DIAGNOSTIC SEROLOGIC AL PARATUBERCULOZEL PRIN METODA ELISA Pe probe de ser si plasm silapte pentru bovine, ovine si caprine kt POURQUIER® ELISA ParatuberculozA Anticorpi Screening Versiune : PO7130/17amele pl destiiata ities POURQUIER® ELISA paratubereulozs anticorpi sereening este un test imunoenzimatic penin-déteetaiea ‘nticorpilor specifici contra Mycobacterium Avium spp. paratuberculosis (MAP) pe probe de ser, plasaii'g fags ‘eatru bovine si pe probe de ser si plasmd pentru rumegatoarele mii Tnformatii generate Paratubereuloza sau bosla Ini Jone ete o enterita cron produ de infect eu Mycobacterium Aviu spp Daratuberculosis (MAP). Animalele sensible sunt fn special bovinele, ole gi eapele dar boela poate apare sila porcine sf cabaline. Bosla afecteazi o populaie lazgh de rumegitonre din toatl lumea, productnd pierderi economice considerable. Testul de confirmare al bolii este izolarea pe culturi bacteriene dar metoda este Jaborioasd si dureazi prea mult timp. Detectarea anticorpilor specific contra MAP este metoda cca mai frecvent Utlizatd pentru screening, In unele fri, pentru diagnosticul serologic se foloseste testul de fixare al Complementului in ciuda diffcutijilor de standardizare dintre laboratoare. Specificittea testlui ELISA a fost mundi prin inrodvcerea une etape de adsorbjc cu Mycobacterium phley canform Manualului OI, pentru ‘a scade reacfiile nespecifice ce pot apare fal de alte mycobacteri, Descriere/Princiy Testl este un ELISA indirect ce uilizearA pli invite cu antigenul Mycobacterium paratuberculosis, Probele sunt mai ft pre-incubate cu un extract de Mycobacterium phy penta elimina anticarpi nesecii la urna ‘eansferuiprobelor pe incubate a plicile ELISA, anor set se vor fx pe suport slid. Antcopi ‘nefixai se elimin§ prin splare.Anticorpi fia sedetecteazd cu ajutoral unui conjugal anti-rumegétoare mareat ou peroxidazk (HRPO). fn prezn enzime, substrata TMB est transforma intc-un prods care reacfianeazd eu romogentl si dio culoare bleu, fa uma edu solic stop, culorea bleu vreaz in galben. Adsorbanja se smlsart Ia singut langime de und la 450nm (A(4S0)] cu autora unui spectofotometns ntenstaea euler este fn fancie de titel anticopilor din srl detest. Pragul de detectare al testului este relizat prin folosirea scrului de cootrol povitiv furniaat in kit, care trebuie adfugat la fiecare plack ‘nstina POURQUIER - ELISA Paratterculoes Aico Screening ~ Veniane PO7130/17® rsa Reagenti Gj bent, cu casein conugnst concent gia probe de sr, plank # ape Webi Isa la | Sempre camer (+ 21°C 45°) fst de foosr, Reagent webvie git rn Virtire ugoar _GOMPONENTO CANTITATEA ‘MODUL DE CONSERVARE $I ALTE. ne L OBSERVATIL Microplici FCS ‘monocupule 5 ial «Dae o pact mu ete ula tn ttaltat, a ar putes ft ‘sensibilizale Jolt terior decd ete uid Ino pores de plastic ‘ei eto contervats lav 3% (2 350 Solufie de spare 1 100ml 2° 100ml +3430 concentratl (20%) ‘Soha presi era la + SMC (4 3%) care vor pare rapid a+ 21°C (2 °C). O optare ward din inp tntnp acclercasd dashes eitlelor ‘Sola pate contest lt + 21°C (2 70) pn fo hd dock cnt ose tn flacoane Unchiseean (decd se bore wttzares med) ups diuae, wlio pote ft comerve timp de 8 aiela® SCI) Soli find identi