Sinteza ADN/ului decurge numai n faza S a ciclului celular al eucariotelor

Unul din factorii care influeneaz

sinteza ADN-ului este timpul necesar celulei
pentru a se divide. Bacteriile au nevoie de 2030 min pentru a-i dubla numrul. Replicarea
este imediat urmat de diviziunea celulelor
fiic, dup care are loc sinteza ADN-ului.
L. Hartwell a studiat celulele de drojdie
(eucariote). El a ncercat s demonstreze cum
celulele controleaz timpul de cretere i
diviziunea celular. Drojdiile sunt organisme
unicelulare care se divid prin nmugurire.
Procesul este similar cu cel al mitozei, cu
excepia ca membrana nuclear rmne intact.
Pe parcursul experimentelor sale Hartwell a
Etapele ciclului celular al eucariotelor
descoperit faptul c n cazul celulelor eucariote
se disting patru etape n decursul ciclului
celular. O celul trebuie ntr-o prima faz s se dezvolte i s se aprovizioneze cu
nutrienii necesari. Aceast faza intermediar (faza G1; G = gap- trecere) are loc
nainte de a se declana sinteza ADN-ului. n etapa urmtoare (faza S) celulele
sintetizeaz ADN-ul (replicarea ADN-ului) i practic celula se pregtete pentru
diviziunea celular. Dup replicarea ADN-ului, celula intr ntr-o alt faz intermediar (
faza G2), faz n care aceasta i sintetizeaz alte proteine sau componente celulare
necesare pentru diviziunea celular. M este faza mitotic, n care celulele se divid, dup
care ciclul se repet. Mitoza este dependent de completarea tuturor celor 3 faze
premergtoare acesteia. n general faza S, faza n care are loc sinteza ADNului, se
caracterizeaz printro perioada mai larg de timp.
Replicarea ADN-ului este n majoritatea cazurilor bidirectional
O alt ntrebare de interes n ceea ce privete procesul de replicare este: Cum
acioneaz mainria de replicare a ADN-ului de-a lungul duplexului?
Cteva mecanisme de sintez a ADN-ului (cretere a lanului) permit replicarea
semiconservativ:
1) Un lan crete dintr-un punct, numit origine de replicare (ori 1), iar celalalt lan este sintetizat dintr-un alt punct (ori 2). Acest mecanism
apare n cazul ADN-ului liniar viral (adenovirus);
2) Existena unei singure furci de replicare
(regiunea n care catenele parentale sunt separate i
servesc ca matri) i a unui singure origini;
3) Sinteza poate porni dintr-un singur punct
i se desfoara n ambele direcii, bidirecional,
fiecare lan fiind copiat n cadrul unei furci repliFurca
cative. Datele din literatur vin n sprijinul
replicativa
ultimului mecanism.

n cromozomii circulari (caracteristici bacteriilor sau unor virusuri) este prezent

o singura origine i dou furci de replicare
apar n pari opuse ale cercului.
Astfel, modelul propus al replicrii
cromosomului circular bacterian a fost cel de
tip (teta), datorit formei pe care o ia
cromosomul bacterian n timpul replicrii.
Cromozomii liniari lungi din eucarioate conin multiple origini; cele dou furci
de replicare rezultate dintr-o anumit origine
avanseaz pn ntlnesc furcile de replicare
dintr-o zon vecin. Fiecare zon deservit de
o anumit origine poart numele de replicon.

Furci replicative care apar in decursul replicarii

Replicarea bidirecional a
fost pentru prima dat pus n eviden prin intermediul audioradiografiei. Studiile de microscopie
electronic au demostrat existena
ochilor sau buclelor lucru care
dovedete implicit posibilitatea replicrii bidirecionale.

