.

DIAGNOSTICUL
VIRUSOLOGIC

Recoltarea produselor patologice

Se pot preleva:
secreii nazale
lichid de spltur nazofaringian
(aspirat traheal, lichid de spltur bronic, piese
necroptice).

Examenul direct al
produsului patologic

Pot fi detectate direct n produsul patologic:

- Virionul, cu ajutorul ME
- Antigenele virale, cu ajutorul:
IFD, realizat pe amprente de mucoas nazal i frotiuri
efectuate din secreii nazale.
ELISA, folosit n special pentru identificarea antigenelor
de tip.
- Acidul nucleic viral poate fi detectat prin:

hibridizare cu sonde nucleotidice

PCR, aplicat dup obinerea ADN-ului complementar
ARN-ul viral prin reverstranscriere

RT-PCR (reverstranscriere-PCR

Izolarea virusului

Produsele patologice sunt prelucrate i sunt

inoculate pe:
Ou embrionate de gin
Culturi de celule
Animale de laborator

 Ou embrionate de gin

Izolarea pe oule embrionate este metoda de elecie i

este accesibil tuturor laboratoarelor de virusologie.
Produsele patologice sunt inoculate pe oule de gin
fecundate, cu embrioni de 8-12 zile.Examinnd oul n
poziie orizontal la ovoscop se stabilete locul inoculrii
n regiunea unde distana dintre cochilie i embrion este
cea mai mic, iar dup badijonarea cu tinctur de iod, se
realizeaz un orificiu de dimensiuni mici n cochilie, fr
s se perforeze membrana proprie a oului. La acest nivel,
se ptrunde cu un ac cu bizou scurt, ataat la o sering de
1ml, prin membrana proprie a oului i membrana
corioalantoidian.


n momentul cnd se ntmpin o rezisten prin
atingerea embrionului, se retrage foarte uor acul i se
inoculeaz o cantitate de 0,1ml din produsul patologic.
Apoi, se retrage acul brusc i se obtureaz orificiul cu o
pictur de parafin topit, steril. Oule inoculate sunt
incubate la temperatura optim de cultivare a virusurilor
gripale, respectiv 33-34oC. Oule se deschid dup
omorrea embrionului prin refrigerare, respectnd
normele de lucru aseptic. Se recolteaz lichidul amniotic
i lichidul alantoidian, ce urmeaz a fi inoculate pe alte
ou embrionate, n vederea obinerii virusului gripal n
cantitate mare, n urma a 2-5 treceri succesive.


Culturi de celule

Virusurile gripale cultiv mai greu n culturi

celulare. Cel mai bine cultiv virusul gripal de tip B,
urmat de tipul A, n timp ce cel de tip C cultiv
extrem de dificil sau deloc. Produsele patologice
tratate cu antibiotice pot fi inoculate n culturi
primare de rinichi de maimu sau linii celulare de
rinichi de cine (MDCK).


Animale de laborator

oarecele alb i dihorul sunt foarte sensibili la

infecia cu virusurile gripale, iar inocularea se
practic n general intranazal. oarecii dezvolt o
pneumonie letal. Din trituratul pulmonar obinut
dup sacrificarea acestora, n urma inoculrii altui lot
de oareci pe cale nazal, se poate obine adaptarea
virusului la organismul animalului, dup 3-8 astfel
de pasaje oarbe.

Identificarea virusurilor
gripale cultivate n
sistemele biologice

Dup cultivarea pe oule embrionate de gin, acestea

sunt deschise aseptic, recoltndu-se lichidul amniotic i
alantoidian. Pentru identificarea antigenelor virale se
recurge la: HA, HAI i RFC. Printre aplicaiile HA se
numr i detectarea i titrarea virusurilor gripale.
Principiul HA: n contact cu o suspensie de hematii,
virusurile hemaglutinante, precum virusurile gripale,
provoac aglutinarea hematiilor.
Virusurile gripale se adsorb pe suprafaa hematiilor prin
intermediul hemaglutininei i se desprind de pe acest
substrat cu ajutorul neuraminidazei.


-n cazul culturilor celulare, identificarea se bazeaz pe
evidenierea
ECP. Leziunile citologice n cazul virusului gripal de tip A
sunt de tip vacuolar, fiind nsoite te desprinderea
celulelor din monostrat. Virusul gripal de tip B produce
ECP de tip granular, cu fragmentarea celulelor, picnoz i
distrugerea monostratului celular.

- n cazul animalelor de laborator, trituratul din plmni

conine cantiti mari de virus gripal, ce poate fi
identificat prin: HA, HAI i RFC.

DIAGNOSTICUL
SEROLOGIC

Se investigheaz dinamica anticorpilor specifici pe

perechi de seruri, prima prob fiind recoltat ct mai
precoce de la debutul bolii, iar cea de-a doua dup
aproximativ 10-14 zile, n convalescen. Diagnosticul de
grip este susinut indirect, prin detectarea seroconversiei
sau a unei creteri semnificative, de cel puin 4 ori a
titrului de anticorpi n proba a doua de ser, comparativ cu
prima.

Ca tehnici sunt utilizate n mod curent HAI i RFC,

recomandndu-se i ELISA atunci cnd este posibil,
datorit sensibilitii crescute a acestei metode


HAI
Prin HAI se investigheaz apariia i creterea
titrului anticorpilor hemaglutinoinhibani. HAI este
o reacie de seroneutralizare, avnd ca principiu
inhibarea aglutinrii hematiilor de ctre
hemaglutininele
virusurilor gripale, atunci cnd acestea s-au unit cu
anticorpii complementari.

Materiale necesare

cele dou probe de ser de cercetat, tratate pentru

ndeprtarea inhibitorilor specifici, inactivate la 56oC,
timp de 30 i diluate 1/7 cu soluie salin izoton;

suspensiile de antigen gripal cu o concentraie de 8

ori mai mare dect titrul hemaglutinant stabilit prin
HA;
soluie salin izoton;
o suspensie de hematii de coco 0,5%;
microplci cu godeuri;
pipete automate i conuri adecvate etc.

Tehnica de lucru

Se execut diluii binare din serurile de cercetat, ncepnd

cu diluia 1/7, n plci sau microplci de plastic cu
godeuri, peste care se pipeteaz un volum egal din
suspensia de antigen ce conine 8 UA. Plcile se agit, se
acoper cu un capac i se las la temperatura camerei
timp de 30. Dup aceea se adaug un volum egal din
suspensia de hematii de coco 0,5% i se las plcile la
temperatura camerei timp de 30-45. Concomitent cu
probele de cercetat, se lucreaz i martorul antigen,
martorul hematii, martorul ser sigur pozitiv i martorul
ser sigur negativ.

Citirea i interpretarea
rezultatelor

Titrul de anticorpi HAI este dat de cea mai mare

diluie de ser de cercetat la care mai apare o inhibare
complet a HA. Diagnosticul de grip este susinut
de detectarea unei creteri n dinamic de cel puin 4
ori a titrului de anticorpi HAI.

Moraru Livia-Raluca
Seria II , Grupa 20