Sunteți pe pagina 1din 32

Programul: IDEI Tipul proiectului: Proiecte de cercetare exploratorie Cod proiect: ID_1225 Contractul de finanţare : Nr. 223/2007

INTERFERAREA MECANISMELOR FARMACO-BIOCHIMICE ALE IMPLICARII HOMOCISTEINEI IN FENOMENUL ATEROGEN Director de proiect: Conf.dr Elena Albu

REZULTATE OBŢINUTE

RAPORT STIINTIFIC 2007

Etapa I : Punerea la punct a metodelor de calibrare a metodei cromatografice de determinare a homocisteinei in lichide biologice.

1. Documentare

2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat

3. Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie

1. Documentare

Tablou biochimic Inainte de stabilirea unor metode de determinare a homocisteinei (Hcy) este utila

cunoasterea biochimiei acestui analit. Homocisteina este sintetizata din metionina printr-o reactie de transmentilare, in urma careia metionina pierde gruparea metil. Homocisteina urmeaza doua cai metabolice diferite :

- se metileaza refacand metionina pe seama a doua reactii catalizate de doua enzyme diferite care implica drept cofactor vitamina B12 si metil tetrahidrofolatul coenzima provenita din acidul folic, drep substrat.

- este convertita la cisteina – precursor al glutationului- in urma a doua reactii succesive dependente de vitamina B6, in care prima reactie ste catalizata de cystationin ß-sintaza (CBS).

Orice dezechilibru intre formarea si utilizarea homocisteinei duce la modificari ale concentratiilor plasmatic al homocisteinei. Aceasta impreuna cu faptul ca metabolismul homocisteinei se bazeaza pe trei vitamine din grupul vitaminelor B, face ca homocisteina sa poata fi un maker pentru statusul acestui grup de vitamine.

Afectiuni in care este implicata homocisteina

Exista un numar relativ mare de afectiuni considerate astazi ca fiind cauzate de cresteri ale nivelelor de homocisteina, cum ar fi :

- afectiunile psihiatrice incluzand depresiile, comportamentul violent, modificarile de personalitate, pierderile de memorie, boala Alzheimer. Studii recente arata ca nivelele ridicate de homocisteina sunt prezente in 15 % din cazurile de dementa.

- sindromul Down , defecte de tub neural, si alte afectiuni legate de sarcina cum ar fi pierderea prematura a sarcinii, nasterea de feti cu greutate mica, incidenta crescuta a avortului etc.

- bolile coronare, afectiunile cerebrovasculare, ateroscleroza si bolile trombotice. Gravitatea situatiei consta in faptul ca in afectiunile mai sus metionate sunt implicate cresteri relative mici, cu putin peste limita superioara, ale homocisteinei.

Din cele expuse se evidentiaza necesitatea determinarii nivelelor acestui analit la urmatoarele categorii :

- persoane cu simptome ale deficitului de vitamine (persoane in virsta, femei insarcinate, copii)

- persoane cu risc crescut de deficit vitaminic (persoane cu afectiuni digestive sau cu rezectie gastrica, vegetarieni, alcoolici, persoane la care se administreaza himioterapice ce interfera cu statutsul folatilor)

- persoane cu afectiuni cardiovasculare

Masurarea Homocisteinei

Homocisteina este un termen colectiv folosit atat pentru homocisteina ca atare sub forma redusa cu gruparile sulhidril in forma SH (HcysH) cat si pentru formele oxidate ale acesteia ce se prezinta sub forma de dimmer in care intre doua molecule de homocisteina se formeaza o punte disulfidica

molecule de homocisteina se formeaza o punte disulfidica Homocisteina totala (tHcys) este un termen cantitativ care

Homocisteina totala (tHcys) este un termen cantitativ care se refera concentratia de homocisteina obtinuta dupa tratarea probei biologice cu un reducator. In plasma homocisteina se gaseste:

in forma redusa in cantitati de ~1% legata de albumina prin punti disulfidice in cantitati de ~70 %

legata de cisteina prin punti disulfidice in cantitati de ~30 % In momentul de fata exista diferite metode de determinare, dar toate utilizeaza acelasi principiu : plasma sau serul este mai intii tratat cu un reductant care converteste diferitele forme de homocisteina in una singura (HcysH) vcare poate fi masurata direct sau dupa derivatizare.

Masuratorile cromatografice si imuno sunt sunt cele doua metode principale utilizate in determinarea homocisteinei. Motoda imunologica de determinare a homocisteinei este relative simpla si foaret potrivita pentru analizele de rutina in laborator. Cu toate acestea nu au fost inca puse la punct reguli de standardizare si calibrarea ale analizei acestui analit si variatiile intre metode si laboratoare sunt relativ mari.

Intervale de referinta si variabilitatea intre persoane Nivele nomale ale homocisteinei prezint o anumita variabilitate data de sex, varsta si mai ales de tipul de alimentatie si aportul de vitamine. Datorita influentei semnificative pe care o are virsta si sarcina trebuiesc stabilite limite normale pentru diferitele categorii: copii (15 ani), adulti, batrani (>65 ani), femei insarcinate.

Valori normale : 8,9 μmol/L Valori patologice Hiperhomocisteinemia a fost clasificata in :

- usoara la valori de 11,7 – 16 μmol/L

- moderata la valori de 16 – 30 μmol/L

- intermediara la valori de 30 – 100 μmol/L

- severa la valori mai mai de 100 μmol/L

Nivele ale tHcy mai mari de 15 μmol/L sunt asociate cu un inalt risc cardiovasculer.

Conditii de recoltare

Sangele periferic se recolteaza pe gheata, in tuburi ce contin anticoagulant EDTA sau heparina. Plasma trebuie separata in decurs de 30 minute prin centrifugare la 40C si depozitata la -80 O C pana la analiza

Metode analitice de determinare a homocisteinei

Importanta biologica a homocisteinei justifica interesul crescut pentru gasirea de metode rapide de determinare a concentratiilor ei plasmatice. Metodele disponibile in momentul de fata se impart in doua categorii : directe si indirecte Metodele directe de detectie se refera la tehnicile imunologice :

determinari enzimatice prin tehnici imunologice (enzyme immunoassay- EIA) determinari de flurecenta polarizata prin tehnici imunologice (fluorescence polarisation immunoassay - FPIA) determinari enzimatice prin tehnici de imunofixare (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA)

Metodele indirecte se bazeaza pe tehnici de separare prin lichid cromatografie (LC), cromatografie de inalta presiune (HPLC), electroforeza capilara (CE) si gaz cromatografie (GC).

Pregatirea probelor

Toate metodele de determinare ale homocisteinei includ o etapa preliminara de reducere, necesara pentru eliberarea Hcy libere din diferitele complexe in care este legata prin legaturi disulfidice. Dintre agentii reducatori frecvent utilizati sunt : ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, tri-n- butilfosfina, si tris (2-carboxietil) fosfina (TCPE).

Metode de determinare cantitativa

Metodele imunologice La baza metodelor imunologice sta principiul reactiei specifice antigen-anticorp. Au fost puse la punct mai multe metode. Metodele EIA si FPIA Principiul general al metodelor EIA si FPIA consta in conversia Hcys libere la S- adrenozilhomocisteina (SAH) urmata de cuantificarea SAH utilizand anticorpi monoclonali anti-SAH. Metoda este selective dar costisitoare.

Metode cromatografice Lichid cromatografie cu spectrometrie de masa (LC – MS) Metoda est deosebit se sensibila si necesita cantitati mici de proba utila in cercetare dar presupune echipamente foarte costisitoare si nu este potrivita pntru aplicatii in diagnosticul clinic

HPLC HPLC a fost utilizat pe scara larga cuplat cu diferite sisteme de detectie. Fiind o metoda complexa de separare cuplata cu detectie, avantajul acesteia este dat de faptul ca poate determina simultan diferiti compusi tiolici, in plus metoda se preteaza la automatizare.

HPLC cu detectie fluorimetrica Spectroscopia in fluorescenta este larg utilizata datorita sensibilitaii si reproductibilitatii mari a metodei. Hcys nu este fluorescenta de aceea este necesara o etapa de derivatizare prin care homocisteina reactioneaza cu fluorofori pentru a genera complecsi detectabili. Pentru derivatizare au fost utilizati diversi compusi (fig.1) ca ; 7-fluoro- 2,1,3-benoxadiazole-4-sulfonate (SBD-F) ca agent de derivatizare pre- coloana fig. [10]. o-ftalaldehida (OPA) este un agent rapid de derivatizare pentru o gama larga de aminoacizi cu grupari tiol monobrombiman (mBrB) Selectivitatea acestor derivatizatori este limitata.

