Sunteți pe pagina 1din 50

CURSURI ANALIZA MEDICAMENTULUI

CURS 1 07.10.2013
Calitatea medicamentului

Structura organizatorica ANM


Departamentul de materii prime si produse finite
Analize fizico-chimice medicamente, forme farmaceutice si substante;
Laborator de toxicologie;
Laborator de imunogenitate si anatomie patologica;
Laborator de microbiologie;
Unitate nucleara;
Biobaza.
Departamentul de inspectie farmaceutica
Se ocupa cu inspectia in industria medicamentului;
Servicii de inspectie privind regulile de buna practica de fabricatie;
Servicii de inspectie privind regulile de buna practica de studii clinice;
Probleme de farmacovigilenta;
Serviciul de primire a probelor si de certificare a acestora;
Serviciul de supraveghere a medicamentului si de alertare;
Serviciul de inspectie in unitatile de distributie en-gros;
Unitatile teritoriale de inspectie (UTI) UTI fac inspectia in farmacie si preleveaza probe pe care le trimit ulterior
la ANM Bucuresti pt analiza.
ANM infiintata in 1998, functioneaza ca insitutie de sine statatoare incepand din 1 ianurie 1999;
Este subordonata MS si constituie domeniul politicii statului in privinta controlului medicamentului si a altor
produse de tip uman;
Productia, importul, distributia si utilizarea medicamentelor in Romania sunt admise numai dupa ce au fost
autorizate si inregistrate de ANM;
Autorizarea = eliberarea certificatelor de autorizare (APP) autorizatia de punere pe piata;
Elaboreaza FR si o armonizeaza la cea europeana (RO a aderat la conventia privind EP, ceea ce o inseamna ca
prevederile EP privind standardele de calitate sunt olbigatorii pt toate medicamentele de uz uman sau veterinar,
de import de fabricatie...
Analiza medicamentului se face si la nivel de industrie (de producator);
Analiza materiei prime, a produsului finit si a produsilor intermediari la nivel de industrie;
Analiza si controlul medicamentului se face si la nivelul unor laboratoare autorizate de ANM (la nivel de
universitati sau laboratoare private autorizate de ANM);
Analiza de buna practica de laborator se face in conformitate cu:
Monografii din FRX sau EP (identificare, dozare, puritate);
Specificatii tehnice;
Stassuri.

Specificatii tehnice:
Generalitati carui tip de forma farmaceutica apartine calea de administrat, grupa terapeutica, compozitia unui
comprimat;
Conditii tehnice proprietati fizico-chimice (aspect, diametru, culoare, gust, uniformitatea masei, testul de
dizolvare, dozare etc.)

Reguli pt verificarea calitatii (cf FRX)


Metode de analiza control organoleptic;
Ambalare, depozitare, transport;
Garantii termen de valabilitate.

Etape in analiza medicamentului


Prelevarea probelor (pentru determinari cantitative si calitative)
Serie = totalitatea unitatilor de produs care au fost obtinute in conditii identice intr-un singur ciclu de operatii;
Lot = cantitatea de materie prima presupusa a fi unitara din care se obtin unul sau mai multe serii de produs;
Proba trebuie sa reprezinte sub toate aspectele caracteristice produsului prelevat din lot sau seria respective;
Unitatile de produs se introduc in ambalaje primare sau secundare.

Prelevarea probelor dintr-un lot


1. Produsele lichide se omogenizeaza, in prealabil, prin agitare dupa care se face o prelevare.
Daca lotul este repartizat in mai multe recipiente, se face prelevarea (analiza) din fiecare recipient.

2. Produsele solide (moi, vascoase) se preleveaza o proba din stratul inferior, mijlociu, superior.
Aceste 3 probe prelevate se amesteca intre ele si reprezinta proba medie pe recipient;
Din aceasta proba medie pe recipient se retine o cantitate de 4 ori mai mare decat cantitatea necesara
efectuarii tuturor analizelor (identificare, puritate, dozare, analiza formei farmaceutice conf FRX);
Aceasta cantitate se imparte in 2: este destinata efectuarii analizelor mentionate si reprezinta contraproba
(se pastreaza pe toata perioada de valabilitate a produsului respectiv;
In procesul de prelevare a probelor se evita interactiunea intre produsul analizat si ustensilele necesare analizei;
Probele si contraprobele se introduc in flacoane (perfect uscate, etanse si daca este cazul pentru cele
fotosensibile in flacoane inchise la culoare).
3. Produsele vegetale se introduc in pungi sau cutii captusite cu hartie pergaminata;
Probele si contraprobele se sigileaza si pe eticheta se specifica:
Denumirea produsului;
Nr lotului;
Provenienta;
Calitatea prelevata;
Nr. Procesului verba prin care s-a facut prelevarea;
Data la care s-a facut prelevarea;
Persoana care a facut prelevarea;
Semnatura.
Prelevarea probelor dintr-o serie
Se face din recipienti a.i. proba respectiva sa fie reprezentativa pt intreaga serie;
2

Conditiile sunt stabilite de producator conform legislatiei in vigoare din aceste probe prelevate se retine o
cantitate de 3 ori mai mare decat cea necesara efectuarii analizelor conform FRX;
2/3 din aceasta cantitate reprezinta proba si 1/3 contraproba care se pastreaza pe toata durata de valabilitate a
produsului respectiv.
Prelevarea de probe din farmacii/depozite
Se preleveaza o cantitate de substanta de analizat proces verbal de scadere din gestiune;
Reactiile de identificare la masa de analizat reactii calitative;
Masa de analiza este totata cu reactivi necesari analizelor calitative conform prevederilor FRX.
Prelevari de probe din laborator
Se preleveaza o cantitate de 3 ori mai mare decat cantitatea necesara efectuarii tuturor analizelor;
2/3 sunt destinate analizei si 1/3 reprezinta contraproba care se pastreaza pe toata durata de valabilitate a
produsului repspectiv.

Prelevari de probe in industria medicamentuli


- Se preleveaza o cantiate de 3 ori mai mare decat cantitatea necesara efectuarii tuturor analizelor;
- 2/3 reprezinta proba de analizat si 1/3 contraproba care se pastreaza pe toata durata de valabilitate a
produsului respectiv;
- Probele se eticheteaza, se sigileaza si pe eticheta se scrie: denumirea substantei, data, cantitatea prelevata,
procesul verbal si semnatura.

Medicamentul
Orice substanta sau combinatie de substanta prezentata ca avand proprietati pentru tratarea bolilor la om;
Orice substanta sau combinatie de substante folosita sau administrate la om pentru corectarea, restabilirea sau
modificarea functiilor fiziologice sau pentru stabilirea unui diagnostic medical.

Substanta orice materie indiferent de origine (umana, animala, vegetala, chimica) si care este utilizata in vederea
obtinerii de medicamente.
Substante de uz farmaceutic (de origine organica sau anorganica)
- Definite in suplimentele FRX sa sau excipienti folosite in scopul obtinerii de medicamente de uz uman sau
veterinar;
- Se obtin prin sinteza, extractie, fermentatie sau natural.

Substante de uz farmaceutic de calitate speciala


Obtinerea de forme farmaceutice prevazute in FRX, cu exceptia cazurilor in care se mentioneaza ca nu se pot
utiliza;
Medimente imunologice: vaccinuri.
Reguli de buna practica de lab (BPL)
Au fost stabilite prin 2 hotarari nr 63/24.01.2002 ulterior completata cu hotararea nr 266/22.02.2006
Principiile se bazeaza pe reglementari internationale si anume Organizarea pt cooperare si dezvoltare
economica (OCDE)
Au stabilite reguli de BPL
Regulile privind etichetarea, ambalarea sunt aplicate tuturor substantelor;

Sunt definite :
Preparatele chmice;
Modul in care se efectueaza testele clinice sau nonclinice etc
In Romania autoritatea e ANM
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Principii care stau la baza bunei practici de lab;


Organizarea si personalul instalatiei de testare;
Programul de asigurare a calitatii;
Instalatiile de laborator;
Aparatele. Materialele. Reactivii;
Sisteme de testare (chimice, biologice);
Substante chimice testate (SCT)/referinta (SCR);
Metode standard de studii in laborator;
Planul de studiu in laborator;
Cum se introduce raportul in laborator;
Stocarea si pastrarea materiei si arhivei.

CURS 2 14.10.2013
Stabilitatea medicamentului
Principii generale
- Niciodata nu a existat ceva facut de mana omului, care sa fie atat de bine elaborat sau atat de bine stabilit incat
sa fie nedegradabil odata cu trecerea timpului... Thomas Cranmer
- Tot ce este facut de mainile omului de la sublimul Parthenon la uzualul milkshake este supus degradarii.
Produsele farmaceutice nu fac exceptie de la aceasta afirmatie generala. Daca exista un atribut relevant al
calitatii unui produs medicamentos care sufera modificari odata cu timpul, evaluarea acestei modificari face
obiectul oamenilor de stiinta si a celor ce impun normele in industria medicamentului, cuantificand stabilitatea.
- Timpul in care produsele medicamentoase se degradeaza variaza puternic. Unele produse farmaceutice
radioactive trebuie folosite in interval de 1-2 zile. Alte produse farmaceutice, pe de alta parte, daca sunt
depozitate si conditionate corespunzator isi mentin stabilitatea pentru un deceniu sau chiar mai mult, desi, in
multe state, durata maxima de viata pe care o va aproba o agentie de reglementare a normelor este de 5 ani.
(Aceasta restrictie nu cauzeaza in general probleme, avand in vedere ca si pentru produsele cu durata de viata
de 5 ani este probabil ca peste 95% din produs sa fie vandut si folost in treizeci de luni de la fabricatie, cu
conditia ca toti cei implicati sa asculte prima regula a depozitarii: primul intrat, primul iesit).
- De vreme ce evaluarea stabilitatii unui produs medicamentos este foarte elaborata, nu se pune accentul pe
testarea organoleptica a produsului de catre pacient. Astfel, guvernele din mai multe parti ale lumii in special
din Vestul Europei, America de Nord si Japonia au decis ca este necesara instituirea obligatorie a testarii
stabilitatii datorita grijilor ridicate de siguranta, eficacitatea si calitatea produsului medicamentos. Totusi,
trebuie sa luam in considerare ca diverse companii reputabile acordau atentie stabilitatii medicamentelor si luau
masurile care se cuveneau inainte de implicarea activa a guvernului.

Inactivarea substantei medicamentoase


Evident, pierderea s.m. este de o importanta majora in studiile de stabilitate ale multor produse farmaceutice.
Din pacate, avem impresia ca unii oameni iau in considerare acest lucru doar cand se gandesc la efectele
4

adverse ale stabilitatii produsului medicamentos. Acest lucru este in mod evident neadevarat, iar pentru unele
produse inactivarea nu este factorul determinant al perioadei de valabilitate. Totusi, este adevarat ca pentru
multe produse, pierderea potentei este de o importanta majora. In general, privim orice produs care contine
mai putin de 90% din cantitatea de s.m. mentionata pe prospect ca fiind de calitate inacceptabila.

