Sunteți pe pagina 1din 32

Programul: IDEI

Tipul proiectului: Proiecte de cercetare exploratorie


Cod proiect: ID_1225
Contractul de finanare : Nr. 223/2007
INTERFERAREA MECANISMELOR FARMACO-BIOCHIMICE ALE
IMPLICARII HOMOCISTEINEI IN FENOMENUL ATEROGEN
Director de proiect: Conf.dr Elena Albu

REZULTATE OBINUTE
RAPORT STIINTIFIC 2007
Etapa I : Punerea la punct a metodelor de calibrare a metodei cromatografice de
determinare a homocisteinei in lichide biologice.
1. Documentare
2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat
3. Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie
1. Documentare
Tablou biochimic
Inainte de stabilirea unor metode de determinare a homocisteinei (Hcy) este utila
cunoasterea biochimiei acestui analit.
Homocisteina este sintetizata din metionina printr-o reactie de transmentilare, in urma
careia metionina pierde gruparea metil.
Homocisteina urmeaza doua cai metabolice diferite :
se metileaza refacand metionina pe seama a doua reactii catalizate de
doua enzyme diferite care implica drept cofactor vitamina B12 si metil
tetrahidrofolatul coenzima provenita din acidul folic, drep substrat.
este convertita la cisteina precursor al glutationului- in urma a doua
reactii succesive dependente de vitamina B6, in care prima reactie ste
catalizata de cystationin -sintaza (CBS).
Orice dezechilibru intre formarea si utilizarea homocisteinei duce la modificari
ale concentratiilor plasmatic al homocisteinei. Aceasta impreuna cu faptul ca
metabolismul homocisteinei se bazeaza pe trei vitamine din grupul vitaminelor B, face ca
homocisteina sa poata fi un maker pentru statusul acestui grup de vitamine.
Afectiuni in care este implicata homocisteina
Exista un numar relativ mare de afectiuni considerate astazi ca fiind cauzate de
cresteri ale nivelelor de homocisteina, cum ar fi :

afectiunile psihiatrice incluzand depresiile, comportamentul violent,


modificarile de personalitate, pierderile de memorie, boala Alzheimer.
Studii recente arata ca nivelele ridicate de homocisteina sunt prezente in
15 % din cazurile de dementa.
sindromul Down , defecte de tub neural, si alte afectiuni legate de
sarcina cum ar fi pierderea prematura a sarcinii, nasterea de feti cu
greutate mica, incidenta crescuta a avortului etc.
bolile coronare, afectiunile cerebrovasculare, ateroscleroza si bolile
trombotice.
Gravitatea situatiei consta in faptul ca in afectiunile mai sus metionate sunt
implicate cresteri relative mici, cu putin peste limita superioara, ale homocisteinei.
Din cele expuse se evidentiaza necesitatea determinarii nivelelor acestui analit la
urmatoarele categorii :
persoane cu simptome ale deficitului de vitamine (persoane in virsta,
femei insarcinate, copii)
persoane cu risc crescut de deficit vitaminic (persoane cu afectiuni
digestive sau cu rezectie gastrica, vegetarieni, alcoolici, persoane la care
se administreaza himioterapice ce interfera cu statutsul folatilor)
persoane cu afectiuni cardiovasculare
Masurarea Homocisteinei
Homocisteina este un termen colectiv folosit atat pentru homocisteina ca atare sub
forma redusa cu gruparile sulhidril in forma SH (HcysH) cat si pentru formele oxidate ale
acesteia ce se prezinta sub forma de dimmer in care intre doua molecule de homocisteina
se formeaza o punte disulfidica

Homocisteina totala (tHcys) este un termen cantitativ care se refera concentratia


de homocisteina obtinuta dupa tratarea probei biologice cu un reducator.
In plasma homocisteina se gaseste:
in forma redusa in cantitati de ~1%
legata de albumina prin punti disulfidice in cantitati de ~70 %

legata de cisteina prin punti disulfidice in cantitati de ~30 %


In momentul de fata exista diferite metode de determinare, dar toate utilizeaza
acelasi principiu : plasma sau serul este mai intii tratat cu un reductant care converteste
diferitele forme de homocisteina in una singura (HcysH) vcare poate fi masurata direct
sau dupa derivatizare.
Masuratorile cromatografice si imuno sunt sunt cele doua metode principale
utilizate in determinarea homocisteinei. Motoda imunologica de determinare a
homocisteinei este relative simpla si foaret potrivita pentru analizele de rutina in
laborator.
Cu toate acestea nu au fost inca puse la punct reguli de standardizare si calibrarea ale
analizei acestui analit si variatiile intre metode si laboratoare sunt relativ mari.
Intervale de referinta si variabilitatea intre persoane
Nivele nomale ale homocisteinei prezint o anumita variabilitate data de sex, varsta si mai
ales de tipul de alimentatie si aportul de vitamine.
Datorita influentei semnificative pe care o are virsta si sarcina trebuiesc stabilite limite
normale pentru diferitele categorii: copii (15 ani), adulti, batrani (>65 ani), femei
insarcinate.
Valori normale : 8,9 mol/L
Valori patologice
Hiperhomocisteinemia a fost clasificata in :
usoara la valori de 11,7 16 mol/L
moderata la valori de 16 30 mol/L
intermediara la valori de 30 100 mol/L
severa la valori mai mai de 100 mol/L
Nivele ale tHcy mai mari de 15 mol/L sunt asociate cu un inalt risc cardiovasculer.
Conditii de recoltare
Sangele periferic se recolteaza pe gheata, in tuburi ce contin anticoagulant EDTA
sau heparina. Plasma trebuie separata in decurs de 30 minute prin centrifugare la 40C si
depozitata la -80OC pana la analiza
Metode analitice de determinare a homocisteinei
Importanta biologica a homocisteinei justifica interesul crescut pentru gasirea de
metode rapide de determinare a concentratiilor ei plasmatice. Metodele disponibile in
momentul de fata se impart in doua categorii : directe si indirecte
Metodele directe de detectie se refera la tehnicile imunologice :
determinari enzimatice prin tehnici imunologice (enzyme immunoassay- EIA)
determinari de flurecenta polarizata prin tehnici imunologice (fluorescence
polarisation immunoassay - FPIA)
determinari enzimatice prin tehnici de imunofixare (enzyme-linked
immunosorbent assay - ELISA)

Metodele indirecte se bazeaza pe tehnici de separare prin lichid cromatografie


(LC), cromatografie de inalta presiune (HPLC), electroforeza capilara (CE) si gaz
cromatografie (GC).
Pregatirea probelor
Toate metodele de determinare ale homocisteinei includ o etapa preliminara de
reducere, necesara pentru eliberarea Hcy libere din diferitele complexe in care este legata
prin legaturi disulfidice.
Dintre agentii reducatori frecvent utilizati sunt : ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, tri-nbutilfosfina, si tris (2-carboxietil) fosfina (TCPE).
Metode de determinare cantitativa
Metodele imunologice
La baza metodelor imunologice sta principiul reactiei specifice antigen-anticorp.
Au fost puse la punct mai multe metode.
Metodele EIA si FPIA
Principiul general al metodelor EIA si FPIA consta in conversia Hcys libere la Sadrenozilhomocisteina (SAH) urmata de cuantificarea SAH utilizand anticorpi
monoclonali anti-SAH. Metoda este selective dar costisitoare.
Metode cromatografice
Lichid cromatografie cu spectrometrie de masa (LC MS)
Metoda est deosebit se sensibila si necesita cantitati mici de proba utila in cercetare dar
presupune echipamente foarte costisitoare si nu este potrivita pntru aplicatii in
diagnosticul clinic
HPLC
HPLC a fost utilizat pe scara larga cuplat cu diferite sisteme de detectie. Fiind o metoda
complexa de separare cuplata cu detectie, avantajul acesteia este dat de faptul ca poate
determina simultan diferiti compusi tiolici, in plus metoda se preteaza la automatizare.
HPLC cu detectie fluorimetrica
Spectroscopia in fluorescenta este larg utilizata datorita sensibilitaii si reproductibilitatii
mari a metodei.
Hcys nu este fluorescenta de aceea este necesara o etapa de derivatizare prin care
homocisteina reactioneaza cu fluorofori pentru a genera complecsi detectabili.
Pentru derivatizare au fost utilizati diversi compusi (fig.1) ca ;
7-fluoro- 2,1,3-benoxadiazole-4-sulfonate (SBD-F) ca agent de derivatizare precoloana fig. [10].
o-ftalaldehida (OPA) este un agent rapid de derivatizare pentru o gama larga de
aminoacizi cu grupari tiol
monobrombiman (mBrB)
Selectivitatea acestor derivatizatori este limitata.