Tabel nr. 1 Fluorofori utilizati ca agenti de derivatizare si limitarile lor

Agent

de

Limitare

derivatizare

Monobrombimane

Instabil la temperatura camerei si in apa Compusul derivatizat hidrolizeaza usor Necesita eluare in gradient

Iodacetamida

Produce reactii incrucisate cu His, Tyr, Met Accelereaza pierderea gruparii NH3 dupa cuplare in special pentru Cys Sensibilitate scazuta in spectrometria de masa

o-ftalaldehida

Reactie sensibila la pH ridicat Complexele formate prezint instabilitate la lumina Produce reactii incrucisate cu alti aminoacizi

Maleilimida

Produce reactii incrucisate cu alti aminoacizi Complexii formati sufera rearanjamente spontane

aminoacizi Complexii formati sufera rearanjamente spontane Fig. 1 Structura fluoroforilor utilizati pentru

Fig. 1 Structura fluoroforilor utilizati pentru derivatizare

HPLC cu detectie UV/Vis Pentru determinarea cantitativa a Hcys a fost utilizata si detectia UV/Vis. Pentru a putea utiliza detectia UV a fost necesara o etapa prealabila de derivatizare. In acest caz. Agentii de derivatizare trebuie sa produca complecsi care sa prezintre o absorbtie semnificativa fie in UV fi in domeniul vizibil. Dintre agentii de derivatizare des folositi sunt : 2-cloro-1-metilpiridinium iodide (CMPI) si 2-cloro-1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT) fig.2

si 2-cloro-1-metilpiridiniu m tetrafluoroborat (CQMT) fig.2 Fig. 2 Agenti de derivatizare HPLC cu detectie electrochimica

Fig. 2 Agenti de derivatizare

HPLC cu detectie electrochimica

Prezenta gruparilor SH in structura Hcy face posibila utilizare detectiei electrochimice. Principiul metodei consta in oxidarea homocisteinei la homocistina. Metoda este rapida, nu necesita derivatizare inaintea separarii cromatografice. Ca electrozi pot fi folsiti electrozii de grafit, platina, aur, argint. Desi prezinta avantajul unui timp de analiza scurt in comparatie cu toate celelalte metode, detectia electrochimica prezinta dezavantajul unei slabe reproductibilitati si a deteriorarii celulei de citire.

Electroforeza capilara (CE) Asemanator HPLC, electroforeza capilara este o metoda complexa care cupleaza separarea cu detectia, motiv pentru care EC poate fi cu detectie electrochimica, in fluorescenta sau prin spectroscopie de absorbtie in UV/Vis. Detectia electrochimica pune o serie de probleme in ce priveste fiabilitatea electrozilor folositi, in timp ce electroforeza capilara cu detectie in UV/Vis este rar folosita datorita slabei sensibilitati. Utilizata des este electroforeza capilara cu detectie fluorimetrica.

Electroforeza capilara cu detectie fluorimetrica In mod asemanator metodei cromatografice cu detectie in fluorescenta, metoda electroforezei capilare necesita o etapa preliminara e derivatizare. Ca agenti de derivatizare in acset caz au fost raportati: fluoresceina izotiocianat (FITC), brommetilflouresceina (BMF), 6-iodoacetamidofluoresceina (IAAF), 4-aminosulfonil-7- fluoro-2,1,3-benzoxadiazole (ASFB), fluorescein-5-maleilamida (FMI) fig.3

(ASFB), fluores cein-5-maleilamida (FMI) fig.3 Fig. 3 Fuorofori utilizati in electroforeza capilara

Fig. 3 Fuorofori utilizati in electroforeza capilara Cromatografia de gaz (GC) Metoda gaz cromatografica a fost rar utilitazata in determinarea Hcy datorita incompatibilitatii gruparilor tiol cu sistemul gaz-cromatografic. Si in aceasta metoda etapa de derivatizare este obligatorie.

Cromatografia de gaz (GC) cu detectie in spectometrie de masa (GC-MS)

In acest tip de metoda agentii de derivatizare tsunt alesi pentru a realiza complexi volatili cu nlitii ce urmeaza a fi determinati. Ca agenti de derivatizare a fost utilizati : etil cloroformiat, N-(tertbutildimetilsilil)-N- metiltrifluoroacetamida. Desi procesul de derivatizare este foarte laborios metoda este reproductibila si serveste ca metoda de referinta.

CONCLUZII

Datorita interferentelor din matricea biologica, determinarea homocisteinei in fluidele biologice este realizata de cele mai multe ori impreuna cu metode de separare cum ar fi LC, HPLC (cea mai utilizata) sau CE. Desi au fost enuntate numeroase protocoale, fiecare dintre ele prezinta dezavantaje sau prezinta limitari incat nu exista inca o metoda standardizata pentru determinarea homocisteinei din lichidele biologice. Tehnica relativ recenta a imnodeterminarilor desi selectiva utilizeaza reactivi foarte scumpi in comparatie cu reactivii chimici usuali. Mai mult , Refsum si colaboratorii care sunt specialistii in domeniu, in lucrarea review publicata, arata ca marea majoriate a metodelor propuse nu intrunesc toate criteriile de reproductibilitate si acuratete. Erorile de reproductibilitate intre laboratoare intra si interpacienti persista de aceea este necesara standardizarea uneia/unor metode care sa respecte toate criteriile de selectivitate, sensibilitate, precizie si reproductibilitate.

2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat

Pentru determinarea homocisteinei a fost aleasa tehnica HPLC cu detectie in UV plecand de la considerentul ca este o tehnica rapida si putin costisitoare. In literatura sunt specificate doua conditii prealabile determinarii homocisteinei si anume a) o etapa de reducere cu un agent reducator si b) o etapa de derivatizare care sa duca la formarea unui compus cu absorbtie puternica in UV sau vizibil.

a) Pentru ca homocisteina este un compus care in probele biologice se prezenta in proportie de 80% in forma legata, fie de proteine fie in forma oxidata de dimeri cu compusi continand grupari tiol. Toate metodele de cuantificare indica o etapa prealabila de reducere cu diferiti agenti reducatori. Am utilizat in studiu doi agenti si anume ditiotritol si mercaptoetanol pentru a stabili comparativ eficinta reducerii. Eficienta reducerii a fost studiata determinand absorbtia esantioanelor de homocisteina tratate cu cei doi agenti reducatori.

b) Deoarece homocisteina nu prezinta absorbtie semnificativa in domeniul UV/Vis s-a realizat derivatizarea ei cu compusul ditio dinitro benzoic acid (DTNB). Metoda se bazeaza pe reactia Edmann in care gruparile tiol reactioneaza cu DTNB ducand la formarea unor compusi colorati in galben care pot fi determinati la 412 nm.

Dat fiind faptul ca homocisteina urmeaza a fi determinate din matrici biologice unde exista multi compusi cu care aceasta poate interfera a fost aleasa tehnica de separare pe lichid cromatograf. (HPLC). Sistemul cromatogafic ales este:

- liquid chromatograph (HPLC) Beckman, Module 126, UV detector, Module 166, with ODS column (250 x 4,6 mm i. d., particle size 5 μm). - faza mobile este un amestec de CH 3 OH:NH 3 (25%) (100:2): bi distilled water (50:50) la un debit de 0,8 ml/min. Temperatura de lucru 25 0 C si detectia a fost realizta la 412 nm.

3. Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie Pentru trasarea curbei etalon a fost preparat o solutie stoc de homocisteina 100

μmol/l. Solutia stoc este stabila la 4 o C timp de o saptamana conform indicatiilor din

literatura Din solutia stoc au fost preparate

1,25 ; 2,5 ; 5 ; 10, 20, 40 μmol/l. La 1 ml de solutie homocisteina au fost adaugati

25 μl ditiotreitol dupa care

amestecul a fost lasat la incubat 10 minute. Dupa 10 minute se adauga 50 μl de DTNB si se lasa la incubat 30 minute pentru formarea complexului dupa care se iau 25 μl si se injecteaza in cromatograf. Cromatograma obtinute este prezentata in figura 4.

solutii de lucru cu concentratii de : 0,65;

injecteaza in cromatograf. Cromatograma obtinute este prezentata in figura 4. solutii de lu cru cu concentratii

Fig. 4

Cromatograma spacifica obtinuta in eluarii etalonului de homocisteinei (5

μmol/l) pe coloana ODS cu detectie in UV/Vis. Timpul de retentie pentru homocisteina in sistemul de elutie ales este t R = 2,87.

Curba etalon obtinuta prin cromatografierea seriei de dilutii a homocisteinei este prezentata in tabelul 2.

Tabel nr. 2 Curba etalon obtinuta utilizand ca faza fixa column ODS (250 x 4,6

mm i.d., particle size 5 μm) si ca faza mobila amestecul de CH 3 OH:NH 3 (25%) (100:2):

apa bi distilata(50:50) la un debit de 0,8 ml/min, temperatura 412 nm.

de lucru 25 0 C, detectia la

Curba de etalon pentru determinarea cromatograficã a homocisteinei

Conc.

(µmol/ml)

A1

1,25

1,822

2,5

3,692

5

7,128

10

14,189

20

27,534

40

57,609

Panta

1,4323

Intercept

-0,1367

RQS

0,9994

Conc

Arie

(µmol/ml)

1,25

1,787

2,5

3,601

5

7,261

10

14,358

20

28,778

40

57,652

Aria picului (A)

 

Medie

Dev.

CV%

A2

A3

A4

A5

Stand.