Medicamentul in canalele de distributie


Nu este suficient sa avem grija de stabilitatea produsului medicamentos numai prin calitatea substantei pure a
materialului proaspat preparat, pe care il privim cu incredere in timp ce acesta asteapta in depozit pentru
distributie, dupa ce a fost scos din carantina de catre Departamentul Controlului Calitatii/ Asigurarii calitatii.
Totusi, evaluarea probelor, care au fost depozitate in conditii ideale in conele de depozitare pentru testarea
stabilitatii ale fabricantului sunt de valoare limitata. Probele retinute pentru testarea stabilitatii nu sunt scapate
pe jos dintr-un camion; nu sunt lasate in soare intr-un spatiu de incarcare; nici nu sunt lasate in frig puternic;
astfel, este destul de nepotrivit sa ne asteptam ca probele de stabilitate sa reflecte cu acuratete intervalul de
stabilitate al produselor aflate in canalele de distributie.
Medicamentul sub controlul pacientului
Exista motive temeinice sa credem ca, in multe cazuri, conditiile in care pacientii pastreaza medicamentele sunt
departe de a fi optime. La un anumit moment, autoritatile din domeniu luau in considerare posibilitatea de a
introduce termene de valabilitate obligatorii, care sa garanteze eficacitatea, pana cand pacientul foloseste
ultima doza din produs. Acum este general acceptat faptul ca aceasta idee nu este fezabila. Se cuvine, totusi, ca
farmacistii sa isi faca timp sa consilieze pacientii asupra modurilor adecvate de depozitare a medicamentelor.
Stabilitatea in vivo
Ultimul aspect al stabilitatii care ne preocupa este degradarea medicamentului in-vivo. Mai exact, hidroliza
medicamentului in conditiile scazute de pH din stomac pot fi foarte serioase. Raspunsul traditional la aceasta
problema particulara este sa acoperim tabletele cu pelicule gastrorezistente. In trecut, materialele folosite ca
pelicule gastrorezistente nu erau totdeauna eficiente. Polimerii disponibili la ora actuala pentru pelicelel
gastrorezistente sunt mult mai de incredere.
Cerintele institutiilor care reglementeaza piata farmaceutica
In multe parti ale lumii, exista cerinte in ceea ce priveste testarea stabilitatii, cerinte impuse de institutiile care
reglementeaza piata farmaceutica. Este totusi gresit sa nu luam in calcul aspectele stiintifice particulare si sa
efectuam doar acele teste obligatorii. Intr-adevar, exista cazuri in care orice producator, cu o adevarata
inclinatie catre calitate, va efectua teste de stabilitate care sunt cu mult peste testele obligatorii.
Crearea unei baze de date care poate fi de folos in formularea altor produse
Datele obtinute in evaluarea stabilitatii produsului X in anul 1999 se pot dovedi a fi de folos cand vom incepe
dezvoltarea produsului Y, in anul 2003. Pot exista situatii, desi probabil sunt rare, cand se va merita sa
continuam testarea stabilitatii in perioada de cercetare si dezvoltare a formularii unui produs medicamentos,
desi stim ca acesta nu va fi comercializat, doar pentru ca suntem interesati de stabilitatea unui nou excipient pe
care l-am introdus in formulare.
Tipuri de degradare
Degradarea chimica (reducere, oxidare, hidroliza etc.) este des intalnita. Cunostintele de cinetica ne pot fi de
folos cand avem de-a face cu degradarea chimica.

Degradarea fizica poate fi cauzata de o varietate de factori (de exemplu: impact, vibratie, abraziune, fluctuatii de
temperatura precum inghetarea sau topirea si fragmentarea).
Degradarea biologica (si, mai ales, microbiologica) In America de Nord, Japonia si Europa de Vest, cei mai
intalniti factori biologici care sunt implicati in problemele de stabilitate sunt cei microbiologici. Totusi, in unele
parti ale lumii, sobolanii, viermii, mustele si alte organisme non-microbiologice pot fi responsabile pentru
problemele de stabilitate.
Cunostinte stiintifice solide
Nu mai este nevoie sa precizam ca testarea stabilitatii produselor medicamentoase necesita o cunoastere
corespunzatoare a formularii farmaceutice, evaluarii, analizei si statisticii. Din pacate, inca mai sunt companii
unde personalul cu o astfel de educatie corespunzatoare lipseste.
Cunostinte la zi cu toate normele relevante ale institutiilor care reglementeaza piata farmaceutica si cu
standardele aplicate ale Farmacopeei:
Reglementarile oficiale si metodele standard de testare continua sa evolueze. Astfel, este important ca cel putin
o persoana din fiecare companie sa fie insarcinata cu responsabilitatea de a pastra documente la zi asupra
datelor de la FDA si Conventia Farmacopeei USA sau de la alte astfel de entitati, pentru ca ar putea avea un
efect semnficativ asupra designului, executiei, sau interpretarii testelor de stabilitate. Folosirea forumului
farmacopeei, jurnalul in care conventia Farmacopeei SUA publica informatii esentiale despre metode sau
monografii noi de testare, ar trebui sa fie obligatorie in toate companiile in care standardele sunt importante.
Comunicarea eficienta intra statia pilor, productie, controlul calitatii/evaluarea calitatii, reclamatii si diferite
reglementari:
Pentru a avea un program de succes de testare a stabilitatii, este important sa existe o comunicare clara, eficare
si rapida intre toate entitatile organizatorice dintr-o companie, care pot furniza date folositoare in programul de
stabilitate.
Monitorizarea atenta a bugetului alocat stabilitatii medicamentului
Este surprinzator ca unele companii nu au un buget de stabilitate. Este si mai surprinzator sa aflam ca exista
oameni de stiinta care dezvolta protocoalele de stabilitate pe baza exclusiva a diferentei de pret. Nu este usor sa
elaboram un mecanism pentru evitarea unui buget de stabilitate despre care putem spune cu siguranta ca ne va
costa o suma fixa de bani. Totusi, desi suma estimata este relativa, poate fi totusi foarte folositoare.
Abilitatile manageriale pentru a coordona si optimiza programul
Piatra de capatai a unui program de stabilitate cost-eficienta de inalta performanta o constituie abilitatile
manageriale care promoveaza si coordoneaza abilitatile personale si profesionale ale tuturor celor implicati in
program.
Perioada de conformitate, termenul de valabilitate si data de expirare
Perioada de conformitate a unui produs medicamentos este definita de cele mai vulnerabile calitati dependente
de timp. Dupa cum a fost indicat si mai devreme, pierderea activitatii este pentru multe produse, parametrul
critic. In acele cazuri in care alte atribute sunt mai vulnerabile, atributul in cauza va defini perioada de
conformitate.
Perioada de viata atribuita unui produs este egala sau mai mica decat perioada de conformitate, fiind de obicei
un numar rotunjit convenabil.

Data de expirare plasata pe eticheta oricarui lot indica data la care ia sfarsit perioada de viata pentru fiecare lot.
Astfel, daca produsul este depozitat conform instructiunilor de pe eticheta, se asteapta ca produsul in cauza sa
isi pastreze valabilitatea pana la acea data.
Cateva strategii posibile pentru a imbunatati termenul de valabilitate
Din fericire, multe substante medicamentoase si produse sunt inerent stabile si, astfel, cu putina dificultate
putem justifica o perioada de valabilitate de 3 ani sau mai mult. Totusi, exista s.m. care sunt mult mai supuse
degradarii este nevoie de multa munca pentru a dezvolta un produs cu o perioada de viata comerciala
acceptabila.
Oxidarea in solutie
Reactiile de oxidare sunt relativ rare in formele farmaceutice, ca reactii principale. De cele mai multe ori
oxidarea duce la canitati mici de compusi de degradare neidentificate. Cand o reactie de oxidare este una dintre
reactiile principale, atunci avem de-a face cu o problema serioasa, iar formularea poate deveni destul de dificila
in acest caz. Exemple notabile sunt constituite de produsele lichide cu vitamina A.
Mecanisme de oxidare
Oxidarea, dupa cum sugereaza si numele, este o interactiune intre s.m., A si oxigenul, iar reactia ar fi de tipul:
A + O2 -> produsi;
In practica, complexarea metalelor grele (de ex, prin folosirea EDTA), este adesea folosita de vreme ce, dupa
cum am vazut si mai devreme, ionii metalici actioneaza in detrimentul stabilitatii medicamentului, in ceea ce
priveste situatiile oxidative.
Antioxidanti
Functioneaza prin consumptia de oxigen la o viteza mai mare decat viteza la care s.m. reactioneaza cu oxigenul;
in astfel de cazuri acestia vor proteja s.m. pana ce sunt epuizati complet.
Cataliza, complexare, fotoliza
Cataliza acida si bazica, constituie doar un exemplu de cataliza. Cand discutam despre acest subiect, totusi
descompunerea indusa de metal este preocuparea cercetatorului din industria farmaceutica. Se pune un mare
accent pe eliminarea metalelor, mai ales in produsele parenterale, deoarece si descompuneri infime ale urmelor
de metale pot cauza o schimbare a culorii, incat produsul sa devina nesatisfacator. Exemple pentru acest caz
sunt injectabilele cu clorhidrat de tiamina si cele cu acid ascorbic.
Complexarea este evident ca, in multe cazuri, medicamentele pot contribui la reactii de complexare cu una
sau mai multe din substantele unei forme farmaceutice. Uneori aceste lucruri sunt intentionate
biodisponibilitatea in anumite cazuri poate fi imbunatatita. In alte cazuri, stabilitatea unui medicament este
afectat favorabil de complexare, desi in multe cazuri este afectata nefavorabil.
Agentii de complexare cafeina si pilivinilpirolidona erau cei mai intalniti agenti de complexare folositi in
farmaceutica pentru o mare perioada de timp. Recent, ciclodextrinele au devenit foarte importante.
Ciclodextrinele sunt agenti puternici de complexare, studii numeroase fiind efectuate pe tema folosirii acestora
in solubilizarea si stabilizarea medicamentelor.
Fotoliza un mare accent in Codul de Buna Practica din 1993 este pus pe stabilitatea in prezenta luminii, desi la
acest moment, metodele de testare nu sunt finalizate.
7

Stabilitatea pentru starea de agregare solida stabilitatea medicamentelor din formele farmaceutice solide este
cea mai importanta, de vreme ce formele farmaceutice solide sunt mai intalnite decat alte forme si pentru ca
primele probe clinice sunt de obicei efectuate asupra acestui tip.
Interactiuni ce implica o faza lichida
Uneori, o s.a. sau un produs de descompunere dintr-o forma farmaceutica solida este lichid si poate
interactiona cu alte ingrediente din forma farmaceutica. Un exemplu tipic il constituie cercetarile efectuate de
Troup si Mitchner (1964) ce implica aspirina si fenilefrina. Autorii au aratat ca descompunerea fenilefrinei este
direct proportionala cu formarea acidului salicilic. Acestia au aratat ca descompunerea fenilefrinei este o reactie
de acetilare. Acest lucru poate fi privit din mai multe perspective. Trebuie sa existe umiditate pentru ca hidroliza
aspirinei sa aiba loc. Daca acidul saliclic este format prin interactiunea aspirinei cu urme de apa, atunci acidul
acetic forma poate reactiona cu fenilefrina (R(OH)3), care pune din nou in libertate apa, astfel incat umiditatea
nu joaca un rol cantitativ in reactia globala. Cu alte cuvinte:
C6C4(OCOCH3) +H2O -> C6H4(OH)COOH + CH3COOH;
CH3COOH + 1/3R(OH)3 -> 1/3 R(OCOCH3)3 + H2O
C6H4

Cazuri de interactiune ale unui solid cu un medicament putin solubil


Exista cazuri in care lichidele se afla intr-o forma farmaceutica solida. Un exemplu il constituie pantenolul in
complimatele de multivitamine. Aici se obisnuieste sa se adsoarba lichidul pe un transportor solid, iar in cazul
pantenolului este folosit trislicat de magneziu. La temperaturi ridicate (si la temperatura camerei sub presiune,
de asemenea) pantenolul va iesi din transportor si va veni in contact direct cu celelalte solide. Daca exista
potentiale de interactiune, atunci se recurge la tabletarea tristratificata (sau filmarea sub presiune). In acest caz,
lichidul inca va mai curge in stratul ce contine reactantul, dar reactia va fi controlata prin difuzie.
Reactii prin intermediul fazei gazoase
Cateodata presiunea de vapori a unui medicament este suficient de ridicata, incat poate interactiona cu alte
substante prin intermediul fazei de vapori. Un astfel de exemplu este ibuprofenul (B). Acesta este un acid Lewis
si poate interactiona cu bazele Lewis. Masurile uzuale, cum ar fi comprimatele tristratificate, nu functioneaza in
acest caz, de vreme ce reactantul va fi prezent in faza gazoasa.
Daca reactia cu alt medicament (D) este: D+B->descompunere, atunci viteza reactiei initiale este data de
d{D}/dt=-kPB[D]a
Unde {D} este densitatea de suprafata a D molecule (nr de molecule pe cm patrat) la momentul t, iar A este aria
suprafetei.
Fotoliza in stare solida
Nu exista un volum mare de munca sistematizat pe subiectul fotolizei solidelor. Lachman si colab (1961) au
aratat de multe ori ca un comprimat solid se va descompune prin descompunere fotolitica doar in zona de
suprafata, a.i. o tableta poate fi practica neafectata in interior.
Caracteristicile fizice ale solidelor
Inainte sa se discute despre stabilitatea medicamentelor in stare solida, este necesar sa se sublinieze cateva
caracteristici ale acestora. Este de ajuns sa se mentioneze ca solidele pot fi caracterizate ca fiind (a) cristaline
sau (b) amorfe. Solidele cristaline sunt asociate cu aranjamentul Bravais, iar solidele amorfe sunt solide care nu
sunt cristaline.

