C, apoi se cntresc
2,76 g NaH2PO4 i se dizolv pn la 1000 ml n ap bidistilat).

Tabel nr.2
pH
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6,0
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
8,0

Sol A (ml)
2,6
3,2
4,0
5,1
5,4
8,0
9,9
12,3
15,1
18,7
22,5
26,7
31,7
37,5
43,3
49,1
55,1
61,1
66,6
72,0
76,8
80,8
84,1
87,0
89,4
91,5
93,2
94,7

Sol B (ml)
97,5
96,8
96,0
94,9
93,6
92,0
90,1
87,7
84,9
81,4
77,6
73,3
68,3
62,5
56,7
50,9
44,9
38,9
33,4
28,0
23,2
19,2
15,9
13,0
10,6
8,5
6,8
5,3

Tamponul Tris-HCl, molaritate constant 0,1 M, pentru pH 7,19 - 7,77.

27

n 25 ml de ap distilat se introduc 0,6 g Tris, se adaug conform tabelului


nr.3 un anumit numr de ml de HCl 0,1 N, n funcie de pH-ul pe care dorim s-l
obinem i se completeaz pn la 100 ml, cu ap distilat.
Tabel nr.3
pH
7,19
7,36
7,40
7,54
7,66
7,77

HCl 0,1 N (ml)


45,0
42,5
42,0
40,0
37,5
35

Tamponul Tris-Maleat 0,2 M, pentru pH 5,8 8,2


Se prepar Soluia stoc: 29g acid maleic, 30,3g Tris, 2g crbune activ, se
dizolv n 500 ml ap distilat, se agit pentru o mai bun dizolvare i se filtreaz.
Se amestec 40 ml din Soluia stoc cu un anumit numr de ml de NaOH 4%,
n funcie de pH-ul pe care dorim s-l obinem, i se completeaz pn la 100 ml
cu ap distilat, conform urmtorului tabelului nr.4
Tabel nr.4
pH
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
7,8
8,0
8,2

NaOH 4% (ml)
9
10,5
13,0
15,0
16,5
18,0
19,0
20,0
21,5
22,5
24,2
26,0
29,0

Tamponul acetat, molaritate constant 0,2 M, pentru pH


prepar conform tabelului nr.5.

28

3,6 5,6, se

Soluii necesare:
A - soluie acid acetic 0,2 M (acid acetic 11,55 g se dizolv n ap bidistilat
adus la 1000 ml)
B - soluie acetat de Na 0,2 M (sarea se usuc la 110C, apoi se cntresc
16,4g i se dizolv pn la 1000 ml n ap bidistilat).

Tabel nr.5
pH
3,6
3,8
4,0
4,2
4,4
4,6
4,8
5,0
5,2
5,4
5,6

Sol A (ml)
92,5
88,0
82,0
73,5
63,0
51,0
40,0
29,5
21,0
14,5
9,5

Sol B (ml)
7,5
12,0
18,0
26,5
37,0
49,0
60,0
70,5
79,0
85,5
90,5

Alte sisteme tampon se prepar ntr-un mod similar.

1.2. Metode de investigare a universului celular


Microscopia optic
Pentru efectuarea preparatelor microscopice din fragmentele de organe
vegetale, sunt necesare mai multe instrumente, care reprezint trusa de
microscopie. Instrumentarul minim pretins pentru efectuarea acestor preparate
cuprinde: briciul, foarfeca, pensa, acul simplu i acul spatulat, bisturiul iar, ca
sticlrie de laborator: cristalizorul, sticla de ceas, lama i lamela.

29

Briciul (1) are o suprafa plan, care se aplic pe suprafaa de secionat i o


suprafa scobit, pe care se adun seciunile. Pentru materialele vegetale rigide se
folosesc brice cu lam ngust iar pentru cele moi brice cu lam lat. Pentru
ascuirea lamei briciului se utilizeaz o curea din piele de bovin, fin i bine
ntins pe un suport.
Foarfeca (2) se utilizeaz pentru tierea organelor vegetale, pentru fasonarea
acestora n vederea secionrii.

Pensa (3) poate fi cu vrful curbat sau drept. Pensele trebuie s fie ascuite i
nguste la capete, perfect superpozabile i s fie uor de manipulat. Pensa se
folosete pentru manipularea i transportul seciunilor n cristalizor, sticl de ceas
i pe lama port-obiect. Se recomand pensa cu vrful curbat.
Acul simplu (4) prezint vrful ascuit i servete la detaarea i dislocarea
hifelor de ciuperci, filamentelor de alge, iar acul spatulat (5) prezint vrful lit de

30

form triunghiular sau romboidal i servete la plasarea seciunilor pe lam,


transportul gruncioarelelor de amidon, sporilor, polenului, la detaarea unor
formaiuni epidermice, ca de ex.: peri, pentru extragerea unor seciuni din
colorani.
Bisturiul (6) servete pentru curarea organelor vegetale i mai ales pentru
fragmentarea i fasonarea celor rigide n vederea secionrii.
Cristalizorul (1) servete pentru recoltarea, n ap, a seciunilor efectuate cu
briciul. Se recomand ca acesta s fie plasat pe un fond negru, pentru seciunile
necolorate i pe un fond alb, pentru seciunile colorate, pentru a avea, prin contrast,
o mai bun vizibilitate n vederea seleciei celor mai fine si bune seciuni. Cele mai
indicate sunt cristalizoarele cu diametrul de 5 sau 8 cm.

- Cristalizorul(1)
- Sticla de ceas (2)
- Lama i lamelele(3)
Sticla de ceas (2) este necesar pentru efectuarea coloraiei seciunilor. Se
recomand cele cu diametrul de 5 sau 8 cm.
Lama port-obiect (3) din sticl de 1-2 mm grosime, 7,5 cm lungime (dup
care se regleaz i distana dintre cavaleri) i 2,5 cm lime, are o form
dreptunghiular i servete pentru efectuarea preparatelor microscopice, n vederea
examinrii lor la microscop.

31

Lamelele (4) sunt confecionate din sticl foarte subire i de bun calitate,
au o form ptrat de 2 x 2 cm i servesc la acoperirea seciunilor sau a altor tipuri
de preparate, pe lam.
Preparatele microscopice pregtite n vederea examinrii la microscopul
optic, n cadrul lucrrilor practice de citologie, pot s fie proaspete (provizorii) sau
permanente (durabile).
Un preparat din fragmente de organe vegetale poate fi obinut fr a fi
necesare operaii speciale, prin simpla rzuire, macerare, jupuire sau secionare a
acestora. Uneori, este necesar efectuarea unor operaiuni ca: fixarea, colorarea, iar
pentru obinerea preparatelor permanente i deshidratarea, lutarea.
Fixarea este operaiunea prin care se pstreaz forma i structura elementelor
anatomice ale materialului de cercetat. Prin fixare se nelege operaia prin care se
opresc instantaneu procesele vitale ale unui esut sau complex de esuturi, omornd
celulele fr a determina apariia unor structuri secundare sau artefacte. n acest
scop se folosesc lichide fixatoare simple sau n amestec. Se recomand ca voluml
fixatorului s fie de 20-40 de ori mai mare dect al fragmentului de esut pe care
urmeaz s-l fixm. Fixarea este un fenomen progresiv; esuturile profunde sunt
fixate mai trziu dect cele superficiale. Pentru o bun fixare se recomand, n
general, cca 24 de ore. Temperatura la care se face fixarea are o deosebit
importan. Fixarea la frigider prezint unele avantaje pentru fixatorii cu penetraie
lent, sau cnd obiectele de fixat sunt foarte mari. De obicei fixarea se face la
temperatura camerei, fragmentele trebuie s fie de dimensiuni mici, pentru ca
fixatorul s ptrund repede i celulele s nu moar nainte de a veni n contact cu
el.
Secionarea se poate efectua n dou moduri:
1.- cu briciul sau cu lama de ras
2.- cu microtomul de mn, care este un aparat cu care se efectueaz
seciuni fine i uniforme, de o anumit grosime.
Fragmentele de organe se pot fixa singure la microtom (dac au o
consisten corespunztoare ) sau cuprinse ntre dou jumti ale unei buci de

32

mduv de soc (dac sunt moi sau sunt de dimensiuni mici). Cele mai bune
seciuni se obin prin includerea prealabil a fragmentelor n parafin.
Pentru secionarea cu briciul sau cu lama de ras, organele vegetale sunt tiate
n prealabil n fragmente de 1-3 cm, dac secionarea se face transversal, i de 5-7
mm, dac secionarea se face longitudinal, fragmente pe care apoi le introducem
ntre dou jumti ale unei buci de mduv de soc. Organele vegetale lignificate
se secioneaz liber, fr a fi introduse n mduva de soc. Bucata de mduv de
soc folosit, se taie longitudinal, n dou jumti, cu ajutorul unei lame sau a unui
cuit. Dac secionarea se face transversal, se formeaz un jgheab n fiecare
jumtate a mduvei de soc i se aeaz fragmentul de organ aici, n sens
longitudinal, se ine n mna stng fr al presa, n timp ce cu mna dreapt se
ncepe secionarea. Pentru obinerea de seciuni foarte subiri i transparente, este
necesar s aezm lama briciului pe suprafaa mduvei de soc, executnd micri
uoare de lunecare cu briciul. Micarea trebuie s fie uniform i nentrerupt,
nainte i ctre sine, revenind mereu. Secionarea se face deasupra unui
cristalizator cu ap, n care se colecteaz seciunile. Trebuie s se evite ca lama
briciului s scape mai adnc n mduv, fiecare seciune trebuie luat cu o singur
micare a briciului, n caz contrar seciunile vor avea o suprafa neegal, avnd
grosimi diferite n diverse puncte. De asemenea, nu este nevoie ca seciunile s fie
mari, cu ct sunt mai mici cu att sunt mai multe anse s fie reuite. De aceea, nu
este nevoie s lum seciuni pornind chiar de la marginea mduvei de soc. Dup ce
am terminat de secionat, briciul se terge cu o crp curat i uscat, dup care se
nchide. Seciunile cele mai subiri i transparente, abia vizibile, se aleg din
cristalizorul cu ap, cu ajutorul unui ac spatulat.
Pregtim o lam foarte curat, alegem o seciune dintre cele mai fine
(subiri) pe care o aezm n mijlocul lamei, n pictura de ap sau n alt lichid n
care dorim s o examinm. Acoperim pictura de lichid de pe lam, n care se afl
seciunea, cu o lamel. Pentru a aeza lamela pe lama port-obiect, lamela se ine de
dou laturi opuse, sprijinind-o pe lam cu una din margini, astfel nct s fie
nclinat pe pictura de lichid (mediul de montaj). Lsm apoi lamela s cad, din

33

unghi de 45, acoperind seciunea. Verificm dac avem suficient lichid sub
lamel. La nevoie se mai adaug o pictur din lichidul de montaj, la marginea
lamelei, pictura ptrunznd sub lamel prin capilaritate. Dac, din contr, avem
un exces de lichid, l absorbim cu ajutorul unei fii nguste de hrtie de filtru,
aplicat la marginea lamelei.
Dup ntrebuinare, lamele i lamelele se spal de mai multe ori cu ap cald
i dac este nevoie se cur cu alcool etilic. Pentru a fi utilizate, se terg cu o crp
curat i moale, prinzndu-se lamele i lamelele ntr-o ndoitur a pnzei i
tergndu-se prin micri de rotire, fr s fie apsate.
Colorarea este operaiunea prin care anumite substane colorante transmit
culoarea lor specific diferiilor constitueni ai materialelor biologice, animale sau
vegetale, pe baza afinitii de adsorbie n cazul colorantului sau de reacie n cazul
reactivului.
Coloraia vital permite examinarea preparatelor n stare proaspt, vie.
Substanele colorante care se utilizeaz (de exemplu, rou neutru pentru colorarea
selectiv a vacuomului, verdele Janus pentru mitocondrii, albastru de Nil pentru
aparatul Golgi, albastru Alcian pentru lizozomi, rodamina G pentru cloroplaste,
albastru de metilen pentru nucleu), trebuie s nu fie toxice pentru celule i s
coloreze n diluii mari.
Colorarea este precedat uneori de o clarificare a seciunilor. Pentru
clarificare se folosete hipocloritul de potasiu (ap de Javel), sub aciunea cruia
coninutul celular se dizolv i dispare. Clarificarea este util atunci cnd se
studiaz natura pereilor celulari i nu a coninutului viu al celulelor, care este
distrus sub aciunea apei de Javel. Sub aciunea clarificatorului, seciunile se
decoloreaz i devin mult mai transparente. Se spal apoi seciunile, de 2-3 ori cu
ap distilat i dup aceea cu ap acidulat (ap distilat i 2-3 picturi de acid
acetic 1%), pentru a ndeprta orice urm de hipoclorit, care poate provoca
formarea unui precipitat sau s mpiedice colorarea seciunilor.
Pentru colorare, se introduc seciunile (sau alte tipuri de fragmente de
material biologic) ntr-o sticl de ceas, peste ele se pune colorantul sau reactivul

34

necesar, meninndu-se o durat de timp ce variaz n funcie de colorantul sau


reactivul respectiv.
Seciunile astfel colorate se spal cu ap distilat, de attea ori pn cnd apa
rmne limpede iar seciunile colorate. Cu ajutorul unei pense sau a unui ac
spatulat se aeaz seciunile pe lama port-obiect, ntr-un mediu lichid (ap sau
glicerin) i se acoper cu o lamel, care mpiedic, pe de o parte, evaporarea
mediului lichid i, pe de alt parte, atingerea lentilei frontale a obiectivului.
Un astfel de preparat microscopic este provizoriu, puin durabil, mediul de
includere (montare) cel mai frecvent folosit fiind apa de robinet. Dup un oarecare
timp se usuc, se decoloreaz i nu mai prezint valoare tiinific.
Montarea presupune i efectuarea de preparate durabile (permanente),
folosind ca mediu de includere (montare): glicerina, glicerina gelatinat sau
balsamul de Canada.
Glicerina este un lichid siropos, dulce, higroscopic, solubil n ap, n alcool,
n eter, insolubil n benzen, cloroform, etc. Datorit indicelui de refracie mai mic
dect al balsamului de Canada, se folosete ca mediu de includere al materialelor
vegetale. Inconvenientul folosirii glicerinei este c decoloreaz preparatele tratate
cu colorani carminai, hematoxilin etc. Pentru evitarea acestui neajuns, glicerina
se aciduleaz cu acid formic sau acid acetic 1%. Preparatele montate n glicerin se
luteaz.
Ca mediu de montare, glicerina se folosete de obicei n soluie apoas, dup
urmtoarea reet:
glicerin pur ..3 pri
ap distilat .1 parte.
Glicerina gelatinat reprezint un mediu foarte des utilizat n laborator,
pentru includerea diferitelor materiale botanice de studiu. Glicerina gelatinat se
prepar n felul urmtor: se taie n buci mici 10 g foi de gelatin alb i se las n
70 cm3 de ap distilat timp de 2 ore, apoi se fierb ntr-o baie de ap, n care
amestecm cu o baghet de sticl. Dup ce s-a dizolvat toat gelatina, se adaug 80
cm3 glicerin pur de 30 grade i acid fenic concentrat sau timol 2 g, amestecnd

35

mereu cu bagheta. Dup fierbere, se scoate vasul din baia de ap i se filtreaz


lichidul la cald, prin vat de sticl. Lichidul obinut trebuie s fie limpede i se
pstreaz n flacoane bine nchise. Glicerina gelatinat devine astfel un mediu
solid, care prezint avantajul c numai printr-o uoar nclzire devine lichid,
permind astfel montarea seciunilor respective. Cnd seciunile respective sunt
gata pregtite pentru includere, se ia cu bagheta de sticl o pictur sau dou de
glicerin gelatinat i se aeaz pe o lam curat, apoi se aeaz lamela (cu ajutorul
unei pensete, dup ce a fost nclzit uor pe placa de nclzit ) deasupra picturii
de glicerin gelatinat.
Pentru a se evita apariia bulelor de aer, sub lamel se introduce vrful
nclzit al unui ac spatulat. Apoi, se apas uor cu vrful curbat al pensetei peste
lamel, timp de 2-3 minute, pn ce gelatina se solidific.
Balsamul de Canada este o substan vscoas, de culoare galben-verzuie,
transparent, cu miros aromatic, insolubil n ap, solubil n benzen, cloroform,
xilol.
Se recomand balsamul solvit n xilol i nu n stare vscoas. Se dilueaz cu
xilol pn cnd, introducnd o baghet de sticl, balsamul se scurge de pe ea sub
form de picturi mobile, care nu se ntind i introducnd bagheta n flacon,
aceasta trebuie s fie invizibil. n aceast stare, balsamul are aproape acelai
indice de refracie ca i sticla i se recomand a fi folosit.
Se folosete la montarea definitiv a preparatelor animale i vegetale.
Seciunile care urmeaz s fie incluse n balsam de Canada se deshidrateaz n
prealabil, folosind seria de alcool etilic. Pentru aceasta, se trec seciunile din ap n
alcool de 70% timp de 1-3 minute apoi, n alcool etilic de concentraii tot mai mari,
pn la alcool absolut, n care se menin timp de 10 minute. Pentru a verifica dac
deshidratarea s-a fcut n bune condiii, se trec seciunile ntr-un vas cu alcool
absolut amestecat cu aceeai cantitate de xilol. Dac lichidul se tulbur, nseamn
c seciunile nu au fost suficient deshidratate. Se trec apoi n dou serii de xilol sau
toluen (2-3 minute) pn la dispariia complet a alcoolului, lucru de care ne dm
seama prin faptul c, la adugarea xilolului sau toluenului, amestecul respectiv nu

36

se mai tulbur. Includerea (montarea) seciunilor se face punnd pe lam seciunile


colorate, deasupra crora se las s cad 2-3 picturi de balsam de Canada peste
care se aeaz lamela, dup care se las s se usuce 20 de ore.
Lutarea este utilizat pentru evitarea uscrii preparatelor proaspete n timpul
examinrii la microscop sau pentru a pstra un timp ndelungat preparatele incluse
n glicerin. Se realizeaz cu ajutorul parafinei sau a unui lut special. n lipsa
acestora, se folosesc guma arabic sau alte substane.
Lutarea cu parafin se face n felul urmtor. Parafina topit n prealabil, se
aplic pe marginile lamelei, cu ajutorul unei anse sau al unei srme de cupru,
ndoit la vrf n forma literei L. Pentru ca parafina s adere perfect, lama i
lamela trebuie s fie curate. Lutarea cu parafin prezint dezavantajul c aceasta
este uor casabil, fragil, de aceea se recomand ca peste parafin s se adauge cu
ajutorul unei pensule, straturi succesive de balsam de Canada. Balsamul se adaug
n straturi subiri unul dup altul, dup ce ultimul strat s-a uscat complet.
Lutarea cu ajutorul lutului special, cu urmtoarea compoziie:
lanolin pur (sau cear) .20 g
colofoniu (sacz) .80 g.
Lanolina din comer se nclzete ntr-un vas de porelan pn la topirea i
deshidratarea ei complet. Cnd toat spuma produs prin fierbere dispare, se
adaug colofoniu pisat i se continu nclzirea (mestecnd continuu cu o baghet)
pn ce se obine un lichid perfect omogen. Amestecul obinut se toarn n cutii
Petri sau cristalizoare unde se solidific n scurt timp. Acest amestec omogen,
numit lut, se aplic pe laturile lamelei cu ajutorul unei anse sau srme ndoite la
capt n L, care se nclzete n prealabil la flacra unei lmpi de spirt. Ansa
nclzit se introduce n lut i apoi se aplic pe una din laturile lamelei n strat
continuu. Operaia se repet cu fiecare latur a lamelei. Acest lut are avantajul c
ader perfect la marginile lamelei, chiar dac acestea sunt uor umezite cu ap,
acid acetic, alcool, glicerin etc.
Lutarea cu lac incolor sau oj de unghii, se utilizeaz n lipsa celorlalte
substane.