Tabel nr. 1 Fluorofori utilizati ca agenti de derivatizare si limitarile lor


Agent
de Limitare
derivatizare
Monobrombimane
Instabil la temperatura camerei si in apa
Compusul derivatizat hidrolizeaza usor
Necesita eluare in gradient
Iodacetamida
Produce reactii incrucisate cu His, Tyr, Met
Accelereaza pierderea gruparii NH3 dupa cuplare in special
pentru Cys
Sensibilitate scazuta in spectrometria de masa
o-ftalaldehida
Reactie sensibila la pH ridicat
Complexele formate prezint instabilitate la lumina
Produce reactii incrucisate cu alti aminoacizi
Maleilimida
Produce reactii incrucisate cu alti aminoacizi
Complexii formati sufera rearanjamente spontane

Fig. 1 Structura fluoroforilor utilizati pentru derivatizare


HPLC cu detectie UV/Vis
Pentru determinarea cantitativa a Hcys a fost utilizata si detectia UV/Vis. Pentru a
putea utiliza detectia UV a fost necesara o etapa prealabila de derivatizare. In acest caz.
Agentii de derivatizare trebuie sa produca complecsi care sa prezintre o absorbtie
semnificativa fie in UV fi in domeniul vizibil.
Dintre agentii de derivatizare des folositi sunt : 2-cloro-1-metilpiridinium iodide
(CMPI) si 2-cloro-1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT) fig.2

Fig. 2 Agenti de derivatizare


HPLC cu detectie electrochimica

Prezenta gruparilor SH in structura Hcy face posibila utilizare detectiei


electrochimice. Principiul metodei consta in oxidarea homocisteinei la homocistina.
Metoda este rapida, nu necesita derivatizare inaintea separarii cromatografice. Ca
electrozi pot fi folsiti electrozii de grafit, platina, aur, argint. Desi prezinta avantajul unui
timp de analiza scurt in comparatie cu toate celelalte metode, detectia electrochimica
prezinta dezavantajul unei slabe reproductibilitati si a deteriorarii celulei de citire.
Electroforeza capilara (CE)
Asemanator HPLC, electroforeza capilara este o metoda complexa care cupleaza
separarea cu detectia, motiv pentru care EC poate fi cu detectie electrochimica, in
fluorescenta sau prin spectroscopie de absorbtie in UV/Vis.
Detectia electrochimica pune o serie de probleme in ce priveste fiabilitatea electrozilor
folositi, in timp ce electroforeza capilara cu detectie in UV/Vis este rar folosita datorita
slabei sensibilitati. Utilizata des este electroforeza capilara cu detectie fluorimetrica.
Electroforeza capilara cu detectie fluorimetrica
In mod asemanator metodei cromatografice cu detectie in fluorescenta, metoda
electroforezei capilare necesita o etapa preliminara e derivatizare. Ca agenti de
derivatizare in acset caz au fost raportati: fluoresceina izotiocianat (FITC),
brommetilflouresceina (BMF), 6-iodoacetamidofluoresceina (IAAF), 4-aminosulfonil-7fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (ASFB), fluorescein-5-maleilamida (FMI) fig.3

Fig. 3 Fuorofori utilizati in electroforeza capilara


Cromatografia de gaz (GC)
Metoda gaz cromatografica a fost rar utilitazata in determinarea Hcy datorita
incompatibilitatii gruparilor tiol cu sistemul gaz-cromatografic. Si in aceasta metoda
etapa de derivatizare este obligatorie.
Cromatografia de gaz (GC) cu detectie in spectometrie de masa (GC-MS)

In acest tip de metoda agentii de derivatizare tsunt alesi pentru a realiza complexi volatili
cu nlitii ce urmeaza a fi determinati.
Ca agenti de derivatizare a fost utilizati : etil cloroformiat, N-(tertbutildimetilsilil)-Nmetiltrifluoroacetamida. Desi procesul de derivatizare este foarte laborios metoda este
reproductibila si serveste ca metoda de referinta.
CONCLUZII
Datorita interferentelor din matricea biologica, determinarea homocisteinei in
fluidele biologice este realizata de cele mai multe ori impreuna cu metode de separare
cum ar fi LC, HPLC (cea mai utilizata) sau CE.
Desi au fost enuntate numeroase protocoale, fiecare dintre ele prezinta
dezavantaje sau prezinta limitari incat nu exista inca o metoda standardizata pentru
determinarea homocisteinei din lichidele biologice.
Tehnica relativ recenta a imnodeterminarilor desi selectiva utilizeaza reactivi
foarte scumpi in comparatie cu reactivii chimici usuali.
Mai mult , Refsum si colaboratorii care sunt specialistii in domeniu, in lucrarea
review publicata, arata ca marea majoriate a metodelor propuse nu intrunesc toate
criteriile de reproductibilitate si acuratete. Erorile de reproductibilitate intre laboratoare
intra si interpacienti persista de aceea este necesara standardizarea uneia/unor metode
care sa respecte toate criteriile de selectivitate, sensibilitate, precizie si reproductibilitate.
2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat
Pentru determinarea homocisteinei a fost aleasa tehnica HPLC cu detectie in UV
plecand de la considerentul ca este o tehnica rapida si putin costisitoare.
In literatura sunt specificate doua conditii prealabile determinarii homocisteinei si
anume a) o etapa de reducere cu un agent reducator si b) o etapa de derivatizare care sa
duca la formarea unui compus cu absorbtie puternica in UV sau vizibil.
a) Pentru ca homocisteina este un compus care in probele biologice se prezenta in
proportie de 80% in forma legata, fie de proteine fie in forma oxidata de dimeri cu
compusi continand grupari tiol. Toate metodele de cuantificare indica o etapa prealabila
de reducere cu diferiti agenti reducatori.
Am utilizat in studiu doi agenti si anume ditiotritol si mercaptoetanol pentru a
stabili comparativ eficinta reducerii.
Eficienta reducerii a fost studiata determinand absorbtia esantioanelor de
homocisteina tratate cu cei doi agenti reducatori.
b) Deoarece homocisteina nu prezinta absorbtie semnificativa in domeniul
UV/Vis s-a realizat derivatizarea ei cu compusul ditio dinitro benzoic acid (DTNB).
Metoda se bazeaza pe reactia Edmann in care gruparile tiol reactioneaza cu DTNB
ducand la formarea unor compusi colorati in galben care pot fi determinati la 412 nm.

Dat fiind faptul ca homocisteina urmeaza a fi determinate din matrici biologice


unde exista multi compusi cu care aceasta poate interfera a fost aleasa tehnica de separare
pe lichid cromatograf. (HPLC). Sistemul cromatogafic ales este:
- liquid chromatograph (HPLC) Beckman, Module 126, UV detector, Module
166, with ODS column (250 x 4,6 mm i. d., particle size 5 m).
- faza mobile este un amestec de CH3OH:NH3 (25%) (100:2): bi distilled water
(50:50) la un debit de 0,8 ml/min. Temperatura de lucru 250C si detectia a fost realizta la
412 nm.
3. Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie
Pentru trasarea curbei etalon a fost preparat o solutie stoc de homocisteina 100
mol/l. Solutia stoc este stabila la 4oC timp de o saptamana conform indicatiilor din
literatura Din solutia stoc au fost preparate solutii de lucru cu concentratii de : 0,65;
1,25 ; 2,5 ; 5 ; 10, 20, 40 mol/l.
La 1 ml de solutie homocisteina au fost adaugati 25 l ditiotreitol dupa care
amestecul a fost lasat la incubat 10 minute.
Dupa 10 minute se adauga 50 l de DTNB si se lasa la incubat 30 minute pentru
formarea complexului dupa care se iau 25 l si se injecteaza in cromatograf.
Cromatograma obtinute este prezentata in figura 4.

Fig. 4 Cromatograma spacifica obtinuta in eluarii etalonului de homocisteinei (5


mol/l) pe coloana ODS cu detectie in UV/Vis. Timpul de retentie pentru homocisteina
in sistemul de elutie ales este tR = 2,87.
Curba etalon obtinuta prin cromatografierea seriei de dilutii a homocisteinei este
prezentata in tabelul 2.
Tabel nr. 2 Curba etalon obtinuta utilizand ca faza fixa column ODS (250 x 4,6
mm i.d., particle size 5 m) si ca faza mobila amestecul de CH3OH:NH3 (25%) (100:2):
apa bi distilata(50:50) la un debit de 0,8 ml/min, temperatura de lucru 250C, detectia la
412 nm.

Curba de etalon pentru determinarea cromatografic a homocisteinei


Conc.
(mol/ml)

A1

Aria picului (A)


A2
A3

A4

Medie

Dev.
Stand.