Numrul de furci de replicare i viteza lor de deplasare

Autoradiografia ADN-ului din celulele etichetate la intervale de timp diferite a
permis estimarea vitezei de deplasare a furcilor de replicare. n cazul Ecoli ciclul celular
este de aproximativ 30 de minute. Dat fiind faptul ca cromozomul circular al E.coli are 3
x 106 perechi de baze este replicat prin intermediul a dou furci de replicare, rata de
deplasare a fiecarei furci este de aproximativ 1000 pb/s (pb = perechi de baze). Rata de
deplasare a furcilor n celulele umane este de 100 pb/s. Dat fiind faptul c ntregul genom
uman are 3 x 109 perechi de baze care se replic n timp de 8 h, acesta trebuie sa conina
cel puin 1000 de furci replicative. Dac exist acest numr de furci replicative fiecare
trebuie s contribuie la replicarea a 106 pb. Rezultatele experimentale au demonstrat
faptul c aceste furci nu sunt aa de ndeprtate. Furcile replicative funcioneaz grupat,
la un moment dat putndu-se evidenia pe un cromosom existena mai multor furci care
funcioneaz, n timp ce alte regiuni sunt n repaus. Astfel, originile de replicare sunt
activate grupat, cte 20-80 de origini. Grupurile de origini de replicare care sunt activate
simultan poart numele de uniti replicative. n timpul fazei S a ciclului celular, dup ce
o unitate replicativ i-a terminat activitatea, este activat urmtoarea, pn in momentul
n care este replicat toat secvena de ADN. n cadrul unei uniti replicative, fiecare
origine de replicare este separat de cealalt printr-un spaiu de 30.000-300.000 de
nucleotide.

Iniierea i propagarea lanului de ADN la nivelul furcilor de replicare

ADN-ul duplex este un helix antiparalel (cele doua lanuri sunt opuse 35
respectiv 53 i au polariti diferite). Toate polimerazele catalizeaz adugarea
nucleotidelor la capatul 3 al lanului printe, iar lanul nou format crete n direcia
53. Mai mult toate polimerazele descoperite pn n prezent continu secvena de noi
polinucleotide pornind de la o secven de ADN sau ARN preexistent.
ADN-ul dublu catenar este desfcut de ctre proteina de iniiere, helicaza, n
regiunile numite origini de replicare (OriC). Aceste regiuni se caracterizeaz printr-o
secven special de nucleotide, reprezentat de perechi de baze A-T. Aceste perechi
nucleotidice sunt mai uor de clivat, deoarece ele conin mai puine legturi de hidrogen,
fa de perechile G-C. Ori C este recunoscuta i de ctre proteina dnaA. Proteina dnaA
recunoate i denatureaz ADN-ul ntr-o regiune de 13 nucleotide n principal baze A sau
T. Aceast etap este asistat i de proteina HU. La aceast regiune se leag proteina
dnaB (helicaza), proces asistat de o alt proteina dnaC (aceast protein ajut la
mpachetarea adecvat a proteinei dnaB pe furca de replicare). Din fiecare origine de
replicare pleac dou furci de replicare care se ndeprteaz de locul de origine,
desfcnd dublul helix de ADN pe msur ce nainteaz. Deci, replicarea ADN-ului n
cromosomii procariotelor i eucariotelor este bidirecional.
Dup legarea helicazei, o nou protein, SSB (single-stranded DNA binding)
stabilizeaz ADN-ul monocatenar din bucla de replicare.
Primozomul, un complex de proteine (format din dnaB, dnaC, primaza i alte
proteine), constituie elementul cheie al iniierii. Acest complex se deplaseaz simultan cu
furca de replicare (consumnd ATP-ul) i este responsabil pentru sinteza unui segment de
ARN necesar replicrii lanului.
La nivelul furcii se afl dispozitivul de replicare reprezentat de ADN-polimeraza,
enzim care catalizeaz ataarea de deoxiribonucleotide la captul 3' al segmentului de
ARN iniial, ulterior la capatul 3 al lanului de ADN n cretere. ADN-polimeraza nu se
disociaz de ADN ori de cte ori adaug un nou nucleotid pe lanul de ADN n cretere,
dimpotriv, ea rmne ataat pe ADN i se mic pas cu pas de-a lungul lui timp de mai
multe cicluri ale reaciei de polimerizare.
Deoarece, cele dou catene ale dublului helixului sunt orientate n direcii opuse,
furca de replicare este asimetric. Astfel, una dintre noile catene de ADN este sintetizat
pe o matri parental 3'5', iar cealat caten este sintetizat pe o matri parental
5'3'.
ADN-polimeraza poate cataliza creterea catenei noi numai n direcia 5'3',
ntruct adaug noi nucleotide numai la captul 3' al catenei parentale. Imediat dup ce
replicarea s-a declanat s-a introdus n mediu timidin marcat cu tritriu. S-a constatat
apariia temporar la nivelul furcii replicative a unor fragmente scurte de ADN, lungi de
1000-2000 de nucleotide, denumite fragmente Okazaki.
Fragmentele Okazaki sunt sintetizate, discontinuu, n direcie opus sintezei
catenei prioritare (n ceea ce privete modul de ataare al nucleotidelor acesta este
identic), i mai trziu alipite prin intermediul ADN-ligazei, pentru a forma o caten nou,
nentrerupt de ADN.