1,766

1,783

1,852

1,712

1,787

0,0537

3,01

3,621

3,422

3,673

3,599

3,6014

0,1071

2,97

7,221

7,438

7,562

6,956

7,261

0,242

3,33

15,031

14,022

14,561

13,963

14,353

0,4448

3,05

29,969

29,529

28,209

28,649

28,778

0,9837

3,41

58,109

56,123

59,128

57,292

57,652

1,1019

1,9

1,458

1,4097

1,4693

1,4355

1,4409

0,0233

1,61

0,1503

0,2176

-0,1199

1,4355

0,3094

0,6491

0,9997

0,9992

1,4693

1

1,0935

0,2101

Curbele etalon pentru determinarea cromatograficã a homocisteinei 70 Series1 60 Series2 50 Series3 40 Series4
Curbele etalon pentru determinarea cromatograficã a
homocisteinei
70
Series1
60
Series2
50
Series3
40
Series4
30
Series5
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Concentratie (µmol/ml)
Arie pic

Curba etalon obtinutã pentru determinarea cromatograficã

a homocisteinei

70 60 50 y = 1,4409x - 0,0061 R 2 = 1 40 30 20
70
60
50
y = 1,4409x - 0,0061
R 2 = 1
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Arie pic

Concentratie (µmol/ml)

Arie Linear (Arie )
Arie
Linear (Arie )

Răspunsul este liniar pe intervalul 1.25 - 40 μg/ml, cu un coeficient de variaţie (CV%) maxim de 3,41%. Limita de detectie este 1,25 μmol/l. Sub aceasta valoare coeficientul de variatie depaseste valoarea de 5% admisa. Coeficientul de corelare pe acest interval este de 1. Valoarea obţinută este mai mare decât coeficientul de corelaţie minim, pentru n = 5 grade de libertate (7-2) la p = 0,05, care este r 2 = 0,98. A fost calculat coeficientul de variaţie (CV%) al pantei. Valoarea obţinută 1.61% este mai mică decât valoarea maxim admisă de 2% conform criteriilor de validare pentru metodele cromatografice [170]. Au fost calculaţi coeficienţii de corelaţie pentru fiecare pereche de date. Valorile individuale obţinute sunt mai mari de 0.99.

Bibliografie :

1. Jacobsen, D. W., Gatautis, V. J., Green, R., Robinson, K., Savon, S. R., Secic, M., Ji, J., Otto, J. M., and Taylor, L. M., Jr. (1994) Clin. Chem. 40, 873–881

2. Ueland, P. M., Refsum, H., Stabler, S. P., Malinow, M. R., Andersson, A., and Allen, R. H. (1993) Clin. Chem. 39, 1764–1779

3. Lawrence de Koning, A. B., Werstuck, G. H., Zhou, J., and Austin, R. C. (2003) Clin. Biochem. 36, 431–441

4. Eberhardt, R. T., Forgione, M. A., Cap, A., Leopold, J. A., Rudd, M. A., Trolliet, M., Heydrick, S., Stark, R., Klings, E. S., Moldovan, N. I., Yaghoubi, M., Goldschmidt- Clermont, P. J., Farber, H. W., Cohen, R., and Loscalzo, J. (2000) J. Clin. Investig. 106,

483–491

5. Weiss, N., Zhang, Y. Y., Heydrick, S., Bierl, C., and Loscalzo, J. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 12503–12508

6. Weiss, N., Heydrick, S., Zhang, Y. Y., Bierl, C., Cap, A., and Loscalzo, J. (2002) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 34–41

7. Huang, R. F., Hsu, Y. C., Lin, H. L., and Yang, F. L. (2001) J. Nutr. 131, 33–38

8. Upchurch, G. R., Jr., Welch, G. N., Fabian, A. J., Freedman, J. E., Johnson, J. L., Keaney, J. F., Jr., and Loscalzo, J. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17012–17017

9. Outinen, P. A., Sood, S. K., Pfeifer, S. I., Pamidi, S., Podor, T. J., Li, J., Weitz, J. I., and Austin, R. C. (1999) Blood 94, 959–967

10. Kryukov, G. V., Castellano, S., Novoselov, S. V., Lobanov, A. V., Zehtab, O., Guigo, R., and Gladyshev, V. N. (2003) Science 300, 1439–1443

11. Baker, R. D., Baker, S. S., LaRosa, K., Whitney, C., and Newburger, P. E. (1993) Arch.

Biochem. Biophys. 304, 53–57

12. Driscoll, D. M., and Copeland, P. R. (2003) Annu. Rev. Nutr. 23, 17–40

13. Shen, Q., Leonard, J. L., and Newburger, P. E. (1995) RNA (N. Y.) 1, 519–525

14. Stadtman, T. C. (1996) Annu. Rev. Biochem. 65, 83–100

15. Lescure, A., Fagegaltier, D., Carbon, P., and Krol, A. (2002) Curr. Protein Pept. Sci. 3,

143–151

RAPORT ŞTIINŢIFIC 2008

Etapa II :

Obiectiv 1:

1. Punerea la punct a metodologiei de extractie prin metoda cromatografica de determinare a nivelelor de homocisteina in lichidele biologice

Activităţi:

trasarea curbei de calibrare prin metoda

1.1. Alegerea metodei de extracţie şi

cromatografică

1.2. Diseminarea rezultatelor

Obiectiv 2:

2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina prin metoda immunoassay

Activităţi:

2.1.

documentare in vederea punerii la punct a metodei

2.2.

Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay

2.3.

Diseminarea rezultatelor

1.

PUNEREA LA PUNCT A METODOLOGIEI DE EXTRACTIE PRIN METODA CROMATOGRAFICA DE DETERMINARE A NIVELELOR DE HOMOCISTEINA IN LICHIDELE BIOLOGICE

1.1

Alegerea metodei de extracţie şi trasarea curbei de calibrare prin metoda

cromatografică

1.1.1 Alegerea metodei de extractie prin metoda cromatografica

Serul/plasma este o matrice biologică complexă ce conţine pe lângă homocisteină o serie de compuşi înrudiţi cum ar fi cisteina, cistein-glicina, glutationul, toţi, compuşi cu caracter hidrosolubil. Homocisteina este prezentă în ser/plasma legată de proteine, în proportie de 80%, sub formă de dimeri (cu compuşi conţinând grupări tiol, prin intermediul punţilor disulfidice ) ~30 % şi in formă liberă în proporţie extrem de mică de ~1%. Datorită caracterului hidrosolubil homocisteina se separă usor prin electroforeză capilară. Metoda este simplă, însă necesită aparatură foarte costisitoare. Din acest motiv majoritatea metodelor de determinare utilizează metodele cromatografice, HPLC cu diferite sisteme de detecţie. Pentru că este prezentă în cantităţi foarte mici în sânge/plasmă/ser, semnalul cromatografic este slab de aceea pentru a putea fi determinata cromatografic, homocisteina trebuie mai întâi derivatizată. În plus, indiferent de metoda de detecţie a homocisteinei, în prealabil, este necesară şi o etapă ce converteşte diferitele forme ale acesteia (forma legată de proteine

sau formele dimere) în una singura şi anume homocisteina redusă Hcys-SH. Pentru aceasta este necesară tratarea matricei biologice cu un agent reductor care rupe punţile disulfidice.

In concluzie determinarea homocisteinei presupune parcurgerea obligatorie a urmatoarelor etape :

- a. eliberarea grupărilor SH prin ruperea punţilor disulfidice, în urma reacţiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.

- b. derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiti agenti de derivatizare.

a. Eliberarea grupărilor SH prin ruperea punţilor disulfidice, în urma reacţiei de reducere cu formarea homocisteinei reduse Hcys-SH.

În scopul ruperii punţilor disulfidice am utilizat mai mulţi agenti reducători:

ditiotreitol, mercaptoetanol, Tris n-butil fosfina (TNBP).

A fost ales ca agent de reducere TNBT [1]. Deşi timpul necesar reacţiei de

reducere este de circa 30 minute, reducerea este mult mai energică, reacţia având loc la temperatura 60 0 C. Temperatura uţor ridicată este favorabilă denaturării proteinelor care ulterior vor fi îndepartate prin centrifugare. Se asigură astfel o purificare suplimentară a matricei biologice.

b. Derivatizarea homocisteinei libere la gruparile SH, cu diferiţi agenţi de derivatizare.

In scopul derivatizării literatura indică un număr relativ mare de compuşi.

Iniţial am utilizat ca agent de cuplare a legăturilor SH, ditio dinitro benzoic acid (DTNB) cu care am obtinut un timp de eluţie bun 2,87 relativ apropiat de timpul de eluţie al solventului. Acest timp de eluţie mic, poate deveni un impediment ducând uneori la eluarea homocisteinei odata cu solventul. În urma mobilităţii efectuate în Polonia am utilizat ca agent de derivatizare 2- cloro-1-metilpiridinium tetrafluoroborat (CQMT). În cazul utilizarii CMQT eluţia homocisteinei are loc la t R = 8,5 semnificativ distanţat de timpul de eluţie al solventului. În plus utilizând CMQT ca agent de derivatizare, reacţia de derivatizare dureaza 5 minute comparativ cu 30 minute în cazul DTNB (metoda utilizata anterior).