A5

CV%

1,25
2,5
5
10
20
40

1,822
3,692
7,128
14,189
27,534
57,609

1,766
3,621
7,221
15,031
29,969
58,109

1,783
3,422
7,438
14,022
29,529
56,123

1,852
3,673
7,562
14,561
28,209
59,128

1,712
3,599
6,956
13,963
28,649
57,292

1,787
3,6014
7,261
14,353
28,778
57,652

0,0537
0,1071
0,242
0,4448
0,9837
1,1019

3,01
2,97
3,33
3,05
3,41
1,9

Panta
Intercept
RQS

1,4323 1,458
-0,1367 0,1503
0,9994 0,9997

1,4097
0,2176
0,9992

1,4693 1,4355
-0,1199 1,4355
1,4693 1

1,4409
0,3094
1,0935

0,0233
0,6491
0,2101

1,61

Curbele etalon pentru determinarea cromatografic a


homocisteinei
70
60
50
40
30
20
10
0

Series1

Arie pic

Series2
Series3
Series4
Series5

10

1,787
3,601
7,261
14,358
28,778
57,652

50

60
y = 1,4409x - 0,0061

50
Arie pic

1,25
2,5
5
10
20
40

40

Curba etalon obtinut pentru determinarea cromatografic


a homocisteinei

70

Conc
Arie
(mol/ml)

20
30
Concentratie (mol/ml)

Arie

R =1

40

Linear (Arie )

30
20
10
0
0

10

20
30
Concentratie (mol/ml)

40

50

Ecuaia dreptei de regresie obinut pentru curba etalon este Y = 1,4409. X - 0,0061.

Rspunsul este liniar pe intervalul 1.25 - 40 g/ml, cu un coeficient de variaie (CV%)


maxim de 3,41%. Limita de detectie este 1,25 mol/l. Sub aceasta valoare coeficientul de
variatie depaseste valoarea de 5% admisa.
Coeficientul de corelare pe acest interval este de 1. Valoarea obinut este mai mare
dect coeficientul de corelaie minim, pentru n = 5 grade de libertate (7-2) la p = 0,05,
care este r2 = 0,98.
A fost calculat coeficientul de variaie (CV%) al pantei. Valoarea obinut 1.61% este
mai mic dect valoarea maxim admis de 2% conform criteriilor de validare pentru
metodele cromatografice [170].
Au fost calculai coeficienii de corelaie pentru fiecare pereche de date. Valorile
individuale obinute sunt mai mari de 0.99.
Bibliografie :
1. Jacobsen, D. W., Gatautis, V. J., Green, R., Robinson, K., Savon, S. R., Secic, M., Ji, J.,
Otto, J. M., and Taylor, L. M., Jr. (1994) Clin. Chem. 40, 873881
2. Ueland, P. M., Refsum, H., Stabler, S. P., Malinow, M. R., Andersson, A., and Allen, R. H.
(1993) Clin. Chem. 39, 17641779
3. Lawrence de Koning, A. B., Werstuck, G. H., Zhou, J., and Austin, R. C. (2003) Clin.
Biochem. 36, 431441
4. Eberhardt, R. T., Forgione, M. A., Cap, A., Leopold, J. A., Rudd, M. A., Trolliet, M.,
Heydrick, S., Stark, R., Klings, E. S., Moldovan, N. I., Yaghoubi, M., GoldschmidtClermont, P. J., Farber, H. W., Cohen, R., and Loscalzo, J. (2000) J. Clin. Investig. 106,
483491
5. Weiss, N., Zhang, Y. Y., Heydrick, S., Bierl, C., and Loscalzo, J. (2001) Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 98, 1250312508
6. Weiss, N., Heydrick, S., Zhang, Y. Y., Bierl, C., Cap, A., and Loscalzo, J. (2002)
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 3441
7. Huang, R. F., Hsu, Y. C., Lin, H. L., and Yang, F. L. (2001) J. Nutr. 131, 3338
8. Upchurch, G. R., Jr., Welch, G. N., Fabian, A. J., Freedman, J. E., Johnson, J. L., Keaney, J.
F., Jr., and Loscalzo, J. (1997) J. Biol. Chem. 272, 1701217017
9. Outinen, P. A., Sood, S. K., Pfeifer, S. I., Pamidi, S., Podor, T. J., Li, J., Weitz, J. I., and
Austin, R. C. (1999) Blood 94, 959967
10. Kryukov, G. V., Castellano, S., Novoselov, S. V., Lobanov, A. V., Zehtab, O., Guigo, R.,
and Gladyshev, V. N. (2003) Science 300, 14391443
11. Baker, R. D., Baker, S. S., LaRosa, K., Whitney, C., and Newburger, P. E. (1993) Arch.
Biochem. Biophys. 304, 5357
12. Driscoll, D. M., and Copeland, P. R. (2003) Annu. Rev. Nutr. 23, 1740
13. Shen, Q., Leonard, J. L., and Newburger, P. E. (1995) RNA (N. Y.) 1, 519525
14. Stadtman, T. C. (1996) Annu. Rev. Biochem. 65, 83100
15. Lescure, A., Fagegaltier, D., Carbon, P., and Krol, A. (2002) Curr. Protein Pept. Sci. 3,
143151

RAPORT TIINIFIC 2008


Etapa II :
Obiectiv 1:
1. Punerea la punct a metodologiei de extractie prin metoda cromatografica de
determinare a nivelelor de homocisteina in lichidele biologice
Activiti:
1.1. Alegerea metodei de extracie i

trasarea curbei de calibrare prin metoda

cromatografic

1.2. Diseminarea rezultatelor


Obiectiv 2:
2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina prin metoda immunoassay
Activiti:
2.1. documentare in vederea punerii la punct a metodei
2.2. Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay
2.3. Diseminarea rezultatelor
1. PUNEREA LA PUNCT A METODOLOGIEI DE EXTRACTIE PRIN
METODA
CROMATOGRAFICA
DE
DETERMINARE
A
NIVELELOR DE HOMOCISTEINA IN LICHIDELE BIOLOGICE
1.1 Alegerea metodei de extracie i trasarea curbei de calibrare prin metoda
cromatografic

1.1.1 Alegerea metodei de extractie prin metoda cromatografica


Serul/plasma este o matrice biologic complex ce conine pe lng homocistein
o serie de compui nrudii cum ar fi cisteina, cistein-glicina, glutationul, toi, compui cu
caracter hidrosolubil.
Homocisteina este prezent n ser/plasma legat de proteine, n proportie de 80%,
sub form de dimeri (cu compui coninnd grupri tiol, prin intermediul punilor
disulfidice ) ~30 % i in form liber n proporie extrem de mic de ~1%.
Datorit caracterului hidrosolubil homocisteina se separ usor prin electroforez
capilar. Metoda este simpl, ns necesit aparatur foarte costisitoare. Din acest motiv
majoritatea metodelor de determinare utilizeaz metodele cromatografice, HPLC cu
diferite sisteme de detecie.
Pentru c este prezent n cantiti foarte mici n snge/plasm/ser, semnalul
cromatografic este slab de aceea pentru a putea fi determinata cromatografic,
homocisteina trebuie mai nti derivatizat.
n plus, indiferent de metoda de detecie a homocisteinei, n prealabil, este
necesar i o etap ce convertete diferitele forme ale acesteia (forma legat de proteine

sau formele dimere) n una singura i anume homocisteina redus Hcys-SH. Pentru
aceasta este necesar tratarea matricei biologice cu un agent reductor care rupe punile
disulfidice.
In concluzie determinarea homocisteinei presupune parcurgerea obligatorie a
urmatoarelor etape :
- a. eliberarea gruprilor SH prin ruperea punilor disulfidice, n urma reaciei
de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.
- b. derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiti agenti de
derivatizare.
a. Eliberarea gruprilor SH prin ruperea punilor disulfidice, n urma reaciei
de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.
n scopul ruperii punilor disulfidice am utilizat mai muli agenti reductori:
ditiotreitol, mercaptoetanol, Tris n-butil fosfina (TNBP).
A fost ales ca agent de reducere TNBT [1]. Dei timpul necesar reaciei de
reducere este de circa 30 minute, reducerea este mult mai energic, reacia avnd loc la
temperatura 600C. Temperatura uor ridicat este favorabil denaturrii proteinelor care
ulterior vor fi ndepartate prin centrifugare. Se asigur astfel o purificare suplimentar a
matricei biologice.
b. Derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferii ageni de
derivatizare.
In scopul derivatizrii literatura indic un numr relativ mare de compui.
Iniial am utilizat ca agent de cuplare a legturilor SH, ditio dinitro benzoic acid
(DTNB) cu care am obtinut un timp de eluie bun 2,87 relativ apropiat de timpul de eluie
al solventului. Acest timp de eluie mic, poate deveni un impediment ducnd uneori la
eluarea homocisteinei odata cu solventul.
n urma mobilitii efectuate n Polonia am utilizat ca agent de derivatizare 2cloro-1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT). n cazul utilizarii CMQT eluia
homocisteinei are loc la tR = 8,5 semnificativ distanat de timpul de eluie al solventului.
n plus utiliznd CMQT ca agent de derivatizare, reacia de derivatizare dureaza 5 minute
comparativ cu 30 minute n cazul DTNB (metoda utilizata anterior).
Sistemul cromatografic
Pentru cromatografierea probelor a fost utilizat un cromatograf HPLC HewlettPackard, cu coloana cu faza inversa C18, 5 um, 125 x 4 mm.
Faza mobil a fost alcatuit din dou soluii :
A. acetonitril
B. amestec de acid triclor acetic 0,1 M, LiON 0,1 M la pH = 1,65.
Eluia a avut loc n gradient de concentraie astfel :
- 4 minute 11% A i 89% B
- 8 minute 35% A i 65% B
- 12 minute 11% A i 89% B
Debitul fazei mobile a fost de 1,2 ml/min.