Polimorfismul
Solidele anorganice (in special ionice) sunt asociate uzual cu un (unul si doar unul) sistem cristalin. Se stie, in
general, ca sarea de bucatarie este cubica;
Solidele organice, totusi, depinzand de faptul cum sunt recristalizate pot aparea in mai multe forme cristaline
diferite (polimorfism). Exista 2 tipuri de polimorfism: enantiotrop si monotrop.
Preformularea
De-a lungul timpului, preformularile au evoluat in special in anii 1950 si 1960 ca rezultatul unei schimbari in
accentul pus pe dezvoltarea produselor farmaceutice industriale. Pana la mijlocul anilor 1950, accentul principal
in dezvoltarea produselor era pus pe dezvoltarea armonioasa a formelor farmaceutice, consideratiile
organoleptice dominand grijile (care erau practic inexistente la acea vreme) conform carora un colorant folosit
in formulare ar putea afecta stabilitatea sau biodisponibilitatea.
De fapt, farmacocinetica si biofarmacia erau in stadiile lor incipiente si, in pofida faptului ca stabilitatea era o
grija principala, majoritatea metodologiilor analitice erau de asa natura incat chiar si descumpunerea primara
avea loc fara a fi identificata.
Sincronizarea si obiectivele preformularii
Obiectivele programului sunt astfel: (1) stabilirea parametrilor fizico-chimic necesari, (2) determinarea profilului
de viteza cinetica, (3) stabilirea caracteristicilor sale fizice si (4) stabilirea compatibilitatii cu excipientii uzuali.
Solubilitatea un obiectiv important al eforturilor de preformulare este de a concepe o metoda pentru
obtinerea solutiilor de s.m. Frecvent, medicamentul nu este suficient de solubil in apa pentru a permite
concentratiile dorite, de exemplu pentru solutiile injectabile. Solubilitatile sunt determinate prin expunerea unui
exces de solid la lichidul in cauza si dupa ce graficul la echilibru a fost trasat.
Predictia solubilitatii este avantajos pentru o noua s.m. sa se poata estima care este valoarea solubilitatii,
inaintea desfasurarii evenimentelor de dizolvare. Exista mai multe sisteme de predictie ale solubilitatii si anume:
cercetarile efectuate de Amidon si colab (1974) si Yalkowsky si colab. Ecuatia lor pt solubilitatea paminobenzoatilor in solventi polari si micsti este un analog bidimensional simplificat al ecuatiei ScatchardHildebrand si se bazeaza pe produsul tenstiunii interfaciale si pe aria de suprafata moleculara a portiunii
hidrocarbonat a moleculei.

Dizolvarea importanta dizolvarii este a.i. (din consideratii biofarmaceutice) sunt folosite Farm. SUA si e
necesara pentru aplicarea pentru Noile Medicamente ale formelor farmaceutice soide. Potrivit cercetarilor
efectuate de Noyes si Whitney :
dm/dt= VdC/dt = - kA(S-C)
Unde m este masa nedizolvata, V este volumul de lichid, t este timpul, k este asa n umita viteza constanta de
dizolvare intrinseca (cm/s) si A este aria suprafetei solidului dizolvat.

Solubilitatea polimorfilor metastabili


- Polimorfismul este un aspect important al proprietatilor fizice ale s.m. Una dintre caracteristicile unei polimorfe
metastabile este ca sunt mai solubile decat cele stabile.

Higroscopicitatea
Este, desigur, o caracteristica importanta a unei pulberi. Poate fi demonstrat pentru un compus relativ solubil ca
higroscopicitatea este corelata cu solubilitatea (Carstense, 1977, VanCampen si colab 1980), desi s-a demonstrat

ca entalpia solutiei joaca un rol important in ceea ce este cunoscut drept higroscopicitate (VanCampen si colab,
1983 a,b,c).

Teste de compatibilitate
Inainte de a testa prima formulare a unui nou medicament, cele mai multe grupuri de cercetare desfasoara
teste de compatibilitate (Carstensen si colab, 1964). Principiul este de a descoperi rapoarte rezonabile pentru
amestecul s.m./excipient, pentru a vedea care excipienti sunt cei potriviti pentru medicament.
Compatibilitatea cu recipientele de conditionare
Studiile asupra compatibilitatii pot include de asemenea si compatibilitatea cu materialele containerelor.
Hourcade si colab (1977), de exemplu, au semnalat ca granisetronul in concentratii de 1mg/mL, cand este
pastrat in seringi de polipropilena era destul de stabil, pe cand dilutiile de 0,9% NaCl sau de 5% glucoza au dus la
o stabilitate de depozit nesatisfacatoare.

CURS 3 21.10.2013
Cromatografia in controlul si analiza medicamentului

Introducere
Cromatografia este una dintre ramurile mari ale analizei instrumentale cu aplicatii largi in separarea, detectia si
determinarea substantelor chimice in general si in analiza si controlul medicamentelor in particular;
Tehnicile cromatografice de analiza sunt tehnici de separare selective si eficiente, putand fi folosite inclusiv
pentru urme de substante;
Tehnicile cromatografice de analiza sunt metode instrumentale performante caracterizate prin urmatoarele
avantaje:
1. Rapiditate;
2. Eficienta;
3. Forta (in ceea ce priveste selectivitatea, sensibilitatea, automatizarea, miniaturizarea senzorilor si a altor
componente, tratarea datelor analitice);
Tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si o faza mobila, iar componentii unui
amestec analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza mobila (gazoasa sau lichida), cu viteze
diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii.
La baza tuturor proceselor cromatografice de separare stau 4 procese fundamentale:
1. Adsorbtia pe suporturi solide;
2. Repartitia intre faza stationara si cea mobila;
3. Schimbul ionic;
4. Excluderea difuzia.
Chiar daca principiul separarii poate fi diferit, etapele analizei cromatografice sunt aceleasi si anume:
1) Pregatirea fazei stationare;
2) Fixarea initiala a analitilor in capul coloanei;
3) Deplasarea selectiva caracteristica analitilor care sunt antrenati de catre faza mobila in cadrul procesului
de developare sau elutie;
4) Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec in detector;
5) Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor picurilor si a altor parametri si dozarea analitilor
corespunzatori concomitent cu evaluarea statistica a rezultatelor.
10

CLASIFICARE
In functie de procesele care stau la baza separarilor cromatografice exista:
1. Cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid care are proprietati adsorbante;
2. Cromatografia de repartitie in care faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid, faza
stationara lichida nefiind miscibila cu faza mobila;
3. Cromatografia de schimb ionic in care faza stationara este un compus macromolecular reticulat care contine
un numar mare de grupari functionale acide sau bazice capabile sa schimbe protoni sau ioni alcalini cu
cationi bi si trivalenti sau anioni precum hidroxil sau clorura de anioni mai grei si cu sarcina mai mare
(gruparile bazice) schimbatori de ioni se mai numesc si rasini cationice (sau cationiti) sau anionice (anioniti);
4. Cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie in care faza stationara este, de regula, un gel
care se comporta ca o sita moleculara fixand anumite molecule si eliminand altele in functie de marimea,
respectiv masa lor moleculara.
Se poate face o clasificare a metodelor cromatografice si in functie de procedeul practic utilizat si anume:
1. Cromatografie pe coloana in care faza stationara este plasata intr-o coloana sau tub de metal sau de sticla
sau de silice topita;
2. Cromatografie planara sau de suprafata, pe hartie sau pe strat subtire.
In functie de migrarea fazei mobile se disting
1. Cromatografie prin developare in care analitii raman pe faza stationara sau sunt localizati pe aceasta in
functie de directia de migrare; exista developare ascendenta sau descendenta, monodimensionala sau
bidimensionala (migrari in directii perpendiculare);
2. Cromatografia de elutie in care analitii sunt eluati pana la iesirea lor completa din coloana, deci din faza
stationara, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor de analiti; in acest caz detectia se face in efluenti.
Bazele teoretice ale cromatografiei
Exista o serie de notiuni teoretice general valabile referitoare la procesele de separare cromatografica, notiuni
care se pot transforma sau adapta tuturor metodelor cromatografice;
Daca se analizeaza un amestec de analiti (diferit) care trebuie sa fie separati (acesta fiind scopul principal al
cromatografiei) indiferent de tehnica aleasa, metodele au urmatoarele aspecte comune:
a. Analitii din amestec se repartizeaza intre faza stationara si faza mobila care sunt nemiscibile (sau foarte
putin solubile una in alta), intre cantitatile de analiti repartizati in cele doua faze unde exista un echilibru ce
depinde de insusirile fiecarui analit fata de cele 2 faze;
b. Adaugand continuu faza mobila noua sau proaspata are loc deplasarea echilibrului de repartitie antrenand
migrarea analitilor de-a lungul fazei stationare cu viteze diferite;
c. Separarea consta in eluarea continua a analitilor care, migrand cu viteza caracteristica fiecaruia, parasesc
succesiv coloana.