Sinteza catenei ntrziate se realizeaz ntotdeauna n urma sintezei catenei

prioritare, ntruct fragmentele Okazaki rezult numai dup ce furca replicativ s-a
desfcut cu un numr de nucleotide egal cu lungimea acestor fragmente.
Replizomul este un amsamblu de proteine care include enzimele i factorii
necesari replicrii ADN-ului. Acest complex este responsabil pentru sinteza a dou
catene noi de ADN.
ADN polimerazele
ADN polimerazele au fost descoperite n extractele celulare datorit capacitii lor
de a ncorpora deoxinucleotide n ADN, utiliznd trifosfaii deoxinucleozidelor drept
substrat. Aceste enzime copie numai o matri de ADN preexistent i mperecherea
bazelor din noului lan sintetizat cu cele din lanul printe se face dup aceleai reguli
postulate de Watson i Crick. Iniial ADN polimeraza a fost purificat din Ecoli i mai
trziu din alte microorganisme. n toate cazurile s-a constatat faptul c enzima are nevoie
de un segment de start care posed un capt 3-OH liber.
Trei ADN polimeraze (I, II si III) au fost purificate din Ecoli.
Deoarece bacteriile n care existau o mutaie specific pentru polimeraza III,
mutaie sensibil la temperatura, ncetau s mai produc ADN la temperaturi mai mici s-a
acordat o atenie deosebit acestei enzime, ncercndu-se s se obin furci de replicare n
vitro.
ADN polimeraza I este important n corectarea erorilor care apar n procesul de
copiere al ADN-ului. Polimeraza de tip II joac un rol n repararea ADN-ului n situaia
n care acesta a suferit denaturri fizice sau chimice.
Odata ce polimeraza III este ataat la ADN-ul matrit este dificil desprinderea
enzimei, n timp ce polimerazele I i II se detaeaza de pe ADN-ul matri dup
adaugarea unui segment de oligonucleotide. Polimeraza III mpreun cu ceilali factori de
replicare poate sintetiza ADN n vitro la aproximativ 500 pb/secund.
Ambele polimeraze (I i III) posed activitate exonucleazic (ADN polimeraza I
ndeprteaz resturile de segment ARN). ADN polimerazele adaug nucleotidele cu o
eroare de 1 la 10000. Datorit activitii exonucleazice, ambele enzime pot ndeprta
nucleotidele greite i dup aceea s adauge nucleotidele corespunztoare. n acest fel
frecvena de apariie a unuei erori este de o
nucleotid ntr-un milion.
ADN polimeraza III din E.coli (vezi
figura) este o enzim cu mai multe subuniti,
cu o masa moleculara de peste 600 KDa.
Complexul se prezint sub forma unui dimer
asimetric. Subunitile , i formeaz
miezul polimerazei i au rolul de a menine
enzima pe lanul matrice. Subunitile din
polimeraza III formeaz un inel care alunec
pe ADN-ul matri.
n celule mamiferelor se afl 5 tipuri de
polimeraze: (multiplicarea ADN-ului nuclear), (rol n corectarea ADN-ului), (replicarea ADN-ului mitocondrial), (este polimeraza principal care particip la procesul de replicare al ADN-ului eucariotelor; se
asociaz cu proteina PCNA (eng proliferating cell nuclear antigen), proteina care