37

Pentru obinerea unor preparate proaspete din fragmente de organe animale,


la ora actual, se utilizeaz un aparat numit criotom. esuturile sunt n prealabil
ngheate i apoi se pot efectua seciuni foarte subiri cu ajutorul acestui aparat.
Criotomul este un microtom (microtomul criostat) adpostit ntr-o camer
frigorific, manipulat din afara camerei cu ajutorul unei manivele, al selectorului i
a comenzilor de revenire la poziia iniial. De asemenea, prezint comenzi
electronice privind manipularea, reglarea temperaturii i a timpului de lucru,
precum i a altor auxiliare. Temperatura minim a camerei este de -30C, atunci
cnd temperatura mediului este de 20C. Temperatura minim va scdea odat cu
creterea temperaturii mediului. Limitele grosimii seciunilor sunt cuprinse ntre 030 m, n pai de 1 m. Principiul tierii de seciuni criostatice este foarte simplu.
Cnd esutul este ngheat, apa din acesta se transform n ghea, care acioneaz
ca un mediu fixator, iar esutul este n stare solid. Consistena blocului ngheat
este alterat prin varierea temperaturii esutului. Scderea temperaturii produce un
bloc mai tare, iar creterea ei determin nmuierea blocului de esut. Majoritatea
esuturilor nefixate, fr grsimi, se secioneaz bine ntre -13C i -23C n funcie
de natura esutului. Temperaturile adecvate pentru tierea esuturilor nefixate sunt
urmtoarele: creier -12C, ficat -14C, nodul limfatic -14C, rinichi -16C, splin,
16C, muchi -20C, tiroid -20C, piele -25C, sn -25C, sn cu grsime -25C,
esut adipos -30C. Se recomand o splare minuioas a esutului naintea
ngherii. Tierea esuturilor care au fost n prealabil fixate, utilizndu-se de la caz
la caz diveri fixatori, este indicat s se realizeze la -12C pn la -17C.
Preparate durabile obinute prin mparafinare
Cnd lucrrile de laborator cer seciuni foarte fine i n serie sau cnd
secionarea cu mna este dificil sau chiar imposibil, se recurge, att n cazul
fragmentelor de organe animale ct i n cazul celor vegetale, la includerea lor n
parafin i secionarea cu ajutorul microtomului.. Includerea n parafin presupune
o tehnic special i prezint avantajul c permite obinerea unor serii de seciuni
subiri (grosimea lor variaz ntre 5 i 10 m) prin fragmente din organe animale i
vegetale, care nu pot fi secionate dect dac sunt incluse n parafin.

38

Trebuie s se in seama de faptul c, prin aceast metod, se menin numai


unii constitueni celulari, deoarece n afar de ap i substanele solvite n ea, sunt
extrase de obicei din celule i lipidele, astfel c pentru evidenierea lipidelor
aceast metod este inutilizabil.
Metoda mparafinrii, prin care se pot obine seciuni subiri, n vederea
efecturii unor preparate permanente ce urmeaz a fi studiate citologic, presupune
urmtoarele etape: fixarea, splarea, deshidratarea, clarificarea, includerea n
parafin, secionarea la microtom a materialelor biologice animale sau vegetale
incluse, lipirea seciunilor pe lam, uscarea, deparafinarea, hidratarea, colorarea
seciunilor i montarea lor n balsam de Canada.
Fixarea implic folosirea unor amestecuri de mai multe lichide, care se
prepar cu puin timp nainte de folosire. Este important ca timpul de fixare s fie
redus la minimum, de aceea se aleg fixatorii cu capacitate optim de penetrare a
esutului iar fragmentele de organe trebuie s fie ct mai mici.
Splarea urmeaz imediat dup scoaterea fragmentelor de esut din fixator.
Dup ce au stat un anumit timp n fixator, piesele se pun la splat 24 de ore n ap
de robinet. O splare bun se realizeaz prin introducerea fragmentelor ntr-o
pung de tifon i legarea acesteia la gura unui robinet pe care curge continuu apa.
Deshidratarea presupune scoaterea apei din esuturi cu ajutorul alcoolului
etilic, n concentraii crescnde i succesive.
Fragmentele de esuturi vegetale splate cu ap se scot cu pensa din punga
de tifon i se pun ntr-un flacon sau eprubet n care se afl alcool cu o concentraie
de 15%. Flaconul se astup cu un dop de plut i se las 30 de minute. Folosindune de o pipet sau prin decantare, nlturm alcoolul de 15% i adugm alcool
mai concentrat, de 35%. n acelai mod fragmentele sunt introduse treptat n bi de
alcool cu concentraie din ce n ce mai mare: 55%, 70%, 80%, 90%, 95%,
ajungnd pn la alcool absolut unde se termin deshidratatea. n fiecare
concentraie de alcool se las cca o jumtate de or pn la dou ore, iar n alcool
absolut sunt trecute de dou ori, a doua oar fiind lsate de la 12 la 24 de ore, n
funcie de mrimea fragmentului de esut vegetal.

39

Referitor la esuturile animale, operaia de deshidratare se face prin trecerea


fragmentelor prin bi de alcool etilic 50%, 70%, 90%, 95% i 100%. Prin alcool
etilic absolut fragmentele pot fi trecute chiar de trei ori. n general durata
deshidratrii dureaz 6-12 ore pentru fiecare baie, n funcie de mrimea
fragmentului de esut i de natura sa.
Clarificarea este necesar deoarece parafina, n care urmeaz s fie incluse
fragmentele, nu este miscibil cu alcoolul ci numai cu benzenul, xilenul, toluenul,
cloroformul.
Scoaterea alcoolului din esuturi i nlocuirea lui cu una din aceste
hidrocarburi se numete clarificare i se face tot prin trecerea acestora prin mai
multe bi.
De exemplu, nlocuirea alcoolului cu cloroform, n esuturile vegetale, se
face n felul urmtor. Se elimin din vas alcoolul absolut, cu ajutorul pipetei sau
prin decantare. Apoi, se pune peste fragmente un amestec de alcool absolut i
cloroform 2:1 (2 pri alcool absolut i o parte cloroform). Cnd cloroformul
nlocuiete alcoolul din esuturi, fragmentele cad pe fundul vasului. Se nltur
primul amestec de alcool absolut i cloroform i se pune peste fragmente, n acelai
mod, amestecul urmtor (1:1), n care se las pn ele devin submerse. La fel se
procedeaz i cu al treilea amestec (1:2). Din ultimul amestec de alcool absolut i
cloroform, fragmentele de esut vegetal se transfer n cloroform pur de dou ori,
n care se las pn ce ele devin submerse, ceea ce poate s dureze destul de mult.
Fragmentele de esuturi animale pot fi trecute, de exemplu, prin trei bi de
toluen, n fiecare baie fiind inute cte 6 ore.
Includerea n parafin presupune impregnarea fragmentelor de esut, nc
relativ moi i deci improprii pentru secionare, cu parafina care le confer duritatea
necesar. Fragmentele sunt trecute prin

mai multe bi de parafin, inute la

termostat la 56-60C (temperatur la care parafina este lichid), un numr variabil


de ore n funcie de mrimea fragmentului i de natura esutului. Cu ajutorul unei
pense, nclzite mereu la flacr, se transfer rapid fragmentele din vasele cu
parafin din termostat (de exemplu, cutii Petri cu parafin) n vase speciale ce

40

conin parafin lichid. Acestea sunt reprezentate de cutiue de porelan, material


plastic sau se pot confeciona cutiue din folie de aluminiu. Dup ce parafina n
parte se solidific, se introduc cutiuele ntr-un cristalizor cu ap rece de robinet,
pentru a grbi solidificarea blocurilor de parafin, ce au incluse n ele fragmentele
de esut animal sau vegetal. Blocurile se desprind din vasele de includere, plutind
la suprafaa apei. Vasele confecionate din folie de aluminiu se depliaz dup
ntrirea blocului.
Secionarea se realizeaz cu ajutorul microtomului mecanic. Microtomul cu
roat (tip Minot) are cuitul fixat, iar portobiectul culiseaz pe vertical cu ajutorul
unei roate cu manivel care se nvrtete ca i roata unei maini de cusut. Piesa
principal a microtomului este o roat dinat, n centrul creia este fixat un urub
cu pas mic. Avansul roii dinate cu un dinte, imprim urubului un avans de 1m.
urubul mpinge cu numrul de micrometrii dorii (fixai n prealabil pe o rozet
gradat) piesa n care este fixat portobiectul (o pies metalic pe care se fixeaz
bloculeul de parafin fasonat, n care e inclus materialul de secionat).
Portobiectul avanseaz, cu fiecare curs a roii dinate, cu numrul de microni
indicat. Cuitul fixat taie de fiecare dat, cu fiecare curs a roii, cte o seciune din
bloculeul de parafin de pe portobiect. Observndu-se, prin transparen, poziia
fragmentului de esut n blocul de parafin, se trece faeta opus celei spre care se
afl fragmentul deasupra unei flcri, printr-o micare rapid, pentru a produce o
topire uoar a parafinei. Dup aceast operaie blocul de parafin se lipete
imediat, prin apsare, pe port-obiectul microtomului. Poziia blocului la fixare pe
port-obiect se alege de ctre cercettor n funcie de direcia de tiere, dup care se
vor efectua seciunile: longitudinal sau transversal. Secionarea propriu-zis
ncepe cu pregtirea microtomului, ceea ce presupune fixarea port-obiectului la
microtom astfel nct orientarea lui s fie perfect paralel cu lama cuitului,
respectiv unghiul de tiere s fie egal cu 90. Stabilirea grosimii seciunilor care
urmeaz a fi efectuate se realizeaz cu ajutorul rotiei gradate pe care sunt nscrise
valorile micronilor. Manipularea propriu-zis a cuitului microtomului se face prin

41

nvrtirea manual a roii, obinndu-se seciuni succesive prin materialul biologic


inclus, sub forma unei benzi sau panglici (tenie).

Figura 2 Aspectul teniei rezultat prin secionare la microtomul mecanic


(d. I. Anghel i colab., 1988)

Lipirea seciunilor se face pe o lam bine splat i degresat, uns cu


albumin glicerinat (amestec de albu de ou i glicerin, n pri egale). Operaia
const n punerea unei picturi de albumin glicerinat pe suprafaa lamei i
ntiderea ei uniform, n lungul acesteia, cu degetul. Pe dou dintre laturile lamei
se pun 3-4 picturi de ap distilat, care contribuie la ntinderea seciunilor i la
orientarea lor. Se aeaz apoi seciunile pe lame, n ordinea obinut la microtom,
ncepnd de la stnga la dreapta, cu grij ca acestea s fie n succesiunea
secionrii lor. De asemenea, trebuie s fie orientate cu faa superioar, care este
mat, n sus iar faa inferioar, care este lucioas, s fie n contact cu apa de pe
lam. Seciunile se apropie, pentru a nu rmne spaii ntre ele i pentru a putea fi
acoperite cu lamela. Se trece apoi lama printr-o flacr nu prea mare, cu micri
rapide, obinndu-se o ntindere perfect a seciunilor i fixarea lor pe lam datorit
evaporrii apei i a coagulrii albuminei.
Uscarea se efectueaz dup ce lamele s-au rcit, lsndu-le mai multe zile la
temperatura camerei sau introducndu-le pentru 24 de ore la termostat, la 37C.

42

Deparafinarea seciunilor se poate face cu una dintre cele trei hidrocarburi:


toluen, benzen sau xilen, trecndu-le prin bi succesive. De exemplu, pentru o
ndeprtare treptat a xilenului i n acelai timp i dizolvarea total a parafinei, se
pun lamele cu seciuni, dup trecerea lor printr-o flacr pentru a se topi puin
parafina, ntr-un vas cilindric, ce conine xilen i se las aici 1-2 ore, ct s se
dizolve parafina din jurul i din interiorul seciunilor. Apoi, acestea se trec n xilen
i alcool etilic absolut (1:1), unde se las cteva minute. n continuare, seciunile
se trec n alcool absolut, n vederea nlocuirii complete a xilolului cu alcool absolut
deoarece, urmtoarea etap, hidratarea seciunilor, nu se poate realiza dect n acest
fel, hidrocarburile nefiind miscibile cu apa.
Hidratarea se face cu bi de alcool de concentraii descresctoare,
meninndu-se seciunile cteva minute n fiecare baie, de la alcool absolut la
alcool 95%, 90%, 80%, 70%, 55%, 35%, 15% i apoi n ap curat de robinet.
Colorarea presupune scoaterea lamelor cu seciuni din ap curat i trecerea
lor n colorantul corespunztor. Peste seciuni se pun 1-2 picturi din colorantul
respectiv, n care se in cteva minute. Se spal apoi lamele cu seciunile colorate,
prin introduceri i scoateri succesive dintr-un vas cu ap de robinet. Lamele cu
astfel de seciuni se trec din ap n seria de de alcool de concentraii diferite, n
ordinea 15%, 35%, 55%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100%, cu scopul de a obine
deshidratarea seciunilor. n continuare este necesar nlocuirea alcoolului cu o
hidrocarbur (clarificarea), de exemplu cu xilen, deorece acestea sunt miscibile cu
mediul de montare, balsamul de Canada. Pentru aceasta se in seciunile, timp de
cteva minute n bi de alcool+xilen (2:1), alcool+xilen (1:1), xilen+alcool (2:1),
xilen I, xilen II. Se scot lamele cu seciuni din cea de a doua baie de xilen i se
aeaz pe o hrtie de filtru, pentru a absorbi excesul de xilen. Apoi, cu o baghet de
sticl, se pun 2-3 picturi de balsam de Canada, aezndu-se lamela cu grij, astfel
nct s nu se formeze bule de aer i n felul acesta se obin preparate microscopice
fixe, care dureaz timp nelimitat.
Desenarea la microscop este o posibilitate de a reda ntr-o manier corect
ceea ce se vede ntr-un preparat. Potenialul instructiv al desenului nu poate fi

43

nlocuit prin microfotografii sau microproiecii, ci cel mult completat. Desenarea la


microscop trebuie nvat de fiecare student, indiferent dac are talent la desen
sau nu, deoarece dezvolt capacitatea de a observa i de a reda cu acuratee ceea ce
se observ i conduce la aprofundarea i consolidarea cunotinelor teoretice
predate la cursuri. Pentru aceasta vom avea nevoie de: hrtie alb velin, creioane
bine ascuite, gum de ters i creioane colorate. Desenul se va face schematic, cu
ajutorul liniilor reprezentndu-se structurile eseniale, respectndu-se poziia i
proporia corect dintre aceste structuri. De exemplu, citoplasma se va reprezenta
prin puncte fine, apoi se poziioneaz nucleul, plastidele sau alte componente
celulare observabile. Desenul va fi considerat terminat cnd, n dreptul fiecrei
componente celulare va fi scris numele ntreg al acesteia, cnd deasupra desenului
va fi precizat ce reprezint el, iar dedesuptul su vor fi notate garnitura
ocular/obiectiv folosite, colorantul folosit etc.
Metodele citochimice
Sunt metode de studiu calitativ al unor compui chimici celulari, care permit
localizarea anumitor substane precum acizi nucleici, enzime i proteine
structurale, polizaharide, lipide, n celule sau n esuturi. Se utilizeaz reactivi
chimici care dau reacii de culoare (de exemplu, localizarea amidonului prin
colorare cu iod n iodur de potasiu), de fluorescen, de reducere a unor ioni
metalici (de exemplu reacia Feulgen pentru ADN) iar, n ceea ce privete
enzimele, acestea se detecteaz prin intermediul produilor rezultai n urma
activitii lor. S-au descoperit enzime hidrolitice ca: fosfataza bazic i acid,
ATP-aza, glucozo-6-fosfataza (enzim marker pentru reticulul endoplasmic), lipaza
etc., care prin hidroliza substratului formeaz anumite substane care intr n
reacie cu ionii metalelor grele (ionii se ncorporeaz n mediul de incubaie) i se
formeaz nite sruri insolubile. Activitatea anumitor enzime se poate evidenia n
preparatele pregtite pentru microscopia optic, dar exist i tehnici speciale,
complexe, de pregtire a preparatelor pentru microscopia electronic.
Citospectrofotometria

44

Este metoda de studiu cantitativ al compuilor chimici celulari (de exemplu,


hemoglobina, clorofila, vitaminele etc.), bazat pe particularitile lor de absorbie
spectral (cu maxim de absorbie, de la caz la caz, n radiaii vizibile, ultraviolete
sau n infrarou). Analize cantitative se pot face i prin fotometria colorantului
care, n urma reaciilor citochimice, se leag specific cu substanele celulei.
Totodat, metoda este utilizat i pentru dozarea, pe baza unor reacii de culoare, a
unor componente biochimice celulare foarte importante (de exemplu, n cinetica
enzimatic, n dozarea proteinelor). Reaciile chimice capabile s dea compui
colorai, permit msurarea intensitii culorii obinute, fie prin comparaie cu o
soluie etalon (colorimetria relativ), fie prin msurarea absorbiei luminii, care are
o anumit lungime de und, de ctre soluia colorat (colorimetria absolut). Dac
trece o raz de lumin printr-o soluie, cantitatea de lumin absorbit este
proporional cu concentraia substanei colorate, absorbante dizolvate. Tot cu
ajutorul colorimetrului se poate msura densitatea optic (extincia) soluiei
colorate.