Faza stationara
- Este formata din particule fine solide, sferice, pe suprafata carora se produc interactiunile cu analitii (ex: in
cromatografia de adsorbtie);
- Este formata din particule fine solide care sunt suportul pe care se fixeaza faza stationara lichida ca in
cromatografia de repartitie;
- In coloanele capilare utilizata in cromatografia de gaze, faza stationara este fixata in stare omogena sub forma
unui film sau pelicula pe peretii interiori ai acesteia.
- Particulele de faza stationara se caracterizeaza prin cativa parametri printre care diametrul lor mediu,
omogenitatea marimilor si suprafata specifica.
11

Aplicatiile metodelor cromatografice


Metodele cromatografice au devenit, in prezent, unele dintre cele mai selective metode de separare cu larga
aplicabilitate in toate domeniile analizei;
Cromatografia are aplicatii largi in analiza calitativa care inseamna separare si identificare.
Cromatografia are aplicatii importante si in analiza cantitativa.
Cromatografie de lichide de inalta performanta
Sub aceasta denumire sunt descrise principalele metode moderne de analiza cromatografica baze pe repartitia
lichid-lichid, pe adsorbtia lichid-solid, pe schimbatori de ioni si pe procesele de excludere-difuzie;
HPLC se poate practica pe coloana sau pe o suprafata plana, de exemplu pe straturi subtiri de faza stationara de
unde si denumirea de cromatografie planara. Aceasta tehnica se noteaza prescurtat TLC (thin layer crom...), iar
tehnica de inalta performanta HPTLC (high....)
In HPLC sunt necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere pentru a asigura debite corespunzatoare ale
fazei mobile, avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC este mica, diametrul particulelor fiind de 310 microni; din acest motiv, aparatura utilizata este mai complicata si, deci, mai scumpa.
Cromatografia HPLC pe coloana
Este tehnica cea mai utilizata in prezent pentru separari, detectii si mai ales pentru determinari cantitative;
In cadrul acestei metode se inscriu:
Cromatografia HPLC de adsorbtie;
De repartitie;
Cromatografia HPLC de adsorbtie
Aceasta tehnica se practica pe faze stationare de silicagel si alumina (singurele care se utilizeaza in aceasta
tehnica); dintre aceste 2 faze stationare se utilizeaza mai ales silicagelul deoarece poate fi folosit intr-o varietate
mai mare de conditionare;
Ca faza mobila se utilizeaza un solvent organic sau un amestec de 2 sau mai multi astfel de solventi;
HPLC de adsorbtie se aplica la separarea unor substante organice relativ nepolare datorita capacitatii metodei
de a fractiona amestecul de izomeri de pozitie: derivati disubstituiti in meta si para ai nucleului aromativ).
HPLC de repartitie
Este cea mai utilizata dintre tehnicile cromatografice in faza lichida si se poate practica sub forma cromatografiei
HPLC lichid-lichid si HPLC lichid-faza grefata sau legata;
In HPLC de repartitie se disting 2 procedee, in functie de polaritatea fazelor stationara si mobila:
1. Cromatografia pe faza stationara normala f polara; ca faza mobila se utilizeaza un solvent practic nepolar
sau foarte slab polar;
2. Cromatografia pe faza inversa in care faza stationara este nepolara iar faza mobila este relativ polara.
Regula de alegere a fazei mobile pt cromatografia de repartitie este urmatoarea:
Faza mobila trebuie sa aiba o putere mare de dizolvare dar sa nu interactioneze clinic cu analitii din probe (sa fie
inerta fata de acestia); trebuie sa fie compatibila cu sistemul de detectie;
Sa nu dizolve faza stationara si sa nu interactioneze chimic cu aceasta (sa fie inerta chimic fata de ea);
In cromatografia pe faza inversa, faza stationara este nepolara iar faza mobila este polara, fiind formata din apa,
metanol, acetonitril sau din amestecuri in diferite proportii ale acestora.

12

Introducere in CSS
Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii, atat in cadrul cercetarii cat si al
multiplelor si variatelor aplicatii ale acesteia, se datoreaza intr-o masura considerabila folosirii tehnicilor
experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a pus la dispozitie.
In aceasta directie aplicarea metodelor fizice in analiza chimica, proces inceput de la consituirea acesteia ca
disciplina stiintifica a condus la elaborarea unor numeroase tehnici de laborator cu mare potentialitate, printre
care se inscrie si metoda cromatografica cu diferitele sale variante;
CSS este una dintre vechile si din noile metode de analiza care, alaturi de celelalte metode cromatografice si
fizico-chimice in general contribuie la studiul si identificarea substantelor chimice naturale si de sinteza.
Generalitati despre CSS
CSS este o metoda fizico-chimica de separare a substantelor dintr-un amestec, pe baza capacitatii deosebite de
distributie intre o faza stationara si una mobila;
Metoda cromatografica se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiala a substantelor din amestecul
respectiv, ca urmare a unor diferente in adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de vapori, marimea
moleculei etc.
Principiul CSS
Un analit migreaza in susul sau de-a latul unui strat de faza stationara, de obicei silicagel, sub influenta unei faze
mobile (de obicei un amestec de solventi organici) care se deplaseaza prin faza stationara prin efect capilar;
Distanta parcursa de un analit este determinata de afinitatea sa relativa, pentru faza stationara vs faza mobila;
Compusii amestecului sunt repartizati intre un adsorbant (faza stationara de obicei silicagel SiO2) si un
solvent (faza mobila) care se deplaseaza prin faza stationara in efect capilar.
Importanta CSS in analiza medicamentului
Determinarea impuritatilor in produsele farmaceutice din materiile prime sau produse preparate;
Folosita adesea ca metoda de baza pentru verificarea materiilor prime farmaceutice;
Poate fi folosita pentru validarea curatirii, o treapta in fabricarea produselor farmaceutice.
Aparat tipic pentru CSS
In figura apare o diagrama tipica a unei placi de CSS dupa ce a fost dezvoltata si pulverizata pentru localizarea
analitului.
Aparatul Linomat: aplica probele in forma de benzi pe straturile subtiri;
Aspectul placilor si al spoturilor la vizualizare: in lumina UV (stanga), in lumina vizibila (dreapta);

Cromatograma CSS cu silicagel ca faza stationara


- In figura compusul A este mai putin polar decat compusul B si parcurge o distanta mai mare odata cu faza
lichida.

Aplicatii ale cromatografiei in analiza medicamentului


CSS a devenit o tehnica foarte sofisticata pentru identificarea compusilor si pentru determinarea prezentei
impuritatilor;
Complexitatea ei deriva din vasta gama de faze stationare si faze mobile ce pot fi folosite cat si din marele
numar de reactivi de pulverizare ce pot fi utilizati pentru vizualizarea cromatogramei.

13

Analiza calitativa
Principala metoda de identificare prin CSS consta in localizarea zonelor diferitilor componenti separat si prin
masurarea valorilor Rf corespunzatoare Rf (retardation factor); acesta se calculeaza altfel:
Distanta parcursa de componentul dat supra distanta parcursa de frontul solventului;
Tot in scopul realizarii analizei calitative, se poate realiza si cromatografia bidimensionala; placa se vizualizeaza
si se compara cu o placa etalon pe care exista un amestec similar, dar cunoscut.
Teste calitative de identitate
CSS se foloseste adesea de monografiile BP ca parte a unui numar de teste de indentitate efectuate pe
substante pure. Pentru confirmarea suplimentara a identitatii se folosesc mai multe sisteme de solventi si, de
asemeni, diferite tipuri de reactivi spray.

CURS 4 28.10.2013
-

Cand structura impuritatii este cunoscuta


Un test limita se bazeaza pe comparatia intre o solutie concentrata a analitului si o solutie diluata a unei
impuritati. O cantitate mica de hidrocortizon impuritate se poate vedea coborand sub spotul mare produs de
hidrocortizonul acetat, care este componenta principala a probei. In linie cu pozitia unde a fost aplicat spotul de
hidrocortizon acetat se observa un spot foarte mic. In acest caz, spotul produs de impuritatea hidrocortizonului
din proba apare mai intens (mai mare) decat spotul produs de etalonul de hidrocortizon 0,01% g/v si deci proba
nu a trecut testul limita.
Cand structura impuritatii este necunoscuta
Un tip asociat de test limita C.S.S. se face cand identitatea impuritatilor nu este pe deplin cunoscuta. Acest tip
de test de face, de exemplu, pe compusi de origine naturala care pot contine o gama de compusi cu structuri
asociate cu a substantei de test si care sunt co-extrasi opdata cu materialul brut.
Trei probe de codeina sunt analizate cum s-a descris, ceea ce arata daca testele limita de mai jos au fost trecute
sau ratate. Solutiile 1-3 apar in ordine numerica de la stanga la dreapta.
i-trece deoarece niciun spot din cromatograma solutiei 1 nu este mai intens decat spotul produs de solutia 2;
ii-nu trece deoarece spotul de la origine este mai intens decat cel produs de solutia 2;
iii trece deoarece desi un spot de deasupra codeinei este mai intens decat spotul solutiei 3, nu exista niciun
spot mai intens ca cel al solutiei 2.
Aplicatii ale HPLC
multe teste farmaceutice limita curente ar putea fi efectuate cu un grad mai mare de acuratete daca s-ar folosi
metodele HPTLC.
HPTLC pentru rifampicina, isoniazida si pirazinamida.
Sensibilitate in CSS
Tehnica CSS a fost utilizata pe scara larga in domeniul farmaceutic pentru a analiza o varietate de aplicatii
specifice si utile, de exemplu:
Pentru a identifica prezenta nedorita a unor compusi organici, ce prezinta impuritati intr-un numar de
substante farmaceutce: morfina in clorhidratul de apomorfina; hidrazina in carbidopa; 3-aminopropan in
dexampanthenol;

14

Substante inrudite prezente in medicamente oficiale si anume: substantele aferente prezente intr-un numar
mare de substante farmaceutice: aminofilina;
Alcaloizi straini prezenti in medicamente alcaloide: sulfatul de atropina; codeina;
Steroizi straini prezenti in medicamente steroidiene.

Introducere in HPLC
HPLC acopera astazi in proportie de aproximativ 80% analiza substantelor moleculare
HPLC reprezinta evolutia unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica care servea in primul rand la
izolarea preparativa a compusilor naturali;
Prin introducerea pompelor si, in consecinta, lucrandu-se la presiuni tot mai ridicate (200 atm), dezvoltarea unor
faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici, in coloane tot mai scurte (3-10 cm) s-a ajuns la
configuratia actuala.
Generalitati cu privire la HPLC
HPLC este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este un lichid iar faza
stationara, continuta intr-o coloana, este constituita dintr-un solid cu granulatie fina sau un solid impregnat cu
un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupari organice.
HPLC este o metoda ce prezinta urmatoarele avantaje:
Usor de controlat cu o precizie cantitativa asigurata prin introducerea exacta a probei;
HPLC este tehnica cromatografica ce a cunoscut cea mai puternica dezvoltare in anii recenti, ducand la
imbunatatirea coloanelor, a detectorilor si a soft-urilor de control;
Varietatea coloanelor si a detectorilor face ca selectivitatea metodei sa poata fi usor ajustata.
Metodele cromatografice pot fi clasificate in functie de mai multe criterii:
Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentur a denumi o gama exinsa de sisteme cromatografice
care au in comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.
In functie de mecanismele de separare:
Cromatografia de lichide;
Cromatografia de gaze;
Cromatografia cu fluide supracritice;
In functie de tehnica utilizata:
Cromatografia pe hartie;
CSS;
CSS de inalta performanta.
Cromatograma in HPLC
In orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu concentratia, alteori cu masa
componentului aflat in celula de masura, semnal ce poate fi inregistrat in functie de timp. Diagrama semnal,
functie de timp sau de volumul de eluent se numeste cromatograma.
Elementele de baza ale cromatogramei HPLC:
Picurile cromatografice acestea sunt semnalele valorificabile in analiza calitativa si cantitativa, in toate
metodele cromatografice.