Sistemul de detecie utilizat a fost un spectrofotometru UV-vis cu diode-array, la 312


nm.
Identificarea picurilor s-a fcut pe baza comparrii timpilor de retenie i a spectrelor
cu datele obtinute pentru homocisteina pur.
1.1.2. Trasarea curbei de calibrare pentru metoda cromatografica
Pentru trasarea curbei de calibrarea a fost preparat o soluie stoc de homocisteina 10
mol/ml (0,0135 g Hcys cu 1 ml HCl 0,1 M, adui la 10 ml apa distilat).
Din soluia stock a fost preparat soluia de lucru de concentraie 50 nmol/ml.
Agentul reducator TNBP a fost preparat soluie 10% n metanol.
Agentul de derivatizare CMQT a fost preparat n concentraie 0,1 mol/L.
Pentru precipitarea proteinelor din ser a fost preparat o soluie 3M acid percloric
(PCA).
La 100 l soluie tampon Tris pH = 8 au fost adaugati 100 l plasma. Apoi au fost
adaugati 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32 l soluie de lucru de homocisteina i 10 l soluie TNBP.
Amestecul a fost incubat pe baie de ap la 600C timp de 30 minute. Dup incubare
amestecul a fost rcit la temperatura camerei i au fost adaugai 10 l de CMQT.
Amestecul a fost lsat n repaus 5 minute pentru definitivarea reaciei de derivatizare,
dup care au fost adaugai 100 l PCA. Dup 3 minute amestecul a fost centrifugat la 12
000 rpm timp de 10 minute i 20 l din supernatant au fost injectai n cromatograf.

Absorbance [mAU]

Cromatogramele obtinute sunt prezentate in figura 1a, 1b, 1c.


19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0

10

11

12

Time [min]

Fig. 1a. Cromatograma obinut n urma elurii unei probe de plasma la care nu s-a
adaugat homocisteina.

Timpul de retenie pentru homocistein este tR = 8,5 semnificativ distanat de


timpul de eluie al solventului care apare la 1-2 minute. n cromatograma se observ
mai multe picuri : la tR = 8,5 se observa homocisteina, in cantitate foarte mica, care

Absorbance [mAU]

provine de la homocisteina endogena din plasma, la tR = 9,1 cisteina, la tR = 9,7 cisteinglicina si la tR = 10,5 CMQT utilizat in exces.
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0

10

11

12

Time [min]

Absorbance [mAU]

Fig. 1b. Cromatograma obinuta in urma eluarii unei probe de plasma la care au fost
adaugati 4 moli homocisteina.

19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0

10

11

12

Time [min]

Fig 1c. Cromatograma obinut n urma elurii unei probe de plasma la care au fost
adaugaii 24 moli homocisteina.

Prin metoda cromatografica aleas se obine un timp bun de eluie pentru


homocistein, distanat de frontul solventului i o separare bun fa de ali compui cu
grupari SH care se gsesc n concentraii importante n plasm. Astfel homocisteina este
eluat la distan de glutation, cisteina i cistein-glicin. Metoda aleas este selectiv
prevenind, prin timpii de retenie distanai, coeluarea compuilor cu structuri
asemntoare.
Curba de calibrare obtinut este prezentat n fig. 2.
Curba de calibrare a fost obinut n urma cromatografierii plasmei la care au fost
adaugate concentratii cresctoare de homocistein. Fiecare punct de pe curb a fost
obinut n urma calculrii mediei aritmetice a trei determinri.

y = 0,6126x + 5,6128
R20,9962 =

30

peak height [mAU]

25
20
15
10
5
0
0

10
15
20
25
HCSH concentration [nmol/ml]

30

35

Fig. 2. Curba de calibrare reprezentand intensitatea absorbantei, functie de concentraia


de homocisteina adaugata n plasma.

Ecuaia dreptei de regresie obinut pentru curba etalon este Y = 0,6126. X +


5,6128.

Rspunsul este liniar pe intervalul 0 - 35 nmol/ml, cu un coeficient de corelaie r2


= 0,9962.
Pe baza curbei de calibrare obinute pot fi determinate concentraiile plasmatice n
probele biologice.
1.2 Diseminarea rezultatelor
Rezultatele obinute n urma etapei I/2007: Punerea la punct a metodelor de
calibrare a metodei cromatografice de determinare a homocisteinei in lichide biologice:
1. Documentare ; 2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat, 3.
Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie
au fost comunicate i publicate, dup cum urmeaz:
- C.Filip, E.Albu, N. Zamosteanu, C. Dimitriu, N. Gheorghi, O.C.Mungiu
homocisteina factor toxic endotelial metode de detecie - The Medical
Journal of Sibiu, vol 19, nr.2, pg. 163-167, 2008, comunicat la al IX-lea
Congres Internaional de Farmacologie, Terapeutic i Toxicologie Clinic,
Sibiu 10-14 iunie, 2008
- E.Albu C.Filip, N. Zamosteanu, C. Dimitriu, N. Gheorghi, O.C.Mungiu
Hiperhomocisteinemia factor de risc cardiovascular independent
mecanisme fiziopatologice, interferare farmacologic Drugs. Use, abuse
and dependency, Editura Gr.T.Popa, 2008, pag 224-228, comunicat la Zilele
Medicamentului, ediia aXVII-a, Iai 2008
Revistele in care au fost publicate lucrrile sunt reviste recunoscute CNCSIS.
Datorit faptului c derularea practic a achiziiilor de materiale i reactivi i
efectuarea mobilitii de documentare/cercetare la data acceptat de ctre laboratorul

gazd din Lotz, Polonia (septembrie-octombrie 2008) s-au ntrziat pn n partea a doua
a etapei 2008, i lund n considerare caracterul pregtitor al obiectivelor de etap n care
s-au investigat i s-au aplicat metodele de extractie prin HPLC n vederea insuirii i
aplicrii unei metode sensibile de dozare a homocisteinei util pentru etapele urmtoare,
rezultate obinute n urma cercetrilor din aceast etap nu au putut fi trimise n timp util
spre publicare la o revist din Baze de Date. n acest moment materialul se afl n
procedura de acceptare spre publicare la Revista Medico-Chirurgical, Iai.
2. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA
PRIN METODA IMMUNOASSAY
2.1. Documentare in vederea punerii la punct a metodei
2.2. Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay
2.3. Diseminarea rezultatelor
2.1. Documentare in vederea punerii la punct a metodei
2.2 Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay
In afara metodelor cromatogragice, n momentul de fa, mai sunt utilizate dou tipuri
de metode pentru determinarea homocisteinei:
a. metoda imunologic
b. metoda enzimatic
a. Metoda imunologica
Metoda imunologica are la baza formarea complexului antigen-anticorp specific.
Principiul metodei const n obinerea unor anticorpi fa de o serie de proteine din serul
uman, n cazul de fa, o enzima implicat n generarea homocisteinei n organism.
Testul are la baza cuplarea enzimei specifice serului uman cu anticorpul, cuplare n urma
careia rezult complexul antigen-anticorp. Acesta este marcat cu un generator de
culoare a carei intensitate este determinat spectrofotometric.
n cazul utilizrii serului de obolan, datorit lipsei de specificitate, complexul
antigen-antigen nu se mai poate forma. Cu alte cuvinte kit-urile existente n mometul de
fa sunt doar pentru utilizare uman.
Metoda imuno de determinare a homocisteinei are la baz legarea specifica la un
anticorp anti sulf-adenozin hidrolaza (SAH) enzim implicat n sinteza homocisteinei n
organism. Principiul metodei const n competiia dintre SAH i un marker etichetat cu
un cromofor fluorescent. Detectia are la baz modificarea polarizrii fluorescentei (fig.
nr. 3).

Fig. 3. Principiul determinrii imunologice a homocisteinei [2]

b. Metoda enzimatic
Datorita imposibilitii determinrii homocisteinei prin metoda imunologic
cauzat de lipsa de specificitate a reaciei imunologice n cazul serului de obolan, am
ales metoda enzimatica standardizata de Roche i comercializat sub denumirea
Diazyme.
Cea mai recenta metod de determinare a homocisteinei poart denumirea de
Enzyme Cycling Method. Principiul metodei const n utilizarea unor reacii
enzimatice ciclice care au ca scop amplificarea semnalului detectat. Ca i n cazul
metodei cromatografice metoda enzimatic necesit o etap n care homocisteina este
redus din formele oxidate, n care se gsete n ser, la homocisteina redusa Hcys-SH.
Homocisteina liber este apoi convertit la metionin n prezena unei metal-transferaze
utiliznd sulf- adenozin metionina (SAM) ca donor de grupri metil. n urma
transmetilrii SAM, convertit la sulf- adenozin homocisteina (SAH), sufer o reactie
rapid de hidroliza n homocisteina i adenozina (Ado). Homocisteina reintr n ciclul de
metilare ceea ce duce la o acumulare de Ado care este detectat printr-o reactie enzimatica
cuplata, dependenta de NAD/NADH, la 340 nm (fig. 4).

