1. Cinetica enzimatic.

Influena concentraiei enzimei i a substratului, a pH-ului i a temperaturii asupra

activitii ezimatice
Factorii care influieniaz activitatea E
Temperatura
pH
Concentraia S
Concentraia E
electroliii
Termolabilitatea (t)
E sunt termolabile
t optim a E din organism - 35 - 40 C
odat cu creterea t cu 10C (dac lum punctul de plecare
0 ) - V reaciei enzimatice sporete de 1,5 ori, atingnd
max la t 40C.
Majorarea de mai departe duce la micorarea activitii
enzimatice - denaturarea proteinei.
Unele E a microorganismelor termofile sunt active la t de
80C
La t joase E se inactiveaz (excepii: catalaza: activitate max
la t=0 C)
Termolabilitatea (t)
v reaciei odat cu t este nterpretat prin prisma
"energiei de activare".
Pentru fiecare E se poate stabili o t optim la care V atinge
valoarea max, mai departe V scade din cauza denaturrii.

Aciunea pH asupra activitii enzimatice

Fiecare E are pH optim propriu (manifest activitate max).
Majoritatea E celulare au pH-ul optim- 6-8 (7,4) (excepii:
hidrolazele acide lizozomale pH= 5; MAO din membrana
MC externa pH= 10).

La E digestive pH optim este cel al sediului lor de aciune:

1. Pepsina pH 1,5 2,
2. Amilaza pancreatic - pH 7,2,
3. Tripsina - pH 7,8-8,0
4. Arginaza- pH 9,5-10 etc.
pH optim e dependent de:
1. gradul de ionizare a grupelor funcionale,
2. afinitii E fa de S,
3. stabilitii E.
In CA al E se afl grupri ionizabile, acide sau bazice. Acestea
interacioneaz direct cu ionii H+ si OH-, rezultatul fiind creterea sau
scderea gradului lor de disociere, acionnd ca adevrai inhibitori ai
E (amilaza n sucul gastric). Ionii H+ si OH- au un efect denaturant
asupra E - rup legturile, ce determin structura teriar.
Deci mrind sau micornd pH-ul mediului, se poate regla
activitatea catalitic a E.
Dependena activitii E de variaia pH-ului - curb n forma
de clopot

[ E ] n condiii standard 2 mol de E ntr-o anumit

perioad de timp vor transforma de 2 ori mai multe molecule
de S dect 1 mol de E (relaie direct proporional).

[ S ] Grafic se reprezint sub form de o curb de tip

hiperbolic.
n perioada iniial a reaciei V crete pe msur ce crete
[S]. La un moment dat cnd CA al E se ocup de S V nu
mai crete. Ea rmne constant i corespunde V max a
reaciei.
n cazul E alosterice curba reprezint un aspect sigmoid
Analiza curbei hiperbolice arat c ea reprezint 3
zone:
a. V de reacie crete proporional cu c% S
b. Creterea este mai ncet
c. V de reacie nu mai crete
Aceast curb este numit curba lui MichaelisMenten i se exprim prin ecuaia:
[S]
V=Vmax x
_________
Km +[S]
unde: V-V reaciei la un moment dat
Vmax- viteza max
Km-constanta lui Michaelis Menten
[S] C% molar a S
Km- este acea concentraie de S pentru care v de reacie este
jumtate din Vmax.
Km reflect afinitatea E pentru S i anume cu ct Km este
mai mic cu att afinitatea este mai mare i invers.

Din curba lui Michaelis Menten nu poate fi determinat V max (deoarece nu se

pot atinge c% infinite ale substratului).
Se procedeaz la linearizarea ecuaiei, obinndu-se ecuaia lui LineweawerBurk

2. Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor

Unitile de msurare a activitii E
1. 1 UI cantitatea de E care catalizeaz transformarea unui mol de S ntr-un minut n condiii standard
2. 1 Cat (catal) cantitatea de E care catalizeaz transformarea unui mol de S ntr-o secund n condiii standard(1U.I.=16,67 nkat)
Condiiile standard - pHul ~ 7,0; t = 25C; p = 1 atm; C substratelor 1 M.
1 cat = 6 107 UI
1 UI = 16.67 10-9 cat
Activitatea specific reprezint numrul de uniti enzimatice per mg de protein-enzim
AS= Nr UI/mg protein
Este expresia puritii unei enzime