15

Timpul mort, tM este timpul in care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge
coloana si tuburile de legatura pana la detector.
Timpul de retentie, tR o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana
reprezinta timpul scurt de la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie in detector.
Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie;
Timpul de retentie ajustat tR introdus in cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe
coloane diferite;
Volum de retentie ajustat reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la
coloana la detector.
Principalele etape in HPLC
Solvent -> pompa->injector->coloana->detector->inregistrator (solventul intra in pompa, din pompa in injector,
coloana, din coloana ies pe rand componentii amestecului, vor trece prin detector si, apoi, se va face o
inregistrare a semnalului emis de detector)

Aparatura din care este alcatuit sistemul HPLC


Sistem HPLC tipic, reglat la un debit de 1 ml/min indicand o presiune a coloanei de 1265 psi si conectat la un
dectector UV/vizibil care este reglat sa monitorizeze efluentul coloanei la 260 nm.
Analiza tabelelor de paracetamol si aspirina
Un extract de tablete continand paracetamol si aspirina rulat la un pH 3,7 in 0,05M acetat de sodiu/acetonitril
(85:15) (coloana ODS 150 nm x 4,6 nm, debit 1ml/min)
Extractul de tablete rulat la pH 4,4 in 0,05 M acetat de sodiu tampon/ acetonitril (85:15). Coloana ODS 150 nm X
4,6 nm, debit 1mL/min. Detectie UV la 243 nm.
Analiza cremei cu hidrocortizon fata de un etalon intern
Cromatograma in urma analizei cremei cu hidrocortizon folosinu-se betametazona ca standard intern pe o
coloana ODS (25 cm X 46 nm) cu metanol/apa (70:30) ca faza mobila.
(A) etanolul de calibrare (Sol 1);
(B) extract de crema etalonul intern (Solutia 3);
(C) extract de crema fara adaugare de etalon intern (Sol2);
Avantaje HPLC
HPLC grupeaza o variata si importanta gama de metode care permit cercetatorului sa separe compusi foarte
asemanatori din amestecuri complexe.
HPLC este o tehnica de un urias potential si chiar are avantajul ca furnizeaza atat informatii calitative cat si
cantitative.
Avantaje HPLC - Majoritatea aplicatiilor HPLC sunt folosite in analizele farmaceutice pentru determinarea
calitativa si cantitativa a substantelor utilizate in formulari. Cu astfel de analize nu se pierde mult timp pentru
pregatirea fazelor mobile si selectionarea coloanelor sau a detectorilor potriviti in cazul amestecurilor complexe.

Generalitati introducere gaz-cromatografiei


Unele dintre cele mai dificile si frustrante probeleme in domeniul analizei medicamentului sunt de separare
simultana, identificare si, mai presus de toate, analiza cantitativa a uneia sau mai multor substante dintr-un
amestec complex al unui produs farmaceutic.
16

Cresterea exponentiala a cromatografiei de gaze poate fi atribuita potentialului incomparabil de a solutiona


problema separarii componentelor dintr-un amestec complex.
Definitie (FRX)
Cromatografia de gaze este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica, in care faza mobila este un gaz
(gaz purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este impregnat un suport solid inert sau un
lichid repartizat uniform pe peretii unei coloane capilare;
Faza stationara se afla intr-o coloana cromatografica, confectionata, de obicei, din sticla sau din otel inoxidabil;
Faza mobila se deplaseaza continuu printr-o coloana, iar la iesire gazul purtator trece prin detector.

Principiul separarii cromatografice


Consta in distributia inegala a componentelor unui amestec intre faza mobila si faza stationara;
Amestecul strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila.

Schema cromatografului de gaze cauta pe net!:D


Principalele etape in cromatografia de gaze
Prepararea probei -> injectarea in coloana -> separarea componentilor -> detectarea componentilor ->
identificare si masurare
Introducerea probelor lichide in coloana cromatografica prin evaporare.
Introducerea probelor solide in coloana cromatografica sunt introduse in coloana prin injectare cu
microseringi dupa ce au fost dizolvate intr-un solvent adecvat.
Cromatograma reprezentarea grafica a semnaului detectorilor in functie de timp, obtinuta cu ajutorul
inregistratorului, se numeste cromatograma.

Parametrii specifici
Timp de retentie, tR este timpul la care apare maximul unui pic, masurat din momentul introducerii probei si
constituie caracteristica calitativa a componentului respectiv;
Inaltimea picului, h, sau aria suprafetei lui, A, constituie parametrul cantitativ, proportional cu cantitatea de
component;
tM este timpul in care elentul si componentele care nu interactioneaza cu faza stationara parcurg distanta pana
la detector.
Aparatura pentru cromatografia de gaz cauta pe net! :D

Aplicatii ale cromatografiei de gaze in analiza medicamentului


caracterizarea uleiurilor volatile (care pot fi folosite ca excipienti in formulari), brevetarea amestecurilor
complexe pentru tuse, a tonicelor si a acizilor grasi in uleiurile stabile;
teste de limita pentru reziduuri de solvent si alte impuritati volatile in substantele medicamentoase;
caracterizarea unor medicamente neformulate in particular in ceea ce priveste procesul de detectare a
impuritatilor;
cuantificarea medicamentelor in formulari in particular daca medicamentul nu are un cromofor.

Analiza cantitativa si calitativa


primele analize de medicamente au inceput cu steroizii anabolizanti;

17

folosirea abuziva a medicamentelor analgezice, narcotive si halucinante a impus analiza lor calitativa si
cantitativa si cantitativa intr-un timp cat mai scurt, pentru a putea interveni la timp cu antidotul cel mai potrivit;
o categorie importanta de medicamente o reprezinta substantele folosite in tratarea bolilor vasculare. Pentru
clonidina, detectorul cu captura de electroni a permis masurarea unei concentratii de 100 pg clonidina intr-un
mL de plasma.

Analiza acidului valproic in plasma


o aplicatie tipica a GC in analiza unui medicament in plasma este determinarea medicamentului antiepileptic
acid valproic dupa extragerea fazei solide prin GC cu ionizare cu flacara;
in aceasta prodedura s-a folosit ca etalon intern acid caprilic care este izomeric cu acidul valproic.

Analiza atropinei din picaturile oculare


picaturile oculare cu atropina sunt folosite pentru a dilata pupila inainte de operatiile de cataracta;
metoda implica extragerea atropinei si a unui etalon intern de homatropina din faza apoasa.

Determinarea dimetilanilinei din solutia injectabila bupivacaina


dimetilanilina este atat o impuritate de fabricatie in bupivacaina cat si un posibil produs de descompunere in
solutiile injectabile.
Cromatografia de gaze cuplata cu spectrometria de masa
atat cromatografia de gaze cat si spectrometria de masa sunt tehnici analitice de mare utilitate pentru analiza
compusilor organici;
combinarea lor intr-un singur sistem duce la obtinerea unor rezultate care depasesc mult ceea ce s-ar realiza
prin simpla insumare a datelor oferite de cele doua tehnici.
Realizarea practica a analizelor GC-MS
fixarea spectrometrului de masa la o anumita valoare m/z caracteristica doar pentru o anumita componenta
care ne intereseaza, el functionand in acest caz ca un detector foarte specific.
Parcurgerea (scanarea) intregului domeniu de masa intr-un interval de timp redus, ceea ce inseamna ca se obtin
sute sau chiar mii de spectre pentru fiecare analiza. Toate aceste spectre sunt stocate in memoria calculatorului
atasat instrumentului.
Aplicatii ale CG-SM calculator
O metoda de mare utilitate in diagnosticarea, urmarirea evolutiei si tratamentului unor boli, in special
determinand constituentii volatili de masa moleculara mica ai fluidelor biologice (metaboliti biologici volatili din
urina, ser, plasma si fluid cerebrospinal).

18

CURS 5, 04.11.2013
Puritatea substantelor farmaceutice. Impuritati farmaceutice
Generalitati
Exista un interes din ce in ce mai mare in ceea ce priveste impuritatile prezente in medicamente (API
substante active). In ultimul timp, nu numai profilul puritatii, dar si profilul impuritatii a devenit esential dupa cum
reglementarile in vigoare o specifica. In lumea farmaceutica, o impuritate este considerate ca orice alt material organic,
pe langa s.a. sau excipienti ce apare in urma sintezei sau din substante chimice nedorite care raman cu API (active
pharmaceutical impurities).
Impurificarea poate fi dezvoltata atat in timpul formularii cat si dupa expirarea timpului de valabilitate atat a
substantelor folosite dar si a preparatelor formulate.
Prezenta acestor substante chimice nedorite, chiar si in cantitate mica, poate influenta eficacitatea si siguranta
produselor farmaceutice. Profilul impurificarii (de exemplu, identificarea, precum si cantitatea de impuritati din
produsele farmaceutice), a castigat in ultimul timp atentia din partea autoritatilor de reglementare.
Diferite farmacopei, cum ar fi farmacopeea britanica, sau farmacopeea SUA, indiana precizeaza limitele,
nivelurile admisibile de impuritati prezente in substantele utilizate sau preparatele formulate.
Impurificarea poate fi evitata doar daca fiecare etapa este realizata cu grija, evitandu-se sinteza prin realizarea
mai multor etape odata; in cazul paracetamolului brut exista un test de limitare pentru p-aminofenol care poate fi un
materiale de pronire in unele cazuri sau un intermediar in altele.
In chimia organica de sinteza, este foarte rar atins randamentul de 100% in obtinerea unui produs final singur; in
obtinerea unui produs final singur exista intotdeauna o sansa de a avea produsi secundari. Spre exemplu, in cazul
producerii paracetamolului brut se poate forma ca produs secundar paracetamol diacetilat.
Impuritatile pot fi de asemenea rezultate prin degradarea produsului final in procesul de fabricatie a
medicamentelor. Degradarea penicilinei si a cefalosporinelor sunt exemple bine cunoscute ale produselor de degradare.
Prezenta unui inel beta-lactamic, precum si a unei grupari amino la C6-C7 joaca un rol critic in degradarea lor.
Aceste impuritati poseda adesea efecte nedorite farmacologic sau toxicologic, dar pot avea si beneficii care la
administrarea lor pot compensa. Compozitia impuritatilor ne permite sa tragem concluzii in ceea ce priveste procesul de
fabricatie a produselor si falsificarea acestora care este din ce in ce mai raspandita in toate tarile din lume, prin urmare,
este necesar a controla cu strictete calitatea produselor farmaceutice si a determina concentratia de impuritati in toate
etapele productiei, de la materiile prime la produsul finit.
Surse de impurificare
Impuritatile pot proveni din diverse surse. Sursa cea mai evidenta de impurificare este sinteza, caz in care
intermediarii din s.a. pot constitui impuritati sau pot sa devina o sursa de alte impuritati care rezulta din acestea.
Orice impuritate prezenta in materia prima este posibil a se regasi in s.a. de interes. In plus, impuritatile care se
refera la substantele inerte (excipientii) si solventii utilizati in timpul sintezei trebuie sa fie, de asemenea, luati in
considerare. Impuritatile pot fi produse in timpul diferitelor etape ale formularii produsului medicamentos.
Exista posibilitatea ca aceste impuritati sa fie prezente in produsul medicamentos final. Potentialii produsi de
reactie care au legatura cu aceste impuritati trebuie sa fie, de asemenea, evaluati.
Impuritatile din produsele medicamentoase pot proveni nu numai din s.m. sau din substantele inerte folosite
pentru formularea unui produs medicamentos, ele pot fi introduse in produsul medicamentos in timpul procesului de
formulare sau in urma contactului cu ambalajul.