45

2. TIPURI DE CELULE, FORMA I DIMENSIUNILE LOR


Celula este unitatea morfo-funcional elementar a tuturor organismelor vii,
procariote sau eucariote.
2.1. Celula procariot
Din punct de vedere structural acest tip de celul are materialul genetic,
nucleoidul, reprezentat de o molecul de ADN circular, molecul dispus n
citoplasm. Cnd vorbim de celula procariot, ne gndim la bacterii.
2.1.1. Frotiuri cu bacilul fnului(Bacillus subtilis)
Materiale necesare: infuzie de fn, ulei de cedru, violet de genian, fuxin,
soluie Lugol, soluie alcool-aceton.
Mod de lucru: frotiurile sunt preparate n care bacteriile au fost n prealabil
omorte, fixate i colorate. Frotiul se poate face recoltnd o pictur dintr-un
mediu de cultur lichid, recoltarea fcndu-se cu ansa bacteriologic sterilizat n
prealabil prin nclzirea la rou sau, dac mediul de cultur este solid, prin raclarea
cu ajutorul ansei a culturii bacteriene de pe mediu. n primul caz, aezm pictura
pe o lam degresat, pe care apoi se etaleaz lichidul prin rotirea ansei. Dac
recoltm de pe un mediu de cultur solid, punem n prealabil pe lam, cu o pipet,
o pictur de ap distilat i apoi omogenizm i etalm materialul biologic
recoltat tot prin rotirea ansei. Dup aceast operaie (etalarea) ansa se sterilizeaz
din nou prin aducere la rou. Un frotiu corect etalat trebuie s fie ntins subire i
uniform, lsnd pe marginile lamei un spaiu liber de 1-2 cm. Se usuc frotiul
etalat la aer, la temperatura camerei. Fixarea frotiului se face prin nclzirea lamei,
trecnd-o rapid de 2-3 ori prin flacra unui bec de gaz, pna ce primete o

46

temperatur ce poate fi suportat pe faa dorsal a minii. Prin fixare bacteriile sunt
omorte, crete permeabilitatea pereilor celulari i se produc modificri ale
citoplasmei care cresc afinitatea fa de unii colorani, materialul biologic ader la
lam i nu se va detaa n timpul operaiilor de colorare i splare.
Pentru izolarea bacteriei Bacillus subtilis se taie mrunt fn uscat i se pune
ntr-un vas cu ap, de exemplu ntr-un balon Erlenmeyer. Vasul se nchide cu un
dop de vat i se las cteva ore la temperatura camerei sau n etuv la temperatura
de 30-35C. Apoi, se decanteaz i se dilueaz cam cu acelai volum de ap. Se
las la temperatura camerei sau mai la etuv, la 30-35C. Dup 2-3 zile la suprafaa
lichidului se formeaz o pelicul subire, mat-cenuie, alctuit aproape numai din
Bacillus subtilis. Se efectueaz un frotiu din infuzia de fn uscat, prin etalare,
fixare i apoi colorare.
Coloraia Gram se desfoar n urmtorii timpi:
a) acoperirea preparatului cu violet de genian, timp de 2 minute, apoi se
scurge colorantul
b) acoperirea cu soluie Lugol pentru mordansare (ntrirea coloraiei), timp de
2 minute, apoi se scurge mordantul
c) se decoloreaz preparatul cu o soluie de alcool-aceton, timp de 20 de
secunde, apoi se spal cu ap curent.
d) se recoloreaz cu fuxin diluat, timp de 2 minute, apoi se spal preparatul
cu ap curent i se las s se usuce la temperatura camerei.
Bacteriile pot fi clasificate n dou mari grupe: gram pozitive, la care
membrana citoplasmatic este acoperit de peretele celular i gram negative,
care au peretele celular situat ntre membrana citoplasmatic intern i o alt
membran extern. Spaiul dintre cele dou membrane, ntre care se gsete
peretele celular, se numete spaiu periplasmic. n tehnicile de colorare ale
cocilor (monococi, diplococi, streptococi, stafilococi), cocobacililor, bacililor,
vibrionilor, spirililor i spirochetelor (aceast clasificare se face dup forma
rotund, de bastona drept, curbat respectiv spiralat a bacteriilor), se ine cont
de acest aspect ce caracterizeaz organizarea celulei procariote. n urma

47

coloraiei Gram, bacteriile gram pozitive se vor colora n violet iar cele gram
negative n rou.
Examinarea microscopic: pentru observarea bacteriilor vom folosi
obiectivele 90x sau 100x, cu imersie. Lichidele de imersie se introduc ntre lentila
frontal a obiectivului i frotiu i au calitatea de a avea acelai indice de refracie
(n) cu cel al sticlei (n = 1,51). Ca lichide de imersie se utilizeaz glicerina, uleiul
de cedru, anisolul, benzoatul de metil. Uleiul de cedru are un miros aromaticbalsamic i este extras din lemnul de Juniperus virginiana. Utilizat ca lichid de
imersie, trebuie s fie limpede, de culoare galben-deschis, vscos i omogen. n
cazul utilizrii glicerinei ca lichid de imersie, nu se mai folosete lamela. Lentila
frontal a obiectivului se afund direct n mediul de includere.
n cazul obiectivelor uscate (4x, 6x, 10x, 20x, 40x), o parte din razele care
pleac dintr-un punct al materialului biologic de cercetat, vor suferi o reflexie
total cnd ajung la faa superioar a lamelei. Prin urmare, numai o parte a conului
luminos ptrunde n obiectiv, restul se pierde. La obiectivul cu imersie,
introducndu-se lichidul de imersie ntre lentila frontal a obiectivului i lamel
sau preparat, sunt eliminate fenomenele de reflexie a luminii. Toate razele care
pleac din punctul i ajung pe lentila frontal ptrund n microscop i contribuie
la formarea imaginii, deci obictivele cu imersie dau o imagine mult mai luminoas
dect cele uscate.
Pentru obinerea imaginii, n cazul utilizrii obiectivului cu imersie, se
procedeaz n felul urmtor. Se pune pe lamel sau, n acest caz, direct pe frotiu, o
pictur mic din lichidul de imersie. Privind lateral tuburile microscopului,
acestea se coboar pn cnd lentila frontal se afund n lichid. Se privete la
microscop i se ridic uor tuburile, folosind macro- i microviza, pn cnd
imaginea apare clar. Constatm, n urma coloraiei Gram, c Bacillus subtilis este
o bacterie gram pozitiv.
Dup ntrebuinare, lichidul de imersie se terge cu o bucat de pnz de
Olanda, de celuloz sau cu hrtie de filtru iar lentila frontal se cur cu benzin,
benzen sau xilol, niciodat cu alcool.

48

2.1.2. Alge albastre verzi (cianobacterii): Oscillatoria i Spirulina


Materiale necesare: eprubete cu culturi de alge, pipete, lame, lamele, hrtie de
filtru.
Mod de lucru: se fac preparate provizorii, utiliznd cteva picturi din
suspensia de alge.
Examinare microscopic: mai nti pe obiectivul 10x, apoi pe 20x i 40x.
Oscillatoria este o cianobacterie filamentoas, are form de baston i este alctuit
din mai multe celule izomorfe. La suprafaa filamentelor exist o teac gelatinoas,
denumit glicocalix, de grosime variabil, care se coloreaz n rou-carmin cu
ajutorul colorantului rou de ruteniu. Pentru colorarea glicocalixului se poate
utiliza i colorantul vital albastru de metilen.
La Spirulina filamentele au form spiralat i sunt alctuite tot din mai
multe celule izomorfe (vezi figura 3).

Figura 3 Cianobacterii filamentoase


a) Spirulina
b) Oscillatoria.
(d. M. Prvu, 2003, modificat)

2.1.3. Obinerea sferoplatilor cianobacterieni prin tratare cu lizozim


Materiale necesare: suspensie de Synechocystis, soluie de L-prolin 1M,
soluie stoc de lizozim (1mg/ml), eprubete, pipete, lame i lamele de microscopie.

49

Mod de lucru: se pipeteaz ntr-o eprubet, suspensie cianobacterian i


soluie de prolin, n cantiti egale i se identific la microscop forma normal a
bacteriei. Se adaug apoi n eprubet soluia de lizozim i se agit uor amestecul.
Dup aproximativ 20 de minute, se face un preparat microscopic.
Examinare microscopic: cu obiectivele 10x, 20x, apoi cu 40x observm c
n medii hipertonice, bacteriile tratate cu lizozim se transform n sferoplati
(corpuri sferice, echivalente protoplasmei) deoarece, sub aciunea lizozimului, se
produce liza mureinei (-1,4 peptidoglican), component de baz a peretelui celular
al celulelor procariote.
2.2. Celula eucariot
Organizarea structural a celulei eucariote animale i a celulei eucariote
vegetale este extrem de complex, ntre aceste dou tipuri de celule eucariote
existnd att asemnri ct i deosebiri de structur.
2.2.1. Celula epidermic din tunica bulbului de ceap (Allium cepa)
Materiale necesare: bulbi de ceap , lame, lamele, pensete, bisturiu, baghet
de sticl sau pipete, lame de ras, hrtie de filtru, colorani i reactivi.
Mod de lucru: bulbul se taie cu bisturiul n fragmente longitudinale. Se
izoleaz fragmentele din tunic, din care se va preleva prin jupuire epiderma
superioar, situat pe partea concav a acestora. n acest scop, n zona mijlocie a
tunicii, se va efectua, cu ajutorul lamei de ras, o incizie superficial de form
dreptunghiular. Vrful lamei de ras se va introduce sub un col al esutului incizat
care se va ridica uor, apoi cu penseta sau cu degetele se va desprinde n sens
longitudinal epiderma, care are aspectul unei foie subiri. Acest fragment de
epiderm se pune pe lam, ntr-o pictur de ap, orientnd lungimea esutului
paralel cu limea lamei. esutul se acoper cu lamela, unghiul de cdere a lamelei
fiind mai mic de 45. Se ndeprteaz excesul de ap de pe marginea lamelei cu
ajutorul hrtiei de filtru, iar bulele de gaz eventual aprute ntre lam i lamel, se
ndeprteaz printr-o uoar lovire a lamelei cu unghia.
Examinare microscopic: se va face mai nti cu obiectivul 10x, iar mai apoi
cu 20x sau 40x. esutul (1), reprezentnd epiderma superioar a tunicii, apare

50

unistratificat, (vezi figura 4) format din celule alungite n sensul longitudinal al


frunzei (heterodiametrice, prozenchimatice), fr spaii intercelulare.
Cea mai mare parte dintr-o celul este ocupat de 1 sau mai multe vacuole,
ce constituie aparatul vacuolar sau vacuomul. Vacuolele mari, cu suc vacuolar sunt
formaiuni caracteristice celulelor eucariote vegetale, ele nu se ntlnesc n celulele
eucariote animale, putnd reprezenta 80-90% din volumul celular, cazuri n care
citoplasma apare redus la o pelicul parietal fin. Fiecare vacuol este limitat de
ctre o membran lipoproteic, cu permeabilitate selectiv, numit tonoplast,
meninut sub tensiune (gr. tonos = tensiune) de ctre proprietile osmotice ale
soluiei interne, sucul vacuolar, soluie care are o extrem de complex compoziie
chimic.
n celule se observ nucleul, care este sferic i mai refringent dect restul
componentelor celulare. Absena nucleului n unele celule se datoreaz ruperii
peretelui celular.

51

Figura 4 Structura celulei de Alium cepa: 1 fragment epidermal; 2 structura unei


celule mult mrit; 3 detaliu structural n care este inclus nucleul: ca cariolimf; cit
citoplasm; es epiderma superioar; le leucoplaste; mit mitocondrii; n nucleu; nu
nucleol; pc perete celular; pct punctuaiune simpl; sf sferozomi (1, 3 d. Braune & colab.,
2 d. Morlova modific., din M. Andrei i colab, 2003).

De la obiectivul 10x, se va aduce n axul optic obiectivul 40x, pentru a


studia mai amnunit celula vegetal (2 i 3). ntruct imaginea este mai ntunecat,
se ridic uor condensatorul i se pune la punct microscopul prin utilizarea vizei
micrometrice. Astfel, se poate studia peretele celular, o alt component structural
caracteristic celulelor vegetale i care nu are corespondent n lumea animal.
Peretele celular apare inegal, prezentnd din loc n loc poriuni mai subiri numite
punctuaiuni, care corespund cu punctuaiunile celulelor vecine, i poriuni mai
groase formate din straturi de celuloz (perete primar). ntre pereii celulari ai
celulelor vecine se afl lamela mijlocie, format din pectat de calciu i magneziu,
care are rolul de a cimenta celulele n cadrul esutului. Peretele celular celulozic se
poate colora n albastru-violaceu cu clorura de zinc iodat. Colorarea se face direct
pe lam, extrgnd apa de sub lamel cu o hrtie de filtru i aplicnd, pe latura
opus a lamelei, o pictur de colorant, care se va infiltra ntre lam i lamel n
locul apei. Colorarea dureaz 5-10 minute dup care se absoarbe colorantul i se
nlocuiete cu o pictur de ap. Dac dorim s scoatem n eviden lamelele
mijlocii, vom nlocui apa dintre lam i lamel cu un colorant numit rou de
ruteniu, care coloreaz aceste formaiuni n roz/rou carmin. Citoplasma, fin
granulat i incolor, este dispus ntr-un strat subire n lungul peretelui celular
(citoplasma parietal), n jurul nucleului (citoplasma perinuclear) i sub form de
cordoane care leag citoplasma perinuclear de cea parietal. Suprafeele
negranulate din cavitatea celulei reprezint vacuolele. n citoplasm se disting
nucleul, sferozomii i leucoplastele. Nucleul, de form sferic, apare rotund, cnd
este plasat n citoplasma de pe pereii interni i externi sau lenticular, cnd este
situat n apropierea pereilor laterali. n nucleu se afl unul, cel mult doi nucleoli,

52

mai refringeni dect acesta. Nucleolul, este o zon din nucleu unde ADN-ul este
folosit ca matri pentru sinteza ARNr, acest ADN numindu-se practic organizator
nucleolar. Nucleolul este alctuit din ADN-ul folosit ca matri, moleculele de
ARNr care iau natere prin transcripie i din proteine ribosomale. Coloraia vital
a nucleului se poate face, dup modalitatea prezentat mai sus, timp de 1 minut, cu
albastru de metilen.
n apropierea nucleului se pot observa formaiuni sferice, mari, clar
conturate, foarte lucitoare numite sferozomi. Leucoplastele (plastide incolore), n
numr mai mic dect sferozomii, sunt mai mari dect acetia, ovale sau alungite i
uor strangulate. n urmtoarele lucrri vor fi prezentate modalitile de colorare a
sferozomilor i a leucoplastelor, ambele organite celulare specifice celulelor
eucariote vegetale, precum i coloraia vital cu verde Janus B a mitocondriilor,
organite celulare comune celulelor eucariote animale i vegetale, care n epiderma
tunicii bulbului de ceap nu se pot observa dect n urma colorrii.
2.3. Forma, dimensiunile i viabilitatea celulelor
Dimensiunile celulelor pot fi stabilite cu uurin i exactitate cu ajutorul
micrometrelor obiectiv i ocular.
Micrometrul obiectiv este o lam de sticl n centrul creia este gravat o
scal pentru msurare, lung de 1mm, divizat n 100 de intervale egale.
Intervalele sunt limitate din 5 n 5 prin linii mai lungi i din 10 n 10 prin linii i
mai lungi (vezi figura 5). Fiecare interval (diviziune) este egal cu 10 m (0,01
mm).
Micrometrul ocular este un disc de sticl n mijlocul cruia este gravat o
scal de 5 sau 10 mm lungime. Fiecare mm de pe acest disc este subdivizat n 10
pri, astfel c intervalul cuprins ntre dou linii reprezint o zecime de mm (0,1
mm).

53

Figura 5 Micrometrie: ob micrometru obiectiv; oc micrometru ocular


(d. M. Andrei i R. Paraschivoiu, 2003, modificat).

Aezm micrometrul ocular n tubul ocularului, dup ce am deurubat lentila


ocular, iar micrometrul obiectiv pe masa microscopului. Punem la punct imaginea
micrometrului ocular i aducem la suprapunerea celor dou scale, astfel nct s
putem preciza, numrnd, cte diviziuni ale micrometrului ocular (Oc) se suprapun
peste cte diviziuni ale scrii micrometrului obiectiv (Ob), dup care se calculeaz
indicele micrometric (I.M.).
I.M.= Ob x 10/Oc
Indicele micrometric se calculeaz, odat pentru totdeauna pentru fiecare
garnitur ocular/obiectiv folosit. De exemplu, la un ocular de 10x i un obiectiv
de 40x vom avea datele prezentate n tabelul nr.6:
Tabelul nr.6
Intervale
ale micrometrului
obiectiv

Intervale
ale micrometrului
ocular

Indice micrometric

2 intervale =20 m
3 intervale =30 m
4 intervale =40 m
8 intervale =80 m
9 intervale =90 m

17
25
33
66
74

20/17 = 1,77 m
30/25 = 1,20 m
40/33 = 1,21 m
80/66 = 1,21 m
90/74 = 1,22 m

Cunoscnd indicele micrometric, pentru garnitura folosit, putem calcula


dimensiunile diferitelor celule. n locul micrometrului obiectiv, aezm lama cu
preparatul pe masa microscopului. Cu ajutorul micrometrului ocular msurm
celula n lungime i lime. Numrul de diviziuni care cuprinde exact celula (sau
organitul celular) va fi nmulit cu indicele micrometric. De exemplu, nmulim
numrul de diviziuni ale micrometrului ocular, n care se cuprinde o granul de
polen, cu indicele micrometric i aflm mrimea n m a granulei respective.
Uniti de lungime

54

metru (m)
centimetru (cm) = 102 m
milimetru (mm) = 103 m
micrometru sau micron (m sau ) = 106 m
nanometru (nm) = 109 m
angstrom () = 1010 m
2.3.1. Seciune transversal prin tulpina de pipirig (Juncus sp.)
Materiale necesare: tulpini de pipirig conservate n alcool 70%, cutii Petri,
pipete, lame de ras, lame, lamele, ace spatulate, hrtie de filtru.
Mod de lucru: cu ajutorul lamelor de ras efectum seciuni transversale prin
tulpina de pipirig, seciuni pe care le lsm s cad n cutia Petri cu ap. Cu acul
spatulat alegem cea mai fin seciune i o aezm pe o lam, ntr-o pictur de ap,
efectund un preparat provizoriu.
Examinare microscopic: se face cu ajutorul obiectivului 10x. Mduva
tulpinii de pipirig apare ca fiind un esut alctuit din celule stelate (izodiametrice,
parenchimatice, cu diametrul de 85m), cu spaii intercelulare mari, de form
triunghiular. Se observ, de fapt, doar pereii celulari, alctuii din celuloz,
hemiceluloz i substane pectice (perei primari), deoarece coninutul viu al
celulelor (protoplatii) s-a distrus.
2.3.2. Seciune transversal prin mduva de soc (Sambucus nigra)
Materiale necesare: mduv de soc, cristalizoare sau cutii Petri, detergent,
lame, lamele, lame de ras, ace simple sau spatulate.
Mod de lucru: cu o lam de ras se secioneaz transversal mduva de soc.
Pentru a obine fragmente ct mai fine, nu este nevoie s realizm seciuni ntregi.
Lsm seciunile s cad n cristalizatorul cu ap cu detergent, care fiind
tensioactiv, scoate aerul din celule i astfel se reduce formarea bulelor de gaz n
preparat. Seciunile trebuie s fie foarte subiri, astfel nct s se poat observa
celulele i detaliile de structur i s fie executate dup sensul pe care ni l-am
propus. O seciune oblic n locul uneia transversale d ntotdeauna o imagine

55

fals. Scoatem seciunile din cristalizor cu acele simple sau spatulate, le aezm pe
o lam ntr-o pictur de ap i le acoperim cu lamela.
Examinare microscopic: cu obiectivul 10x, se poate observa forma rotund
i oval a celulelor (izodiametrice, parenchimatice) ce alctuiesc mduva de soc,
celule care au diametrul cuprins ntre 105 i 135 m i ntre care exist spaii
intercelulare (vezi figura 6). Pereii celulari primari rmai dup distrugerea
protoplatilor sunt ntrerupi de punctuaiuni simple, vzute n seciune i sunt
cimentai prin lamelele mijlocii. Punctuaiunile simple pot fi vzute i apical.

Figura 6 Seciune transversal prin


mduva de la Sambucus nigra: ps
punctuaiuni simple; pa punctuaiuni
simple vzute apical; lm lamel
mijlocie; si spaii intercelulare (d. I.
Grinescu, din M.Andrei i colab.,
2003, modificat).

2.3.3. Evidenierea periorilor absorbani ai rdcinilor i a celulelor


suculente din endocarpul fructelor de citrice
Materiale necesare: semine de mutar, germinatoare, cilindru gradat, lupe
de mn, hrtie de filtru, o portocal.
Mod de lucru: se vor pune la germinat semine de mutar, cte 50 de
boabe/germinator, utiliznd ca substrat de germinaie hrtia de filtru, umidificat
cu 20 ml ap de robinet. Din cea de-a treia zi de germinaie se vor putea face
observaii la nivelul rdcinilor.