Sistemul cromatografic

Pentru cromatografierea probelor a fost utilizat un cromatograf HPLC Hewlett- Packard, cu coloana cu faza inversa C18, 5 um, 125 x 4 mm. Faza mobilă a fost alcatuită din două soluţii :

A. acetonitril

B. amestec de acid triclor acetic 0,1 M, LiON 0,1 M la pH = 1,65.

Eluţia a avut loc în gradient de concentraţie astfel :

- 4 minute 11% A şi 89% B

- 8 minute 35% A şi 65% B

- 12 minute 11% A şi 89% B

Debitul fazei mobile a fost de 1,2 ml/min.

Sistemul de detecţie utilizat a fost un spectrofotometru UV-vis cu diode-array, la 312

nm.

Identificarea picurilor s-a făcut pe baza comparării timpilor de retenţie şi a spectrelor cu datele obtinute pentru homocisteina pură.

1.1.2. Trasarea curbei de calibrare pentru metoda cromatografica

Pentru trasarea curbei de calibrarea a fost preparată o soluţie stoc de homocisteina 10 μmol/ml (0,0135 g Hcys cu 1 ml HCl 0,1 M, aduşi la 10 ml apa distilată).

Din soluţia stock a fost preparată soluţia de lucru de concentraţie 50 nmol/ml.

Agentul reducator TNBP a fost preparat soluţie 10% în metanol.

Agentul de derivatizare CMQT a fost preparat în concentraţie 0,1 mol/L.

Pentru precipitarea proteinelor din ser a fost preparată o soluţie (PCA).

La 100 μl soluţie tampon Tris pH = 8 au fost adaugati 100 μl plasma. Apoi au fost adaugati 1, 2, 4, 8, 16, 24, 32 μl soluţie de lucru de homocisteina şi 10 μl soluţie TNBP. Amestecul a fost incubat pe baie de apă la 60 0 C timp de 30 minute. După incubare amestecul a fost răcit la temperatura camerei şi au fost adaugaţi 10 μl de CMQT. Amestecul a fost lăsat în repaus 5 minute pentru definitivarea reacţiei de derivatizare, după care au fost adaugaţi 100 μl PCA. După 3 minute amestecul a fost centrifugat la 12 000 rpm timp de 10 minute şi 20 μl din supernatant au fost injectaţi în cromatograf.

3M acid percloric

Cromatogramele obtinute sunt prezentate in figura 1a, 1b, 1c.

19 17 15 13 11 9 7 5 3 1 -1 0 1 2 3
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Absorbance [mAU]

Time [min]

Fig. 1a. Cromatograma obţinută în urma eluării unei probe de plasma la care nu s-a adaugat homocisteina.

Timpul de retenţie pentru homocisteină este t R = 8,5 semnificativ distanţat de timpul de eluţie al solventului care apare la 1-2 minute. În cromatograma se observă

provine de la homocisteina endogena din plasma, la t R = 9,1 cisteina, la t R = 9,7 cistein- glicina si la t R = 10,5 CMQT utilizat in exces.

19 17 15 13 11 9 7 5 3 1 -1 0 1 2 3
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Absorbance [mAU]

Time [min]

Fig. 1b. Cromatograma obţinuta in urma eluarii unei probe de plasma la care au fost adaugati 4 μmoli homocisteina.

19 17 15 13 11 9 7 5 3 1 -1 0 1 2 3
19
17
15
13
11
9
7
5
3
1
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Absorbance [mAU]

Time [min]

Fig 1c. Cromatograma obţinută în urma eluării unei probe de plasma la care au fost adaugaţii 24 μmoli homocisteina.

Prin metoda cromatografica aleasă se obţine un timp bun de eluţie pentru homocisteină, distanţat de frontul solventului şi o separare bună faţă de alţi compuşi cu grupari SH care se găsesc în concentraţii importante în plasmă. Astfel homocisteina este eluată la distanţă de glutation, cisteina şi cistein-glicină. Metoda aleasă este selectivă prevenind, prin timpii de retenţie distanţaţi, coeluarea compuşilor cu structuri asemănătoare.

Curba de calibrare obtinută este prezentată în fig. 2.

Curba de calibrare a fost obţinută în urma cromatografierii plasmei la care au fost adaugate concentratii crescătoare de homocisteină. Fiecare punct de pe curbă a fost obţinut în urma calculării mediei aritmetice a trei determinări.

30 y = 0,6126x + 5,6128 R 2 0,9962 = 25 20 15 10 5
30
y = 0,6126x + 5,6128
R 2 0,9962 =
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
peak height [mAU]

HCSH concentration [nmol/ml]

Fig. 2. Curba de calibrare reprezentand intensitatea absorbantei, functie de concentraţia de homocisteina adaugata în plasma.

Ecuaţia dreptei de regresie obţinută pentru curba etalon este Y = 0,6126. X +

5,6128. Răspunsul este liniar pe intervalul 0 - 35 nmol/ml, cu un coeficient de corelaţie r 2 = 0,9962. Pe baza curbei de calibrare obţinute pot fi determinate concentraţiile plasmatice în probele biologice.

1.2 Diseminarea rezultatelor

Rezultatele obţinute în urma etapei I/2007: Punerea la punct a metodelor de

calibrare a metodei cromatografice de determinare a homocisteinei in lichide biologice:

1. Documentare ; 2. Alegerea sistemului cromatografic si de detectie adecvat, 3. Trasarea curbei etalon si stabilirea limitei de detectie au fost comunicate şi publicate, după cum urmează:

- C.Filip, E.Albu, N. Zamosteanu, C. Dimitriu, N. Gheorghiţă, O.C.Mungiu – homocisteina factor toxic endotelial – metode de detecţie - The Medical Journal of Sibiu, vol 19, nr.2, pg. 163-167, 2008, comunicată la al IX-lea Congres Internaţional de Farmacologie, Terapeutică şi Toxicologie Clinică, Sibiu 10-14 iunie, 2008

- E.Albu C.Filip, N. Zamosteanu, C. Dimitriu, N. Gheorghiţă, O.C.Mungiu – Hiperhomocisteinemia – factor de risc cardiovascular independent – mecanisme fiziopatologice, interferare farmacologică – Drugs. Use, abuse and dependency, Editura Gr.T.Popa, 2008, pag 224-228, comunicată la Zilele Medicamentului, ediţia aXVII-a, Iaşi 2008 Revistele in care au fost publicate lucrările sunt reviste recunoscute CNCSIS.

Datorită faptului că derularea practică a achiziţiilor de materiale şi reactivi şi efectuarea mobilităţii de documentare/cercetare la data acceptată de către laboratorul

gazdă din Lotz, Polonia (septembrie-octombrie 2008) s-au întârziat până în partea a doua a etapei 2008, şi luând în considerare caracterul pregătitor al obiectivelor de etapă în care s-au investigat şi s-au aplicat metodele de extractie prin HPLC în vederea insuşirii şi aplicării unei metode sensibile de dozare a homocisteinei utilă pentru etapele următoare, rezultate obţinute în urma cercetărilor din această etapă nu au putut fi trimise în timp util spre publicare la o revistă din Baze de Date. În acest moment materialul se află în procedura de acceptare spre publicare la Revista Medico-Chirurgicală, Iaşi.

2. DETERMINAREA

PRIN METODA IMMUNOASSAY

2.1. Documentare in vederea punerii la punct a metodei

2.2. Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay

2.3. Diseminarea rezultatelor

NIVELELOR

PLASMATICE

DE

HOMOCISTEINA

2.1. Documentare in vederea punerii la punct a metodei

2.2 Utilizarea kit-urilor pentru metoda immunoassay

In afara metodelor cromatogragice, în momentul de faţă, mai sunt utilizate două tipuri de metode pentru determinarea homocisteinei:

a. metoda imunologică

b. metoda enzimatică

a. Metoda imunologica Metoda imunologica are la baza formarea complexului antigen-anticorp specifică. Principiul metodei constă în obţinerea unor anticorpi faţă de o serie de proteine din serul uman, în cazul de faţă, o enzima implicată în generarea homocisteinei în organism. Testul are la baza cuplarea enzimei specifice serului uman cu anticorpul, cuplare în urma careia rezultă complexul antigen-anticorp. Acesta este marcat cu un « generator » de culoare a carei intensitate este determinată spectrofotometric. În cazul utilizării serului de şobolan, datorită lipsei de specificitate, complexul antigen-antigen nu se mai poate forma. Cu alte cuvinte kit-urile existente în mometul de faţă sunt doar pentru utilizare umană. Metoda imuno de determinare a homocisteinei are la bază legarea specifica la un anticorp anti sulf-adenozin hidrolaza (SAH) enzimă implicată în sinteza homocisteinei în organism. Principiul metodei constă în competiţia dintre SAH şi un marker etichetat cu un cromofor fluorescent. Detectia are la bază modificarea polarizării fluorescentei (fig. nr. 3).