19

Surse de impuritati organice


Impuritatile organice pot aparea in timpul procesului de fabricatie si/sau la depozitarea s.m. Ele sunt derivate
din procesele de sinteza si din reactiile de degradare a s.m. si produselor medicamentoase. Impuritatile rezultate din
procesul de sinteza pot proveni din materiile prime, intermediarii, reactivii, liganzii si catalizatorii utilizati in sinteza
chimica, precum si din produsii secundari rezultati in urma reactiei chimice de sinteza.
Produsii de degradare se obtin in urma degradarii chimice a s.m. si a produselor medicamentoase in functie de
conditiile de depozitare sau solicitare. Acestea pot fi identificate sau neidentificate, volatile sau non-volatile si pot sa
includa urmatoarele tipuri de impuritati:
a. Impuritati provenind din procese de sinteza a s.m.;
b. Impuritati rezultate in urma degradarii s.m.
Impuritati provenind din procese de sinteza a s.m.
Entitatile chimice, altele decat s.m., care sunt implicate sau produse in procesul de sinteza pot ajunge in s.m.
finala sub forma de urme de impuritati. Aceste entitati chimice includ materii prime, produse intermediare, solventi,
reactivi chimici, catalizatori, produse secundare, impuritati prezente in materialele de baza si entitati chimice formate
din aceste impuritati (in special a celor implicate in ultimele etape de sinteza).
Materiile prime si produsii intermediari
Materiile prime si produsii intermediari sunt structurile chimice folosite pentru a construi forma finala a unei
molecule de s.m. Materiile prime nereactionate si produsii intermediari, in special cei implicati in ultimele etape ale
sintezei, pot supravietui procesului de sinteza si purificare si apar in produsul final sub forma de impuritati.
Impuritatile prezente in materiile prime ar putea urma aceeasi cale de reactie ca si materialul de baza in sine, iar
produsii de reactie pot duce la formarea de impuritati in produsul final.
Cunoasterea impuritatilor din materiile prime de baza ajuta la identificarea impuritatilor prezente in produsul
final si la intelegerea mecanismelor de formare a acestor impuritati.
Reactivi, liganzi si catalizatori:
Aceste substante chimice sunt mai rar intalnite in API-uri; cu toate acestea, in unele cazuri, ele pot constitui o
problema ca impuritati.
Reactivii chimici, liganzii si catalizatorii utilizati in sinteza unei s.m. pot fi regasite in produsele finale ca
impuritati sub forma de urme.
Produsi secundari de sinteza
Selectivitatea unei reactii este rareori de 100%, iar reactiile secundare sunt frecvente in timpul sintezei de s.m.
Produsii secundari sunt printre cele mai comune impuritati de proces.
Produsi over-reaction:
In multe cazuri etapele precedente sau cele finale ale sintezei nu sunt suficient de selective si reactivii ataca si
produsul intermediar/produsii intemerdiari.
Impuritati provenite de la solventi utilizati in reactie
De exemplu, clorura de metilen, care este adesea folosita ca solvent intr-o reactie Friedel-Craft de acilare a
benzenului sau a derivatilor de fenil poate constitui o sursa de impuritati. Impuritatile din solventi pot fi, de asemenea, o

20

sursa de impuritati. De exemplu, 2-hidroxitetrahidrofuran este o impuritate in tetrahidrofuran, care este adesea folosit
ca solvent al reactivului Grignard.
Impuritati rezultate in urma degradarii s.m.
Impuritatile pot fi, de asemenea, formate in urma degradarii produsului final, in timpul procesului de fabricatie.
Produsele de degradare care rezulta din depozitarea sau formularea diferitelor forme dozate sau datorita
imbatranirii produselor sunt impuritati comune in medicamente.
Impuritati enantiomerice
Activitatea biologica a substantelor chirale de multe ori depinde de stereochimia lor, deoarece organismul viu
este un mediu chiral. Un procent mare de compusi farmaceutici comerciali si experimentali sunt enantiomeri si multi
dintre ei prezinta diferente semnificative de enantio-selectivitate in farmacocinetica si farmacodinamia lor.
Importanta chiralitatii medicamentelor a fost recunoscuta de mult timp, iar consecinta utilizarii lor ca racemi sau
enantiomeri a fost discutata frecvent in literatura de specialitate. Cu o crestere evidenta a problemelor legate de
stereoselectivitate in actiunea medicamentelor, cromatografia chirala a devenit un instrument important in analiza lor.
Mari eforturi au fost dedicate dezvoltarii unei metodologii mai bune pentru cromatografia enantioselectiva in ultimele
doua decenii.
Metode de detectare
Profilul impurificarii s.m. si formularea medicamentelor incepe cu detectarea impuritatilor. Metodele cele mai
frecvent utilizate pentru aceasta sunt CSS (TLC), HPLC, dar, in cazul materialelor volatile, stabile termic, gaz
cromatografia (GC), joaca, de asemenea, un rol important.
Alte tehnici cromatografice si electroforetice, cum ar fi cromatografia cu fluide supercritice, electroforeza
capilara si electrocromatografia capilara pot fi, de asemenea, utilizate. Spectrostopia de masa (MS) si rezonanta
magnetica nucleara se inalta rezolutie (RMN) pot contribui, de asemenea, la detectarea impuritatilor.
Metode de caracterizare
Metode spectroscopice
Urmatoarele tehnici spectroscopice de masurare au fost utilizate pentru caracterizarea impuritatilor; cele mai
multe dintre aceastea sunt foarte utile ca detectori pentru metodele cromatografice:
Ultraviolet;
Infrarosu;
Spectroscopia Raman;
Spectroscopia de masa;
Rezonanta magnetica nucleara (RMN).
Spectrometria in UV
Spectrofotometria UV la o singura lungime de unda furnizeaza o selectivitate minima a analizei; cu toate
acestea, datorita accesibilitatii detectorilor campului de diode se pot obtine simultan suficiente informatii, la diferite
lungimi de unda, pentru a asigura o mai mare fiabilitate.
Spectrometria in IR
Ofera informatii specifice privind unele grupari functionale care ofera selectivitate si permit cuantificarea. Cu
toate acestea, datorita nivelului scazut de detectibilitate, este dificil. Acest lucru necesita abordari mai complexe care
sunt, in general, un factor de descurajare pentru analisti.

21

Spectroscopia Raman
Se bazeaza pe masurarea radiatiilor electromagnetice difuze care rezulta din iradierea materiei. Concret, atunci
cand un material este iradiat cu o sursa de lumina monocromatica puternica (de exemplu: laser), o cantitate mica de
radiatii este difuzata la o lungime de unda diferita.
Exista aceeasi diferenta in energia vibrationala dintre fasciculul dispersat si fasciculul incident care este masurat.
Spectroscopia Raman este considerata complementara spectroscopiei IR, cele 2 tehnici oferind o imagine completa
vibrationala asupra materialului.
Spectrometria de masa
A avut un impact semnificativ asupra procesului de dezvoltare farmaceutica in ultimele decenii. Progresele in
proiectarea si eficienta interfetelor care conecteaza direct tehnicile de separare cu spectrometrie de masa au acordat
noi oportunitati pentru monitorizarea, caracterizarea si cuantificarea s.a. ca atare cat si din formele farmaceutice.
Dotata cu o specificitate analitica si o sensibilitate exceptionale, spectrometria de masa reduce semnificativ
timpul ciclului metodei de dezvoltare cromatografica, validarea si analiza probei.
RMN
Are capacitatea de a furniza informatii cu privire la structura si stereochimia moleculei de interes constituind o
metoda de analiza utila in elucidarea structurii. Din pacate, RMN a avut in mod traditional o sensibilitate limitata in
comparatie cu alte metode analitice.
Metode de izolare
Metodele de izolare includ atat metode cromatografice dar si metode non-cromatografice. La inceput ar trebui
incercate metodele simple, deoarece acest lucru poate duce la economii considerabile in timp si pot produce o cantitate
mai mare de informatii cu o mai mare usurinta.
Pentru izolarea unui compus dat dintr-un amestec complex, metodele cromatografice utilizate pentru separarea
de impuritati in determinarile analitice sunt metode de prima alegere, care sunt corespunzator modificate in scopul
izolarii impuritatilor in cazul in care o fractiune adecvata este colectata.
Metodele de izolare:
Extractia fazei solide;
Extractia lichid-lichid;
Extractia accelerata a solventului;
Cromatografia in strat subtire (TLC);
Cromatografia in faza gazoasa (GC);
HPLC;
Electroforeza capilara (CE).
Metode de separare
Urmatoarele metode pot fi utilizate pentru separarea impuritatilor si a produsilor de degradare:
Electroforeza capilara;
Separarea chilara;
GC;
22

HPLC;
Cromatografia cu gluide supercritice;
CSS.
Natura si complexitatea componentei ce trebuie separata determina ce metoda ar trebui utilizata. Scopul
principal al unei metode de separare bune este rezolutia tuturor impuritatilor de interes. Un rezumat al avantajelor
metodelor amintite mai sus este dat aici pentru a oferi o scurta trecere in reviza a utilizarii lor potentiale.
Electroforeza capilara
Este o tehnica eficienta in situatiile in care avem de-a face cu cantitati foarte mici de proba si o inalta rezolutie
este esentiala. Reproductibilitatea sa relativ mica este principala dificultate a acestei proceduri. Este o metoda fizica de
analiza, care se bazeaza pe migrarea particulelor incarcate electric, dizolvate sau dispersate intr-o solutie de electroliti si
supuse actiunii unui camp electric.
Mobilitatatea electroforetica a unei particule este viteza de deplasare in metri pe secunda a particulei supuse
actiunii unui camp electric de un volt pe metru si se exprima in metri patrati pe volt si pe secunda (m2 x V-1 X s-1).
Submultiplul curent folosit este centimetrul patrat pe volt si pe secunda (cm2/VXs).
Separarea chirala
Proprietatile stereochimice ale medicamentelor chirale au fost in multe cazuri factorul de control privind
activitatea acestora. Un enantiomer poate avea o functie biologica. Altii pot fi inactivi sau avea o alta functionalitate
care ar putea avea efecte secundare. In unele cazuri, un izomer optic poate fi daunator. FDA impune producatorilor de
medicamente testarea enantiomerilor individuali pentru noile medicamente pentru a le cunoaste toxicitatea.
Cromatografia chirala reprezinta separarea cromatografica a compusilor enantiomerici. Fazele lichide stationare
comune nu poseda o selectivitate adecvata pentru separarea enantiomerica. Adaosul macromoleculelor de
ciclodextrina derivatizate la fazele fixe comune creeaza coloane capilare care au capacitatea de a separa numerosi
enantiomeri.
Gaz-cromatografie
Gaz cromatografia este o tehnica extrem de utila pentru cuantificare. Se poate oferi rezolutia dorita,
selectivitate si usurinta de cuantificare. Principala sa limitare, insa, este faptul ca proba trebuie sa fie volatila sau trebuia
sa devina volatila prin derivatizare. Aceasta tehnica este foarte practica pentru impuritatile organice volatile (OVI).
Cromatografia de lichide de inalta presiune
Este adesea mentionata ca HPLC in zilele noastre. Ambii termeni pot fi abreviati ca HPLC si termenii pot fi folositi
alternativ. Aplicatiile acestei tehnici foarte eficiente au fost semnificativ extinse prin utilizarea unei varietati de
detectori, cum ar fi fluorescenta, electrometria, MS s.a.m.d.
CSS
Este una dintre tehnicile de separare cele mai utilizate datorita usurintei de utilizare, costului redus, inaltei
sensibilitati, vitezei de separare, precum capacitatii sale de a analiza simultan mai multe probe. Ea a fost aplicata in
disciplinele de biochimie, toxicologie, farmacologie, stiinta mediului si in chimie. CSS poate fi utilizata pentru separarea,
izolarea, identificarea si cuantificarea componentelor intr-un amestec.