3. Inhibiia activitii enzimelor (specific i nespecific, reversibil i ireversibil, competitiv, necompetitiv

i noncompetitiv)
Inhibiia activitii enzimelor

Deosebim:
1. inhibiie nespecific (T, pH, agenii denaturrii )
2. inhibiie specific
Inhibiia poate fi reversibil i ireversibil.
La o inhibiiie reversibil - inhibitori se fixeaza slab, necovalent de E
Inhibiia ireversibil
I covalent se fixeaz de E cu formarea EI nedisociabil.
Exemple: Diizopropilfluorfosfatul (toxina neuroparalitica) se fixeaz de OH-serinei n CA a acetilholinesterazei (scindeaz acetilcolina) cu
formarea E neactive.
n rezultat se menine efectul acetilcolinei n permanen ce duce la paralici muscular i moarte.
- ionii metalelor grele (Hg, Pb) inhib gruparea SH a multor E; acidul iodacetic- inhib ribonucleaza
Deosebim:
1. Inhibiie competitiv
3. Inhibiie prin exces de S
2. Inhibiie necompetitiv
4. Inhibiie alosteric

Inhibiia competitiv

I se aseamn dup structur cu S.

Apare o competiie dintre I i S pentru CA.
Nu e posibil simultan fixarea S i a I.
E va fixa pe acel competitor care se afl intr-o concentraie mai mare.
E+I ---- E
Este o inhibiie reversibil- I poate fi nlturat cu adugarea n exes a S.
Inhibiia competitiv diminueaz v catalizei:
nu modific V max,
dar crete mult Km, micornd afinitatea E pentru S.
Exemplu: inhibiia SDH cu malonat (SDH -oxideaza succinatul in fumarat).
Malonatul inhib aceasta E datorit asemnrii cu S.
Sulfamidele substituie acidul p-amino-benzoic din a. folic, indispensabil pentru creterea microorganismelor, mpedicnd dezvoltarea
lor (antibacterian)
inhibiia enzimei (SDH)cu malonat. SDH oxideaza succinatul in fumarat)

Malonatul inhiba aceasta E datorita asemanarii cu S.

Particularitatea principal a acestui tip de inhibiie este c poate fi nlturat cu adugarea n
exes a S(succinat).

Inhibiia necompetitiv

inhibitorul nu se aseamn ca structur cu S

I i S se leag simultan cu E dar locusurile sint diferite (I nu se leag n CA)
E+S+I--------- ESI
Acest tip de inhibiie nu se nltur prin exces de substrat.
I necompetitivi scad V max dar nu afecteaz Km
Ex: cianurile, CO se fixeaz cu Fe 3+ din citocromoxidaz ---se ntrerupe LR
I poate fi nlturat de substane care l leag numite reactivatori
I i S se leag simultan cu E n locusuri diferite
Mrirea concentraiei de S nu micoreaza inhibiia.
Cei mai de vaz inhibitori de acest tip n celulele vii sint produsele intermediare ale metabolismului, care reversibil se fixeaz la unele
E reglatoare i modific activitatea lor.

Inhibiia uncompetetiv I se leag la complexul ES, inhib activitatea E

E+S----ES +I-----ESI
Micoreaz i Km i Vmax
inhibiia prin modificarea covalent a moleculei E prin fosforilare pe baza ATP-ului. Unele E fosforilate pierd
activitatea de exemplu enzima glicogensintaza
Inhibiia prin exces de S n CA se fixeaz simultan
surplus de S ce nu poate fi transformat. Este o inhibiie
reversibil nlturarea S

Inhibiie prin exes de S

4.

Reglarea activitii enzimelor (proteoliza parial, reglarea alosteric, autostructurarea cuaternar, reglarea
covalent)

Mecanismele de activare a E
Sunt : 1. nespecifice: temperatura , iradierea
2. specifice
Se activeaz la:
1. majorarea concentraiei S cnd este insuficient
2. majorarea cantitii E
3. introducerea Co cnd sunt insuficiente
4. Introducerea ionilor metalelor Fe, Cu

Se cunosc urmtoarele tipuri de reglare a activitii enzimatice:

1. Reglare covalent - proteoliza limitata
2. Reglare covalent fosforilare/ defosforilare
3. Autostructurarea cuaternar
4. Alosteric

Proteoliza limitat:
Unele enzime (proteine) se sintetizeaz n forma neactiv de precursor proenzime (zimogeni)
Exemplu:
1) enzimele digestiei: pepsinogenul, chimotripsinogenul,
2) coagularea singelui e determinat de cascada de reacii cu
tripsinogenul, proelastaza, procarboxipeptidaza - scindeaza
activitate proteolitic;
proteinele in stomac i duoden.
3) hormonii proteici (insulina);
4) proteinele fibrilare (colagenul).
Mecanismele de activare a proenzimelor este proteoliza limitata - este scindarea unui sector al catenei n rezultat E se restructureaz i se
formeaz CA.
H+
1. Protejaz de proteoliz proteinele celulelor productoare de E.
Pepsinogen ------pepsin
2. Este o forma de rezerv a E, care rapid pot fi activate i intervin n
-42AA
reacie.
Importanla biologic a prezenei formelor neactive