56

Examinare macroscopic: cu ochiul liber sau cu lupa de mn, se observ c


rdcina este nconjurat de un puf de culoare alb, care este alctuit dintr-o
mulime de periori absorbani, alungii, unicelulari.
ndeprtnd epicarpul i mezocarpul portocalei, vom observa c endocarpul
este alctuit dintr-o mulime de celule fusiforme. Ele sunt suculente deoarece
partea cea mai bine reprezentat a acestor celule o reprezint vacuola cu suc
vacuolar.
2.3.4. Frotiu sanguin pentru evidenierea hematiilor i a leucocitelor
Materiale necesare: lame microscopice degresate i uscate, ap distilat,
pahare Berzelius, soluie May-Grnwald, soluie Giemsa, pipete Pasteur, spirt
medicinal, vat, ac steril sau hemostilet, ulei de cedru.
Mod de lucru: se realizeaz puncia pulpei degetului cu un ac steril sau cu
un hemostilet. Pictura de snge care apare la nivelul nepturii se terge cu un
tampon de vat cu spirt i se folosete urmtoarea pictur. Se apropie lama de
pictur i se atinge pictura n aa fel nct sngele s rmn plasat la mijlocul ei.
Cu o alt lam, inut oblic n unghi de 45, se atinge pictura de snge astfel nct
aceasta s se ntind de-a lungul ntregii muchii a acestei lame. Apoi, cu vitez, se
deplaseaz aceast lam pn la extremitatea opus a primei lame. Se realizeaz
astfel un strat subire de snge care reprezint frotiul sanguin. Frotiul realizat se
usuc la aer i se pot observa, fr colorare, hematiile. Colorarea implic
introducerea prin imersare a lamelor cu frotiu uscat ntr-un pahar Berzelius ce
conine soluie May-Grnwald, cunoscndu-se cantitatea de soluie introdus n
pahar (ml). Se las 5 minute, timp n care alcoolul metilic din compoziia soluiei
realizeaz fixarea celulelor din frotiu. Apoi, deasupra stratului de soluie MayGrnwald se toarn aceeai cantitate de ap distilat i se amestec uor cu vrful
unei pipete Pasteur. Se las nc 5 minute, timp n care soluia acioneaz ca i
colorant. Dup expirarea timpului de 5 minute, se arunc soluia May-Grnwald de
pe frotiuri i fr a le spla, n paharul Berzelius se toarn soluie Giemsa 10%,
preparat n momentul folosirii, prin adugarea, ntr-un cilindru gradat, la fiecare
10 ml de ap distilat a cte 15 picturi din soluia stoc. Colorantul Giemsa

57

realizeaz colorarea nucleilor celulari ai leucocitelor (hematiile fiind anucleate), iar


timpul de colorare variaz n funcie de calitatea colorantului, fiind n medie ntre
10 i 30 de minute. Dup expirarea timpului de colorare, frotiurile se spal cu ap
de robinet i se acoper pentru 1 minut cu ap distilat pentru diferenierea
coloraiei. Se usuc la temperatura camerei sau la curent de aer cald.
Examinare microscopic: observarea se face, pentru o imagine de ansamblu,
cu obiectivul 10x sau 20x. Eritrocitele apar cu coninutul omogen, colorat n
cenuiu sau n nuane roii-albstrui.
Pentru surprinderea detaliilor, se trece la examinarea cu obiectivul de
imersie 90x, utiliznd ulei de cedru. Eritrocitele normale sunt aproape rotunde, cu
diametrul de 7,5 , cu marginile bine conturate, deoarece sunt mai slab colorate la
mijloc unde au depresiunea central (au form de lentil biconcav). Leucocitele
pot fi numrate, fiind mult mai rare. Numrndu-se i identificndu-se la
microscop cel puin 100 de leucocite, se poate scrie formula leucocitar, care
reprezint raportul procentual al diferitelor tipuri de leucocite. Identificarea
tipurilor de leucocite se face pe baza unor caractere morfologice. n funcie de
aspectul nucleului i de prezena sau absena granulaiilor n citoplasm,
leucocitele sunt: mononucleare, cu un nucleu unic fr lobi, numite i agranulocite
(limfocitele i monocitele) i polimorfonucleare, cu un nucleu unic dar lobular,
numite i granulocite (neutrofile, acidofile i bazofile). Granulocitele se mpart n
aceste trei categorii n funcie de afinitile granulaiilor fa de coloranii neutrii,
acizi respectiv bazici.
Limfocitele au nucleul mare, intens colorat n albastru-violet, cu grunji de
cromatin i lipsit de nucleoli i o band ngust de citoplasm, care nconjoar
nucleul.
Monocitele au un diametru mai mare i o mas relativ mare de citoplasm,
colorat n albastru-cenuiu. Nucleul colorat violet palid are aspect reniform, nu se
observ grunjii limfocitului, doar zone
reprezint nucleolii.

58

ca nite pete de cromatin, care

Neutrofilele au granulaii foarte mici n citoplasm, colorate n violet.


Nucleul lor este segmentat, prezint un numr variabil de lobi, numrul lobilor
fiind cu att mai mare cu ct celulele sunt mai vrstnice.
Acidofilele, numite i eozinofile, au n citoplasm granulaii ovale,
luminoase, mult mai mari dect celelalte dou varieti de granulocite, granulaii
care se coloreaz cu eozina n rou aprins. Nucleul este de obicei bilobat, deci cu
un grad de segmentare nuclear mult mai mic dect al neutrofilului. Citoplasma nu
se vede din cauza numrului mare al granulaiilor. Bazofilele au mai puine
granulaii ca eozinofilele, granulaii inegale ca mrime, adesea aglomerate i
colorate intens n albastru iar nucleul este trilobat, fr o segmentare adevrat
(vezi figura 7).

Fig. 7 - Tipuri de leucocite, dimensiunile lor, formula leucocitar


(d. N. Drago, nepublicat)

2.3.5. Viabilitatea polenului


Materiale necesare: 2,3,5-trifeniltetrazol clorid (TTC), praf de culoare
galben uor solubil n ap, otrvitor, tampon fosfat 0,1 M cu pH = 7,2.
Mod de lucru: pe o lam de sticl se presar puin din polenul supus
controlului de viabilitate. Cu o pipet se adaug 1-2 picturi de tampon fosfat i se
las 3-4 minute n contact, se absoarbe amestecul tampon cu o hrtie de filtru. Se
pipeteaz 1-2 picturi din soluia de TTC 0,1% i se acoper cu lamela. Soluia de
TTC 0,1% se obine dizolvnd 1mg praf de culoare galben n 1ml tampon fosfat.
Se introduc lamele n termostat, pentru 20-30 de minute, la 37C. Sub aciunea
dehidrogenazelor TTC-ul se transform n formazan, care este de culoare roie.

59

Examinare microscopic: se analizeaz la microscop 3-5 preparate, cte 5


cmpuri microscopice din fiecare preparat. Se numr n cmpurile alese granulele
de polen roii, care vor fi viabile (cu activitate dehidrogenazic). Polenul neviabil
i pstreaz culoarea galben iniial (dehidrogenazele inactive), iar cel cu
viabilitate parial se coloreaz n rou deschis. Aceast tehnic poate fi folosit cu
rezultate bune i pentru determinarea viabilitii seminelor i a unor esuturi.
3. UNELE ASPECTE STRUCTURALE COMUNE CELULELOR
EUCARIOTE ANIMALE I VEGETALE
3.1. Membrana plasmatic (plasmalema)
Structur lipoproteic, organizat dup modelul mozaicului fluid (model ce
presupune existena unui bistrat fosfolipidic, n care se gsesc proteine), acoperit
de peretele celular n cazul celulei vegetale .
3.1.1. Izolarea membranelor plasmatice eritrocitare
Materiale necesare: snge recoltat pe anticuagulant (citrat de sodiu, EDTA,
heparin), tampon fosfat salin (TFS), ap distilat, eprubete de centrifug,
centrifug, pipete.
Mod de lucru: se recolteaz 5 ml de snge pe anticuagulant i se
centrifugheaz la 3000 rotaii/minut, timp de 10 minute. Se aspir cu o pipet
supernatantul, ce conine plasma sanguin i leucocitele (care se acumuleaz sub
forma unui strat albicios la suprafaa supernatantului). Sedimentul de hematii
rmas, se suspend n 10 ml TFS, prin aceasta realizndu-se splarea hematiilor de
plasma sanguin i se centrifugheaz din nou, la 3000 r/m, timp de 10 minute. Se
aspir supernatantul iar sedimentul de hematii se resuspend n 10 ml de ap
bidistilat, se agit energic i se las proba n repaus timp de 15 minute.
Suspendarea n ap bidistilat va produce liza osmotic a hematiilor i eliberarea
membranelor n suspensie. Hematiile nu au organite celulare i nici nucleu, de
aceea, este suficient s producem spargerea lor prin liz osmotic, pentru a
ndeprta hemoglobina i a obine membranele n suspensie. Se centrifugheaz
proba la 6000 r/m, timp de 20 de minute, pentru depunerea n sediment a

60

membranelor. Se aspir supernatantul, care conine hemoglobina i celelalte


proteine citoplasmatice eritrocitare solubile, iar sedimentul de membrane se spal
de cte ori este nevoie cu cte 10 ml de ap distilat, prin centrifugri repetate,
pn se ndeprteaz urmele de hemoglobin. Dup aceste splri, supernatantul
aspirat va fi incolor, iar n sediment vor fi membranele eritrocitare albeopalescente.
Examinare microscopic: se observ sedimentul de membrane de aspect alb i
apoi se suspend n 10 ml de TFS. Membranele astfel obinute pot fi utilizate
pentru extracia i cercetarea proteinelor sau lipidelor constituiente, pentru
examinarea microscopic, cu obiectivul 40x, a fantomelor eritrocitare.
Aceast denumire este folosit deoarece eritrocitele, ca urmare a ndeprtrii
hemoglobinei, devin albe. Fantomele eritrocitare reprezint un complex format din
plasmalema propriu-zis i citoschelet (reea proteic subplasmalemal, ce rmne
ataat de membran n mai multe puncte).
3.1.2. Evidenierea indirect a plasmalemei prin plasmoliz
Materiale necesare: ceap roie, soluie KNO3 5%, lame, lamele, hrtie de
filtru, baghete din sticl sau pipete.
Mod de lucru: Pentru izolarea peretelui celular de plasmalem, se aeaz pe o
lam de sticl un fragment din epiderma inferioar a unei tunici a bulbului de
ceap roie, frgment recoltat prin jupuire. Peste esut se pun cu pipeta 1-2 picturi
de KNO3 5% sau, n lipsa acestei substane, o soluie de zahr de aceiai
concentraie, apoi se aplic lamela.
Examinare microscopic: folosind obiectivul 10x, dup puin timp se observ
micorarea ntregului protoplast (coninutul celulei vegetale dup ndeprtarea
peretelui celular). Acest fapt se datoreaz concentraiei mai mari a soluiei de
KNO3 5%, dect a sucului vacuolar din vacuole. Pentru egalarea acestei
concentraii, o parte din apa din vacuol iese din celul. n micarea sa de
retragere, vacuola antreneaz citoplasma, care se dezlipete de peretele celular,
lng care se afla datorit presiunii vacuolare, celula aflndu-se n stare de
plasmoliz incipient. Apoi, citoplasma rmne legat de peretele celular numai

61

prin tractusuri fine (vezi figura 8), spunndu-se c n acest caz celula este n stare
de plasmoliz concav. Apare un spaiu ntre peretele celular i plasmalem, spaiu
care se umple cu soluie plasmolizant de KNO3 sau cu zaharoz 5% i cu apa care
a prsit vacuola. n final, se observ n celule vacuolele mici, rotunde, celulele
fiind n faza de plasmoliz convex.

Figura 8 Celul plasmolizat: pl plasmalema care apare sub form de tractusuri fine;
c citoplasm; n nucleu; p perete; s spaiu ntre perete i plasmalem; v vacuol
retractat (d. Buvat, din C. Toma i colab., 1997, modificat).

3.2. Matricea citoplasmatic ( hialoplasma, citosolul )


Alctuit dintr-o faz polimerizat, care este o reea bogat n proteine
structurale (citoscheletul) i o faz fluid, bogat n ap, ce se afl n ochiurile
reelei proteice, matricea citoplasmatic este n mobilitate continu, gelsol. n
stare de sol, pot fi observate micrile intracelulare, datorate prezenei curenilor
citoplasmatici, micri n care sunt antrenate i organitele celulare.
3.2.1. Cloroplastele antrenate n cicloz, n celulele frunzelor de Elodea
canadensis (ciuma apelor)
Materiale necesare: frunze tinere de Elodea canadensis, plant care crete n
mediul acvatic, pense, lame, lamele, pipete, hrtie de filtru.

62

Mod de lucru: se detaeaz, cu ajutorul unei pense o frunz tnr de Elodea


din vrful tulpinii, se pune pe lam ntr-o pictur de ap i se acoper cu lamela.
Examinare microscopic: micarea hialoplasmei antreneaz i cloroplastele,
este mai activ n celulele care conin un numr mai mic de cloroplaste, fiind
indicat s se examineze celulele din apropierea nervurii frunzei. Incluziunile i
plastidele din interiorul celulei, cnd sunt n cantitate mare, ncetinesc micarea,
putnd-o opri complet (vezi figura 9).
Lumina i cldura mresc viteza curenilor citoplasmatici, de aceea micarea
citoplasmei (cicloza) se observ bine la plantele care au fost expuse n prealabil la
aciunea razelor solare i n ap cldu. n celulele prevzute cu o vacuol mare,
central, ea se rotete de jurul mprejurul vacuolei, n acest caz, micarea fcnduse ntr-un singur sens, iar n cazurile n care n celul se gsesc mai multe vacuole,
circul printre aceste vacuole.

Figura 9 Rotaia citoplasmei la Elodea sp.: cit


citoplasm;
cl cloroplaste; ep celul
epidermal; n nucleu; pc perete celular; v
vacuole. Sgeile indic sensul de rotaie al
citoplasmei (d. Braune & colab., din M. Andrei
i colab., 2003).

63

3.3. Mitocondriile (condriozomii)


Mitocondriile sunt organite specifice celulelor eucariote, lipsesc n celulele
procariote i n hematiile adulte. Dimensiunea lor variaz ntre 0,3-1,5 m lime i
0,3 i 10 m lungime.
3.3.1. Evidenierea mitocondriilor n leucocite prin coloraie vital cu verde
Janus B
Materiale necesare: snge recoltat pe anticuagulant (EDTA, heparin),
pipete Pasteur, lame, lamele, verde Janus B.
Mod de lucru: 10 ml de snge recoltat pe anticuagulant se centrifugheaz la
3000 r/m, timp de 10 minute. Dup centrifugare, n eprubeta de centrifug se
observ sedimentul de hematii, supernatantul reprezentat de plasm iar, la
suprafa, un strat alb de leucocite. Se ndeprteaz supernatantul prin aspirare i
apoi se culege stratul de leucocite cu o pipet Pasteur, prevzut cu o par de
cauciuc. Se utilizeaz o soluie 1/10.000 de verde Janus B, diluat n acest caz n
alcool etilic 70%, care se ntinde ntr-un strat subire pe lam. Dup evaporarea
alcoolului, se aeaz o pictur din concentratul leucocitar pe zona cu colorant i se
aplic lamela.
Examinare microscopic: cu obiectivul de imersie 90x, se observ n
leucocite, formaiuni rotunde de culoare albastr, care sunt mitocondriile. Verdele
Janus reacioneaz cu flavinenzimele mitocondriale i cu citocromii. n prezena
flavinenzimelor verdele Janus este redus, transformndu-se ntr-un derivat leuco,
iar datorit cantitilor mari de citocromi, are loc reoxidarea formei leuco i
recolorarea verdelui Janus B.
3.3.2. Evidenierea mitocondriilor n celula vegetal prin coloraie vital cu
verde Janus B
Materiale necesare: bulbi de ceap alb, bisturiu, foarfece, cutii Petri, sticle
de ceas, ace spatulate i ascuite, lame, lamele, hrtie de filtru, pipete, ervete,
verde Janus B.
Mod de lucru: epiderma inferioar a tunicii bulbului de ceap alb se
introduce ntr-o sticl de ceas, n soluia de lucru (1/10.000) preparat din

64

colorantul vital verde Janus, unde se ine 10 minute. Se trece epiderma, n vederea
splrii, ntr-o cutie Petri cu ap distilat, i se taie cu ajutorul unui foarfece, sub
ap, n fragmente mai mici. Aceste fragmente se aeaz, cu ajutorul unui ac
spatulat, pe lama port-obiect ntr-o pictur de ap i se acoper cu lamela.
Examinarea microscopic: ncepe cu obiectivul 10x, pentru punerea la punct
a imaginii, iar pentru observarea mitocondriilor vom aduce n axul optic
obiectivele 40x, 100x. Mitocondriile, colorate n albastru cu verdele Janus B, sunt
vizibile n cordoanele citoplasmatice dintre vacuole, prezentndu-se sub form de
mici granule libere sau uneori asociate n iraguri scurte (condriomite).
3.3.3. Metode de determinare citochimic a unor enzime mitocondriale
(succinatdehidrogenaza, citocromoxidaza, ATP-aza dependent de Mg2+)
Succinatdehidrogenaza, metoda Nachlas-Tsou-Souza-Chang
Enzima elibereaz hidrogenul din srurile acidului succinic, transformndu-l
n fumarat. Hidrogenul eliberat este acceptat de o sare de tetrazoliu, care se reduce
astfel n formazan insolubil, colorat.
Mod de lucru (protocol): se pegtete un mediu de incubare,
- tampon fosfat de sodiu 0,2 M, pH = 7,6..10 ml
- succinat de sodiu 0,2 M (50 g la 1 l ap distilat)...10 ml
- Nitro blau tetrazoliul (Nitro-BT) 0,1% n ap distilat...20ml (20 mg)
Epidermele superioare, jupuite de pe tunicile bulbului de ceap alb, sunt
lsate n acest mediu, ntr-un pahar Berzelius, timp de 10 minute, la termostat, la o
temperatur de 37C. Apoi, se spal cu ap distilat i se efectueaz un preparatului
microscopic provizoriu. Cu obiectivul 40x, se observ mitocondriile colorate n
albastru.
Citocromoxidaza, dup Butcher, Diengdah i Chayen
Mod de lucru (protocol):
a) Epidermele tunicilor de ceap alb se in n mediul de incubare, la
temperatura camerei, pn cnd culoarea albastr a epidermelor e suficient
de intens. Mediul de incubare, se prepar n felul urmtor: 20 mg - naftol

65

i 20 mg Variamin Blau se solv n 1 ml de alcool etilic absolut i totul se


adaug la 70 ml ap distilat. Se adaug apoi 30 ml tampon Tris-HCl, pentru
pH = 7,4 (0,6 g Tris n 25 ml ap distilat + 42 ml HCl 0,1 N i se
completeaz pn la 100 ml cu ap distilat. Se filtreaz i se adaug cteva
cristale de citocrom c - 0,4 mg citocrom c/ml).
b) Transfer, timp de 2 minute, n soluie Lugol (2 g KI n 100 ml ap distilat,
apoi se adaug 1 g iod metalic), care va intensifica reacia de culoare i o
stabilizeaz.
c) Tratare, timp de 4 minute, cu soluie 5% de tiosulfat de Na (la 95 ml ap
distilat adugm 5 g tiosulfat).
d) Transfer, timp de o or, n soluie 1% acetat de Co n formol 4% (1 g acetat
de Co n 100 ml formol 4%).
e) Splare cu ap distilat i efectuarea preparatului microscopic.
Examinarea microscopic: cu obiectivul 40x sau 100x, se observ
mitocondriile, care se coloreaz n albastru.
Succinatdehidrogenaza i citocromoxidaza sunt considerate enzime marker
pentru membrana

mitocondrial

intern. Toate

componentele

structurale

mitocondriale pot fi caracterizate ca avnd un foarte bogat echipament enzimatic.