23

CURS 6, 11.11.2013
Spectrometria de absorbtie UV-VIS in analiza si controlul medicamentelor

Domeniul spectral UV-VIS


Spectrometria in UV-VIS se aplica in domeniul spectral 180-1100 nm;
Domeniul spectral UV-VIS este alcatuit din 3 zone spectrale:
UV apropiat 185-400 nm;
Vizibilul 400-700 nm;
IR 700-1100;
Determinarile spectrometrice in acest domeniu se bazeaza pe fenomenul de absorbtie a radiatiilor cuprinse in
acest domeniu spectral de catre speciile chimice analizate.
Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta (sau transmitanta) cu ajutorul
spectrofotometrelor automatizate, inclusiv pentru analiza multicomponent;
Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor analiti, din amestecuri cu mai multe
componente, dupa prealabila lor separare prin cromatografia de lichide;
Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si 900 nm. Limita inferioara se opreste la
cca 185 nm datorita aerului care devine opac sub aceasta limita.
Absorbtia luminii
Producerea absorbtiei luminii se explica prin faptul ca in UV-VIS radiatiile au o energie mai mare decat in IR ceea
ce duce la tranzitii electronice de pe anumite niveluri (orbitali) pe altele;
Tranzitiile electronice se suprapun peste tranzitiile rotationale si peste cele vibrationale care sunt produse de
energii mai mici: deltaE = deltaE rotatie + delta E vibratie + delta E electronice
La impactul unui foton asupra unei molecule izolate se modifica termenul E electronic ceea ce determina
variatia energiei mecanice totale.
Compusii organici obisnuiti, inclusiv cei medicamentosi, sunt formati din atomi usori, precum C, H, N, O, iar
tranzitiile care se observa pentru acesti compusi sunt determinate de electroni implicati in legaturile sigma si pi
si de electronii n neparticipanti care formeaza dublete neimplicate in legaturi;
In cursul acestor tranzitii se produc modificari ale polaritatii legaturilor iar spectrele care se obtin pentru acesti
compusi se mai numeste si spectre de transfer de sarcina;
In afara de tipurile de tranzitie mentionate mai sus exista si tranzitii in care sunt implicati orbitalii moleculari d
specifice compusilor anorganici;
Din punctul de vedere al participarii sau neparticiparii electronilor existenti intr-o molecula, la tranzitii
electronice se disting 4 tipuri de electroni:
1) invelis de electroni inchis, in care electronii nu sunt implicati in legaturi chimice deoarece au energii de
excitare foarte mari; acesti electroni nu contribuie la absorbtia in UV-VIS;
2) electroni de tip sigma in legaturi covalente sigma care au de asemenea energii mari de excitare si deci nu
contribuie la absorbtii in UV-VIS
3) electronii n, care se gasesc sub forma electronilor neparticipanti, pot fi excitati cu radiatii UV-VIS si pot
contribui la absorbtii in acest domeniu spectral;

24

4) electroni pi, situati pe orbitali pi, in legaturile duble si triple fiind mai usor excitabili, ei fiind responsabili
pentru majoritatea spectrelor electronice.

Producerea culorii. Cromofori. Solvatocromie. Deplasari bato si hipsocrome.


La originea tranzitiilor electronice stau gruparile cromofore care includ diverse tipuri de electroni;
Daca o molecula contine mai multi cromofori separati prin cel putin doua legaturi simple, se poate observa o
suprapunere a efectelor gruparilor individuale;
Este important de precizat ca atat potizia cat si intensitatea si chiar forma benzilor de absorbtie ale compusilor
in solutie sunt influentate de natura solventului. Procesul acesta se numeste solvatocromie iar modificarile
mentionate sunt datorate interactiunilor analit-solvent.
Efectul hisocromic si efectul batocromic
Efectul hipsocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai mici;
Efectul batocromic consta in deplasarea benzilor de absorbtie spre lungimi de unda mai mari.
Spectrofotometria UV-VIS
Pentru inregistrarea spectrelor electronice se utilizeaza un spectrofotometru UV-VIS care este compus dintr-o
sursa de radiatii, un sistem dispersiv combinat cu un monocromator si un detector.
Legea fundamentala a absorbtiei
In spectrometria de absorbtie in UV-VIS se masoara de regula absorbanta care este proportionala cu
concentratia analitului, conform legii Lambert-Beer:
A= epsilon X b X c
In care:
A=absorbanta; b=grosimea stratului de solutie (cm); c=concentratia analitului determinat; epsilon=absorbanta
molara.
Inregistrarea spectrelor
Este una dintre problemele de mare importanta in detectia si dozarea substantelor medicamentoase;
Inregistrarea spectrelor se poate face fie prin reprezentarea grafica a absorbantei in functie de lungimea de
unda fie a transmitantei in functie de lungimea de unda;
Aceasta inregistrare se face automat, datele experimentale fiind inmagazinate in calculator, acesta avand
programe de prelucrare a datelor;
Inregistrarea spectrelor in UV-VIS se face in solutiile analitilor in solventi potriviti, iar alegerea solventului in
fiecare caz este o problema deosebita;
Spectrometria UV se poate utiliza si in studiul unor reactii chimice care se petrec in solutie. De exemplu,
salicilatul de metil sufera in solutie apoasa alcalina o reactie de hidroliza din care rezulta acid salicilic, iar cu
exces de baza salicilatul alcalin corespunzator.
Tratarea rezultatelor analitice
Pentru tratarea (prelucrarea sau evaluarea) rezultatelor analitice sunt necesare cateva cunostinte de analiza
statistica, care permit analistului sa inteleaga semnificatia rezultatelor obtinute si pentru a ordona limitarile
fiecarei etape si tehnici de analiza;
Analistul trebuie sa aiba propria lui intelegere cu privire la felul rezultatelor pe care trebuie sa le raporteze.

25

Spectrometria IR in analiza si controlul medicamentului

Introducere
IR analitic grupeaza metode de identificare si dozare (nedistructive) bazate pe absorbtia sau reflexia de catre
proba a radiatiilor electromagnetice cuprinse intre 0,78 microni (780 nm) si 1000 microni (1 mm) fiind subdivizat
in IR apropiat, IR mijlociu si IR indepartat.
Regiunea fundamentala situata intre 2,5 si 15 microni este regiunea care furnizeaza cele mai multe informatii
privind structura moleculara, majoritatea spectrometrelor fiind limitate la masuratori in aceasta regiune;
Spectrele de absorbtie in IR sunt spectre de vibratie ale moleculelor. Atomii situati la cele doua extremitati ale
unei legaturi sunt supusi unei miscari de vibratie.
Prin absorbtie de energie legatura chimica isi creste nivelul energetic vibrational. Moleculele probei vor absorbi
energii din radiatia IR numai la anumite lungimi de unda dand nastere in spectrul IR unor maxime de absorbtie;
La lungimile de unda la care nu se absoarbe energie, inregistratorul spectrometrului va inscrie linia zero a
spectrului;
Maximele de absorbtie in IR se manifesta in spectru ca benzi (si nu ca linii) deoarece orice modificare energetica
vibrationala este insotia, de regula, de modificari energetice rotationale si, din acest motiv, spectrele in IR se
mai numesc si spectre de vibratie rotatie ale moleculelor.
Fiecare maxim spectral este asociat unei vibratii corespunzatoare unei anumite legaturi din molecula probei,
insa trebuie mentionat ca orice vibratie a moleculei de nastere unui maxim de absorbtie intrucat regulile de
selectie fundamentale ale mecanicii cuantice arata ca un maxim apare numai daca vibratia corespunzatoare
produce o modificare a distributiei de sarcina (a marimii sau directiei momentului de dipol).
In absenta momentului de dipol permanent cum este cazul moleculelor simetrice nu apar benzi de absorbtie in
IR. Legatura din acetilena nesubstituita nu se manifesta in IR. In aceste cazuri se spune ca legatura este
transparenta in IR mediu sau inactiva.
Vibratiile pe care le executa o molecula in ansamblu cu pastrarea imobila a centrului sau de gravitatie se numesc
vibratii normale sau fundamentale.
Cresterea numarului de benzi fata de numarul teoretic se datoreaza:
1) Armonicelor;
2) Benzilor de combinare;
3) Rezonantelor Fermi.
Armonicele sunt benzi de intensitate mica care apar la un numar de unda dublu fata de banda fundamentala;
Benzile de combinare benzi de intensitate mica care apar la nume de unda egale cu suma sau cu diferenta
numerelor de unda a 2 vibratii fundamentale.
Rezonanta Fermi reprezinta scindarea unei benzi fundamentale atunci cand in imediata ei apropiere se
gaseste o armonica sau o banda de combinare;
Scaderea numarului real de benzi fata de cel teoretic se datoreaza:
1) Vibratiilor care nu produc modificari ale momentului de dipol al moleculei;
2) Vibratiilor degenerate care dau benzi la acelasi numar de unda;
3) Vibratiilor situate in afara domeniului IR uzual.
Frecventele de grup

26

Unele grupe de atomi, in special gruparile functionale din chimia organica, prezinta in IR benzi de absorbtie
caracteristice, intense, situate la frecvente bine determinate numite frecvente de grup sau caracteristice;
Grupele functionale se comporta ca si cum ar fi izolate de restul moleculei desi aceasta influenteaza intr-o
masura mica pozitia benzilor de grup. Aceste mici deplasari sunt frecvent utilizate in studiul structurii
compusilor organici;
Intensitatea uneori foarte mare a benzilor de grup este rezultatul polaritatii crescute a gruparilor functionale
respective.
Aspecte tehnice ale spectrometriei in IR
In IR aparatura utilizata se subimparte in:
Spectrometre cu transformata Fourier;
Analizoare specializate;
Spectrometre de tip dispersiv pentru IR apropiat;
Spectrometru cu transformata Fourier
Radiatiile provenite de la o sursa lovesc o interfata constituita dintr-un film semitransparent de germaniu depus
pe lama de KBr. Acest dispozitiv permite generarea a doua fascicule, unul dirijat spre o oglinda fixa, celalalt spre
o oglinda mobila care permite modificarea distantei fata de interfata. Cele doua fascicule recombinate pe
aceeasi directie traverseaza proba inainte de a ajunge la detectorul care masoara intensitatea luminoasa
globala.
Surse si detectori in IR
A. Surse luminoase
In IR sursele se prezinta sub forma unor filamente groase fie sub forma unor batoane subtiri cu lungimea de 3-4
cm formate dintr-un amestec de oxid de zirconiu si pamanturi rare incalzite de o rezistenta interioara sau de o
bara de carbura de siliciu. Aceste surse sunt alimentate la o tensiune joasa, ajung la 1500C si, in conditiile lipsei
unui invelis protector, ele disipa o putere de ordinul sutelor de watt, emitand intr-un domeniu larg cuprins intre
vizibil si IR termic.
B. Materiale optice
Materialele optice utilizate in mod obisnuit in vizibil sau in IR apropiat sunt in IR mediu opace;
Prismele monocromatoare aparatelor secventiale utilizate in trecut erau confectionate din NaCl sau KBr si au
fost inlocuite in aparatele moderne de retele metalice a caror suprafata asigura reflexia luminoasa;
Pentru peretii celulelor sau ferestrelor detectorilor se aleg materiale cristalizate sau amorfe, fiecare acoperind o
anumita plaja spectrala.
C. Detectori
In functie de tipul de aplicatie sau aparat se utilizeaza ca detectori termistori, termocupluri sau alte dispozitive
asociate.
Analiza calitativa in IR
Identificarea compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale sau a celor speciale propuse de
societati sau edituri;
Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute plecand de la compusi aflati in aceeasi
stare fizica cu cei supusi identificati;
Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu toate cele care
formeaza spectroteca considerata in vederea stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.