Reglarea covalent (fosforilare-defosforilare)

Activitatea unor E se modific prin fosforilare. Reaciile de fosforilare sunt catalizate de kinaze specifice.
E-OH + ATP -------- E-O-P +ADP
Defosforilarea are loc sub aciunea fosfotazei specifice E-OP +H2O------- E-OH +H3PO4

Fosforilare -defosforilare

unele E sunt active n forma fosforilat, iar altele n forma

defosforilat.
Ex.: glicogen fosforilaza activ n forma fosforilat; glicogen
sintaza este activ n forma defosforilat

Autostructurarea cuaternar

Este caracteristic E ce posed structur cuaternar

Fiecare protomer n parte nu e activ

La asamblarea lor se modific conformaia fiecrui

protomer i corespunztor se modific i conformaia CA,
devenind astfel favorabil pentru fixarea i transformarea S

Reglarea alosteric

Inhibiie alosteric - inhibitorul (efectorul) se leag n

centrul alosteric al enzimei, modificnd conformaia
moleculei (structura teriar) ce are ca consecin
deformarea centrului activ.

5. Organizarea enzimelor n celul (ansamblurile ezimatice , compartimentalizarea). Reglarea activitii

enzimelor n celul. Importana principiului de retroinhibiie
Sistemele polienzimatice Tipurile de organizare a sistemelor polienzimatice

Fiecare celul a organismului conine setul su specific de E.

Unele se gsesc n toate celulele, altele sunt prezente doar n anumite celule sau anumite compartimente celulare.
Funcia fiecrei E, nu este izolat, ci strins legat de funcia altor enzime.
Astiel din E aparte se formeaza sisteme polienzimatice sau conveiere.
Se cunosc urmatoarele tipuri de organizare a sistemelor polienzimatice:
1. - funcional,
2. - structural-funcional
3. - mixt.

Organizarea funcional
enzimele sunt asociate n sistemul polienzimatic cu ajutorul metaboliilor, care difuzeaz de la o enzim la alta.
produsul reaciei primei E servete drept S pentru E urmtoare etc.
Ex.: glicoliza. Toate enzimele participante la glicoliza sunt n stare solubil, legtura se face doar prin intermediarii
metabolici.

E1
E2
E3
E4
A---------------- B------------- C---------- D---------- P
Organizarea structural-funcional

E sunt fixate prin legturi slabe pe o protein central, care poate fi chiar una din E.
Proteina central dispune de un bra care fixeaz S i l duce la E1, care l transform n P1;
P1devine S2 , braul l preia i l duce la E2, care l transform n P2.
Avantajul este c braul duce de fiecare dat S la E corespunztoare, potrivindu-l cu mare exactitate pe CA, ceea ce asigur n
ansamblu o vitez mai mare dect cea corespunztoare aciunii E neasociate.
Ex.- complexul polienzimatic piruvatdehidrogenazic, constituit din 3 E i 5 Co
sintetaza acizilor grai constituit din 7 E legate structural de PPA, care n ansamblu ndeplinesc funcia de sinteza a AG.
E se pot aranja n lan, fixndu-se de MB. Ex.enzimele LR, care particip la transferul de H+ i e.

Tipul mixt de organizare

reprezint o mbinare a ambelor tipuri de organizare, adic o parte din sistemul polienzimatic are organizare structurala, iar cealalta
parte - organizare funcional.
Ex.- ciclul Krebs, unde o parte din enzime sunt asociate n complex structural (complexul 2-oxoglutaratdehidrogenazic), ar alt parte
se leag funcional prin metaboliii de legtur.

6. Izoenzimele particularitile structurale i funcionale, valoarea lor biomedical

1.
2.
3.

forme moleculare multiple ale E, ce catalizeaz aceeai

reacie chimic, dar difer prin structur, proprieti fizice,
chimice i cinetice
Diferite forme de izoE se pot gsi:
mpreun (LDH din ficat);
n esuturi diferite (fosfotaza acid n prostat i hematii);
sau n diferite compartimente ale aceleiai celule (MDH
MC i Cit)

IzoE difer ntre ele prin:

1. sarcina electric (ce permite separarea lor prin
electroforez);
2. V max de cataliz,
3. sensibilitatea fa de modulatorii allos;
4. pH-optim de aciune;
5. termolabilitate, au afinitate diferit fa de S.