Fig. 3 . Principiul determin ă rii imunologice a homocisteinei [2] b. Metoda enzimatic ă

Fig. 3. Principiul determinării imunologice a homocisteinei [2]

b. Metoda enzimatică

Datorita imposibilităţii determinării homocisteinei prin metoda imunologică cauzată de lipsa de specificitate a reacţiei imunologice în cazul serului de şobolan, am ales metoda enzimatica standardizata de Roche şi comercializată sub denumirea Diazyme.

Cea mai recenta metodă de determinare a homocisteinei poartă denumirea de “Enzyme Cycling Method”. Principiul metodei constă în utilizarea unor reacţii enzimatice ciclice care au ca scop amplificarea semnalului detectat. Ca şi în cazul metodei cromatografice metoda enzimatică necesită o etapă în care homocisteina este redusă din formele oxidate, în care se găseşte în ser, la homocisteina redusa Hcys-SH. Homocisteina liberă este apoi convertită la metionină în prezenţa unei metal-transferaze utilizând sulf- adenozin metionina (SAM) ca donor de grupări metil. În urma transmetilării SAM, convertit la sulf- adenozin homocisteina (SAH), suferă o reactie rapidă de hidroliza în homocisteina şi adenozina (Ado). Homocisteina reintră în ciclul de metilare ceea ce duce la o acumulare de Ado care este detectat printr-o reactie enzimatica cuplata, dependenta de NAD/NADH, la 340 nm (fig. 4).

Fig. 4 . Ciclul de reactii enzimatice cuplate utilzate pentru determinarea homocisteinei [2]. Determinarea homocisteinei

Fig. 4. Ciclul de reactii enzimatice cuplate utilzate pentru determinarea homocisteinei [2].

Determinarea homocisteinei utilizand un kit standardizat (Diazyme)

Procedeul pentru determinarea homocisteinei utilizează un kit ce conţine 3 reactivi :

R1: HADH 0,2 mMol/L R2: Homocistein metionin transferase (HMTase ) 5kU/L R3: S-adenozil homocistein hidrolase (SAH) 3,0 kU/L

Procedura de lucru este prezentata în figura 5.

3,0 kU/L Procedura de lucru este prezentata în figura 5. Fig. 5 . Procedura de lucru

Fig. 5. Procedura de lucru pentru determinarea homocisteinei in ser/plasma [2]

Trasarea curbei de calibrare pentru metoda enzimatica utilizind kituri standardizate

Pentru trasarea curbei de calibrarea a fost preparată o soluţie stoc de homocisteina 10 μmol/ml (0.0135 g Hcys cu 1 ml HCl 0,1 M, adusi la 10 ml apă distilată).

La 240 μl R1 au fost adaugaşi 18 μl plasma la care a fost adaugată homocisteina în concentraţii crescătoare în domeniul 0 – 50 nmoli/ml şi 38 μl R2. După incubare 5 minute la 37 0 C au fost adaugaţi 25 μl R3 în toate eşantioanele. Pentru fiecare concentraţie de pe curbă de calibrare au fost făcute trei probe.

Determinarea homocisteinei a fost făcută prin măsurarea absorbanţiei probelor la 340 nm în mod cinetic. Curba de calibrare obţinută este prezentata în figura 6

0.02 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0 10 20 30
0.02
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0
10
20
30
40
50
60
[viteza]

nmoli/ml

Fig. 6. Curba de calibrare reprezentand viteza reactiei enzimatice functie de concentratia de homocisteina

Ecuaţia dreptei de regresie obţinută pentru curba de calibrare este:

Y = 0,000309. X + 0.003029.

Coeficient de corelatie r 2 = 0,951937.

Pe baza curbei de calibrare obtinute pot fi determinate concentratiile plasmatice în probele biologice.

Pentru a compara cele două metode aceeaşi probă de plasma la care a fost adaugată o cantitate de homocisteina de 10 nmoli/ml a fost analizată atât prin metoda

cromatografică cât şi prin metoda enzimatica. Valorile obţinute sunt prezentate in tabelul

1.

Tabel 1: Valori ale concentratiei homocisteieni obtinuta prin metoda cromatografica si prin metoda enzimatica, in urma determinarii homocisteinei intr-o proba de plasma de sobolan la care au fost adaugate 10 ug/ml homocisteina.

Metoda HPLC

Metoda enzimatica utilizand kit Diazyme

10.3

9.78

9.86

9.51

9.72

9.33

Valoarea medie = 9.96

Valoarea medie = 9.54

CONCLUZII :

1. Determinare homocisteinei prin metoda cromatografiică prezintă o sensibilitate şi specificitate foarte bune. Pe domniul 0 - 35 nmol/ml răspunsul este liniar, coeficientul de corelaţie obţinut fiind 0.9962.

2. Determinarea homocisteinei prin metoda imunologică nu a putut fi realizată deoarece kit-urile pentru homocisteină sunt strict pentru plasma/serul uman, reacţia imunologică de formarea a complexului antigen-anticorp neavănd loc pentru serul de şobolan. Din acest motiv a fost aleasă metoda enzimatică de determinare a homocisteinei.

3. Determinarea homocisteinei prin metoda enzimatica prezinta o specificitate si sensibilite bună. Pe domniul 0 - 50 nmol/ml răspunsul este liniar, coeficientul de corelaţie obtinut fiind 0.9519, ceva mai mic ca în cazul metodei cromatografice.

4. Comparând cele două metode utilizate se observă ca ambele sunt asemănătoare în ceea ce priveşte sensibilitatea şi specificitatea, metoda cromatografica fiind, aşa cum era de aşteptat, mai precisă. Metodei cromatografică a confirmat aplicabilitatea metodei enzimatice la serul de şobolan ân urma analizării aceleeaţi probe de ser de şobolan efectuată în paralel prin metoda enzimatică.

BIBLIOGRAFIE :

1. E. Bald, E. Kaniowska, G. Chwatko, R. Glowacki, “Lichid chromatographic assessment of total and protein-bound homocysteine in human plasma”, Talanta 50 (2000), 1233-1243

2. Diazyme References

3. Eikelboom JW et all., Ann Intern Med 131(1999), 363-375

4. Scott J., Weir D., QJMed. 89 (1996), 561-563

5. Refsum, H., et al., Facts and Recommendations about Total Homocysteine Determinations: An Expert Opinion. Clin. Chem. 50: 3-32, 2004

6. Refsum, H. ,Total Homocysteine, guidelines for determination in clinical laboratories, Clinical Laboratory News, May 2002

7. Jacques, P.F., et al., Determinants of plasma total homocysteine concentration in the Framingham Offspring cohort. Am J Clin Nutr 2001;73:613–21

8. Nygård, O., et al., Plasma homocysteine levels and mortality in patients with coronary artery disease. N Engl J Med 1997;337:230–6

RAPORT ŞTIINŢIFIC 2009

ETAPA III :

OBIECTIV 1:

1. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse experimental la animale de laborator

Activităţi:

1.1 Documentare

1.2 Realizarea modelului de diabet experimental – determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

OBIECTIV 2:

2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse

experimental la animale de laborator

Activităţi:

2.1 Realizarea modelului de stres experimental – determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

2.2. Diseminarea rezultatelor

OBIECTIV 3:

2. Determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina in diferite procese patologice induse

experimental la animale de laborator

Activităţi:

3.1. Inducerea experimentala a hiperhomocisteinemiei – determinarea nivelelor plasmatice de

homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ 3.2 Diseminarea rezultatelor

1.

DETERMINAREA

NIVELELOR

PLASMATICE

DE

HOMOCISTEINA

IN

DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA ANIMALE DE LABORATOR

1.1

Documentare

In literatura studiata sunt prezentate mai multe modalitati de inducere a diabetului la animalele de experienta si anume: administrarea streptozotocinei intraperitoneal sau per os sau administrarea aloxanului intra peritoneal [1-6].

Am ales pentru inducerea diabetului experimental, aloxanul in administrare unica, intraperitoneala, la sobolan.

1.2 Realizarea modelului de diabet experimental – determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina,

parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In momentul de fata este cunoscut faptul ca diabetul este implicat intr-o multitudine de procese patologice. Printre mecanismele patologice care se asociaza acestei afectiuni este generarea de radicali liberi . Pe de alta parte diabetul este corelat cu bolile cardiovasculare si cu modificarea functiilor endoteliului vascular, fenomene in care se considera ca este implicata si homocisteina in concentratii crescute […]. In plus se considera ca hiperhomocisteinemia este generatoare de radicali liberi [7-12]. Apare astfel ca, atat hiperglicemia cat si hiperhomocisteinemia ar putea fi corelate cu generarea de radicali liberi, cei doi parametri putand determina un efect cumulativ.

În etapa de faţă a fost studiată influenţa nivelelor crescute ale glucozei asupra statusului oxidativ si a concentratiei homocisteinei la sobolan.

Modelul experimental de diabet indus la sobolan a fost realizat prin administrare unica de alloxan in doza de 110 mg/kg corp. Au fost efectuate apoi urmatoarele determinari :

- determinarea nivelelor glicemiei in vederea confirmarii diabetului -determinarea nivelelor homocisteinemiei

- determinarea parametrilor statusului oxidativ.