formeaza un trimer un inel asemeni subunitilor din polimeraza III a E.coli) i (rol
neelucidat n replicarea ADN-ului).
ncheierea replicrii se face prin intermediul situsurilor de terminare (Ter), poriuni de circa 23 pb, care permit trecerea furcii de replicare numai ntr-o singura direcie.
Situsurile Ter foreaza cele dou furci de replicare s se ntlneasc numai ntr-un anumit
punct. La aceste situsuri se leag o protein monomer (Tus, M 35 KDa), proteina care
se leag Dna B (helicaza), inhibnd astfel procesul de desfacere a ADN-ului duplex.
Digestia enzimatic
Endonucleazele de restricie sunt enzime bacteriene ce recunosc specific anumite
secvene de ADN dublu catenar i cliveaz ambele catene n interiorul sau n apropierea
situsului de recunoatere. Lungimea enzimelor de restricie este variabil (ntre 150 AA
la PvuII i 1250 AA la CjeI). Enzimele de restricie protejeaz bacteriile fa de infeciile
virale, avnd astfel rolul unui sistem imunitar microbian. n lipsa enzimei de restricie la
E coli, aceasta sufer o infecie viral rapid. Enzimele de restricie sunt prezente n
combinaie cu una sau dou enzime de modificare (ADN-metiltransferaze), care protejeaz celula mpotriva clivrii propriului ADN de ctre enzima de restricie cu care acesta se
asociaz. Enzimele de modificare recunosc acelasi situs catalitic asemeni enzimei de
restricie pe care o nsoesc, dar n loc de clivare, acestea metileaz una din bazele azotate
la fiecare caten. Gruparile metil ptrund n adncitura major a ADN-ului la nivelul
situsului de restricie. Enzima de restricie mpreun cu enzimele de modificare formeaz
mpreuna un sistem de restricie i modificare (R-M). n anumite sisteme cele dou
enzime acioneaz independent una fa de cealalt. n alte sisteme, cele dou
componente se prezint sub forma a dou subuniti separate, ale unei enzime mai mari,
ce combin ambele activiti catalitice (de restrictie i de modificare).
Enzimele de restricie sunt clasificate n funcie de compoziia subunitii de
clivare, a situsului de restricie, a specificitii secvenei i a cofactorilor necesari. Enzimele care fac parte din prima categorie sunt enzimele de tip I, care conin subuniti
multiple care se prezint sub forma de combinaii R-M i care taie ADN-ul aleator fa de
secvenele de recunoatere. n categoria enzimelor de tip II se gsesc enzime care taie
ADN-ul n apropierea sau n interiorul secvenei de recunoatere. Aceasta genereaz
fragmente de restricie discrete, fragmente care migreaz diferit n geluri de agaroz
(electroforez orizontal) fa de cel neclivat. Cele mai cunoscute enzime de tip II sunt
HhAI, HindIII, Not I, care taie n interiorul secvenei de recunoatere. Enzimele de acest
tip sunt cele mai des utilizate. De exemplu, enzima NotI recunoate urmtoarea secven:
5-GCGGCCGC-3
3-CGCCGGCG-5
NotI taie ADNul uman n medie la fiecare 10 Mb.
Majoritatea enzimelor de restricie de tip II recunosc secvene de ADN care sunt
simetrice deoarece ele se cupleaz la ADN sub forma de dimeri, n timp ce unele se
cupleaz sub forma de heterodimeri deoarece recunosc secvenele de ADN asimetrice
(BbvCI). Unele recunosc secvene continue (EcoRI-GAATTC), n care cele dou
jumati de recunoatere sunt adiacente, n timp ce altele recunosc secvene discontinue
(Bgl I recunoate secvena GCCNNNNNGGC) n care cele dou situsuri sunt separate.