petra too kre Instr Peurger, pote fists pena cricare din aces net Tampon de dilujie [1° 100mt 2° 100ml +SCAIO 12 (pentru seruri), = Agha incite de faire verde ‘Tampon de dilufie | 1° 120ml 1 * 120mt + SCeRT 1 (pentru cconjugat), blew ‘Ser de control 1405 2°05 +See RD pozitiv Ser de control 1405 105 negativ ‘Conjugat HRPO 190.75 115 SCE SG anti-IgG Solute de conn dad ma pose conserva rumegitoare Solufie de revelare 1* 60 1*120 +SCERO 9 (substrat) in ‘dilgie de lucra cw) ‘Soluie stop 3 1°60 17 120 TSCESO ‘Solijie poate conser ls + 21% (a $°) pind la lnk acd st pet flacaane Inch tan (ck dre liarea medit®) ‘Mod de folosire 1 1 lest POURQUIER - ELISA Parsabercolok Antico Sereening ~Versive PO7130!17 auAparaturi si materiale necesare (nefurnizate in kit) Cititor de microplaei (echipat cu un filtu pentra 450 nm) ici sau tuburi de diluyie pentru probe si serurile de control Agitator tip vortex. Sistem de spalare a microplacilor ce permit distribuirea a 300! pe godeu. ‘Micropipete de precizie gi multicanal (precizia ceruth pentru mAsurare trebuie si fie inferioard sau egald Zi 10% pentru volume inferioare sau egale a 10 pil si de 5% toate celelalte volume indicate) ‘Comuri de micropipete uzaj unie, 7. Api distilati : apa utilizaté pentru reconstituirea solujei de spalare concentrat (20%) ce poste fi produst printr-un sistem de distilare conventional sau prin oricare alt sistem performant de purifcare (osmozi inversf, purificare pe rezine gi carbon activ, ete) & Capace sau scotch pentru mieroplici, hirte de aluminiu Precaufii $i avertismente pentru utilizatori + Manipulai tot materiahl biologic a potenilinfetat + Nu pipet reactivi eu gure + Nu mincai, nu bi sm fama cind manipula probe sau reagenii itu + Substratul TMB este iritant pentru oci, sistem respirator sau piel Evitafi contactal ca echil sau pielea + Nuexpuneti substrtul TMB lao fumin pueriek sau a ageni oxidant. Manipulai substratul TMB in vase curate de sticé sau plastic ‘+ Soluja sop confine 1,80, (0,5MB gi poate cauza arsui + Toate reziduriletrebuie decontaminate coretinsinte de eliminare + Luaj toote misurile de prevenire penta a evita contaminares componentelor kita * Nu folosti comonentele ktului dupa data de expirare gi nu amestecaji comonentele de Ia kit diferite + Votiobjine rezulttele cele mai bune dacd respecafisict acest protocol. Pentru a méstne precizs gi curate acestei proceduri,acordafi tot atcotia Ia pipes, sprig timpii de luca + Folosti mumai apt distilatd pentra preparearea reagentior folosit petra teste + Kita se foloseste moma pent uz veterinar Prepararea reagentilor Plécile/coloanee, tampoanele de dilute, erurile de control, substratul TMB i solutia stop sunt gata de folosire Solutia de spilare Solutia de spAlare concentrath (20x) trebuie adus' la temperature camerei gi agitatl pentr a dizolva toate serurile Precipitate. Solufia de spalare trebuie diluaté 1/20 cu apS distilatinainte de folosire (ex. 15 ml de solute de sp8lare concentratd in 285 ml spa distilat) Conjugatul anti-rumegitoare Dituati conjugatul este fn functie de metoda de incubare uilizatl pent probe 1 nehereserth Sinn 2-C4 0) 100% Toop deaiyie » SESS + incubare lungi (16-24 ore la + 5®C + 3°C)-sdiluai