Enzimele sunt implicate n diverse procese fiziologice intramitocondriale de o
deosebit importan, de exemplu: ciclul Krebs, -oxidarea acizilor grai,
fosforilarea oxidativ etc., procese n urma crora are loc punerea n rezerv, sub
form de adenozintrifosfat ATP, a enegiei eliberate prin oxidarea moleculelor
nutritive.

Succinatdehidrogenaza

catalizeaz,

cadrul

ciclului

Krebs,

transformarea acidului succinic n acid fumaric, iar citocromoxidaza, enzim a


lanului respirator, catalizeaz transferul electronilor de la citocromul c ctre O2.
Citocromoxidaza, G. Nadireacia dup Grff, varianta Moog
n

urma

activitii

citocromoxidazei,

amestecul

de

-naftol

dimetilparafenilendiamin devine donator de hidrogen, rezultnd prin cuplarea


oxidativ, albastru de indofenol. Cuvntul nadi provine de la iniialele
reactivilor principali.

66

Mod de lucru (protocol):


a) Se secioneaz la criotom fragmente congelate din ficat, rinichi, putnduse folosi i seciunile mai groase.
b) Seciunile se incubeaz la 37C, timp de 3-5 minute sau 10 minute pn la
1h, la temperatura laboratorului. Mediul de incubare este alctuit din:25 ml tampon
fosfat pH = 7,2 7,6;1-2 ml sol.1% de -naftol n etanol de 40;1-2 ml sol. apoas
1%, proaspt, de dimetilparafenilendiamin.
c) Seciunile se spal n clorur de sodiu 0,85%
d) Se monteaz n mediu hidrosolubil i se luteaz. Culoarea albastr a
mitocondriilor devine repede palid.
Citocromoxidaza, metoda descris de Burstone (1961).
Reactanii sunt p-aminodifenilamina i 8-hidroxi-1,4-naftochinona.
Mod de lucru (protocol):
a) Seciunile la criotom, seciuni prin creier, se aeaz pe lame.
b) Se incubeaz seciunile n urmtorul mediu de incubare:
p-amino-difenilamina

10-15 mg

8-hidroxi-1,4-naftochinona

10-15 mg

etanol absolut

0,5 ml

Se dizolv reactanii n etanol, apoi se adaug:


ap

35 ml

tampon Tris, pH=7,4

15 ml.

Se agit soluia, care este tulbure i se filtreaz.


Incubarea dureaz 15 minute pan la 3 ore, la temperatura camerei (30 de
minute sunt adesea suficiente), pn ce culoarea este puternic pentru ochiul liber.
c) Se transfera lamele, timp de o or, n soluia de fixare:
(CH3COO)2Co 4H2O

5g

formaldehid 40%

5 ml

ap

pan la 50 ml.

Soluiile pentru incubare i pentru fixare se prepar n ziua utilizrii.

67

d) Se spal n ap curgtoare, timp de 5-10 minute, se deshidrateaz, se


clarific i se monteaz ntr-un mediu rinos (se poate folosi i un mediu miscibil
cu apa).
Locurile cu activitate citocromoxidazic (mitocondriile) sunt brune.

Adenozintrifosfataza Mg2+ dependent (ATP-aza Mg2+- dependent)


Este o enzim cu localizare pe faa intern a membranei plasmatice i pe
membrana mitocondrial intern. Poate fi determinat conform metodei Wachstein
i Meissel (1969), metoda cu plumb, utiliznd ca substrat sarea disodic a ATPului, n tampon Tris Maleat.
Mod de lucru (protocol):
a) Incubarea seciunilor de creier, efectuate cu criotomul, timp de o or, la
37C. n cazul esuturilor vegetale (de exemplu, se poate utiliza epiderma
superioar a tunicilor de ceap) perioada de incubaie se poate reduce la 30
de minute, n urmtorul mediu:
soluie sare disodic a ATP 0,125 %

20ml

tampon Tris Maleat, 0,2 M, pH=7,2

20ml

Pb(NO3)2 2%

3ml

MgSO4 1M

5ml

H2O bidistilat

2ml

Observaie: La turnarea azotatului de plumb, acesta se va pune pictur cu


pictur, sub agitare, pentru a evita precipitarea. Se prepar numai inainte de
folosire.
b) Se spal n ap distilat, n cinci schimburi
c) Se trateaz 1-2 minute cu soluie 2% de polisulfur de amoniu
d) Se spal din nou n ap distilat timp de 2 minute
e) Se monteaz i se examineaz microscopic ca i n cazurile anterioare

68

3.4. Aparatul Golgi


3.4.1. Impregnarea argentic a aparatului Golgi prin metoda Cajal - Da
Fano
Materiale necesare: creier, microtom i materiale pentru tehnica includerii n
parafin sau secionarea esutului cu ajutorul criotomului.

Mod de lucru (protocol):


a) Fixare timp de 8-12 ore, la 10C n lichidul Da Fano (se preparar
extemporan acest fixator din 85 ml de ap distilat, 1 g nitrat de Co i 15
ml de formol neutru)
b) Cltire cteva secunde cu ap distilat
c) Impregnare 24-48 ore, la 10C n soluie apoas 1% de azotat de argint
d) Splare 15-45 de minute cu ap distilat, schimbat de mai multe ori
e) Reducerea, cel puin 8 ore, n amestecul: ap distilat 85 ml, formol
neutru 15 ml, hidrochinon 1 g, sulfit de sodiu anhidru 0,5 g
f) Splare cteva minute cu ap distilat
g) Deshidratare, clarificare, includere n parafin, secionare, deparafinare,
colodinare, hidratare
h) Tonare, 5-10 minute cu soluie Cajal, soluie preparat prin amestecarea
n pri egale a dou soluii care se conserv separat. O soluie se prepar
adugnd n 100 ml de ap distilat, 3 g tiosulfat de sodiu i 3 g
sulfocianur de amoniu, iar cealalt prin introducerea a 1 g de clorur de
aur n 100 ml de ap distilat
i) Splare cu ap curent 2-5 minute
j) Deshidratare, clarificare, montare n balsam de Canada
Examinare microscopic: n neuroni, cu obiectivele uscate, se poate observa
aparatul Golgi, care apare negru iar citoplasmele apar cenuii.

69

3.5. Reticulul endoplasmatic


3.5.1. Glucozo-6-fosfataza, enzim marker pentru reticulul endoplasmatic
n cadrul metodei Wachstein-Meisel, enzima descompune prin hidroliz
glucozo-6-fosfatul din mediul de incubare n acid ortofosforic, care intr n reacie
cu azotatul de plumb insolubil, care apoi este transformat n sulfur de plumb (de
culoare neagr), cu ajutorul unei soluii de sulfur de amoniu.
Mod de lucru (protocol)
a) Seciunile prin esuturi bogate n glucozo-6-fosfataz (ficat, rinichi) se
obin numai la rece (criotom), deoarece enzima e foarte sensibil la cldur.
b) Seciunile se incubeaz 5-15 minute, la 32C, n urmtorul mediu: soluie
apoas de 0,125% de glocozo-6-fosfat, sare de potasiu-20ml; tampon Tris-HCl
0,2M cu pH = 6,7-20ml; soluie azotat de Pb 2%-3 ml; ap distilat-7 ml.
c) Se spal seciunile cu ap distilat
d) Se introduc n soluia de sulfur de amoniu 2%, timp de 1 minut
e) Se spal cu ap distilat
f) Postfixare n formol neutru 10%, timp de 2 minute
g) Se monteaz seciunile ntr-un mediu hidrosolubil.
Examinare microscopic, cu obiectivele mari (40x, 100x).
Locurile cu activitate enzimatic apar colorate n nuane de la brun la negru.
3.6. Lizozomii
Vezicule sferice de 0,3-1, delimitate de o membran lipoproteic i cu un
extrem de complex coninut de hidrolaze (fosfataze, proteaze, ribonucleaze, lipaze,
aril-sulfataze), particip la procesul de digestie intracelular, att a substanelor din
exteriorul celulelor (substane organice, virusuri, bacterii), ct i a componenilor
celulari mbtrnii (mitocondrii, reticul endoplasmatic etc.).
3.6.1. Evidenierea fagozomilor n leucocite
Materiale necesare: snge recoltat pe anticuagulant, suspensie de microbi,
reactivii May-Grnwald i Giemsa, lame, hrtie de filtru, pipete Pasteur, ulei de
cedru.

70

Mod de lucru: se amestec ntr-o eprubet de plastic, 1ml de snge recoltat


pe heparin cu 10 ml suspensie de microbi. Se incubeaz amestecul la 37C, timp
de 30 de minute, ntr-o baie de ap cald, cu agitare lent (18-20 rotaii pe minut).
Din acest amestec se ntinde un frotiu, care se coloreaz dup metoda MayGrnwald-Giemsa, prezentat ntr-o lucrare anterioar. Lamele se usuc, aezndule pe o hrtie de filtru ntr-o poziie apropiat de vertical.
Examinare microscopic: se va face cu obiectivul de imersie. Dintre
leucocite, monocitele (macrofage) i neutrofilele (microfage) sunt capabile de
fagocitoz (endocitoza particulelor solide). Particulele microbiene sunt preluate din
mediul extracelular i sunt nglobate n celule, prin intermediul unor vezicule care
se desprind din membrana plasmatic i care se vor numi fagozomi (vezi figura
10).

Figura 10 1 Leucocit polimorfonuclear; 2 Nucleu polilobat; 3 Microbi fagocitai;


4 Hematii (d. G. Benga, 1997).

Lizozomii primari, reprezentai de granulaiile din citoplasma leucocitelor,


au echipamentul enzimatic hidrolazic inactiv. Acetia fuzioneaz cu particulele
microbiene, care urmeaz s fie digerate, deci cu fagozomii. Astfel, ia natere un
lizozom secundar (fagolizozom), enzimele devin active, rezultnd practic o
vacuol digestiv.
3.6.2. Fosfataza acid, enzim prezent la nivelul sistemului lizozomal
Materiale necesare: bulbi de ceap, lame, lamele, hrtie de filtru, cutii Petri,
Sudan III, reactivi.
Mod de lucru (protocol):

71

Determinarea fosfatazei acide se poate face dup

metoda lui Gmori.

Aceasta se bazeaz pe faptul c, n prezena unui substrat adecvat i a ionilor de


plumb, n zonele unde este localizat fosfataza acid, se formeaz un precipitat de
culoare neagr. Enzima descompune prin hidroliz -glicerofosfatul de sodiu, din
mediul de incubaie, n glicerin i acid fosforic. Acidul fosforic intr n reacie cu
acetatul de Pb, rezultnd fosfat de Pb insolubil, care apoi este transformat n
sulfur de Pb neagr, cu ajutorul unei soluii de sulfur de amoniu..
a) Epidermele superioare jupuite de pe tunicile de ceap alb, vor fi incubate
timp de 10 minute, la temperatura camerei, n urmtorul mediu: 50 ml
tampon acetat 0,2 M, pH=5,4 i 5 ml -glicerofosfat de Na 3%, proaspt
preparat, la care se adaug 80 mg cristale de acetat de Pb.
b) Splare cu ap distilat, 5 minute
c) Transfer n acid acetic 2%, 2 minute
d) Splare cu ap distilat, 2 minute
e) Transfer n polisulfur de amoniu 1%, 1 minut
f) Splare cu ap distilat i efectuarea preparatului microscopic
Examinarea microscopic: mai nti cu obiectivul 10x, apoi cu obiective cu
o putere de mrire mai mare, 20x i 40x.
n urma studiilor fcute, cercettorii susin (innd cont de faptul c o
enzim marker pentru evidenierea sistemului lizozomal este fosfataza acid), c n
celulele vegetale, pe lng lizozomii descrii mai sus, care au o rspndire mai
limitat, exist i aa numiii fitolizozomi, structuri celulare rspunztoare i ele de
activitile de digestie intracelular. Dintre fitolizozomi, sferosomii, care se
observ n celulele epidermei de ceap alb, n apropierea nucleului, dup metoda
lui Gmori, sunt vezicule delimitate de o membran lipoproteic, avnd
dimensiunea de 1,5 , putnd ajunge pn la 2,5 , n care sunt depozitate lipide. O
alt modalitate de evideniere a lor, este colorarea cu Sudan III, care coloreaz
lipidele n rou. Prezena fosfatazei acide n sucul vacuolar face ca i vacuolele s
fie considerate ca aparinnd sistemului lizozomal.

72

3.7. Cilii i flagelii


Dei nu sunt componente fundamentale ale celulelor, cilii i flagelii sunt larg
rspndii n lumea animalelor i n lumea vegetal. La animale ei se ntlnesc la
unele protozoare (parameciul) dar i la metazoare (la unii spongieri, viermi lai
etc.), precum i la gameii brbteti (spermatozoizii), iar n lumea vegetal, la
flagelate (Euglena), la algele verzi unicelulare (Chlamydomonas) i coloniale
(Volvox aureus), la anumite celule reproductoare (zoospori, zoogamei) de la
plante (de exemplu, la pteridofite).
3.7.1. Preparate microscopice din suspensii de Euglena viridis i
Chlamydomonas
Materiale necesare: eprubete cu alge, pipete, lame, lamele, ervete, hrtie de
filtru.
Mod de lucru: se fac preparate provizorii, utiliznd cteva picturi din
suspensia de alge.
Examinare microscopic: mai nti pe obiectivul de 10x, apoi pe 20x i 40x.
La Euglena vom observa existena unui singur flagel, iar la Chlamydomonas a doi
flageli.
3.7.2. Preparate microscopice din spematozoizi de bovine conservai n azot
lichid (-196C)
Materiale necesare: fiole cu material, baie cu ap cald la 37C, pipete, lame,
lamele, ervete, hrtie de filtru.
Mod de lucru: se decongeleaz rapid materialul prin introducerea fiolelor n
ap cald i se fac apoi preparate provizorii.
Examinare microscopic: mai nti pe obiectivul de 10x, apoi pe 20x i 40x,
vom observa spermatozoizii i flagelul lor.
3.8. Nucleul i diviziunea celular
Nucleul reprezint centrul de comand i control al activitii vitale a unei
celule eucariote. Este alctuit din nveliul nuclear dublu prevzut cu pori,
nucleoplasm i cromatin (nucleoprotein n care ADN-ul este organizat cu
ajutorul proteinelor histonice) i unul sau civa nucleoli. n timpul diviziunii

73

nucleului, cromatina se organizeaz n cromozomi, vizibili la microscop, n numr


constant pentru fiecare specie.
3.8.1. Izolarea nucleilor hepatici
Materiale necesare: ficat de obolan, soluie de omogenizare format din
sucroz 0,44 M, ajustat la pH 5,8 cu acid citric, hrtie de pH, soluie de splare
format din sucroz 0,25 M, preparat n acid citric 1,5%, alcool metilic absolut,
soluie Giemsa, ap distilat, centrifug pentru minim 3000 rotaii/minut,
omogenizator Potter, microscop optic, lame, lamele, cristalizoare, eprubete de
centrifug, pipete, vas cu ghea.
Mod de lucru: se mrunete ficatul cu o foarfec, apoi se spal ntr-un
cristalizor cu soluia de omogenizare (sucroz 0,44 M, cu acid citric), care trebuie
s fie rece, la 4C, pentru ndeprtarea hematiilor. Ficatul mrunit se introduce
ntr-o eprubet de omogenizare, adugndu-se 2-3 ml de soluie de omogenizare
rece, de la ghea. Se omogenizeaz cu omogenizatorul Potter, de 3 ori cte un
minut. ntre dou omogenizri succesive eprubeta cu omogenatul se pune n vasul
cu ghea, pentru cte 3 minute. Omogenatul celular obinut se dilueaz la 10 ml cu
soluie de omogenizare i se centrifugheaz la 500 rotaii/minut, timp de 10
minute. Prin aceast centrifugare se depun n sediment fragmentele de esut
neomogenizate. Se colecteaz supernatantul i se centrifugheaz din nou la 3000
rotaii/minut, 15 minute. La aceast centrifugare se depun n sediment nucleii. Se
aspir supernatantul, iar sedimentul de nuclei se resuspend n 10 ml soluie de
splare (sucroz 0,25 M preparat n acid citric 1,5%). Se va avea grij ca
sedimentul s fie splat bine, prin folosirea unei pipete Pasteur, prin aspirarerefulare repetat. Se centrifugheaz apoi la 3000 rotaii/minut, 15 minute. Se aspir
supernatantul i se repet splarea i centrifugarea nc de dou ori, realizndu-se
astfel splarea nucleilor de detritusurile citoplasmatice. Acidul citric are rolul de a
solubiliza proteinele citoplasmatice i de a nltura aderena lor la membrana
nuclear, iar folosirea mediului izoton de sucroz asigur pstrarea morfologiei
intacte a nucleilor. Sedimentul de nuclei se fixeaz prin suspendare n alcool
metilic absolut, timp de 15 minute. Pe o lam de microscop se pune o pictur de

74

suspensie nuclear i se ntinde un frotiu. Dup uscare, frotiul se acoper 10


minute cu soluie Giemsa 10%, n vederea colorrii. Se spal cu ap de robinet i
apoi se acoper pentru 1 minut cu ap distilat, pentru diferenierea coloraiei i se
usuc la temperatura camerei.
Examinare microscopic: privii la microscop nucleii, colorai n rou, au o
morfologie intact. Dac sunt prezente detritusuri citoplasmatice, se recomand ca
sedimentul s mai fie splat de cteva ori pentru a obine o suspensie ct mai pur.
Sedimentul de nuclei poate fi utilizat pentru extracia de ADN.
3.8.2. Evidenierea firului de ADN
Materiale necesare: ficat sau timus de broasc, pahare Berzelius, baghete de
sticl, mojare cu pistil, sticl pisat, eprubete de centrifug, centrifug, soluie
NaCl 0,14 M, dodecil sulfat de sodiu,SDS, 5% n alcool etilic 45%, alcool etilic
96%.
Mod de lucru: se mojareaz utiliznd sticl pisat 1 g de ficat sau de timus
de broasc, tiate n prealabil cu o foarfec n fragmente mici. Se adaug apoi, 12
ml de soluie NaCl 0,14 M i se omogenizeaz amestecul. Omogenatul se
decanteaz ntr-un pahar Berzelius, se adaug imediat 2,5 ml de soluie SDS 5% i
se agit timp de 5 minute. n acest amestec se introduc, sub form solid, 0,7g de
NaCl, urmrindu-se de fapt ca soluia de NaCl s ajung la o concentraie de 1M.
Amestecul se agit timp de 30 de minute, se adaug apoi 12 ml soluie NaCl 0,14
M i 2 ml SDS 5% i se continu agitarea nc 10 minute. Sub aciunea SDS 5%,
n prezena NaCl 1M, proteinele din structura cromatinei sunt denaturate.
Amestecul rezultat, se repartizeaz n eprubete de centrifug i se centrifugheaz la
3500 r/m, timp de 30 de minute, pentru a ndeprta proteinele denaturate. n
paharele Berzelius, se trateaz 20 ml din supernatantul rezultat cu 40 ml de alcool
etilic 96%. Alcoolul se toarn treptat, agitndu-se coninutul paharului cu o
baghet de sticl. Cu ochiul liber sau cu lupele de mn se observ c, ADN-ul
precipit sub forma unui fuior i, prin rsucire, firele se nfoar pe bagheta de
sticl.
Diviziunea celular

75

Multiplicarea celulelor (citochineza) este precedat ntotdeauna de


diviziunea nucleului (cariochineza). Se deosebesc dou tipuri de diviziune a
nucleului: mitotic (somatic, ecvaional) i meiotic (reducional).
Diviziunea ecvaional (mitoza)
Mitoza este diviziunea rspunztoare de creterea i dezvoltarea
organismelor, desfurndu-se n celulele somatice (gr. soma = corp), diploide (2n)
ale acestora. La plante mitoza este deosebit de intens la nivelul meristemelor
(esuturilor embrionare) ( gr. meristos = a se divide).
Studiul mitozei se poate face pe preparate provizorii, efectuate prin metoda
rapid carmin-acetic sau pe preparate permanente, efectuate dup tehnica
Feulgen.
3.8.3. Pregtirea preparatelor pentru evidenierea mitozei prin metoda
rapid carmin-acetic
Materiale necesare: bulb de ceap, lame, lamele, pipete, sticle de ceas,
soluie carmin-acetic, soluie Carnoy, spirtiere, ervete.
Mod de lucru: un bulb de ceap se ine cteva zile n ap pentru a forma
rdcini adventive. De la rdcinile de circa 10 mm lungime, se taie vrfurile lungi
de circa 5 mm, ntre orele 11-13.30, pentru a surprinde un numr mai mare de
celule n diviziune. Materialul prelevat se conserv n soluia Carnoy, timp de 24
de ore. Apoi, vrfurile de rdcin se pun n sticle de ceas, n soluia carminacetic, care coloreaz cromozomii n rou. Materialul se nclzete timp de 5
minute la flacra unei spirtiere, evitndu-se fierberea. Pe lama port-obiect se pune
o pictur de soluie carmin-acetic proaspt i n aceasta se include un vrf de
rdcin. Se aplic lamela i cu partea neascuit a unui creion se lovete uor
lamela pn ce esutul meristematic al rdcinii se etaleaz ntr-un singur strat
(engl. squash = a zdrobi, a terciui). n acest timp lamela se ine fix, apsnd cu
degetul un col al acesteia pe care s-a pus puin hrtie de filtru. n preparatele
obinute prin aceast metod nu se menine integritatea esutului din vrful
vegetativ meristematic al rdcinii, celulele fiind chiar izolate.