Fig. 4. Ciclul de reactii enzimatice cuplate utilzate pentru determinarea homocisteinei [2].

Determinarea homocisteinei utilizand un kit standardizat (Diazyme)


Procedeul pentru determinarea homocisteinei utilizeaz un kit ce conine 3 reactivi :
R1: HADH 0,2 mMol/L
R2: Homocistein metionin transferase (HMTase ) 5kU/L
R3: S-adenozil homocistein hidrolase (SAH) 3,0 kU/L
Procedura de lucru este prezentata n figura 5.

Fig. 5. Procedura de lucru pentru determinarea homocisteinei in ser/plasma [2]

Trasarea curbei de calibrare pentru metoda enzimatica utilizind kituri


standardizate
Pentru trasarea curbei de calibrarea a fost preparat o soluie stoc de homocisteina
10 mol/ml (0.0135 g Hcys cu 1 ml HCl 0,1 M, adusi la 10 ml ap distilat).

La 240 l R1 au fost adaugai 18 l plasma la care a fost adaugat homocisteina


n concentraii cresctoare n domeniul 0 50 nmoli/ml i 38 l R2. Dup incubare 5
minute la 370C au fost adaugai 25 l R3 n toate eantioanele. Pentru fiecare
concentraie de pe curb de calibrare au fost fcute trei probe.

[viteza]

Determinarea homocisteinei a fost fcut prin msurarea absorbaniei probelor la


340 nm n mod cinetic. Curba de calibrare obinut este prezentata n figura 6
0.02
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0

10

20

30

40

50

60

nmoli/ml

Fig. 6. Curba de calibrare reprezentand viteza reactiei enzimatice functie de concentratia


de homocisteina

Ecuaia dreptei de regresie obinut pentru curba de calibrare este:


Y = 0,000309. X + 0.003029.
Coeficient de corelatie r2 = 0,951937.
Pe baza curbei de calibrare obtinute pot fi determinate concentratiile plasmatice n
probele biologice.
Pentru a compara cele dou metode aceeai prob de plasma la care a fost
adaugat o cantitate de homocisteina de 10 nmoli/ml a fost analizat att prin metoda
cromatografic ct i prin metoda enzimatica. Valorile obinute sunt prezentate in tabelul
1.
Tabel 1: Valori ale concentratiei homocisteieni obtinuta prin metoda cromatografica si
prin metoda enzimatica, in urma determinarii homocisteinei intr-o proba de plasma de
sobolan la care au fost adaugate 10 ug/ml homocisteina.

Metoda HPLC
10.3
9.86
9.72

Metoda enzimatica utilizand


kit Diazyme
9.78
9.51
9.33

Valoarea medie = 9.96

Valoarea medie = 9.54

CONCLUZII :
1. Determinare homocisteinei prin metoda cromatografiic prezint o sensibilitate i
specificitate foarte bune. Pe domniul 0 - 35 nmol/ml rspunsul este liniar,
coeficientul de corelaie obinut fiind 0.9962.
2. Determinarea homocisteinei prin metoda imunologic nu a putut fi realizat
deoarece kit-urile pentru homocistein sunt strict pentru plasma/serul uman,
reacia imunologic de formarea a complexului antigen-anticorp neavnd loc
pentru serul de obolan. Din acest motiv a fost aleas metoda enzimatic de
determinare a homocisteinei.
3. Determinarea homocisteinei prin metoda enzimatica prezinta o specificitate si
sensibilite bun. Pe domniul 0 - 50 nmol/ml rspunsul este liniar, coeficientul de
corelaie obtinut fiind 0.9519, ceva mai mic ca n cazul metodei cromatografice.
4. Comparnd cele dou metode utilizate se observ ca ambele sunt asemntoare n
ceea ce privete sensibilitatea i specificitatea, metoda cromatografica fiind, aa
cum era de ateptat, mai
precis. Metodei cromatografic a confirmat
aplicabilitatea metodei enzimatice la serul de obolan n urma analizrii aceleeai
probe de ser de obolan efectuat n paralel prin metoda enzimatic.
BIBLIOGRAFIE :
1. E. Bald, E. Kaniowska, G. Chwatko, R. Glowacki, Lichid chromatographic
assessment of total and protein-bound homocysteine in human plasma, Talanta
50 (2000), 1233-1243
2. Diazyme References
3. Eikelboom JW et all., Ann Intern Med 131(1999), 363-375
4. Scott J., Weir D., QJMed. 89 (1996), 561-563
5. Refsum, H., et al., Facts and Recommendations about Total Homocysteine
Determinations: An Expert Opinion. Clin. Chem. 50: 3-32, 2004
6. Refsum, H. ,Total Homocysteine, guidelines for determination in clinical
laboratories, Clinical Laboratory News, May 2002
7. Jacques, P.F., et al., Determinants of plasma total homocysteine concentration in
the Framingham Offspring cohort. Am J Clin Nutr 2001;73:61321
8. Nygrd, O., et al., Plasma homocysteine levels and mortality in patients with
coronary artery disease. N Engl J Med 1997;337:2306

RAPORT TIINIFIC 2009


ETAPA III :
OBIECTIV 1:
1. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse
experimental la animale de laborator

Activiti:
1.1 Documentare
1.2 Realizarea modelului de diabet experimental determinarea nivelelor plasmatice de
homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

OBIECTIV 2:
2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse
experimental la animale de laborator

Activiti:
2.1 Realizarea modelului de stres experimental determinarea nivelelor plasmatice de
homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ
2.2. Diseminarea rezultatelor

OBIECTIV 3:
2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse
experimental la animale de laborator
Activiti:
3.1. Inducerea experimentala a hiperhomocisteinemiei determinarea nivelelor plasmatice de
homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ
3.2 Diseminarea rezultatelor

1. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA IN


DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA
ANIMALE DE LABORATOR

1.1 Documentare
In literatura studiata sunt prezentate mai multe modalitati de inducere a diabetului la
animalele de experienta si anume: administrarea streptozotocinei intraperitoneal sau
per os sau administrarea aloxanului intra peritoneal [1-6].
Am ales pentru inducerea diabetului experimental, aloxanul in administrare unica,
intraperitoneala, la sobolan.

1.2 Realizarea modelului de diabet experimental determinarea nivelelor plasmatice de


homocisteina,
parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In momentul de fata este cunoscut faptul ca diabetul este implicat intr-o


multitudine de procese patologice. Printre mecanismele patologice care se asociaza
acestei afectiuni este generarea de radicali liberi .
Pe de alta parte diabetul este corelat cu bolile cardiovasculare si cu modificarea
functiilor endoteliului vascular, fenomene in care se considera ca este implicata si
homocisteina in concentratii crescute []. In plus se considera ca hiperhomocisteinemia
este generatoare de radicali liberi [7-12].
Apare astfel ca, atat hiperglicemia cat si hiperhomocisteinemia ar putea fi corelate
cu generarea de radicali liberi, cei doi parametri putand determina un efect cumulativ.
n etapa de fa a fost studiat influena nivelelor crescute ale glucozei asupra
statusului oxidativ si a concentratiei homocisteinei la sobolan.
Modelul experimental de diabet indus la sobolan a fost realizat prin administrare
unica de alloxan in doza de 110 mg/kg corp.
Au fost efectuate apoi urmatoarele determinari :
- determinarea nivelelor glicemiei in vederea confirmarii diabetului
-determinarea nivelelor homocisteinemiei
- determinarea parametrilor statusului oxidativ.
Determinarea glicemiei, in vederea confirmarii diabetului, a fost realizata prin
determinarea glicemiei la 4 zile de la administrarea aloxanului utilizand un kit enzymatic
cu glucozoxidaza numele.
Concentratia homocisteinei a fost determinata utilizand un kit standardizatDyazime.
Pentru investigarea parametrilor statusului oxidativ au fost determinate activitatea
sistemelor intracelulare antioxidante: superoxid dismutaza (SOD) si glutationperoxidazei
(GPx), precum si capacitatea antioxidanta totala (CAT) a speciilor reducatoare circulante
in plasma. Activitatea SOD i GPx n eritocite i CAT n plasm a fost realizata utilizand
kituri Randox standardizate, pentru determinare manual.
Mod de lucru
S-a lucrat pe un lot de 10 sobolani aduli Wistar, n greutate de 150-200g, la care a fost
administrat aloxan i.p. in doza unica de 11omg/kg. C.
La 4 zile de la administrarea aloxanului au fost prelevate probe de sange prin punctie
retroorbitara si in plasma au fost determinate glicemia, nivelele homocisteinei si
capacitatea totala antioxidanta. In eritrocite a fost determinata activitatea SOD si GPx.
Rezultate si discutii