conjugatul 1/200 in «Tampon de diluje 1» Insite POURQUIER -ELISA Partubereuloes Anticon Screening ~ Vninne PO713017|Protocolul delucru Pre-incubarea probelor Li Seratsi plasma igh o> Dini probete de conto ide testa 1/20 in «Tampon de dle 12» Loong BH aps ena I 21°C (540) fle 15 minute 2 oe Laple de ack Diluaproelede contol 1/20 i probele de late in «Tampon de diluie 12» ‘Asis apo incuba l-+ 21°C (5%C) fate 15 minute g1 2 ore + iy 2) Incubarea probelor => Depunet (ef. figurii 1, notei 2513) +100 plde ser de contro! negativ difust fn godeul Al + 100 pl de ser de control port dua i godeul BL ‘+ 100 din fiecare ser dilut de testa in fiecare godeu (un singur godeu pe probe de text) => Omogenizati confinutul godeurlorprint-o usoard agitare a plicilor (of note 1). => Acoperifi placa (cu capac, hirtie de aluminiu sau adenv) si incubati placa 45 min (2 § min) (£ 5°C) sau 1 noapte la + SOC (£3 a fy B [P| N= serde contol negativ cia = ser e contol pazitiv p [2 1 = ser detest n*l B [3 2 ser de estat n°? eo lia 3s. 6 H 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figural: depunerea probelor Noth: : 1). fn laboratearele noastre uli un agitator de microplict 2) Unmplerea individual a celor 96 de godeuri poate fetteadaté cam lung’ fn scopul standart timpulut de incubare al probelor, este recomandabil sii pre-diluaji probele in microplici de 96. In acest fel este posibl sd trnsferayi rapid probele,coloan’ dupa coloand, eu autorul nel pipete muticanal. Este ini Indspensobil ca distia serurilor de estat se fact in aceeayi manier ca dita seruilr de contol eu excepiaprobelor de lopte 3) dn caz cd serurile au fost puse la incubat in microtuburi, transferul in placa de testat se poate face direct, coloan’ dup coloand, cu aor une pipete miticanal 4) Seruritede control pot fi dispuseoriunde in plac Inst POURQUIER - ELISA Partborealoak Antico Screening ~ Versa POTI3ON'7 583) Spilarea 2) Aspirtilchidul din micropldei sau elimina confnutulplcilorintr-ua recipient destnat degerilor b) Spilafi fiecare godeu cu eproximativ 300 pl de trei ori & ©) Aspiraticonitl lich dn tote godesile dp cea spllare. Dp ultima aspires, elimina comple” Tebidul rezidul tnd ex placa pe un material aborbant. Evi weave plier are pj twit adduga reactivul urmator_ Not: Petr proble de lope, tn scopul reducer poms de fnd, ete foarte bine co inate de fecare aspirare s6 se lase solujia de spAlare in contact cu placa timp de 2 minute 4) Incubarea conjugatului Depunefi in fiecare godeu cite, 100 pl de conjugat HRPO anti-rumegitoare (conform paregrafului .Prepararea reagentlor” este in fimetie de metoda de incubare utilizath pentru probe. ) b) Acoperifi plicile (ou capac penrtu plici, hirtie de aluminiu sau scotch adeziv) si incubaf-le timp de 30 minute (#3 minute) la + 21°C @5°C). 