Determinarea glicemiei, in vederea confirmarii diabetului, a fost realizata prin determinarea glicemiei la 4 zile de la administrarea aloxanului utilizand un kit enzymatic cu glucozoxidaza – …numele. Concentratia homocisteinei a fost determinata utilizand un kit standardizat- Dyazime. Pentru investigarea parametrilor statusului oxidativ au fost determinate activitatea sistemelor intracelulare antioxidante: superoxid dismutaza (SOD) si glutationperoxidazei (GPx), precum si capacitatea antioxidanta totala (CAT) a speciilor reducatoare circulante in plasma. Activitatea SOD şi GPx în eritocite şi CAT în plasmă a fost realizata utilizand kituri Randox standardizate, pentru determinare manuală.

Mod de lucru

S-a lucrat pe un lot de 10 sobolani adulţi Wistar, în greutate de 150-200g, la care a fost administrat aloxan i.p. in doza unica de 11omg/kg. C. La 4 zile de la administrarea aloxanului au fost prelevate probe de sange prin punctie retroorbitara si in plasma au fost determinate glicemia, nivelele homocisteinei si capacitatea totala antioxidanta. In eritrocite a fost determinata activitatea SOD si GPx.

Rezultate si discutii

Nivelele glicemiei obtinute initial si la 4 zile de la administrarea aloxanului si ale homocisteinei sunt prezentate in tabelul nr. 1 Nivelele glicemiei, determinate înainte şi la 4 zile de la administrarea aloxanului, sunt prezentate in tabelul nr. 1

Tabelul nr 1. Concentratia glucozei determinată în plasmă de şobolan înainte şi la 4 zile de la administrarea aloxanului

 

Concentratia plasmatica a glucozei (mg/100ml)

Initial

Dupa 4 zile de la administrarea aloxanului

Lotul I

 

135,071±19,89

351,698 ±28,624

(a

primit

aloxan

110

mg/kg

corp

i.

p.,

administrare unica

 

Datele obtinute arata instalarea hiperglicemiei confirmand astfel modelul de diabet indus experimental la sobolan.

Nivelele de homocisteina determinate înainte şi dupa 4 zile de la administrarea aloxanului, sunt prezentate in tabelul nr. 2

Tabelul nr 2. Concentratia homocisteinei determinată în plasmă de şobolan înainte şi dupa 4 zile de la administrarea aloxanului

 

Concentratia plasmatica a metioninei (μM/ml)

Initial

Dupa 4 zile de la administrarea aloxanului

Lotul I

 

13.276±1,89

15.72±2,25

(a

primit

aloxan

110

mg/kg

corp

i.

p.,

administrare unica)

 

Valorile obtinute indica o crestere a concentratiei homocisteinei in plasma, fara ca aceasta sa fie semnificativa din punct de vedere statistic. Datele obtinute arata ca nivelele crescute ale glucozei nu pot fi corelate cu hiperhomocisteinemia.

Capacitatea antioxidanta totala determinata în plasma este prezentata în tabelul nr.3

Tabelul nr 3. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan înainte şi dupa 4 zile de la administrarea aloxanului

Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)

Initial

Dupa 4 zile de la administrarea aloxanului

Lotul I (a primit aloxan 110 mg/kg corp i. p., administrare unica)

0.921

0.883

Valorile obtinute indica o scadere a CAT in plasma, fara ca aceasta sa fie semnificativa din punct de vedere statistic. Datele obtinute arata la 4 zile de la instalarea hiperglicemiei nu apar modificari semnificative ale acestui parametru. In concluzie la 4 zile de la administrarea aloxanului si instalarea hiperglicemiei parametrii studiati homocisteina si capacitatea totala antioxiidanta nu sufera modificari semnificative.

2. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA IN DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA ANIMALE DE LABORATOR

Activităţi:

2.1 Realizarea modelului de stres experimental – determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In momentul de fata este unanim acceptat faptul ca stresul este implicat in procesele de imbatranire celulara prin multiple mecanisme. Unul din mecanismele prin care se considera ca stresul intervine in aceste procese este generarea de radicali liberi.

La nivel celular stresul oxidativ reprezintă o scădere considerabilă a capacitătii reducătoare, capacitate utilizata de celule in vederea anihilarii speciilor reactive[13-14]. Celulele, în mod normal, sunt capabile să se apere împotriva speciilor reactive utilizând sisteme enzimatice ca superoxide dismutaza, catalaza, glutathione peroxidaza şi peroxiredoxina. Moleculele mici antioxidante, ca acidul ascorbic (vitamin C), tocopherolul (vitamin E), acidul uric, şi glutathionul, joacă deasemenea, un rol important

ca antioxidanţi celulari. În contrast, capacitatea antioxidantă a spaţiului extracelular este

mult scăzută cel mai important antioxidant prezent la nivel plasmatic fiind acidul uric. Efectele stresului oxidativ depind de mărimea şi intensitatea acestui fenomen astfel ca celulele pot depăşi micile perturbări şi reveni la starea originală. Stresul moderat poate declanşa apoptoza în timp ce oxidarea severă duce la moarte celulara [15].

Pe de alta parte este cunoscut faptul ca hiperhomocisteinemia reprezinta un factor

de risc independent in bolile cardiovasculare, nivelele crescute de homocisteină sunt

asociate cu alterarea functiei epiteliale si riscul trombozei, chiar la concentratii usor crescute fata de nivelele normale [16]. Mecanismul prin care homocisteina determină aceste efecte nu este încă elucidat dar se crede că în acest proces sunt implicate speciile reactive generatoare de radicali liberi. În aceasta etapa a fost studiată influenţa stresului, indus experimenal la sobolan, asupra nivelelor homocisteinei si a parametrii statusului oxidativ.

Stresul a fost indus prin inversarea regimului lumina/intuneric la animalele de experienta.

A fost determinata activitatea intracelulară a superoxid dismutazei (SOD), glutation

peroxidazei (GPx) si capacitatea antioxidantă totală serică (CAT) pentru a evidentia in ce masura stresul este un proces generator de specii reactive. Au fost determinate concentraţiile plasmatice ale homocisteinei pentru a vedea daca exista o corelatie intre cei doi factori de risc stresul si hiperhomocisteinemia.

Mod de lucru

S-a lucrat pe două loturi de 10 sobolani adulţi Wistar, în greutate de 150-200g. Animale din ambele loturi au fost supuse stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric, timp de 15 zile. Cele două loturi au primit hrană diferentiata astfel :

- Lotul I a primit hrană lipsită de acid folic şi vitamina B 12 (alcătuită din mere 5g/100g animal, morcov 5g/100g animal, piine neagra 10g/100g animal şi orz 10g/100g animal), 15 zile, timp in care au fost supuse stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric

- Lotul II a primit hrană standard furaje combinate sub formă de granule (care conţin acid folic 0,5 mg/kg c şi vitamina B 12 10 mg/kg c), 15 zile timp in care au fost supuse stresului prin inversarea regimului lumina/intuneric Pentru determinarea parametrilor stresului oxidativ şi a nivelelor de homocisteină au fost

recoltate probe de sânge înainte şi dupa cele 15 zile cat a durata expunerea animaleleor la stres. Homocisteina totală a fost determinată în plasmă utilizând kituri Diazyme.

A fost determinată activitatea SOD şi GPx în eritocite şi CAT în plasmă utilizand kituri

Randox pentru determinare manuală.

Rezultate şi discuţii

Nivelele de homocisteina determinate înainte şi dupa 15 zile de expunere la stres sunt prezentate in tabelul nr. 4

Tabelul nr 4. Concentratia homocisteinei determinată în plasmă de şobolan înainte şi după 15 zile de expunere la stres

 

Concentratia plasmatica a metioninei (μM/ml)

Inainte de expunerea la stres

Dupa 15 zile de de expunere la stres

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B 12 + expunere la stres timp de 15 zile)

18.21

16.72

Lotul II (alimentatie standard + expunere la stres timp, de 15 zile)

16.80

19.39

Datele din tabelul nr 1 arată că, după 15 zile de expunere la stres, concentraţiile plasmatice ale homocisteinei nu sunt semnificativ modificate fată de momentul initial. In cazul lotului ce a primit hrana standard nivelele plasmatice ale homocisteinei sunt

nesemnificative crescute, deşi ar fi fost de aşteptat ca aportul de vitamina B 12 şi acid folic

in alimentaţie să ducă, cel putin la mentinerea constanta a nivelelor homocisteinei. Datele

obtinute arata ca nu exista o cauzalitate intre stresul acut/semiacut si nivelele serice de homocisteina.

Capacitatea antioxidanta totala determinata în plasma este prezentata în tabelul nr.5

Tabelul nr 5. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan inainte si dupa 15 zile de expunere la stres

Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)

Inainte de expunere la stres

Dupa 15 zile de expunere la stres

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + expunere la stres, timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + expunere la stres timp, de 15 zile)

0.921

0.911

0.933

0.805

Datele obţinuţe arată că la lotul I capacitatea antioxidanta totala nu a suferit modificari, in timp ce la lotul II capacitatea antioxidanta totală a scăzut usor, nesemnificativ statistica, în urma expunerii la stres.