Nivelele glicemiei obtinute initial si la 4 zile de la administrarea aloxanului si ale


homocisteinei sunt prezentate in tabelul nr. 1
Nivelele glicemiei, determinate nainte i la 4 zile de la administrarea aloxanului, sunt
prezentate in tabelul nr. 1
Tabelul nr 1. Concentratia glucozei determinat n plasm de obolan nainte i la 4 zile de la
administrarea aloxanului
Concentratia plasmatica a glucozei (mg/100ml)
Initial
Dupa 4 zile de la administrarea
aloxanului
Lotul I
135,07119,89
351,698 28,624
(a primit aloxan 110 mg/kg corp i. p.,
administrare unica

Datele obtinute arata instalarea hiperglicemiei confirmand astfel modelul de diabet indus
experimental la sobolan.
Nivelele de homocisteina determinate nainte i dupa 4 zile de la administrarea
aloxanului, sunt prezentate in tabelul nr. 2
Tabelul nr 2. Concentratia homocisteinei determinat n plasm de obolan nainte i dupa 4 zile de la
administrarea aloxanului
Concentratia plasmatica a metioninei (M/ml)
Initial
Dupa 4 zile de la administrarea
aloxanului
Lotul I
13.2761,89
15.722,25
(a primit aloxan 110 mg/kg corp i. p.,
administrare unica)

Valorile obtinute indica o crestere a concentratiei homocisteinei in plasma, fara ca


aceasta sa fie semnificativa din punct de vedere statistic. Datele obtinute arata ca nivelele
crescute ale glucozei nu pot fi corelate cu hiperhomocisteinemia.
Capacitatea antioxidanta totala determinata n plasma este prezentata n tabelul nr.3
Tabelul nr 3. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan nainte i dupa 4 zile
de la administrarea aloxanului
Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)
Initial
Dupa 4 zile de la administrarea
aloxanului
Lotul I
0.921
0.883
(a primit aloxan 110 mg/kg corp i. p.,
administrare unica)

Valorile obtinute indica o scadere a CAT in plasma, fara ca aceasta sa fie semnificativa
din punct de vedere statistic. Datele obtinute arata la 4 zile de la instalarea hiperglicemiei
nu apar modificari semnificative ale acestui parametru.
In concluzie la 4 zile de la administrarea aloxanului si instalarea hiperglicemiei
parametrii studiati homocisteina si capacitatea totala antioxiidanta nu sufera modificari
semnificative.

2. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA IN


DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA ANIMALE DE
LABORATOR
Activiti:
2.1 Realizarea modelului de stres experimental determinarea nivelelor plasmatice de
homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In momentul de fata este unanim acceptat faptul ca stresul este implicat in


procesele de imbatranire celulara prin multiple mecanisme. Unul din mecanismele prin
care se considera ca stresul intervine in aceste procese este generarea de radicali liberi.
La nivel celular stresul oxidativ reprezint o scdere considerabil a capacittii
reductoare, capacitate utilizata de celule in vederea anihilarii speciilor reactive[13-14].
Celulele, n mod normal, sunt capabile s se apere mpotriva speciilor reactive utiliznd
sisteme enzimatice ca superoxide dismutaza, catalaza, glutathione peroxidaza i
peroxiredoxina. Moleculele mici antioxidante, ca acidul ascorbic (vitamin C),
tocopherolul (vitamin E), acidul uric, i glutathionul, joac deasemenea, un rol important
ca antioxidani celulari. n contrast, capacitatea antioxidant a spaiului extracelular este
mult sczut cel mai important antioxidant prezent la nivel plasmatic fiind acidul uric.
Efectele stresului oxidativ depind de mrimea i intensitatea acestui fenomen astfel ca
celulele pot depi micile perturbri i reveni la starea original. Stresul moderat poate
declana apoptoza n timp ce oxidarea sever duce la moarte celulara [15].
Pe de alta parte este cunoscut faptul ca hiperhomocisteinemia reprezinta un factor
de risc independent in bolile cardiovasculare, nivelele crescute de homocistein sunt
asociate cu alterarea functiei epiteliale si riscul trombozei, chiar la concentratii usor
crescute fata de nivelele normale [16]. Mecanismul prin care homocisteina determin
aceste efecte nu este nc elucidat dar se crede c n acest proces sunt implicate speciile
reactive generatoare de radicali liberi.
n aceasta etapa a fost studiat influena stresului, indus experimenal la sobolan,
asupra nivelelor homocisteinei si a parametrii statusului oxidativ.
Stresul a fost indus prin inversarea regimului lumina/intuneric la animalele de experienta.
A fost determinata activitatea intracelular a superoxid dismutazei (SOD), glutation
peroxidazei (GPx) si capacitatea antioxidant total seric (CAT) pentru a evidentia in ce
masura stresul este un proces generator de specii reactive.
Au fost determinate concentraiile plasmatice ale homocisteinei pentru a vedea daca
exista o corelatie intre cei doi factori de risc stresul si hiperhomocisteinemia.
Mod de lucru
S-a lucrat pe dou loturi de 10 sobolani aduli Wistar, n greutate de 150-200g. Animale
din ambele loturi au fost supuse stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric,
timp de 15 zile. Cele dou loturi au primit hran diferentiata astfel :
- Lotul I a primit hran lipsit de acid folic i vitamina B12 (alctuit din mere 5g/100g
animal, morcov 5g/100g animal, piine neagra 10g/100g animal i orz 10g/100g animal),
15 zile, timp in care au fost supuse stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric

- Lotul II a primit hran standard furaje combinate sub form de granule (care conin
acid folic 0,5 mg/kg c i vitamina B12 10 mg/kg c), 15 zile timp in care au fost supuse
stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric
Pentru determinarea parametrilor stresului oxidativ i a nivelelor de homocistein au fost
recoltate probe de snge nainte i dupa cele 15 zile cat a durata expunerea animaleleor la
stres. Homocisteina total a fost determinat n plasm utiliznd kituri Diazyme.
A fost determinat activitatea SOD i GPx n eritocite i CAT n plasm utilizand kituri
Randox pentru determinare manual.
Rezultate i discuii
Nivelele de homocisteina determinate nainte i dupa 15 zile de expunere la stres sunt
prezentate in tabelul nr. 4
Tabelul nr 4. Concentratia homocisteinei determinat n plasm de obolan nainte i dup 15 zile de
expunere la stres
Concentratia plasmatica a metioninei (M/ml)
Inainte de expunerea la stres
Dupa 15 zile de de expunere la
stres
Lotul I
18.21
16.72
(alimentatie carenat n acid folic i vitamina
B12 + expunere la stres timp de 15 zile)
Lotul II
16.80
19.39
(alimentatie standard + expunere la stres timp,
de 15 zile)

Datele din tabelul nr 1 arat c, dup 15 zile de expunere la stres, concentraiile


plasmatice ale homocisteinei nu sunt semnificativ modificate fat de momentul initial. In
cazul lotului ce a primit hrana standard nivelele plasmatice ale homocisteinei sunt
nesemnificative crescute, dei ar fi fost de ateptat ca aportul de vitamina B12 i acid folic
in alimentaie s duc, cel putin la mentinerea constanta a nivelelor homocisteinei. Datele
obtinute arata ca nu exista o cauzalitate intre stresul acut/semiacut si nivelele serice de
homocisteina.
Capacitatea antioxidanta totala determinata n plasma este prezentata n tabelul nr.5
Tabelul nr 5. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan inainte si dupa 15
zile de expunere la stres
Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)
Inainte de expunere la stres
Dupa 15 zile de expunere la stres
Lotul I
0.921
0.911
(alimentatie carenat n acid folic i vitamina
B12 + expunere la stres, timp de 15 zile)
Lotul I I
0.933
0.805
(alimentatie standard + expunere la stres timp, de
15 zile)

Datele obinue arat c la lotul I capacitatea antioxidanta totala nu a suferit


modificari, in timp ce la lotul II capacitatea antioxidanta total a sczut usor,
nesemnificativ statistica, n urma expunerii la stres.