5) Spalarea 8) Aspire lichidul din microplici sau eliminati confinutul plicilorint-um recipient destinat degeurilor b) Spllafi fecare goden cu eproximativ 300 yl de tre on ©) Aspirafi confinutul lichid din toate godeurile dup& fiecare spilare. Dupa ultima aspire, eliminsti complet lichidul rezidual btind cu placa pe un material absorbant Evitai uscarea plicilor fntre spllri gi inainte de 4 adiuge reactivul urmbtor din punctulb (deci 3 spslsri in total) 6) Revelarea 8) Depuneti 100 pl de «Substrat TMB 9» in Gecare godeu. ) Incubafi plicile timp de 10 minute Ia temperature laboratorulai + 21°C ( $°C) Ia intuneric. Incepefi ‘nregistrareatimpului dup umplerea primului godeu ©) Depuneti 100 pi de «Solute stop 3» In fiecare godeu 8) _Agitafi ugor plcile pind la omogenizarea solutiei colorate. Sterge(i eu atenfie fndul plicitor oti Cele 10 minute de revelare previizute in paragraful precedent dau valori OD ce se ineadreazd in paragrafil ulnterpretare”. Totodaté, rata de evolujie a culorii poate fi usor modificats de diferji factor’ (spAlarea, ccalitatea apei, pipetarea, temperature laboratorului..). In functie de acesti factori, fimpul de incubare al substratulul poate fi ajustat in consecing& (10 min + 5 min) Citirea plicilor poate fi facut pind ta 1 ord dupa soluia stop cu condisia ca placile $8 fie tinue la fesiue POURQUIER - ELISA PartberculeeS Antica Srening~ Venivne PO7I30017“Executali citirea plécilor la 0 densitate optict de 450 nm ((A(AS0)). Punctul zero («bancul») “spectrofotometrului se msoard in eer. ETS Reacjia este validata dack on Deasitates optics (DO) a serul de control pozitv are o valoare a DO. 450 de minim 0,350 si dacd Report dintre DO. 450 a serului de coatrol poztiv DO (CP) si DO. 450 a serutui de coatzol negativ DO (CN) dl 0 valoare de minim 3.00 @atewte | CCaleulaji pentrafiecare egantion de testa, raportal E/P [A@S0)] Prob - CN EP = 100 cP -NC Titesprecatea fecmleatelon |< ‘+ Sersau plasm plasma (bovine, ovine, caprine) : ‘Toate eyantioanele a ciror valoare % TIP este inferioar sau egalé cu 45% sint considerate ca provenind de 4a animale care nu au fost infectate cu Micobacterium paratuberculosis Anas @ + Toate egantioancle a ciror valoare % E/P este cuprins iatre 45% si 55% sint considerate dubioase. Un now {est este necesar pentru a confirma statutul acestor esantioane, © = Toate egantionnele a cirorvaloare % E/P este superiard sau egall cu 55% sit considerate ca Provenind de 4a animale care au fost infectate cu Micobacterium paratuberculosis. eRe, so oy eer Insite POURQUIER - ELISA Pastuberclord Antico Screening ~ VeninoePO7130/17 1+ Lapte (bovine) : = Toate esantioanele a ciror valoare % E/P ese inferioaré sau egal8 eu 20% sint considerate ca ta animale care nu au fost infectate cu Micobacterium paratuberculosis = Toate egantioanee a cdror valoare % E/P este cuprinst intre 20% gi 30% sint considerate dubicase, Un now test este necesar pentru a confirma statutul aestor esantioane, = Toate egantioanele a céror valoare % EJP este superioar8 sau egald cu 30% sint considerate ex provenind de 1a animale care au fost infectate cu Micobacterium paratuberculasis. Nota: Desi animalele se infected in general faite de Ian, rispunsil fmm mu se dervl medi nterpretares rezultaelorserologice negative trebuie fcuth in fanete de istoriculseptelull gi de rezultatleserologice ale restului animalelor din septel. Bibliografie = OIE MANUAL, Volume Il, 1991, Paratuterculosis (Johne's Disease) (B/009) MILNER AR. MACK WN. COATES K, WOOD PR, SHELDRICK P, HILL. & GILL 1. (1988) - The absorbed ELISA for the dingposis of Johne's discaze in cate. In: Johne's