Datele obtinute arata ca nu exista o cauzalitate intre stresul acut/semiacut si nivelele serice de homocisteina, stresul acut/subacut nu determina o diminuarea semnificativă a capacitaţii antioxidante generale.

Activitatea eritrocitară a superoxid dismutazei şi glutation peroxidazei, enzime implicate în anihilarea speciilor reactive generate este prezentata în tabelul 6 respectiv 7.

Tabelul nr 6. Activitatea eritrocitara a superoxid dismutazei determinata la şobolan înainte şi dupa 15zile de expunere la stres

Activitatea superoxid dismutazei (U/ml)

Inainte de expunere la stres

Dupa 15 zile de expunere la stres

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + expunere la stres timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + expunere la stres timp, de 15 zile)

219.08

945.90

211.22

946.22

Datele obţinute arată ca atât la lotul I cât şi la lotul II activitatea SOD creşte în urma expunerii la stres. Creşterea activităţii SOD, enzima implicată în neutralizarea speciilor reactive, indică faptul că expunerea la stress. chiar in situatia in care acesta este acut/subacut determina o mobilizare a sistemelor de aparare antioxidanta impotriova speciilor reactive

Tabelul nr 7. Activitatea eritrocitară a glutation peroxidazei (GPx) determinată la şobolan înainte şi după 15 zile

de expunere la stres

Activitatea glutation peroxidazei (U/L)

Inainte de expunere la stres

Dupa 15 zile de expunere la stres

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + expunere la stres timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + expunere la stres timp, de 15 zile)

67907

40927

68669

49434

Datele obtinute arată ca atât la lotul I cât şi la lotul II activitatea GPx scade în urma expunerii la stres. Glutation peroxidaza este o enzimă implicată în neutralizarea apei oxigenate generate ca urmare a prezenţei radicalilor liberi. Aceasta enzimă utilizează drept cofactor glutationul care este un tripeptid cu rol in reducerea speciilor reactive. Probabil consumarea lui, ca urmare a creşterii concentraţiei radicalilor liberi, duce la diminuarea activităţii enizmei GPx, glutationul funcţionând drept cofactor pentru enzima. Cu alte cuvinte scăderea activitatii GPx indică o diminuare a cantităţii de glutation ca urmare a consumului sporit a acestuia. Datele obtinute arata o mobilizare a sistemelor implicate in apararea antioxidanta. Faptul ca capacitatea totala antioxidanta nu sufera modificari semnificattive poate sugera faptul ca perioada expunerii la stres a fost una moderata ceea ce a facut posibila adaptarea

si nu a epuizat capacitatea totala intracelulara si extracelulara de aparare impotriva speciilor reactive.

Concluzii

Datele obtinute arata ca stresul moderat/ semiacut activeaza sistemele de aparare antioxidanta dar nu modifica semnificativ capacitatea totala antioxidanta. Expunerea la stres acut/subacut nu determina o crestere a nivelelor serice ale homocisteinei.

2.2. Diseminarea rezultatelor:

1. Elena Albu, Cristiana Filip, Nina Zamosteanu, Irina Maria Jaba, Nastasia Gheorghita, Luminita Jerca, O.C. Mungiu, The influence of the experimental stress on homocysteine plasma levels in rat, Terapeutics, Pharmacology and Clinical Toxicology, 2009, INDEX COPERNICUS, http://www.terapeutica.ro/,

2. Elena Albu, Cristiana Filip, Nina Zamosteanu, Irina Maria Jaba, Nastasia Gheorghita, Luminita Jerca, O.C. Mungiu, Investigation of correlation stress hyperhomocysteinemia , in rat, Terapeutics, Pharmacology and Clinical Toxicology, 2009, INDEX COPERNICUS, http://www.terapeutica.ro/,

3. DETERMINAREA NIVELELOR PLASMATICE DE HOMOCISTEINA IN DIFERITE PROCESE PATOLOGICE INDUSE EXPERIMENTAL LA ANIMALE DE LABORATOR

Activităţi:

3.1. Inducerea experimentala a hiperhomocisteinemiei – determinarea nivelelor plasmatice de homocisteina, parametrii biologici si ai parametrii stresului oxidativ

In ultima perioadă s-au acumulat dovezile privind faptul că nivelele crescute de homocisteină sunt asociate cu riscul trombozei şi al bolilor cardiovasculare.[17-23 ]. Homocisteina provine în organism din metabolizarea metioninei, aminoacid esential, metabolizare strict dependenta de o serie de vitamine: B 6 , B 12 , acid folic. Orice deficit genetic sau un aport alimentar deficitar al vitaminelor amintite duce la diminuarea/blocarea metabolizarii metioninei şi acumularea de homocisteină. Deşi legătura directă între nivelele crescute de homocisteina şi riscul trombozei şi al bolilor cardiovasculare nu a fost elucidata, se consideră că un posibil mecanism pentru leziunile produse de homocisteina asupra endoteliului vascular ar putea fi legat de creşterea stresului oxidativ [24-27 ]. In aceasta etapa a fost studiată influenţa hiperhomocisteinemiei asupra parametrilor stresului oxidativ la animale de experienta. Pentru aceasta a fost indusă experimental hiperhomocisteinemia prin administrarea de metionină şi s-a determinat concentratia plasmatica a homocisteinei. Pentru investigarea parametrilor stresului oxidativ au fost determinate activitatea sistemelor enzimatice intracelulare superoxid dismutaza (SOD), glutation peroxidaza (GPx) şi capacitataea antioxidantă totală serica (CAT).

Mod de lucru

S-a lucrat pe două loturi de 10 sobolani adulţi Wistar, în greutate de 150-200g. Animalelor din ambele loturi le-a fost indusă hiperhomocisteinemia prin administrare de

metionină 2g/kg c per os prin sondă endogastrică în doză unică, timp de 15 zile. Cele două loturi au primit hrană diferentiata astfel :

- Lotul I a primit hrană lipsită de acid folic şi vitamina B 12 (alcătuită din mere 5g/100g animal, morcov 5g/100g animal, piine neagra 10g/100g animal şi orz 10g/100g animal) şi metionina 2g/kg c per os, 15 zile.

- Lotul II a primit hrană standard furaje combinate sub formă de granule (care conţin

acid folic 0,5 mg/kg c şi vitamina B 12 10 mg/kg c) şi metionină 2g/kg c per os, 15 zile. Pentru determinarea parametrilor stresului oxidativ şi a nivelelor de homocisteină au fost recoltate probe de sânge înainte şi la 15 zile după administrarea acesteia. Homocisteina

totală a fost determinată în plasmă utilizând kituri Diazyme.

A fost determinată activitatea SOD şi GPx în eritocite şi CAT în plasmă utilizand kituri

Randox pentru determinare manuală.

Rezultate şi discuţii

Nivelele de homocisteina determinate înainte şi la 15 zile după administrarea metioninei sunt prezentate in tabelul nr. 8

Tabelul nr 8. Concentratia homocisteinei determinată în plasmă de şobolan înainte şi după 15 zile de administrare a metioninei

Concentratia plasmatica a metioninei (μM/ml)

Inainte de administrare a metioninei

Dupa 15 zile de administrare de metionina

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B 12 + metionină 2g/kgc.p.o. doza unica, timp de 15 zile) Lotul II (alimentatie standard + metionină 2g/kg c. p.o. doza unică timp, de 15 zile)

16.3

>50

14.28

>50

Datele din tabelul nr 8 arată că, aşa cum era de aşteptat, după 15 zile de administrare a metioninei concentraţiile plasmatice ale homocisteinei sunt semnificativ statistic crescute fată de momentul initial,

confirmându-se modelul de hiperhomocisteinemie indusă experimental. Nivelele plasmatice ale homocisteinei sunt la fel de mari în cazul lotului ce a primit hrana standard ca şi in cazul lotului care a fost supus carenţei vitaminice, deşi ar fi fost de aşteptat ca aportul de vitamina B 12 şi acid folic in alimentaţie să ducă la scăderea nivelelor homocisteinei. Este cunoscut faptul că una din metodele terapeutice de scădere a nivelelor de homocisteina la subiecţii umani este tocmai aportul unei cantităţi adecvate

de vitamine, dar se pare ca în cazul animalelor de experienţă carenţa vitaminică nu pare a

fi implicată în instalarea hiperhomocisteinemiei. Acest fenomen face ca modelul experimental să nu fie dependent de tipul de alimentaţie şi, astfel, reproductibil în conditii experimentale diverse.