Asemeni multor altor endonucleaze de restricie EcoRI scindeaz ADN-ul la situsul de

restricie din secvena palindromic. EcoRI scindeaz legturile fosfodiesterice din ambele catene
ale ADN-ului ntre G i A. Result dou capete
monocatenare complementare (AATT), care iniial erau n contact una cu cealalt. Acestea pot fi
separate la nclzire, dar pot fi realiniate la
temperaturi mai mici. Situsurile scindate pot fi
din nou realipide cu ajutorul unei enzime numit
ADN ligaza. Prin clivare se geneaz un capt
hidroxil 3 i unul fosfat 5. Activitatea enzimelor
se face n prezena magneziului (enzima de
restricie) i a S-adenozil-metioninei (enzima de
modificare corespunztoare).
Clonarea ADN-ului
Majoritatea segmentelor de ADN (de pe
gene) se gsesc n cantiti mici n celul. Pentru
Scindarea ADNului dublu-catenar cu
a lucra experimental cu ADN-ul este nevoie de o
ajutorul enzimei de restrictie EcoRI
cantitate mare de copii (clone). Procedura clasic de
clonare a ADN-ului se bazeaz pe abilitatea bacteriilor de a prelua i replica secvene
relativ mici de ADN circular cunoscute sub numele de plasmide.
Segmentul care trebuie copiat trebuie taiat din ADNul amplificat (prin intermediul
tehnicii PCR) cu ajutorul enzimelor de restrictie
O hart de restricie reprezint o secven liniar sau circular pe care sunt
reprezentate situsurile particulare pentru enzimele de restricie. Distana dintre aceste
situsuri de restricie este msurat n funcie de numrul perechilor de baze din ADN sau
ARN. n cazul n care molecula de ADN este tiat cu o enzim de restricie
corespunztoare aceasta este scindat n fragmente distincte. Aceste fragmente sunt
separate pe baza mrimii cu ajutorul gelurilor de agaroz sau poliacrilamid. Construirea
unei hri de restricie necesita folosirea mai
multor enzime de restricie. n unele tehnici, se
folosete o grupare fosfat radioactiv la
capatul 5 sau 3 al secvenei scindate.
n situaia simpl n care vectorul
(plasmidul) este deschis (scindat) cu ajutorul
enzimei de restricie EcoRI i recircularizarea
se face dup adugarea fragmentului de ADN
izolat, fragment care posed capete complementare cu ale plasmidei. Astfel dup alipirea
acestui fragment de ADN rezult o plasmid
nou. Prin prenclzirea unui numr de celule
bacteriene cu ADN-ul circular modificat unele
dintre acestea pot prelua plasmidul nou i s l
replice ca pe propriul ADN. Pentru a fi siguri
de faptul ca bacteria gazd conine plasmidul
n scopul replicrii aceti plasmizi confer
Obtinerea unui plasmid recombinat cu
ajutorul enzimelor de restrictie

suplimentar i rezistenta acestei gazde la diverse antibiotice. n cazul n care bacteriile

sunt incubate n prezenta acelor antibiotice, numai celulele care vor conine plasmidul
nou se vor replica. Plasmidul este izolat mai trziu din celule, scindat cu enzima de
restricie EcoRI i fragmentele sunt separate utiliznd electroforeza. Fragmentele de
interes pot fi identificate dup mrime i extrase din gelul de agaroz pentru experimente
ulterioare.