76

3.8.4. Obinerea preparatelor prin tehnica Feulgen


La analiza cromozomilor n diviziune, se folosete astzi tot mai frecvent
metoda Feulgen. Ea se bazeaz pe proprietatea pe care o are reactivul Schiff
(fuxina bazic) de a colora cromozomii n rou-violaceu. Se folosete fixatorul
Carnoy, dar rdcinile de ceap se pot fixa i dup Navashin i colora dup
Feulgen.
Materiale necesare: bulb de ceap, fiole de sticl, soluie apoas de bromonaftalen, soluie Carnoy, HCl N/10, Reactiv Schiff, acid acetic glacial 45%,
albumin glicerinat, lut special, lame, lamele, pipete, ervete
Mod de lucru: vrfurile vegetative meristematice ale rdcinilor adventive
ale bulbului de ceap, se trec prin urmtoarele faze succesive:
Prefixarea are rolul de a inhiba formarea fusului nuclear i ca urmare se
individualizeaz clar cromozomii. Prefixarea materialului se face cu o soluie
apoas de -bromonaftalen, timp de 3-5 ore.
Fixarea, dup prefixare, const n nlturarea soluiei de -bromonaftalen i
nlocuirea ei cu fixator Carnoy. Fiolele cu material se in 12-15 ore la temperatura
de 0-4C.
Hidroliza presupune ndeprtarea fixatorului din fiole i nlocuirea lui cu 2-3
ml de HCl (N/10). Se introduc fiolele n termostat, la 60C i se las un anumit
timp pentru hidroliz (10 minute pentru vrfurile vegetative meristematice de la
ceap). Hidroliza materialului asigur macerarea esuturilor, o colorare bun i o
etalare unistrat a lor.
Dup hidroliz urmeaz colorarea, cnd se nltur HCl i se nlocuiete cu
2-3 ml din reactivul Schiff. Dup 10-15 minute vrfurile vegetative meristematice
se coloreaz n rou-violaceu. Dac dorim s obinem o colorare intens,
prelungim timpul pn la o jumtate de or sau chiar o or.
Efectuarea propriu-zis a preparatelor se face dup metoda etalrii prin
apsare (squash). Vrfurile vegetative meristematice se scot din colorant i se pun
pe lam ntr-o pictur de acid acetic glacial 45%. Se aaz lamela, uns n
prealabil cu albumin glicerinat i uor nclzit, dup care, cu ajutorul unui

77

creion sau b de chibrit, se lovete deasupra pn cnd materialul se etaleaz


unistrat sub lamel. Preparatele obinute se luteaz, putnd fi astfel pstrate o
perioad lung de timp.
Examinarea microscopic: celulele meristematice sunt mici, izodiametrice i
prezint nuclei mari. Cu ajutorul unui obiectiv mare, 20x sau 40x, se analizeaz
meristemul, n care se gsesc celule n diferite faze ale ciclului celular (vezi figura
11).
Interfaza se recunoate n celulele care au nucleii bine conturai i conin 12 nucleoli.
Celulele aflate n profaz prezint nuclei mai voluminoi n care ncep s se
observe cromozomii, ca urmare a spiralizrii cromonemelor. ncepe formarea
fusului de diviziune, iar la sfritul profazei se observ clivarea cromozomilor
bicromatidici n cele dou cromatide, care rmn unite prin centromer (apariia de
fante intercromatidice).
Metafaza se caracterizeaz prin aezarea cromozomilor bicromatidici n
partea ecuatorial a celulei, cu braele lor foarte lungi ndreptate n afar i cu
centromerul spre centru, formnd placa metafazic.
n anafaz, se pot observa n preparate, celule cu dou grupuri de cromozomi
monocromatidici, care se deplaseaz cu centromerii nainte i braele napoi, spre
cei doi poli ai celulei.
Telofaza se caracterizeaz prin gruparea cromozomilor monocromatidici la
cei doi poli celulari i individualizarea a doi nuclei n care cromozomii sunt subiri,
despiralizai i nu mai sunt vizibili. Telofaza ncheie cariochineza, urmnd
citochineza, adic diviziunea citoplasmei i a organitelor acesteia prin apariia, n
partea mijlocie a celulei, a unui perete despritor numit fragmoplast.
Numrul mare de celule aflate n interfaz i n profaz demonstreaz c
aceste faze au o durat mai mare dect celelalte faze ale ciclului celular.

78

79

Figura 11 Mitoza din vrful vegetativ de la Allium cepa (2n = 16) preparate obinute prin
etalare: 1 nucleu interfazic; 2 profaz timpurie; 3-5 profaz avansat; n 4 se vd fante
cromatidice; 6, 7 metafaz, cromozomi cu fant intercromatidic; 8-10 etape ale anafazei; 11
telofaz; 12 nceput de interfaz a nucleelor fii (d. Braune & colab., din M. Andrei i
colab., 2003)

Diviziunea celular prin nmugurire


nmugurirea reprezint o modalitate de multiplicare a celulelor caracteristic
drojdiilor, iar dintre nevertebrate unii spongieri, hidrele (hidra de ap dulce) se
nmulesc asexuat n acest mod.
3.8.5.

Diviziunea

celular

prin

nmugurire

la

drojdia

de

bere

(Saccharomyces cerevisiae)
Materiale necesare: drojdie de bere proaspt, cutii Petri, lame, lamele,
pipete
Mod de lucru: cu 24 de ore nainte de analiza materialului, drojdia de bere
bine omogenizat, se las ntr-un vas la o temperatur de 18-28C. Se ia o cantitate
mic din omogenat i se amestec cu o soluie de albastru de metilen, n 500 ml
ap de robinet. Se las 10 minute n vederea colorrii (albastrul de metilen
coloreaz nucleii n albastru), dup care se ia cu pipeta din omogenat, se pune pe o
lam de sticl i se acoper cu lamela.
Examinare microscopic: folosind un obiectiv puternic, chiar obiectivul cu
imersie, se pot observa celule rotunde izolate, cu sau fr mugurai, colorate n
albastru deschis (vezi figura 12). Fiecare celul conine citoplasm, nucleu i o
vacuol mare. Formarea muguraului ncepe prin nmuierea peretelui celular ntr-o
anumit regiune. Citoplasma mpinge n afar poriunea respectiv de perete
celular i astfel se formeaz un mugura. Concomitent cu formarea muguraului
are loc i diviziunea nucleului celulei mame. Unul din nuclei ptrunde n mugura,
dup care acesta ncepe s se dezvolte pn atinge dimensiunile celulei mam,
dup care se desprinde. Deseori muguraii rmn ataai de celula mam, dnd
natere, la rndul lor, la ali mugurai.

80

Figura 12 Diviziunea prin


nmugurire la Saccharomyces
cerevisiae:
1 etape n diviziunea
celular; 2 microfotografie:
ci citoplasm;
m mugura (blastospor) n
formare;
n nucleu;
pc perete celular;
v vacuol.
Sgeile indic stadiile de
formare a noilor celule
provenite din mugurai.
(1 d. Strasburger, din M.
Andrei & colab., 2003;
2 d. M. Andrei & colab.,
2003).

Diviziunea reducional (meioza)


Meioza este diviziunea rspunztoare de formarea celulelor haploide (n),
reproductoare sexuate din lumea animal (ovule i spermatozoizi) i de formarea
celulelor reproductoare asexuate (micro- i macrospori), n lumea vegetal. n
urma meiozei (gr. meiosis = mpuinare) dintr-o celul mam diploid (2n) rezult
4 celule fiice cu un numr de cromozomi redus la jumtate (n).

81

3.8.6. Meioza n anterele staminelor florii de crin (Lilium candidum)


Materiale necesare: antere din flori n stadiul de boboc de la crin (2n = 24),
colectate din luna mai pn la mijlocul lunii iunie. Pentru analiza meiozei pot fi
utilizate, n octombrie-noiembrie, antere din florile de zambile, Hyacinthus
orientalis.
Mod de lucru: anterele se desprind cu o foarfec fin din boboci, ct mai
devreme dimineaa, n zilele calde. Se fixeaz imediat n Carnoy, timp de 24 de
ore, dup care se prelucreaz prin metoda rapid carmin-acetic, pentru obinerea
de preparate provizorii, iar pentru obinerea de preparate permanente, se aplic
reacia Feulgen. Dac nu se prelucreaz imediat, anterele fixate pot fi transferate i
conservate n alcool 70%, pn n momentul folosirii lor.
Examinare microscopic: ncepe cu obiectivul 10x, cnd se vor observa
celule ale peretelui anteral i, n funcie de celulele mam ale microsporilor (2n)
din interiorul anterei, stadiul meiozei. Se trece la analiza preparatelor cu obiectivul
40x. Fazele meiozei nu pot fi reperate ntr-un singur preparat i nici ntr-o
succesiune caracteristic acestei diviziuni.
Meioza se realizeaz prin dou diviziuni succesive. Prima diviziune meiotic
I este reducional sau heterotipic (gr. heteros = diferit), a doua diviziune meiotic
II, este ecvaional sau homeotipic (gr. homois = la fel). Ambele diviziuni parcurg
aceleai etape ca i n cazul mitozei (vezi figura 13).
Etapa heterotipic, se mai numete reducional deoarece numrul de
cromozomi se reduce de la 2n la n. Se desfoar ca i mitoza n pro-, meta-, ana-,
i telofaz i se ncheie cu citochineza.
Interfaza se caracterizeaz prin evenimente replicative, n urma crora are
loc dublarea ADN, ARN i a proteinelor. n interfaz, nucleii celulelor esutului
sporogen (2n) din interiorul anterelor cresc de 3-4 ori n dimensiuni i se coloreaz
intens.
Profaza I, este o faz deosebit de lung i se desfoar n cteva stadii
succesive: leptoten, zigoten, pachiten, diploten i diachinez.

82

83

Figura 13 Diviziunea meiotic la o plant cu 2n = 14 (schematic): 1 leptoten;


2 zigoten; 3 pahiten; 4, 5 metafaza I; 6, 7 anafaza I; 8 citochineza; 9 diad
microsporal n profaza II; 10 metafaza II; 11, 12 anafaza II; 13-16 formarea tetradei
microsporale; 17-18 microspori (n = 7) separai din celula mam microsporal; pc fragmente
din peretele celular al celule-mam microsporale (d. M. Andrei i colab., 2003).

a. Leptotenul (gr. leptos = subire i nema = filament), este etapa n care


cromozomii lungi i foarte subiri au cromatide strns alipite, de aceea par
monocromatidici.
b. Zigotenul (gr. zigon = jug), este stadiul n care cromozomii se spiralizeaz
devenind mai scuri, apoi, cromozomii omologi se mperecheaz prin
procesul numit sinaps, formnd aa numiii bivaleni. La Lilium, nucleele
sunt att de mari nct se poate observa mperecherea cromozomilor
omologi.
c. Pachitenul (gr. pachys = gros), este stadiul n care cromozomii puternic
spiralizai sunt mai groi, iar bivalenii au cte 4 cromatide evidente, de
aceea se mai numesc i tetrade cromatidice, fiecare bivalent avnd cte 2
centromeri. La un moment dat are loc o micare de separare a cromozomilor
omologi, acesta nerealizndu-se complet, pentru c ei rmn unii n unul
sau mai multe puncte numite chiasme.
d. Diplotenul (gr. diplos = dublu), se finalizeaz printr-un schimb egal de
material genetic realizat ntre cromozoni omologi, la nivelul chiasmelor,
schimb care reprezint manifestarea citologic a procesului de crossing-over.
n urma crossing-overului, cromatidele prezint un mozaic genetic matern i
patern.
e. Diachineza, se caracterizeaz prin scurtarea puternic a cromozomilor, care
ncep s se despart. La sfritul diachinezei dispare nucleul i membrana
nuclear, iar la cei doi poli ai celulei apar filamentele fusului de diviziune.
Metafaza I, n care se desvrete formarea fusului de diviziune. Bivalenii
se prind de filamentele fusului, la nivelul plcii ecuatoriale, prin centromerii care
rmn ntregi, fiecare centromer fiind orientat ctre un pol al fusului.

84

Anafaza I, cnd are loc separarea tetradelor bivalenilor n cte doi


cromozomi biocromatidici, recombinai genetic, i are loc deplasarea lor ctre cei
doi poli ai celulei. Se realizeaz reducerea la jumtate a numrului de cromozomi,
fenomen care reprezint diferena esenial ntre prima i a doua diviziune
meiotic.
Telofaza I, se caracterizeaz prin faptul c, cromozomii biocromatici ajuni
la polii celulei se alungesc prin despiralizare, apar necleolii i membrana nuclear,
formndu-se doi nuclei haploizi. Urmeaz citochineza I cnd se formeaz
fragmoplastul, apoi peretele celular, ntre cele dou celule fiice (diad
microsporal), care vor avea un numr de cromozomi redus la jumtate comparativ
cu celula mam. Astfel, se formeaz dou celule fiice haploide (n) care au provenit
dintr-o celul mam diploid (2n).
Etapa homeotipic, se mai numete i somatic deoarece, aparent, este
echivalent cu o mitoz. Se desfoar sincron n ambele nuclee fiice. Dup
meioza I se trece printr-un stadiu scurt numit interchinez, dup care nucleele intr
n meioza II.
Profaza II, n care cromozomii bicromatidici sunt despiralizai. La sfritul
profazei membrana nuclear se fragmenteaz i apare fusul de diviziune.
Metafaza II, cnd cromozomii se orienteaz n planul ecuatorial al fusului de
diviziune.
Anafaza II se caracterizeaz prin faptul c, spre cei doi poli ai fusului se
deplaseaz cromozomii monocromatidici.
Telofaza II, cnd se formeaz 4 nuclee fiice, care au cromozomi
monocromatidici.
Citochineza II, presupune formarea noului perete celular i, ca urmare, iau
natere tetrade haploide de microspori (tetrade microsporale), protejate de peretele
celular al celulei mam, tetrade care din punct de vedere genetic nu concord ntre
ele.

85

Meioza, prin producerea crossing-overului, determin o redistribuire a


genelor ntre cromozomii omologi, deci o recombinare a factorilor genetici, mrind
posibilitatea de adaptare la condiiile de mediu.

4. ASPECTE STRUCTURALE PRIVIND CELULELE EUCARIOTE


VEGETALE
4.1. Peretele celular, punctuaiuni i plasmodesme
Prezena peretelui celular, care este alctuit n special din celuloz,
hemiceluloz i substane pectice (peretele celular primar), la care se mai adaug
uneori i alte substane ca: lignina, suberina, cutina, taninul, srurile minerale
(peretele celular secundar), constituie o particularitate major a celulei vegetale.
4.1.1. Digestia peretelui celular primar i obinerea de protoplati din
mezofilul frunzelor de mazre (Pisum sativum)
Materiale necesare: frunze de mazre de pe ramurile tinere, de la plante de 57 sptmni crescute n ser, cutii Petri, bisturiu, foarfece, pense, lame, lamele,
hrtie de filtru, amestec enzimatic.
Mod de lucru: cu 30 de ore naintea utilizrii frunzelor, ramurile sunt tiate
i inute la ntuneric. Frunzele se sterilizeaz 1,5 minute cu alcool etilic 70%, apoi
se spal cu ap distilat pentru ndeprtarea alcoolului. Cu ajutorul unui bisturiu i
a unei pense fine se ndeprteaz cu grij epiderma. Se taie esutul dintre nervurile
principale n fragmente mici (0,5-0,8 g de esut), cu ajutorul unei foarfece i se
introduce ntr-o cutie Petri cu amestec enzimatic (5 ml). Sub aciunea amestecului
enzimatic, care trebuie s aib pH-ul 6,2 i s conin: pectinaz 2,5 mg/ml,
celulaz 5 mg/ml, hemicelulaz 5 mg/ml, un stabilizator osmotic (sorbitol sau
manitol) 36,4 mg/ml i o surs de ioni de calciu, reprezentat de CaCl 2 x 2H2O 0,9
mg/ml i CaH4(PO4)H2O 0,1 mg/ml, are loc macerarea esutului i degradarea
pereilor celulari primari. Se nfoar cutia Petri ntr-o folie de aluminiu, pentru

86

mpiedicarea unor reacii de lumin i se incubeaz timp de 4-6 ore, n condiii de


agitare continu, la o vitez de 30 de rotaii/minut, la temperatura camerei.
Examinare microscopic : dup realizarea incubrii se pot observa, cu
obiectivul 10x, n preparatele proaspete efectuate din suspensia de protoplati,
obinut dup descrierea de mai sus, protoplati nuzi, sferici, fragmente de esut
nedigerat i protoplati distrui. n zona periferic a citoplasmei protoplatilor, se
remarc cloroplastele situate linear.
4.1.2..Modificri chimice secundare ale pereilor celulari. Izolarea cuticulei
frunzelor
Materiale necesare: frunze proaspete de garoafe, de ficus, soluie concentrat
de acid cromic n acid azotic concentrat, clorur de zinc iodat, lame, lamele,
pipete, hrtie de filtru.
Mod de lucru: frunzele se taie n buci mici i se pun n soluia concentrat
de acid cromic n acid azotic concentrat. Fragmentele de frunze astfel tratate devin
rapid brune pn la negricioase. Meninerea lor n acid crom-azotic trebuie s
dureze pn la distrugerea substanelor organice n afar de cuticul, ceea ce
dureaz 1- 4 ore, n funcie de natura materialului. Dup aceea, cuticula plutete la
suprafaa soluiei ca o pelicul. Se spal cuticula cu ap de robinet i poate fi
analizat imediat ntr-o pictur de ap. Un contrast mai puternic se obine prin
introducere sub lamela preparatului a unei picturi de clorur de zinc iodat, ceea
ce duce la colorarea cuticulei n maroniu.
Examinare microscopic: cu obiectivele cu putere mic de mrire, 6x sau
10x. O colorare bun a cuticulei se poate realiza folosind o soluie de Sudan III,
care coloreaz lipidele (cutina) n rou. Depunerea cutinei sub forma unei pturi
continui, de grosime variabil de la specie la specie, pe pereii celulari externi ai
celulelor epidermale ale frunzelor, este cunoscut sub denumirea de cuticularizare.
4.1.3.Suberul de la exteriorul tuberculilor de cartof ( Solanum tuberosum)
Materiale necesare : tuberculi de cartof, cutii Petri, ace ascuite sau spatulate,
lame de ras, lame, lamele, hrtie de filtru, ervete, Sudan III.