Capacitatea antioxidanta totala determinata în plasma este prezentata în tabelul nr.9

Tabelul nr9. Capacitatea antioxidanta totala (CAT) determinata in plasma de sobolan inainte si dupa 15 zile de administrare a metioninei

Capacitatea antioxidanta totala (mM/L)

Inainte de administrare a metioninei

Dupa 15 zile de administrare de metionina

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + metionină 2g/kgc.p.o. doza unica, timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + metionină 2g/kg c. p.o. doza unică timp, de 15 zile)

0.908

0.760

0.897

0.756

Datele obţinuţe arată că atât la lotul I cat şi la lotul II capacitatea antioxidanta totală a scăzut în urma administrării metioninei. Aceasta indică faptul că în urma instalării hiperhomocisteinemiei nivelul speciilor reactive a crescut ducând la diminuarea semnificativă a capacitaţii antioxidante generale.

Activitatea eritrocitară a superoxid dismutazei şi glutation peroxidazei, enzime

implicate în anihilarea speciilor reactive generate este prezentata în tabelul 10 respectiv

11.

Tabelul nr 10. Activitatea eritrocitara a superoxid dismutazei determinata la şobolan înainte şi dupa 15zile de administrare a metioninei

Activitatea superoxid dismutazei (U/ml)

Inainte de administrare a metioninei

Dupa 15 zile de administrare de metionina

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + metionină 2g/kgc.p.o. doza unica, timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + metionină 2g/kg c. p.o. doza unică timp, de 15 zile)

202.88

944.7

195.30

945.7

Datele obţinute arată ca atât la lotul I cât şi la lotul II activitatea SOD creşte în urma administrării metioninei. Creşterea activităţii SOD, enzima implicată în neutralizarea speciilor reactive, indică faptul că hiperhomocisteinemia determină o creştere a nivelelor speciilor reactive. Nivelele ridicate ale activitătii SOD se coreleaza astfel cu capacitatea totală antioxidanta scăzuta cauzată de creşterea radicalilor peroxidici.

Tabelul nr 11. Activitatea eritrocitară a glutation peroxidazei (GPx) determinată la şobolan înainte şi după 15 zile de administrare a metioninei

Activitatea glutation peroxidazei (U/L)

Inainte de administrare a metioninei

Dupa 15 zile de administrare de metionină

Lotul I (alimentatie carenţată în acid folic şi vitamina B12 + metionină 2g/kgc.p.o. doza unica, timp de 15 zile) Lotul I I (alimentatie standard + metionină 2g/kg c. p.o. doza unică timp, de 15 zile)

60211

34259

64254

39835

Datele obtinute arată ca atât la lotul I cât şi la lotul II activitatea GPx scade în urma administrării metioninei. Glutation peroxidaza este o enzimă implicată în neutralizarea apei oxigenate generate ca urmare a prezenţei radicalilor liberi. Aceasta enzimă utilizează drept cofactor glutationul care este un tripeptid cu rol in reducerea speciilor reactive. Consumarea lui ca urmare a creşterii concentraţiei radicalilor liberi duce la diminuarea activităţii enizmei GPx, glutationul funcţionând drept cofactor pentru enzima. Cu alte cuvinte scăderea activitatii GPx indică o diminuare a cantităţii de glutation ca urmare a consumului sporit a acestuia. Rezultatele obţinute confirmă diminuarea CAT, glutationul fiind unul dintre factorii neenzimatici implicaţi în neutralizarea radicalilor liberi.

Concluzii Administrarea de metionină permite realizarea unui model reproductibil de hiperhomocisteinemie. Alimentaţia lipsită de vitamine administrată şobolanilor nu pare să influenţeaze modelul experimental, probabil datorită unor particularităţi metabolice ale animalelor de experienţă, diferite de cele umane. Capacitatea totală intracelulară cât şi cea plasmatică a sistemelor implicate în apararea antioxidantă celulară scad semnificativ ca urmare a instalării hiperhomocisteinemiei.

3.2 Diseminarea rezultatelor

1. C.Filip, E. Albu, N.Zamosteanu, L. Jerca, N. Gheorghita, I.M. Jaba, A. Negru, O.C.Mungiu, - Investigarea parametrilor stresului oxidativ in hiperhomocisteinemia provocata experimental la şobolan – Medicina Modernă, vol. XVI. Sp nr.1, 2009

2. FilipC., Albu E.,Zamosteanu N., Jaba I.M., Jaba I.M, Silion M, Gheorghita N., Mungiu O.C. Hyperhomocysteinemia effect's on antioxidant capacity, in rats - acceptata spre publicare in Central European Journal - manuscript number:

CEJMED-D-09-00016.

BIBLIOGRAFIE :

1.

(2003)

2.

Willy J. Malaisse. Alloxan toxicity to the pancreatic B-cell : A new hypothesis, Biochemical Pharmacology, Volume 31, Issue 22, 15 November 1982, Pages

3527-3534

3.

Aug;28(8):1185-90.

4.

4. Hidaka S, Yoshimatsu H, Kondou S, Tsuruta Y, Oka K, Noguchi H, Okamoto K, Sakino H, Teshima Y, Okeda T, Sakata, Chronic central leptin infusion restores hyperglycemia independent of food intake and insulin level in streptozotocin-induced diabetic rats., T FASEB J. 2002 Apr;16(6):509-18.

5.

Oct;84(5):728-36.

6.

6. Ferraz M, Brunaldi K, Oliveira CE, Bazotte RB.,Hepatic glucose production from L-alanine is absent in perfused liver of diabetic rats., Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 1997 Feb;95(2):147-55.

7.

McCully K, Wilson R. Homocysteine theory of arteriosclerosis. Atherosclerosis

1975;22:215–227.

8.

Starkekbaum G, Harlan J. Endothelial cell injury due to copper-catalyzed hydrogen peroxide generation from homocysteine. J Clin Invest 1986;77:1370–

1376.

9.

Stamler J, Loscallzo J. Endothelium-derived relaxing factor modulates the atherothrombogenic effects of homocysteine. J Cardiol Pharmacol

1992;20:S202–S204.

10.

Stamler J, Osborne J, Jaraki O. et al. Adverse vascular effects of homocysteine are modulated by endothelium-derived relaxing factor and related oxides of nitrogen. J Clin Invest 1993;91:308–318.

11.

Upchurch GJ, Welch G, Loscalzo J. Homocysteine EDRF and endothelial function. J Nutr 1996;126:1290S–1294S

12.

Upchurch GJ, Welch G, Fabian A. et al. Homocyst(e)ine decreases bioavailable nitric oxide by a mechanism involving glutathione peroxidase. J Biol Chem

1997;272:17012–17017.

13.

Kanani PM, Sinkey CA, Browning RL. et al. Role of oxidant stress in endothelial dysfunction produced by experimental hyperhomocyst(e)inemia in humans. Circulation 1999;100:1161–1168.

14.

Topol G, Brunet A, Millanvoye E. et al. Homocysteine induces oxidative stress by uncoupling of NO synthase through reduction of tetrahydrobiopterin. Free Radic Biol Med 2004;36:1532–1541.

16. Fiona Wotherspoon , David W Laight, Kenneth M Shaw Michael H Cummings, Review: Homocysteine, endothelial dysfunction and oxidative stress in type 1 diabetes mellitus, The British Journal of Diabetes & Vascular Disease, Vol. 3, No. 5, 334-340 (2003)

17. Wu L, Wu J, Hunt S. et al. Plasma homocyst(e)ine as a risk factor for early

familial coronary artery disease. Clin Chem 1994;40:552–561. 18. Dalery K, Lussier-Cacan S, Selhub J. et al. Homocysteine and coronary artery

disease in French Canadian subjects: relation with vitamins B 12 , B 6 , pyridoxal phosphate, and folate. Am J Cardiol 1995;75:1107–1111.

19. Verhoef P, Stampfer M, Buring J. et al. Homocysteine metabolism and risk of

myocardial infarction: relation with vitamins B 6 , B 12 and folate. Am J Epidemiol

1996;143:845–859.

20. Verhoef P, Kok F, Kruyssen D. et al. Plasma total homocysteine, B vitamins, and risk of coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:989–995.

21. Robinson K, Arheart K, Refsum H. et al. for the European COMAC Group. Low

circulating folate and vitamin B6 concentrations. Risk factors for stroke, peripheral vascular disease, and coronary artery disease. Circulation

1998;97:437–443.

22. McCully K, Ragsdale B. Production of arteriosclerosis by homocysteinemia. Am J Pathol 1970;61:1–8.

23. Harker L, Harian J, Ross R. Effect of sulfinpyrazone on homocysteine-induced endothelial injury and arteriosclerosis in baboons. Circ Res 1983;53:731–739.

24. Weiss N. Mechanisms of increased vascular oxidant stress in hyperhomocysteinemia and its impact on endothelial function. Curr Drug Metab

2005;6:27–36.

25. Schafer FQ, Buettner GR (2001). "Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple". Free Radic. Biol. Med. 30 (11): 1191–212

26. Lennon

apoptosis in human tumour cell lines by widely diverging stimuli". Cell Prolif. 24 (2): 203–14. 27. Boyce, N, Oxidative Stress Testing: A New Addition to Lab Menus? Clin. Lab

SV,

Martin

SJ,

Cotter

TG

(1991).

"Dose-dependent

induction

of

News 23:1-2 (1997).