Datele obtinute arata ca nu exista o cauzalitate intre stresul acut/semiacut si nivelele


serice de homocisteina, stresul acut/subacut nu determina o diminuarea semnificativ a
capacitaii antioxidante generale.
Activitatea eritrocitar a superoxid dismutazei i glutation peroxidazei, enzime
implicate n anihilarea speciilor reactive generate este prezentata n tabelul 6 respectiv 7.
Tabelul nr 6. Activitatea eritrocitara a superoxid dismutazei determinata la obolan nainte i dupa 15zile
de expunere la stres
Activitatea superoxid dismutazei (U/ml)
Inainte de expunere la stres
Dupa 15 zile de expunere la stres
Lotul I
219.08
945.90
(alimentatie carenat n acid folic i
vitamina B12 + expunere la stres timp
de 15 zile)
Lotul I I
211.22
946.22
(alimentatie standard + expunere la
stres timp, de 15 zile)

Datele obinute arat ca att la lotul I ct i la lotul II activitatea SOD crete n


urma expunerii la stres. Creterea activitii SOD, enzima implicat n neutralizarea
speciilor reactive, indic faptul c expunerea la stress. chiar in situatia in care acesta este
acut/subacut determina o mobilizare a sistemelor de aparare antioxidanta impotriova
speciilor reactive..
Tabelul nr 7. Activitatea eritrocitar a glutation peroxidazei (GPx) determinat la obolan nainte i dup
15 zile
de expunere la stres
Activitatea glutation peroxidazei (U/L)
Inainte de expunere la stres
Dupa 15 zile de expunere la stres
Lotul I
67907
40927
(alimentatie carenat n acid folic i
vitamina B12 + expunere la stres timp
de 15 zile)
Lotul I I
68669
49434
(alimentatie standard + expunere la
stres timp, de 15 zile)

Datele obtinute arat ca att la lotul I ct i la lotul II activitatea GPx scade n


urma expunerii la stres. Glutation peroxidaza este o enzim implicat n neutralizarea
apei oxigenate generate ca urmare a prezenei radicalilor liberi. Aceasta enzim utilizeaz
drept cofactor glutationul care este un tripeptid cu rol in reducerea speciilor reactive.
Probabil consumarea lui, ca urmare a creterii concentraiei radicalilor liberi, duce la
diminuarea activitii enizmei GPx, glutationul funcionnd drept cofactor pentru enzima.
Cu alte cuvinte scderea activitatii GPx indic o diminuare a cantitii de glutation ca
urmare a consumului sporit a acestuia.
Datele obtinute arata o mobilizare a sistemelor implicate in apararea antioxidanta.
Faptul ca capacitatea totala antioxidanta nu sufera modificari semnificattive poate sugera
faptul ca perioada expunerii la stres a fost una moderata ceea ce a facut posibila adaptarea

si nu a epuizat capacitatea totala intracelulara si extracelulara de aparare impotriva


speciilor reactive.
Concluzii
Datele obtinute arata ca stresul moderat/ semiacut activeaza sistemele de aparare
antioxidanta dar nu modifica semnificativ capacitatea totala antioxidanta.
Expunerea la stres acut/subacut nu determina o crestere a nivelelor serice ale
homocisteinei.
2.2. Diseminarea rezultatelor:
1.

Elena Albu, Cristiana Filip, Nina Zamosteanu, Irina Maria Jaba, Nastasia
Gheorghita, Luminita Jerca, O.C. Mungiu, The influence of the experimental
stress on homocysteine plasma levels in rat, Terapeutics, Pharmacology and
Clinical Toxicology, 2009, INDEX COPERNICUS, http://www.terapeutica.ro/,

2.

Elena Albu, Cristiana Filip, Nina Zamosteanu, Irina Maria Jaba, Nastasia
Gheorghita, Luminita Jerca, O.C. Mungiu, Investigation of correlation stress
hyperhomocysteinemia , in rat, Terapeutics, Pharmacology and Clinical
Toxicology, 2009, INDEX COPERNICUS, http://www.terapeutica.ro/,

3. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA IN


DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA ANIMALE DE
LABORATOR

Activiti:
3.1. Inducerea experimentala a hiperhomocisteinemiei determinarea nivelelor plasmatice de
homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In ultima perioad s-au acumulat dovezile privind faptul c nivelele crescute de


homocistein sunt asociate cu riscul trombozei i al bolilor cardiovasculare.[17-23 ].
Homocisteina provine n organism din metabolizarea metioninei, aminoacid esential,
metabolizare strict dependenta de o serie de vitamine: B6, B12, acid folic. Orice deficit
genetic sau un aport alimentar deficitar al vitaminelor amintite duce la
diminuarea/blocarea metabolizarii metioninei i acumularea de homocistein.
Dei legtura direct ntre nivelele crescute de homocisteina i riscul trombozei i al
bolilor cardiovasculare nu a fost elucidata, se consider c un posibil mecanism pentru
leziunile produse de homocisteina asupra endoteliului vascular ar putea fi legat de
creterea stresului oxidativ [24-27 ].
In aceasta etapa a fost studiat influena hiperhomocisteinemiei asupra parametrilor
stresului oxidativ la animale de experienta.
Pentru aceasta a fost indus experimental hiperhomocisteinemia prin administrarea de
metionin i s-a determinat concentratia plasmatica a homocisteinei.
Pentru investigarea parametrilor stresului oxidativ au fost determinate activitatea
sistemelor enzimatice intracelulare superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza
(GPx) i capacitataea antioxidant total serica (CAT).
Mod de lucru

S-a lucrat pe dou loturi de 10 sobolani aduli Wistar, n greutate de 150-200g.


Animalelor din ambele loturi le-a fost indus hiperhomocisteinemia prin administrare de
metionin 2g/kg c per os prin sond endogastric n doz unic, timp de 15 zile. Cele
dou loturi au primit hran diferentiata astfel :
- Lotul I a primit hran lipsit de acid folic i vitamina B12 (alctuit din mere 5g/100g
animal, morcov 5g/100g animal, piine neagra 10g/100g animal i orz 10g/100g animal) i
metionina 2g/kg c per os, 15 zile.
- Lotul II a primit hran standard furaje combinate sub form de granule (care conin
acid folic 0,5 mg/kg c i vitamina B12 10 mg/kg c) i metionin 2g/kg c per os, 15 zile.
Pentru determinarea parametrilor stresului oxidativ i a nivelelor de homocistein au fost
recoltate probe de snge nainte i la 15 zile dup administrarea acesteia. Homocisteina
total a fost determinat n plasm utiliznd kituri Diazyme.
A fost determinat activitatea SOD i GPx n eritocite i CAT n plasm utilizand kituri
Randox pentru determinare manual.
Rezultate i discuii
Nivelele de homocisteina determinate nainte i la 15 zile dup administrarea metioninei
sunt prezentate in tabelul nr. 8
Tabelul nr 8. Concentratia homocisteinei determinat n plasm de obolan nainte i dup 15 zile de
administrare a metioninei
Concentratia plasmatica a metioninei (M/ml)
Inainte de administrare a metioninei
Dupa 15 zile de administrare de
metionina
16.3
>50
Lotul I
(alimentatie carenat n acid folic i vitamina
B12 + metionin 2g/kgc.p.o. doza unica, timp
de 15 zile)
14.28
>50
Lotul II
(alimentatie standard + metionin 2g/kg c. p.o.
doza unic timp, de 15 zile)

Datele din tabelul nr 8 arat c, aa cum era de ateptat, dup 15 zile de administrare a
metioninei concentraiile plasmatice ale homocisteinei sunt semnificativ statistic crescute
fat de momentul initial,
confirmndu-se modelul de hiperhomocisteinemie indus experimental.
Nivelele plasmatice ale homocisteinei sunt la fel de mari n cazul lotului ce a primit hrana
standard ca i in cazul lotului care a fost supus carenei vitaminice, dei ar fi fost de
ateptat ca aportul de vitamina B12 i acid folic in alimentaie s duc la scderea
nivelelor homocisteinei. Este cunoscut faptul c una din metodele terapeutice de scdere
a nivelelor de homocisteina la subiecii umani este tocmai aportul unei cantiti adecvate
de vitamine, dar se pare ca n cazul animalelor de experien carena vitaminic nu pare a
fi implicat n instalarea hiperhomocisteinemiei. Acest fenomen face ca modelul
experimental s nu fie dependent de tipul de alimentaie i, astfel, reproductibil n conditii
experimentale diverse.

Capacitatea antioxidanta totala determinata n plasma este prezentata n tabelul nr.9


Tabelul nr9. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan inainte si
dupa 15 zile de administrare a metioninei
Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)
Inainte de administrare a metioninei
Dupa 15 zile de administrare de
metionina
0.908
0.760
Lotul I
(alimentatie carenat n acid folic i
vitamina B12 + metionin 2g/kgc.p.o.
doza unica, timp de 15 zile)
0.897
0.756
Lotul I I
(alimentatie standard + metionin
2g/kg c. p.o. doza unic timp, de 15
zile)

Datele obinue arat c att la lotul I cat i la lotul II capacitatea antioxidanta total a
sczut n urma administrrii metioninei. Aceasta indic faptul c n urma instalrii
hiperhomocisteinemiei nivelul speciilor reactive a crescut ducnd la diminuarea
semnificativ a capacitaii antioxidante generale.
Activitatea eritrocitar a superoxid dismutazei i glutation peroxidazei, enzime
implicate n anihilarea speciilor reactive generate este prezentata n tabelul 10 respectiv
11.
Tabelul nr 10. Activitatea eritrocitara a superoxid dismutazei determinata la obolan nainte i
dupa 15zile de administrare a metioninei
Activitatea superoxid dismutazei (U/ml)
Inainte de administrare a metioninei
Dupa 15 zile de administrare de
metionina
202.88
944.7
Lotul I
(alimentatie carenat n acid folic i
vitamina B12 + metionin 2g/kgc.p.o.
doza unica, timp de 15 zile)
195.30
945.7
Lotul I I
(alimentatie standard + metionin
2g/kg c. p.o. doza unic timp, de 15
zile)

Datele obinute arat ca att la lotul I ct i la lotul II activitatea SOD crete n urma
administrrii metioninei. Creterea activitii SOD, enzima implicat n neutralizarea
speciilor reactive, indic faptul c hiperhomocisteinemia determin o cretere a nivelelor
speciilor reactive. Nivelele ridicate ale activittii SOD se coreleaza astfel cu capacitatea
total antioxidanta sczuta cauzat de creterea radicalilor peroxidici.