Diseases. A. Milner & P. Wood, eds. CSIRO Publications, Melbourne, Australi, pp. 138-163 = YOKOMIZ2O Y,, MERKAL RS. & LYLE PAS. (1983) - Esryme-linked immunosorbeat assay for detection of bovine ine nonobulig @ anibedy to a protoplasmic antigen of Mycobacterium paratuberculoss, Am. J vet. Res, 44, 2205- gnosis of Bovine Paratubercoloss. Clinical end «MF. Collins, Evaluation of Five Antibody Detection Tests for Di Disgnostic Laboratory Immunology. June 2005. P 685-692. “« NAvvgoni OL Bellet, G Camm .R Tadéei, D Pravetton, A Ballo, M.Tamba. Dingnosi di Paratiberculosi boing aaaratee din test ELISA del commercio su sco late i animal aft i forma subliiea (sito Zooprofatico Spotmentle dtl Lomita eds Emilia- Romagon~ Cedro di Refereza nazionle pe le partbercoles tov eer Facenza (Italia) Dipartimeato di Seemze Clinithe Veterinarie ~ Sezione di Clinica Medica Veterinaria (Milano, Halla) @ = Modificare in instruejunile de folosire wherculozk Ascari Sereming~ Versiane POTI3017 lost FOURQUIER - ELISA PaELISA PARATUBERCUI LOSI Ser Screening-480 Teste TEST PENTRU DETECTIA IMUNOENZIMATICIA ANTICORPILOR TG DE Componentt seta fm crop sensiliate oro: omit2 | 1 x 00m! Sole spre, concentrat 2 1102 2iNts ON © 100m Tonpon de dituie 12 piss 268113 vince |X 12001 Tampon de iii 145660815, a tx OSml Manor post 956 16/1212 | 105ml Martrnegati 977 onions i Hk OFS Conger hos naira hx GOmt Saban THB 9 9203 omatte 1x 6Oml Soli de stopare 3 3052. 1907113 Tnsracrun de wiicare ronison7 hte g: Cee] TRSTITOT POURQUIER 326 RUT DTA GANIA~SADDT MONTWITTTER CTI ~ FRANTA TH: 33.09.9925 24.25 Fax: 33 (0.67.0420.25, ELISA 1 8 g| UE soturespatare 2m == 3 i i ma | i t (100m) , 2 tot: 1102 Expi2tt 2015 3 | lnstitut Pourquier - FRANTA | ELISA Coningat 1 1.98 | isti202 tut POURQUIE 2 Tampon be owurie 4 ol i 2 Q i a . Ete 124s Exp: 26082013 2 : i Institut Pourquler- FRANTA | 3p ernaean | : a | ELISA i} eo. terra oo LPP Testu pounquigR | E SoLUTE DE sToraRE 3 (om) | BO eanatinromsn | 052 Bepci9aris 4 Sess aoe nner a) [By uo on dt Pourguler- FRANTA J i} ee. e022 | PEt POURQUIER | 2 2 souwrre RevetATOARE i ; ° 3 a oat a tm POURQUIER FANT, Institut Pourquler- FRANTAELISA) PARATUBERCULOSIS-Paratub Serum-S Ser —Serééniig-480 Teste [TEST PENTRU DETECT IMUNOENZIMIATICTA ANTICORPILOR GDR Componente seta ‘= 68 io Mcropltsesibiliate 0103 omit2 : | Solute spore, concent 205 1402 PAIS 7 Pampon de disie 2 12-458 26108113 15456 6081s 936 16-2 Tampon de dia I 05m Menor posit Om Martor nepaiv 977 20213 1S ml Conger 1398 1ayn42 130 ml Substrag TMI 9.223 osizits 120m) ‘Solutie de sopare 3 40821990713 Inatretant de lice Ponisi? | a one 306 Wa Di TA Gata A SADT MON TOVTHIIR GDI S~ PRANTA TM: 3304.99. 23.2425 Fax: 33 (0.67.042025, | Teer ant TnsTUT PouRgUT ELISA. ¢ SOLUTIE SPALARE 20x. i : TA er i i Tt oui Tampon De wu tim POUR ie | ohm Lot 12-458 Exp: 26.08.2013, Inst Pourguiee-FRANTA | a a I ‘ees eee 12 Lot 956 1 ELISA | The. 16.122012 EP Mraueroungiten 5 | : 2 Sotumie ve srorane i 4 ‘3 (120ml) ¥ f PARATUBSeom SB | Bape Mgomn B | PES. ne | de sit Pourqee-FRANTA | ale. 2022013 : EF Tostitat POURQUTER ELISA ] eon f soul Ea oan 1 Z| ate.‘ anante (aon a as tate 1ts6 eps osananis 2 Institut Pourguler- FRANTA