87

Mod de lucru : se execut seciuni transversale fine prin coaja tuberculului


de cartof i se adun ntr-o cutie Petri cu ap. Se selecteaz cele mai fine seciuni i
se coloreaz cu Sudan III. Se face un preparat microscopic, montat n ap de
robinet.
Examinare microscopic : cu obiectivul 10x, observm un esut alctuit din
cteva straturi de celule dispuse unele sub altele, fr spaii intercelulare. Acest
esut este numit suber (plut) i este alctuit din celule a cror pereii celulari au
depuneri secundare de lipide ( suberin ), care se coloreaz n rou cu Sudan III.
4.1.4.Colenchimul angular i sclerenchimul scleros n seciune transversal
prin tulpina de dovleac (Cucurbita pepo)
Materiale necesare: tulpini de dovleac conservate n alcool 70%, cutii Petri,
pense, ace ascuite i spatulate, pipete, lame de ras, rou de Congo i verde de iod.
Mod de lucru: se efectueaz seciuni transversale prin tulpini i se las s
cad n cutiile Petri cu ap. Se aleg cele mai fine seciuni, se introduc n sticlele de
ceas i se acoper cu rou de Congo (coloreaz celuloza n rou), lsndu-se la
colorat, timp de 1 minut. Se decanteaz roul de Congo i se acoper seciunile cu
verde de iod (coloreaz lignina n verde), lsndu-se la colorat, timp de 30 de
secunde. Se decanteaz colorantul din nou i apoi se spal bine seciunile n cutiile
Petri, cu ap de robinet. Se efectueaz preparate microscopice proaspete.
Examinare microscopic: cu obiectivul 10 x, se observ sub epiderm
colenchimul angular i, sub acest esut mecanic se gsete sclerenchimul scleros,
un alt esut mecanic, mult mai rezistent.
Pereii celulari primari ai celulelor ce alctuiesc colenchimul angular, se
coloreaz n rou cu rou de Congo, observndu-se depunerile suplimentare de
celuloz la unghiurile celulelor.
Sclerenchimul scleros se coloreaz n verde cu verdele de iod datorit
depunerilor de lignin n pereii celulari i spre lumenul celulelor . Peretele celular
astfel modificat secundar, va fi foarte ngroat, lumenul celulelor va deveni foarte
mic, iar protoplatii vor fi distrui..

88

4.1.5. Punctuaiuni i plasmodesme n endospermul secundar al seminelor


de curmal (Phoenix dactylifera)
Materiale necesare: semine de curmal, brici sau lam de ras, lame, lamele,
hrtie de filtru, pipete, cutii Petri, sticle de ceas, soluie Lugol, H 2SO4 25%, violet
de genian, glicerin sau glicerin gelatinat.
Mod de lucru: seminele de curmal se taie n dou i se in cteva minute n
ap, pentru nmuierea pereilor celulari ai celuleor din endospermul secundar. Se
fac seciuni transversale foarte fine cu ajutorul briciului, seciuni care se
imersioneaz timp de o or ntr-o soluie Lugol (IIK) concentrat, apoi se transfer
pentru 10-12 ore n H2SO4, soluie apoas 25%. n acest timp acidul sulfuric
realizeaz hidroliza parial a unor compui chimici din pereii celulari i o
puternic imbibiie cu ap a acestora. Dup o splare repetat cu ap, seciunile
sunt colorate cu violet de genian la care se adaug 1-2 picturi de soluie Lugol i
se las 3-5 minute. Seciunile se spal cu ap distilat i se monteaz n glicerin
sau glicerin gelatinat.
Examinare microscopic: analiznd cu obiectivul 40x, observm celule
poligonale cu pereii celulari ntrerupi de punctuaiuni simple prin care trec
plasmodesmele (punile citoplasmatice intercelulare) (vezi figura 14).

Figura 14 Punctuaiuni i plasmodesme seciune transversal prin endospermul


seminal de Phoenix dactylifera: ci citoplasm; n nucleu; lm lamele mijlocii; pl
plasmodesme; ps punctuaiuni simple (d. Strasburger, din I. Anghel i colab., 1988).

89

4.2. Cloroplastele
Organite celulare care conin pigmeni fotoreceptori, cloroplastele se
ntlnesc la eucariotele fotosintetizante (dinoflagelate, diatomee, alge galben-aurii,
galben-verzui, verzi, roii, brune, muchi, ferigi, gimnosperme i angiosperme).
La alge, dimensiunile, numrul, forma i culoarea cloroplastelor (verde,
brun, roie) variaz foarte mult. Muli botaniti folosesc termenul de cromatofor
pentru a desemna

cloroplastele algelor. Majoritatea

acestor

cloroplaste

(cromatofori) au una sau mai multe granule proteice numite pirenoizi, n jurul
crora se afl granulele de amidon.
La plante, cloroplastele sunt organite lenticulare, de culoare verde, cu
dimensiunile de 3-10 m lungime i 1-4 m grosime, foarte uor de identificat la
microscopul fotonic.
4.2.1. Forme de cromatofori la alge
Materiale necesare: culturi de alge, pipete, foarfece, pense, ace ascuite sau
spatulate,lame, lamele, hrtie de filtru.
Mod de lucru: preparatele cu alge unicelulare se realizeaz n felul urmtor.
Cu o pipet se absoarbe din cultur i se depun una sau dou picturi pe lam i se
aplic lamela. n cazul formelor pluricelulare filamentoase, se taie filamentele
algale cu foarfecele, n fragmente de circa 1 cm. Cu pensa se iau cteva fragmente
de tal i se depun pe lam ntr-o pictur de ap. Cu ajutorul a dou ace ascuite
sau spatulate se separ filamentele ct mai bine, evitndu-se pe ct posibil
suprapunerile. Peste material se aeaz lamela, evitnd formarea bulelor de aer.
Examinarea microscopic: se face ntr-o prim etap cu obiectivul mic, 10x,
iar detaliile pot fi reliefate cu un obiectiv cu o putere de rezoluie superioar (20x,
40x, 90x).
Chlorella, alg verde unicelular, sferic, nu prezint nici mcar polaritate,
are un cromatofor ( gr.chroma = culoare, gr. phoros = purttor) n form de cup
n concavitatea cruia se afl nucleul.

90

Pleurococcus (verzeala zidurilor) alg verde a crei tal este un cenobiu,


adic o form de plant unicelular n care mai muli indivizi, nscui prin
diviziune ecvaional dintr-o celul mam, rmn alturai sub o membran
comun, care este membrana fostei celule mame.
Scenedesmus este tot o alg verde, tot un cenobiu, celulele de la extremitate
fiind prevzute cu codie.
Spirogyra (mtasea broatei), alg verde cu tal pluricelular filamentos
simplu. Este format din celule puse cap la cap n care ntlnim cromatofori sub
form de benzi n spiral. n fiecare celul pot fi unul s-au mai muli cromatofori n
form de panglic n spiral, cu marginile uor franjurate, pe care se afl pirenoizii
nconjurai de granule de amidon. Cu un obiectiv puternic se poate observa un
nucleu nconjurat de citoplasm i meninut n centrul celulei de cordoane
citoplasmatice ancorate, la rndul lor, de citoplasma parietal.
Cladophora (lna broatei) alg verde, tal pluricelular filamentos ramificat,
cu difereniere polar, prezentnd parte bazal (rizoidal) cu care se fixeaz pe
substrat precum i o ax principal din care se desprind subterminal ramificaii
laterale. n citoplasma fiecrei celule exist un cromatofor perietal, sub forma unui
cilindru perforat prevzut cu pirenoizi, n jurul crora se depoziteaz amidon,
precum i numeroi nuclei.
4.2.2. Cloroplastele

frunzei de ciuma apelor (Elodea canadensis) i

amidonul de asimilaie prezent n interiorul lor.


Materiale necesare: frunze de Elodea, lame, lamele, pipete, hrtie de filtru,
soluie Lugol, ulei de cedru.
Mod de lucru: pentru observarea granelor se detaeaz frunzele de pe
tulpinile inute n prealabil la ntuneric (evidenierea granelor poate fi deranjat de
prezena amidonului de asimilaie), se pun pe lam ntr-o pictur de ap de robinet
i se acoper cu lamela.
Pentru observarea amidonului de asimilaie se decoloreaz frunzele,
luminate intens n prealabil, cu alcool i se clarific cu ap de Javel, cu un mic

91

adaus din soluia Lugol, dup care se execut un preparat microscopic provizoriu,
montat n ap de robinet.
Examinare microscopic: se va analiza un cloroplast ct mai mare, cu
obiectivul de imersie. Cloroplastele apar sub form de discuri mici, plate, rotund
ovale, de 8-10m. Suprafaa plastidei prezint un desen alctuit din disculee verzi
nchis, dispuse n mod regulat, numite grana, n care sunt depozitai pigmenii
fotoreceptori. Distana dintre grane este egal peste tot.
Amidonul primar (de asimilaie), rezultat n urma procesului de fotosintez,
se coloreaz n albastru cu soluia Lugol.
4.2.3. Metoda spectrofotometric de determinare a pigmenilor fotoreceptori
(clorofila a i b, caroten i xantofil)
Materiale necesare: frunze proaspete de mucat, aceton 80% sau 100%.
Mod de lucru: se iau 2 g de frunze, se mojareaz i se toarn peste ele 20 ml de
aceton. Se amestec bine i se pun la frigider timp de o or. Se centrifugheaz
apoi amestecul la 2000 rot/min, timp de 10 minute. Se ia supernatantul i se face
un amestec de 1ml supernatant la 100 ml de aceton, amestec care nu va fi prea
concentrat pentru aparat. Absorbia se msoar la 662 nm pentru clorofila a, la 645
nm pentru clorofila b i la 470 nm pentru caroten mpreun cu xantofila (atunci
cnd se utilizeaz aceton 100%).
Rezultat: pentru a calcula coninutul n pigmeni, n g/ml extract, se utilizeaz
urmtoarele formule:
Pentru aceton 100%
Ca = 11,75 x A662 2,35 x A645

Pentru aceton 80%

Ca = 12,21 x A663 2,81 x A646

Cb = 18,61 x A645 3,96 x A662

Cb = 20,13 x A646 5,03 x A663

Cx + c = 1000xA470 2,27xCa 81,4 x Cb

Cx + c = 1000xA470 3,27xCa 104 x Cb

227

229

4.3. Alte tipuri de plastide


nafar de cloroplaste, n celulele vegetale exist i cromoplaste, amiloplaste
(gruncioare de amidon), oleoplaste, proteoplaste, leucoplaste (plastide incolore).
Totalitatea plastidelor dintr-o celul alctuiesc plastidomul.

92

4.3.1. Gruncioarele de amidon (amiloplastele) din parenchimul de rezerv


al tuberculului de cartof, (Solanum tuberosum)
Materiale necesare : tuberculi de cartof, lam, lamel, lam de ras, I2 + KI
(soluie Lugol), hrtie de filtru.
Mod de lucru : se taie tuberculul de cartof i din parenchimul de rezerv de
pe suprafaa secionat se rzuie cu lama. Cu puin material rzuit, se efectueaz un
preparat provizoriu, folosind ca mediu de includere o pictur de ap.
Examinare microscopic: se ncepe cu obiectivul mic, 10x (vezi figura 15).

Figura 15 Solanum
tuberosum - 1-4 stadii de formare
a granulei de amidon; 5 dou
amiloplaste: cea din dreapta,
stroma n form de pelicul i
calot, este lipsit de amidon; 6
celul din parenchimul medular
plin cu granule de amidon; 7
granule simple; 8 granule
compuse;
9

granule
semicompuse: am amidon; apl
amiloplaste; ga granule de
amidon; n nucleu; nu nucleol;
sd straturi de formare a
amidonului; si spaiu intercelular;
str stroma (d. Braune & colab.,
din M. Andrei i colab., 2003).

93

n masa preparatului se observ gruncioarele de amidon (amidon secundar),


de mrimi diferite, ntre 45-65 m, iar unele dintre ele atingnd i 150 m. Forma
gruncioarelor este de obicei ovoid. Cu obiectivul mare se observ c suprafaa
grunciorului este stratificat. Amidonul secundar se depune n stroma
leucoplastelor, n jurul unui punct situat excentric numit hil, astfel rezultnd
grunciorul de amidon. Gruncioarele de amidon prezint de obicei un singur hil,
ele fiind simple. Altele ns, au 2-3 hiluri i se numesc compuse. Uneori n jurul
gruncioarelor compuse se depun noi straturi comune, rezultnd astfel
gruncioarelor semicompuse. Preparatul se poate colora cu reactivul specific
amidonului, iodul n iodura de potasiu. Cu o hrtie de filtru se absoarbe apa de sub
lamel, iar cu bagheta de sticl se aplic la marginea lamelei o pictur de reactiv.
Gruncioarele de amidon se coloreaz n albastru.
4.3.2 Gruncioarele de amidon din endospermul secundar al cariopsei de
gru (Triticum aestivum)
Materiale necesare: cariopse (boabe) de gru, ace ascuite, lame, lamele,
hrtie de filtru, iod n iodur de potasiu.
Mod de lucru: se sparge o cariops de gru, iar cu acul ascuit se ia un
fragment de endosperm secundar, care este un parenchim amilifer (esut de culoare
alb), i se mrunete fin pe lama port-obiect ntr-o pictur de ap. Se aplic
lamela.
Examinare microscopic: cu obiectivul10x, n preparat se identific o
mulime de gruncioare de amidon de mrimi variate, de la 2-9 m la 30-40 m.
Gruncioarele mici sunt poliedrice, sferice, iar cele mari sunt disciforme. Forma
gruncioarelor se poate observa atingnd uor marginea lamelei cu acul ascuit,
ceea ce determin deplasarea lor n preparat. Cu obiectivul mare se constat
prezena unui hil punctiform, situat central i o stratificare concentric slab
conturat.

94

4.3.3. Gruncioarele de amidon i aleurona n parenchimul cotiledonar al


embrionului seminei de fasole (Phaseolus vulgaris)
Materiale necesare: semine de fasole, lame, lamele, lame de ras, I2 + IK
(soluie Lugol).
Mod de lucru: se ndeprteaz pe o poriune mic tegumentul seminal al
seminei i cu vrful lamei de ras se desprinde un mic fragment din parenchimul
cotiledonar al embrionului. Acesta se pune pe lama port-obiect, ntr-o pictur de
ap. esutul se mrunete bine cu acul i se aplic lamela.
Examinare microscopic: la obiectivul mic se observ c, gruncioarele de
amidon au ieit din celulele parenchimului, ele fiind mai mult sau mai puin
uniforme, dispersate n tot preparatul. Gruncioarele de amidon sunt de 24-56 m
i au form elipsoidal. Folosind obiectivul mare (40 x) se observ c amidonul
este fin stratificat n jurul unui hil alungit i ramificat, situat n axul longitudinal al
grunciorului. Alturi de gruncioarele de amidon n preparat se mai identific
aleurona amorf (substan proteic cu structur cuaternar). Prin colorarea
preparatului cu I2 n KI gruncioarele de amidon se coloreaz n albastru, iar
aleurona (protein vegetal) n galben deschis.
4.3.4. Evidenierea activitii amilazelor din cariopsele de gru (Triticum
aestivum) n timpul germinaiei
Materiale necesare: cariopse de gru, germinatoare, hrtie de filtru, soluie
Lugol, lame, lamele, bisturiu.
Mod de lucru: se pun cariopsele la germinat, la temperatura camerei, pe
substrat constnd din hrtie de filtru umidificat, pe tot parcursul germinaiei, cu
ap de robinet. n cursul germinaiei cariopselor de gru, amidonul din amiloplaste
va fi descompus n urma activitii amilazelor (- amilaza i - amilaza), n
compui mai simpli, care nu se coloreaz n albastru cu soluia de iod. Hidroliza
enzimatic a amidonului se poate evidenia dac se observ comparativ, la
microscop, gruncioare de amidon din parenchimul amilifer al cariopselor
negerminate i din a celor germinate.

95

Se face un preparat din cariopse negerminate, dup modelul descris anterior,


i se coloreaz cu soluie Lugol. Gruncioarele de amidon se vor colora n albastru.
Pe o alt lam de microscopie, se pune puin lichid alb, lptos, obinut prin
strngerea cariopsei unei plante de gru n vrst de 12-14 zile. Se coloreaz
preparatul cu soluie iodat.
Examinare microscopic: cu obiectivele 10x, apoi cu 20x, se poate constata
c unele gruncioare de amidon sunt corodate, adic au poriuni necolorate,
datorit descompunerii amidonului sub aciunea amilazelor n compui mai simpli,
care nu dau reacia cu iodul.
4.3.5. Gruncioarele de amidon din endospermul secundar al cariopsei de
ovz (Avena sativa)
Materiale necesare : cariopse de ovz, ace ascuite, lame, lamele, hrtie de
filtru.
Mod de lucru : se ndeprteaz paleile de pe cariops i se taie transversal
cariopsa. Cu acul se desprinde puin parenchim amilifer, care se pune ntr-o
pictur de ap pe lama port-obiect. Se omogenizeaz preparatul, apoi se aplic
lamela.
Examinarea microscopic : cu obiectivul mic se identific sectoarele din
preparat mai puin dense. Gruncioarele de amidon pot fi compuse, de form
elipsoidal, de 20-50 m. Prin operaia de omogenizare a preparatului unele
gruncioare compuse se dezorganizeaz uor n gruncioare simple, poliedrice,
foarte mici, de 5-7 m. ntr-un gruncior compus se gsesc n jur de 300 de
gruncioare simple (vezi figura 16).

96

Figura 16 Granule de amidon:


1 Triticum aestivum;
2 Phaseolus vulgaris;
3 Avena sativa:
h hil (d. Prozina).
(din M. Andrei i colab.,2003, modificat)

4.3.6. Cromoplastele n celulele fructului de roie (Lycopersicon


esculentum)
Materiale necesare: fructe coapte de roie, bisturiu, lam, lamel, ac ascuit.
Mod de lucru: se ia cu vrful bisturiului puin mezocarp din fructul de roie
i se pune ntr-o pictur de ap pe lama port-obiect. Se mrunete esutul cu
ajutorul unui ac ascuit i se aplic lamela.
Examinare microscopic: cu obiectivul 4x i 10x, n cmpul microscopic
apar celule izolate deoarece lamelele mijlocii se distrug la maturitatea fructului
(vezi figura 17). Celulele sunt mari i au forme variabile: sferic, piriform,
ovoid. Peretele celular este foarte subire, celulozic (perete primar), de aceea prin
aplicarea lamelei se poate cuta. Nucleul este mare i n el se observ, de obicei, un
nucleol. Cromoplastele sunt prezente n citoplasm, fiind mai numeroase n jurul
nucleului. Ele sunt rou-portocalii, inactive din punct de vedere fotosintetic,
ntruct conin caroten. Forma cromoplastelor la roie este sferic sau elipsoidal.
Pe msura coacerii fructelor carotenul trece n licopen (izomerul carotenului), care
cristalizeaz sub form de cristale aciculare.