Tabelul nr 11. Activitatea eritrocitar a glutation peroxidazei (GPx) determinat la obolan


nainte i dup 15 zile
de administrare a metioninei

Lotul I
(alimentatie carenat n acid folic i
vitamina B12 + metionin 2g/kgc.p.o.
doza unica, timp de 15 zile)
Lotul I I
(alimentatie standard + metionin
2g/kg c. p.o. doza unic timp, de 15
zile)

Activitatea glutation peroxidazei (U/L)


Inainte de administrare a metioninei
Dupa 15 zile de administrare de
metionin
60211
34259

64254

39835

Datele obtinute arat ca att la lotul I ct i la lotul II activitatea GPx scade n


urma administrrii metioninei. Glutation peroxidaza este o enzim implicat n
neutralizarea apei oxigenate generate ca urmare a prezenei radicalilor liberi. Aceasta
enzim utilizeaz drept cofactor glutationul care este un tripeptid cu rol in reducerea
speciilor reactive. Consumarea lui ca urmare a creterii concentraiei radicalilor liberi
duce la diminuarea activitii enizmei GPx, glutationul funcionnd drept cofactor pentru
enzima. Cu alte cuvinte scderea activitatii GPx indic o diminuare a cantitii de
glutation ca urmare a consumului sporit a acestuia. Rezultatele obinute confirm
diminuarea CAT, glutationul fiind unul dintre factorii neenzimatici implicai n
neutralizarea radicalilor liberi.
Concluzii
Administrarea de metionin permite realizarea unui model reproductibil de
hiperhomocisteinemie.
Alimentaia lipsit de vitamine administrat obolanilor nu pare s influeneaze modelul
experimental, probabil datorit unor particulariti metabolice ale animalelor de
experien, diferite de cele umane.
Capacitatea total intracelular ct i cea plasmatic a sistemelor implicate n apararea
antioxidant celular scad semnificativ ca urmare a instalrii hiperhomocisteinemiei.
3.2 Diseminarea rezultatelor
1.

C.Filip, E. Albu, N.Zamosteanu, L. Jerca, N. Gheorghita, I.M. Jaba, A. Negru,


O.C.Mungiu,
Investigarea
parametrilor
stresului
oxidativ
in
hiperhomocisteinemia provocata experimental la obolan Medicina Modern, vol.
XVI. Sp nr.1, 2009

2.

FilipC., Albu E.,Zamosteanu N., Jaba I.M., Jaba I.M, Silion M, Gheorghita N.,
Mungiu O.C. Hyperhomocysteinemia effect's on antioxidant capacity, in rats acceptata spre publicare in Central European Journal - manuscript number:
CEJMED-D-09-00016.

BIBLIOGRAFIE :
1. Anjaneyulu M et al - Protective effect of pioglitazone against multiple low-dose
streptozotocin-induced diabetes in rats. Methods Find Exp Clin Pharmacol.
(2003)
2. Willy J. Malaisse. Alloxan toxicity to the pancreatic B-cell : A new hypothesis,
Biochemical Pharmacology, Volume 31, Issue 22, 15 November 1982, Pages
3527-3534
3. Gad HI., The potential osteogenic effects of systemic leptin and insulin
administration in streptozotocin-induced diabetic female rats., Saudi Med J. 2007
Aug;28(8):1185-90.
4. 4. Hidaka S, Yoshimatsu H, Kondou S, Tsuruta Y, Oka K, Noguchi H, Okamoto
K, Sakino H, Teshima Y, Okeda T, Sakata, Chronic central leptin infusion
restores hyperglycemia independent of food intake and insulin level in
streptozotocin-induced diabetic rats., T FASEB J. 2002 Apr;16(6):509-18.
5. 5, Gopalakrishnan V, Arunakaran J, Aruldhas MM, Srinivasan N. Effects of
streptozotocin-induced diabetes mellitus on some bone turnover markers in the
vertebrae of ovary-intact and ovariectomized adult rats., Biochem Cell Biol. 2006
Oct;84(5):728-36.
6. 6. Ferraz M, Brunaldi K, Oliveira CE, Bazotte RB.,Hepatic glucose production
from L-alanine is absent in perfused liver of diabetic rats., Res Commun Mol
Pathol Pharmacol. 1997 Feb;95(2):147-55.
7. McCully K, Wilson R. Homocysteine theory of arteriosclerosis. Atherosclerosis
1975;22:215227.
8. Starkekbaum G, Harlan J. Endothelial cell injury due to copper-catalyzed
hydrogen peroxide generation from homocysteine. J Clin Invest 1986;77:1370
1376.
9. Stamler J, Loscallzo J. Endothelium-derived relaxing factor modulates the
atherothrombogenic effects of homocysteine. J Cardiol Pharmacol
1992;20:S202S204.
10. Stamler J, Osborne J, Jaraki O. et al. Adverse vascular effects of homocysteine
are modulated by endothelium-derived relaxing factor and related oxides of
nitrogen. J Clin Invest 1993;91:308318.
11. Upchurch GJ, Welch G, Loscalzo J. Homocysteine EDRF and endothelial
function. J Nutr 1996;126:1290S1294S
12. Upchurch GJ, Welch G, Fabian A. et al. Homocyst(e)ine decreases bioavailable
nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase. J Biol Chem
1997;272:1701217017.
13. Kanani PM, Sinkey CA, Browning RL. et al. Role of oxidant stress in endothelial
dysfunction produced by experimental hyperhomocyst(e)inemia in humans.
Circulation 1999;100:11611168.
14. Topol G, Brunet A, Millanvoye E. et al. Homocysteine induces oxidative stress by
uncoupling of NO synthase through reduction of tetrahydrobiopterin. Free Radic
Biol Med 2004;36:15321541.

15. Nasser M. Al-Daghri and Omar S. Al-Attas, Homocysteinemia, hypertension, and


family history of diabetes in a smoking male population in Saudi Arabia, Central
European Journal of Medicine, Vol. 3, Nr. 2 / June, 2008, 167-172
16. Fiona Wotherspoon , David W Laight, Kenneth M Shaw Michael H Cummings,
Review: Homocysteine, endothelial dysfunction and oxidative stress in type 1
diabetes mellitus, The British Journal of Diabetes & Vascular Disease, Vol. 3, No.
5, 334-340 (2003)
17. Wu L, Wu J, Hunt S. et al. Plasma homocyst(e)ine as a risk factor for early
familial coronary artery disease. Clin Chem 1994;40:552561.
18. Dalery K, Lussier-Cacan S, Selhub J. et al. Homocysteine and coronary artery
disease in French Canadian subjects: relation with vitamins B12, B6, pyridoxal
phosphate, and folate. Am J Cardiol 1995;75:11071111.
19. Verhoef P, Stampfer M, Buring J. et al. Homocysteine metabolism and risk of
myocardial infarction: relation with vitamins B6, B12 and folate. Am J Epidemiol
1996;143:845859.
20. Verhoef P, Kok F, Kruyssen D. et al. Plasma total homocysteine, B vitamins, and
risk of coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:989995.
21. Robinson K, Arheart K, Refsum H. et al. for the European COMAC Group. Low
circulating folate and vitamin B6 concentrations. Risk factors for stroke,
peripheral vascular disease, and coronary artery disease. Circulation
1998;97:437443.
22. McCully K, Ragsdale B. Production of arteriosclerosis by homocysteinemia. Am J
Pathol 1970;61:18.
23. Harker L, Harian J, Ross R. Effect of sulfinpyrazone on homocysteine-induced
endothelial injury and arteriosclerosis in baboons. Circ Res 1983;53:731739.
24. Weiss N. Mechanisms of increased vascular oxidant stress in
hyperhomocysteinemia and its impact on endothelial function. Curr Drug Metab
2005;6:2736.
25. Schafer FQ, Buettner GR (2001). "Redox environment of the cell as viewed
through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple". Free
Radic. Biol. Med. 30 (11): 1191212
26. Lennon SV, Martin SJ, Cotter TG (1991). "Dose-dependent induction of
apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuli". Cell Prolif. 24
(2): 20314.
27. Boyce, N, Oxidative Stress Testing: A New Addition to Lab Menus? Clin. Lab
News 23:1-2 (1997).