STRUCTURA IZOE
Sunt E oligomere, cu structur cuaternar, alctuite din cel puin 2 protomeri diferii

Ex. LDH (lactat piruvat)

Prezint un tetramer, alctuit din 2 tipuri de subuniti (H inim; M- muchi) n diferite raporturi; codificate de gene diferite.
HHHH inim; HHHM;HHMM; HMMM; MMMM muchi

Izoformele lactat dehidrogenazei (LDH)

Rol :
LDH-1 (4H) - in inima

LDH-2 (3H1M) - in sistemul

reticuloendotelial
LDH-3 (2H2M) - in plamani
LDH-4 (1H3M) - in rinichi
LDH-5 (4M) - in ficat si muschiul
striat

1.

n controlul metabolic ( faciliteaza

adaptarea metabolismului in diferite
esuturi.)
Ex: in miocard predomina H4
(inhibat de piruvat) - orienteaz oxidarea
piruvatului pe cale aeroba.

M4 este activat de catre piruvat i

orienteaz transformarea piruvatului pe cale
anaerob spre lactat.
2. n diagnosticul unelor stri patologice
(variaia diferitor forme de izoE)

Exemple de izoenzime:
1.
2.

Creatinfosfokinaza -2 tipuri de
monomeri: M-Muscle i B brain
LDH

3.
4.
5.

MDH
Aldolaza
Fosfataza alcalin

6.

Fosfataza acid

7. Deosebirea privind componena enzimatic a organelor i esuturilor. Enzimele organospecifice.

Modificarea activitii enzimatice n diferite afeciuni (enzimodiagnosticul).
Enzimele indicatorii sunt localizate intracelular:

n citoplasm (LDH, aldolaza),

n MC * glutamatdehidrogenaza),
n lizosomi (-glucoronidaza, fosfataza alcalin).

Acestea E n norm n plasm se gsesc n c% foarte mici.

La afeciunile celulare activitatea acestor E n plasm este
brusc mrit.

8. Metodele de obinere i purifcarea a enzimelor.Cromatografia de afinitate

Metodele de separare i purificare ale E
1. Dializ
2. Salifiere
3. Cromatografie
4. Gel-filtrare
5. Electroforez
Cea mai eficient cromatografia de afinitate

Metodele de determinare a activitii E

Viteza reaciei este proporional cu
1. Viteza consumului substratului
2. Viteza formrii produsului
3. Viteza transformrii coenzimei
Cantitatea substanei respective se determin colorimetric.

9. Utilizarea enzimelor n practica medical. ntrebuinarea enzimelor imobilizate n medicin.

Preparatele farmaceutice contemporane
sunt asociate i conin ca regul
urmtoarele enzime:
tripsin,
chimotripsin,
lipaz,
amilaz,

pancreatin,
bromelain,
papain,
Utilizarea E n practica medical
Efectele exercitate de preparatele enzimatice
De substituie (E digestive)

Fibrinolitic i trombolitic
Antiedematic
Analgezic
Antiinflamatoare
Imunomodulatoare

Terapia cu enzime
Enzimele sunt ageni terapeutici unici ce produc efecte importante i specifice.
Motivele care au limitat folosirea larg a enzimelor ca medicaie e natura protC:IC6:legat de natura proteic:
distribuie redus n organism, dependena de dimensiuni, sarcina i de fenomenele de glicozilare (prin glicozilare proteinele sunt
recunoscute de receptori i fixate n anumite locuri
posibilitate mic de dirijare extrahepatic, ficatul avnd tendin de a capta i reine proteinele strine;
inactivarea lor sub aciunea proteazelor digestive n cazul administrarii orale, iar proteazele tisulare le scurteaza de asemeni actiunea;
potentialul lor antigenic, anticorpii formati pot genera reacii de hipersensibilizare adesea grave i pot inactiva enzima.
Tehnici propuse pentru optimizarea proprietilor terapeutice ale enzimelor.
Prin N-acilare a fost crescut semiviata asparaginazei, folosit n leucemie
S-au incercat de asemeni metode de obinere a enzimelor imobilizate.
De ex. prin reticularea enzimei, ce conduce la agregate insolubile, prin adsorbie pe polimeri sintetici ori prin ataare covalent, sau prin
incorporare ntr-un gel in cursul polimerizarii
Aceste preparate catiga rezistena la enzimele proteolitice i sunt mai putin imunoactive dar pot fi alterate proprietaisile farmacocinetice.
Asemenea avantaje au dovedit conjugatii cu polietilenglicol (PEG) ai arginazei, ai glutaminasparaginazei sau ribonucleaza supusa
reticularii, enzime cu efect antitumoral. Un succes n terapia defectelor genetice a fost imobilizarea enzimelor din ciclul ureogenetic pe un
suport de fibrina.