97

Figura 17 Cromoplastele din mezocarpul de roie Lycopersicon esculentum:


pc perete celular;
ci citoplasm;
cr cromoplaste;
v vacuol;
a gruncior de amidon;
l cristal de licopin;
n nucleu cu nucleoli (d. V. Ciocrlan i L. Ungurean, 1994)

4.3.7. Cromoplastele n celulele fructului de ardei (Capsicum annuum)


Materiale necesare: fructe coapte de gogoar, lame, lamele, brici sau lam de
ras, sticl de ceas, hrtie de filtru.
Mod de lucru: cu ajutorul lamei de ras se taie fructul n fragmente de 2 cm
lungime i 0,5 cm lime. Printr-un astfel de fragment, se fac cu briciul sau cu lama
de ras seciuni transversale. Seciunile subiri se pun ntr-o pictur de ap pe lama
port-obiect i se acoper cu lamela.
Examinare microscopic: preparatul se examineaz mai nti cu obiectivul
10x. Se caut zonele subiri din preparat, n care se disting celulele poliedrice ale
mezocarpului. n citoplasma acestor celule se observ cromoplaste de culoare
roie-portocalie. Cu obiectivul 40x, se distinge mai clar forma sferic elipsoidal a
cromoplastelor, fiind mai mari dect cele de la roie.
4.3.8. Leucoplastele n celulele epidermei inferioare a frunzelor de telegraf
(Zebrina pendula)
Materiale necesare: frunze proaspete, tinere de telegraf, lame, lamele, hrtie
de filtru, cutii Petri, penset cu vrf ascuit.
Mod de lucru: se detaeaz prin juouire fragmente din epiderma inferioar a
frunzei de telegraf i se pun n cutii Petri, cu o soluie diluat de violet de genian.
Dup 10-20 de secunde, leucoplastele se coloreaz n violet intens, pereii celulari
i nucleele colorndu-se slab. Detaarea epidermei se va face cu mult atenie
pentru a nu se desprinde i esutul inferior adiacent. Se spal epidermele n cutii
Petri cu ap distilat, se aeaz pa lam ntr-o pictur de ap i se acoper cu
lamela.
Examinare microscopic: epiderma este constituit din celule transparente,
strns unite ntre ele, dispuse ntr-un singur strat, uor alungite n lungul frunzei. n

98

citoplasma celulelor, grupate n jurul nucleului pe care uneori l acoper complet,


se observ corpuri sferice, violete, care refract puternic lumina i care sunt
denumite leucoplaste. n mijlocul celulelor incolore ale epidermei se vd
stomatele, alctuite din: dou celule stomatice reniforme, ce conin cloroplaste i
las ntre ele un spaiu numit ostiol i din 4 celule anexe, mai mult sau mai puin
trapezoidale. Leucoplastele se pot observa extrem de bine n jurul nucleilor
celulelor anexe (vezi figura 18).

Figura 18 Leucoplaste la Zebrina pendula: ca celulele anexe; ce celul epidermal; cl


cloroplast; le leucoplaste; n nucleu; o ostiol (d. Strasburger, din M. Andrei i
colab.,2003, modificat).

4.4. Vacuolele
Vacuolele, delimitate de o membran lipoproteic simpl, denumit
tonoplast, conin n interiorul lor sucul vacuolar, care are o compoziie chimic
extrem de complex.
4.4.1. Evidenierea tonoplastului
Materiale necesare: aceleai ca i la lucrarea privind evidenierea
plasmalemei prin plasmoliz.

99

Mod de lucru: cnd celulele ajung n faza de plasmoliz convex, cu ajutorul


acelor ascuite se fixeaz epiderma i se efectuez cu o lam de ras mai multe
tierii, n sensul longitudinal al esutului. Se aaz lamela i se urmrete n cmp
microscopic ieirea vacuolelor din celule, n urma tierii pereilor celulari ai
acestora.
Examinare microscopic: vacuolele ies n mediul de includere (zaharoz) i
pot fi observate cu obiectivul 10 x.
4.4.2. Analiza inulinei din sucul vacuolar
Materiale necesare: rdcini tuberizate de dalie, rdcini sau rizomi de
cicoare fixate n alcool 70%, glicerin, lame de ras, lame, lamele, pipete, cutii Petri
sau cristalizoare, ace spatulate, hrtie de filtru, ervete.
Mod de lucru: se fac seciuni transversale foarte fine prin materialul vegetal,
se pun pe lam ntr-o pictur de glicerin.
Examinare microscopic: cu obiectivul 40x, se observ sferocristale de
mrimi diferite care ocup uneori ntreaga cavitate celular (vezi figura 19). Cum
acest polizaharid precipit n alcool 70-80 % sau n glicerin, fiind solubil n ap,
dac glicerina dintre lam i lamel va fi nlocuit cu ap, aceste sferocristale vor
disprea.

100

Figura 19 Incluziuni ergastice organice:


1, 2 -sferocristale de inulin de la Dahlia variabilis (d. Sachs,din M. Andrei i
colab.,2003, modificat).

4.4.3. Analiza aleuronei i a lipidelor


Materiale necesare: semine de ricin, bisturiu, lame, lamele, pipete, glicerin,
soluie alcoolic de Sudan III, soluie apoas de IIK, soluie concentrat de
zaharoz, cutii Petri sau cristalizoare, ace spatulate, hrtie de filtru, ervete.
Mod de lucru: se ndeprteaz tegumentul sclerificat al seminelor de ricin
cu ajutorul bisturiului, se rade endospermul i se pune pe o lam.
Examinare microscopic: la ricin (vezi figura 20), granulele de aleuron
(alctuite din dou pri, cristaloid i globoid), se pot observa bine ntr-o soluie
concentrat de zaharoz; cristaloizii cresc n dimensiuni i se rotunjesc.
Endospermul se poate observa i ntr-o soluie apoas de IIK n amestec cu sirop
de zahr; cu obiectivul 40x se observ picturi de grsime galbene i granule mari
de aleuron (2-4 ), ovale i adesea piriforme. Pentru evidenierea picturilor de
grsime se poate folosi soluie alcoolic 5% de Sudan III, care va colora lipidele n
rou-oranj.

Figura 20 Incluziuni ergastice organice:


granule de aleuron i globul de ulei din endospermul de la Ricinus communis;
ci citoplasm;
cr cristaloid;

101

ga granule de aleuron;
gl globoid;
u picturi de ulei
(d. Strasburger; din M. Andrei i colab.,2003, modificat)

4.4.4. Metoda spectofotometric de determinare a activitii peroxidazice, dup


Hans Lck.
Materiale necesare: cariopse de gru, germinatoare, hrtie de filtru, cilindrii
gradai, mojare, eprubete de centrifug, pipete gradate, cronometru, cuve de sticl,
pahare Berzelius cu ghea, tampon fosfat n concentraie de 6,7x 10 M, pH=7,
ap oxigenat, diluie 1 la 9 din apa oxigenat n concentraie de 3x 10M, pfenilendiamin 1%.
Mod de lucru: cu 24 de ore nainte de nceperea experimentului, o parte
dintre cariopsele de gru vor fi puse la germinat n cutii din material plastic, pe
substrat constnd din hrtie de filtru, umidificat cu cantitii echivalente de ap de
robinet (20 ml) adus la temperatura camerei.
Determinarea activitii peroxidazei se va face prin metoda colorimetric,
cantitativ de dozare, dup Hans Lck, folosind p-fenilendiamina ca donor de
hidrogen. n urma oxidrii p-fenilendiaminei, n prezena extractului vegetal,
rezult o coloraie violet a soluiei, intensitatea acestei coloraii fiind msurat
spectofotometric cu un filtru de 483 nm. Intensitatea activitii peroxidazice este
direct proporional cu nchiderea la culoare a amestecului spectofotometrat.
Pentru aceasta se mojareaz, pentru o prob, 0,5 g de cariopse martor,
negerminate i pentru cealalt prob 0,5 g cariopse puse la germinat cu 24 de ore
nainte de nceperea experimentului. Mojararea se face, pentru fiecare prob, cu
nisip splat bine i sterilizat n prealabil prin cldur, n etuv la 120C. Se adug
peste fiecare omogenat obinut prin mojararea cariopselor, cte 4 ml tampon fosfat
diluat (tamponul fosfat n concentraie de 6,7x 10 M, pH=7, inut anterior la rece
cteva ore, a fost diluat 1 la 9 cu ap distilat). Probele se centrifugheaz apoi la
6000 rotaii/minut, timp de 20 de minute i supernatantul se ine la frigider, la
ghea, timp de 30 de minute. Pentru determinri, se iau cte

0,5 ml din

supernatantul ce reprezint extractul de enzim, la care se adug (pentru fiecare


prob) cte 1ml tampon fosfat n concentraie de 6,7x 10 M, pH=7; 0,05 ml ap

102

oxigenat (diluie 1 la 9 din apa oxigenat n concentraie de 3x 10M), plus 0,05


ml p-fenilendiamin 1%. Intensitatea coloraiei violete a amestecului rezultat
(agitat pentru omogenizare) se citete la un spectofotometru tip Spekol 11, cu un
filtru reglat la o lungime de und de 483 nm. Citirile spectofotometrice privind
valorile extinciei se fac la 1 minut, folosindu-se un cronometru, deoarece culoarea
amestecului se intensific n timp.
Valoarea extinciei probei rezultate din cariopsele germinate va fi mai mare
comparativ cu cea a probelor martor, deoarece peroxidazele sunt enzime implicate
n variate procese fiziologice, printre care i germinaia seminelor, creterea i
dezvoltarea rapid a plantulelor i de aceea, pe msur ce germinaia avanseaz, tot
mai multe enzime se sintetizeaz n celule. La plante, peroxidazele sunt enzime
care se gsesc nu numai n sucul vacuolar, ci i n peretele celular i n spaiile
intercelulare.
4.4.5. Evidenierea cristalelor de oxalat de calciu
Materiale necesare: frunze de Begonia sp., tulpini de Zebrina sp., tulpini
aeriene de Solanum tuberosum, proaspt recoltate sau conservate n alcool 70%,
lame de ras, lame, lamele, pipete, cutii Petri, ace spatulate, hrtie de filtru, ervete.
Mod de lucru: se vor efectua, cu lama de ras, seciuni transversale prin
peiolul frunzei de begonie, prin tulpina de telegraf i prin tulpina de cartof, lsnd
s cad seciunile n cutiile Petri cu ap. Cu acele spatulate se vor colecta cele mai
subiri seciuni, se vor aeza pe lam ntr-o pictur de ap, n vederea obinerii
unui preparat microscopic provizoriu.
Examinare microscopic: observaiile se vor face cu obiectivul 10x, apoi cu
obiectivele mai mari. Oxalatul de calciu mbrac forme de nisip (nisip cristalin)
sau cristale. Cristalele pot fi: izolate, mari, nfindu-se ca octoedri, romboedri,
prisme, piramide, sau pot s fie grupate formnd rafide, druze ( ursini, macle).
La cartof, n parenchimul medular al tulpinii se gsete nisip cristalin; n
peiolul frunzei de Begonia sp. vom observa druzele, care sunt o concretere de
cristale, iar n celulele tulpinii de Zebrina sp., rafidele care sunt cristale lungi,
aciculare, grupate n mnunchiuri (vezi figura 21).

103

Figura 21 Cristale de
oxalat de calciu:
1 rafide n tulpina de
Zebrina sp.;
2 nisip cristalin din
celulele
parenchimului
medular de la Solanum
tuberosum;
3 cristale i druze din
peiolul de la Begonia sp.:
cr cristal tetragonal;
dr druze;
n nucleu;
r rafide;
v vacuol;
(1, 2 d. Strasburger;
3 d. Mevius, din M.
Andrei, 2003, modificat).

4.4.6. Formarea de lipozomi n sucul vacuolar al vacuolelor celulelor


epidermale ale petalelor de trandafir ( Rosa sp.)
Materiale necesare: petale proaspete de trandafir sau bujor, seringi, pahare
Berzelius, lame, lamele, soluie de clorhidrat de procain PHCl, 10g/l de ap
distilat.
Mod de lucru: dup prelevare se jupoaie epiderma petalelor i se
transparentizeaz prin vidare (se scoate aerul din spaiile intercelulare) cu ajutorul
unei seringi. Fragmentele de epiderm se introduc ntr-un pahar Berzelius ce

104

conine soluie de PHCl 10g/l i se las cteva minute. Se pregtete i o prob de


fragmente epidermale n soluie de procain, de aceeai concentraie ca i cea
precizat mai sus, cu 24 de ore nainte de examinarea microscopic. Martorul
(proba control) este reprezentat de fragmente epidermale pstrate n ap distilat.
Se vor efectua preparate microscopice proaspete, montate n ap de robinet, din
epidermele martor, din cele inute cteva minute n soluie de procain i din cele
inute timp de 24 de ore n aceast soluie.
Examinarea microscopic: pentru aceasta vom utiliza microscopul cu lumin
polarizat. n fragmentele epidermale inute n paharul Berzelius cu ap distilat,
fragmente utilizate ca martor, nu se observ nici o modificare a componentelor
sucului vacuolar, acesta rmnnd colorat rou i fiind optic vid.
Dup cteva minute de submersare a petalelor de trandafir n soluia de
procain 10g/l, n sucul vacuolar al vacuolelor celulelor epidermale se observ
corpusculi minusculi, aflai ntr-o vie micare brownian dar i corpusculi de
dimensiuni mai mari, care sunt lipozomii. n sucul vacuolar exist fosfolipide iar
soluiile concentrate de PHCl induc destabilizarea echilibrului compuilor
moleculari care alctuiesc sucul vacuolar, destabilizare care se concretizeaz prin
formarea de lipozomi. Acetia sunt vezicule sferice sau ovoidale, delimitate de o
membran n care lipidele sunt prezente sub form de fosfolipide, organizate n
dublu strat. Structura de bistrat fosfolipidic nu e proprie doar lipozomilor ci ea se
regsete n structura tuturor membranelor biologice. Din punct de vedere optic,
lipozomii se comport ca nite corpusculi hialini, puternic refringeni. Au
proprietatea de a roti planul luminii polarizate, prezentnd o cruce de polaritate
caracteristic. Faza de cristal lichid, observabil n lumin polarizat, este
caracteristic unor substane organice, printre care i fosfolipidelor (vezi figura
22).
Lipozomii formai n sucul vacuolar al celulelor epidermale ale petalelor de
trandafir, n urma unui tratament cu soluie de PHCl, 10g/l, timp de 24 de ore, sunt
mai mari deoarece cu timpul numrul lipozomilor scade (fuzioneaz lipozomii mai
mici) iar volumul lor crete. Lipozomii n celulele cu antocian nglobeaz

105

colorantul ntr-o msur foarte ridicat, observndu-se decolorarea vacuolelor,


avnd chiar capacitatea de a acumula ntreaga cantitate de antocian din vacuol,
fenomen spectaculos n celulele epidermale ale petalelor de trandafir.
Lipozomii sunt produi n laboratoare, dezvoltndu-se o adevrat industrie
pentru prepararea lor, deoarece ei fuzioneaz cu membranele plasmatice (ale
celulelor animale, umane sau cu protoplatii vegetali), fiind considerai cele mai
promitoare microcapsule, folosite pentru introducerea n celule a lipidelor,
proteinelor fixate n membrana lipozomal sau a unor molecule prinse n interiorul
lor apos, deoarece lipozomii au proprietatea de a include un volum mic din
solventul n care au fost preparai.

Figura 22 Lipozomi n lumin polarizat (d. C.D. Cachi, 1980)

106

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Acatrinei G., 1975, Biologia celulei vegetale, Editura tiinific i
enciclopedic, Bucureti.
2. Andrei M., Anghel I., Popescu I., Stoica E., 1981, Lucrri practice de
biologie vegetal, Editura didactic i pedagogic, Bucureti.
3. Andrei M., Paraschivoiu R.M., 2003, Microtehnic botanic, Editura
Niculescu, Bucureti.
4. Andrei M., Predan G.M.I., 2003, Practicum de morfologia i anatomia
plantelor, Editura tiinelor Agricole, Bucureti.
5. Anghel I., 1979, Citologie vegetal, Editura didactic i pedagogic,
Bucureti.
6. Anghel I., BrezeanuA., Toma N., 1981, Ultrastructura celulei vegetale
Atlas, Editura Academiei R.S.R.
7. Anghel I., Toma N., Brezeanu A., 1981, Practicum de citologie vegetal,
Tipografia Universitii din Bucureti.
8. Anghel I., Andrei M., Voica C., Toma N., Mohan G., Talaba I.A., 1988,
Practicum de biologie, Tipografia Universitii din Bucureti.
9. Benga Gh., 1997, ndrumtor pentru lucrrile practice de Biologie celular
i molecular, Editura Carpatic, Cluj-Napoca.
10.Butcher R.G., Diengdah J.V., Chayen J., 1964, Quant.J. micros.Sci, 105,
p:497-502.
11.Cachi C.D., 1978, Procedeu pentru obinerea unor cristale lichide,
Brevet de invenie R.S.R., Nr. 69638 (cu prioritate din 1979).
12.Cachi C.D., Crciun C., Ciobanu I.R., 1980, The procaine effect on the
vacuoles structure of the epiderme cells in rose (Rosa sp.) petals, trv. Mus.
Hist. Nat. Grigore Antipa, vol. XXII, p: 55-57.
13.Ceauescu S., Turcu A., Mihescu A., Petrovanu V., 1981, Lucrri
practice de biochimie general, Tipografia Universitii din Bucureti.

107

14.Ciocrlan V., Ungurean L., 1994, Lucrri practice de botanic


Morfologie, Tipografia Universitii de tiine Agronomice, Bucureti.
15.Crciun C., Florea A., Drago N., Ardelean A., 1999, Introduction to Cell
and molecular biology, Cluj University Press.
16.Deliu C., Kis Zoltan, 1986, Biologie celular - lucrri practice pentru uzul
studenilor, Cluj-Napoca.
17.Diculescu I., Onicescu D., Benga Gh., Popescu L.M., 1983, Biologie
celular, Editura didactic i pedagogic, Bucureti.
18.Frsinel N., Verde D., 1994, Biologie celular i molecular, Editura
Mirton, Timioara.
19.Ionescu-Varo M., Dimitriu Gh., Deliu C., 1981, Biologie celular, Editura
didactic i pedagogic, Bucureti.
20.Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R., 1983, Determinations of total
carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, in
Biochemical society transactions, vol.11, nr.5, p: 591-592.
21.Mixici F., Cruce M., Ardelean A., Toici A.I., Berceanu Vduva M.,
1997, Principii experimentale n biologia celular, Editura Sitech, Craiova.
22.Murean E., Bogdan A.T., Gaboreanu M., Baba A.I., 1976, Tehnici de
histochimie normal i patologic, Editura Ceres, Bucureti.
23.Prvu M., 2003, Botanic sistematic I, Editura Gloria, Cluj-Napoca.
24.Raicu P., Ionescu-Varo M., Canavici G., Moisescu G., 1972, Celula
structur, ultrastructur i funcii, Editura Academiei R.S.R.
25.erbnescu-Jitariu G., Andrei M., Rdulescu-Mitroiu N., Petria E.,
1983, Practicum de biologie vegetal, Editura Ceres, Bucureti.
26.ipo M., Cachi C.D., Flori C., 2004, Activitatea peroxidazic n
embrionii i n cariopsele exembrionate de gru (Triticum aestivum
var.Turda) care au fost submersate n prealabil n azot lichid (-196C),
Analele Universitii din Oradea, Fascicula Agricultur-Horticultur, vol.X,
p: 531-535.
27.Toma C., Ni M., 1997, Celula vegetal, Editura Universitii Alexandru
Ioan Cuza, Iai.
28.Vaida T., 1992, Microbiologie - ghid practic, Litografia Universitii din
Oradea.
29.Zarnea G., 1983, Tratat de microbiologie general, vol. I, Editura
Academiei R.S.R.

108