27

Analiza cantitativa in IR
Analistul trebuie sa examineze cu atentie rezultatele si in cazul schimbarii algoritmului de comparare, acestea
nu trebuie sa difere;
In lipsa unor spectre de referinta, interpretarea spectrelor in IR urmareste punerea in evidenta a unor grupari
functionale, asocieri prin legaturi de hidrogen inter si intramoleculare, configurari sterice etc.
Precizia cu care se masoara absorbanta si posibilitatile de repliere a spectrelor constituie avantaje ale analizei
cantitative in IR;
Metoda este frecvent utilizata, pe de o parte datorita faptului ca in IR mediu gasirea intr-un spectru al unui
amestec al benzilor caracteristice compusului dozat este relativ usoara, iar, pe de alta parte, exista la dispozitie
metode statistice de prelucrare a datelor.
Analiza cantitativa in IR mediu
In cazul probelor solide, acestea sunt dispersate in interiorul unui disc de KBr carora li se adauga un standard
intern in cantitati egale atat pentru standard cat si pentru proba;
Pentru lichide determinarea absorbantei se face in cuve pe parcurs optic mic pentru a minimaliza absorbtia
proprie solventului in cazul in care solventul nu este transparent in acest domeniu.
Analiza cantitativa in IR apropiat
Aceasta metoda utilizeaza domeniul spectral situat intre 800 si 2700 nm. Benzile observate in acest domeniu
sunt date nu numai de tranzitiile electronice ci si de benzile de vibratie de tipul armonicelor si benzilor de
combinare;
Benzile armonice sunt mai putin intense decat cele corespunzatoare vibratiilor fundamentale si de aceea se
lucreaza in cuve cu parcursul optic de 1 cm si pe probe nediluate.
Chiar daca metodele de dozare in IR apropiat nu sunt sensibile, intotdeauna ele sunt usor de utilizat.

IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR CU SUBSTANTE ACTIVE ORGANICE


INTRODUCERE
- Identificarea medicamentelor este poate cea mai importanta proba din controlul medicamentelor,
deoarece experienta a aratat ca accidentele cele mai deosebite au avut loc atunci cand identificarea nu sa facut la ambalarea subst sau foremlor farmaceutice.
- Din aceasta cauza legislatia in vigoare prevede efectuarea probelor de identificare a substantelor
medicamentoase destinate a fi folosite la prepararea medicamentelor pe tot circuitul lor si anume la
intrarea in fabrica pentru conditionare si la iesirea din fabrica sub forma de medicamente conditionate la
intrarea in depozitele oficiilor farmaceutice si la intrarea substantelor in farmacii.
- Pentru identificarea substantelor medicamentoase si a medicamentelor conditionate se utilizeaza dupa
caz reactii chimice, constante fizico-chimice, metode fizico-chimice, spectrofotometrice si
cromatografice.
IDENTIFICAREA PRIN REACTII CHIMICE
- La identificarea medicamentelor cu reactii chimice se disting 3 cazuri : substanta unitara cunoscuta,
amestec de 2 sau mai multe substante cunoscute si substante necunoscute.
SUBSTANTE UNITARE
28

Pentru identificarea SM ca atare sau a SA dintr-o forma farmaceutica, FRX si alte farmacopei straine
recomanda una sau mai multe reactii chimice completate de constante fizico-chimice si de teste bazate pe
metodele fizico-chimice.
Este obligatorie executarea tuturor acestor reactii chimice si dupa tehnicile indicate in FR sau
specificatiile tehnice, deoarece numai cu respectarea acestor tehnici ele sunt reproductibile si valabile in caz de
litigiu.
FR la alegerea reactiilor tine seama de cateva criterii :
a. Specificitatea reactiei;
b. Exactitatea reactiei;
c. Tehnica simpla;
d. Utilizare de reactivi comuni;
e. Stabilirea unui nr mic de reactii.
IDENTIFICAREA SM ORGANICE
- Pentru identificarea s.m. organice in multe cazuri, reactiile de identificare sunt date de o anumita
grupare functionala din molecula fara suficienta specificitate;
- Reactiile specifice sunt mai rare si din aceasta cauza FRX utilizeaza constantele fizice ale substantelor
respective si capata o importanta deosebita metodele fizico-chimice.
REACTIILE DE IDENTIFICARE ALE BARBITALULUI ( VERONAL)
EX. DE IDENTIFICARE A UNOR SA ORGANICE DIN FRX
- 5.5 dietil-2,4,6-(1H,3H,5H)-pirimidinotriona sunt redate in FRX
H

O
N
C2H5

O
C2H5
N
H
-

Barbitalul tratat cu Co(NO3)2 solutie alcoolica si apoi amoniac trece intr-un complex de culoare violeta
a carui structura se presupune a fi urmatoarea: [CoIII(NH3)5OH] (C8H12N2O3)2
Barbitalul tratat cu H2SO4 si formaldehida (reactivul Marquis) la cald, la zona de contact a celor 2
lichide nu apare nicio coloratie.

REACTIILE DE IDENTIFICARE PENTRU BARBITAL SODIC


Barbitalul sodic (veronalul sodic, medinal) este sarea de sodiu a 5,5-dietil-2,4,6-(1H,3H,5H)pirimidinotriona.
O- Na+
N
C2H5
O
C2H5
N
29

FRX prevede urmatoarele reactii de indentificare:


- Reactie cu Co(NO3)2 in metanol si amoniac cand se obtine un complex de culoare violet (la fel ca la
barbital);
- Reactia cu reactivul Marquis cand la zona de contact a celor 2 lichide nu apare niciun inel colorat (la fel
ca la barbital);
Deoarece aceste 2 reactii sunt identice ca la barbital, pentru o mai precisa identificare s-au introdus in
monografie alte 2 reactii si anume :
a. Reactia cu acid acetic prin care se deplaseaza acidul dietilbarbituric, cand se obtine un pp alb
Se verifica punctul de topire al acestui pp care trebuie sa fie intre 189-191 grade C
b. Reactia in flacara pentru Na: se calcineaza subst iar rezidul umectat cu HCl diluat face efervescenta si
coloreaza flacara in galben
In aceste conditii pentru caracterizarea exacta a celor 2 subst, cand se face analiza subst respective devin
f importante probele de solubilitate in diferiti solventi si reactia solutiilor si anume :
Barbitalul este greu solubil in apa dar solubil in eter sau cloroform iar solutia apoasa are o reactie slab
acida
Barbitalul sodic este solubil in apa si practic insolubil in eter si cloroform iar solutia apoasa are reactie
alcalina.

REACTII DE INDENTIFICARE ALE SUBSTANTELOR DIN CLASA SULFAMIDE


- Reactia cea mai utilizata pentru identif este diazotarea cu azotit de sodiu in mediu de HCl urmata de
cuplarea cu beta-naftol
- Aceasta reactie este pozitiva cu toate sulfamidele( care au gruparea amina aromatica primara libera) si
conduce la formarea unor pp de culoare rosie cu diferite nuante deci nu este specifica
- Astfel la sulfadiazina, sulfadimidina si sulfatiazol culoarea pp este rosu intens, la sulfafurazol sau
sulfafenazol pp este rosu-portocaliu
- Alta reactie foarte utilizata la sulfamide este reactia cu sulfat de Cu in mediu NAOH ce conduce la
obtinerea unor pp care sunt putine diferite intre ele in ceea ce priveste
Exemplu: sulfadiazina si sulfatiazolul dau un pp violet cenusiu, sulfafurazolul verde-albastru,
sulfafenazolul verde deschis, sulfadimidina verde brun care trece in rosu brun.
- Tinand seama de aceasta a fost necesara introducerea altor reactii chimice precum si spectrul in UV si
infrarosu
- Pentru sulfadiazina si sulfadimidina s-au introdus reactia de topire cu carbonat de Na in urma careia
subst respective degaja vapori care albastresc hartia rosie de turnesol si o innegresc pe cea de acetat de
Pb.
- Pentru sulfatiazol s-a introdus reactia de topire fara adaos de carbonat de Na cand subst se coloreaza in
brun roscat si se percepe un miros de amoniac, anilina si hidrogen sulfurat, reactie foarte specifica ce
deosebeste sulfatiazolul de celelalte sulfamide.
- Pentru sulfafurazol si pentru sulfafenazol s-au introdus spectrele de absorbtie in UV
- La sulfafurazol sol 0.001% ,in HCl 0.01 mol/l are un max de absorbtie la X=268nm
- Pentru sulfafenazol sol 0.0005%, in metanol are un max de absorbtie la X=267 nm
La majoritatea sulfamidelor s-a introdus spectrul in infrarosu, acesta fiind un test f specific care asigura
o identif precisa si o diferentiere intre subst respective chiar daca acestea au o structura chimica f asemanatoare.
30

AMESTEC DE SUBSTANTE ORGANICE


Identif in acest caz este mai complicata, deoarece se cunosc putine reactii specifice pentru subst
organice care sa nu fie interferate de alte reactii.
Se impune si in acest caz ca fiind obligatorie separarea componentelor utilizand diferiti solventi cum
sunt : apa, HCl diluat, NaOH si KOH diluat , diferiti solventi organici, in special eterul si cloroformul.
APA
- Diferenta mare de solubilitate in apa la rece sau la cald a SM organice permite in multe cazuri separarea
acestora in vederea executarii reactiilor de identif necesare
FENACETINA SI SALICILAT DE Na
- Pulberea se trateaza cu apa si apoi se filtreaza. Salicilatul de Na se dizolva usor si va trece in filtrat, in
timp ce fenacetina greu solubila in apa nu se va dizolva si va ramane pe filtru.
- In filtrat se identifica salicilatul de Na cu clorura ferica (FeCl3) cand se obtine un complex colorat in
violet.
- Fenacetina se identif cu acid nitric(acid azotic) cand se obtine un pp galben cristalin si cu dicromat de
potasiu in mediu de HCl cand se obtine o coloratie rosie.
ACIZII
- Cu ajutorul acizilor ( in special HCl diluat) se poate realiza separarea unor amestecuri : practic se
utilizeaza apa acidulata cu o cantitate de HCl diluat.
- Asa de exemplu un amestec de fenacetina si codeina se separa prin tratare cu HCl diluat in care
codeina este usor solubila, iar fenacetina insolubila.
HIDROXIZII DE Na SI K
- Ca si in cazul acizilor practic se utilizeaza in apa in care s-a adaugat NaOH sau KOH. In acest fel se
poate separa un amestec de fenacetina si aspirina.
- Fenacetina este f greu solubila in apa si insolubila in NaOH, iar aspirina este greu solubila in apa si usor
solubila in NaOH. Amestecul se trateaza cu apa alcalinizata cu NaOH si apoi se filtreaza.
- In filtrat se identifica aspirina iar pe filtru ramane fenacetina care se va identif prin reactiile
caracteristice.
- Un amestec de codeina si aspirina se separa usor datorita solubilitatii f bune a aspirinei in NaOH,
comparativ cu cea a codeinei.
SOLVENTII ORGANICI
- In multe cazuri se recurge la separarea subst cu ajutorul solventilor organici printre care cei mai utilizati
sunt eterul si cloroformul.
- Asa de exemplu, un amestec de aspirina si salicilat de Na se separa astfel : amestecul se trateaza cu 5 ml
eter si se filtreaza.
- Solventul organic va extrage numai aspirina, salicilatul de Na ramane sub forma de reziduu .
- Solutia eterica se evapora si cu rezidul se fac reactiile pt aspirina. Salicilatul de Na neextras se va identif
cu reactiile caracteristice.
31

SEPARAREA COMBINATA
In unele cazuri pentru separarea amestecurilor de subst este necesara folosirea a 2 sau mai multi
solventi.
Acest procedeu se aplica mai ales la amestecurile constituite din 3 sau mai multe SM.
Pentru separarea amestecului constituit din antipirina, cafeina si bromura de K se adauga mai intai eter
care extrage antipirina.
Portiunea neextrasa se trateaza cu cloroform la cald care extrage cofeina. Reziduul este constituit din
KBr care se dizolva in apa si se identif .
In amestec de aspirina, fenacetina si cafeina se trateaza cu NaOH care dizolva aspirina.
Se filtreaza si portiunea nedizolvata se trateaza cu apa care dizolva cofeina; reziduul contine fenacetina
care se va identif cu reactiile specifice.
Un amestec constituit din aminofenazona, luminal si cafeina se separa utilizand solubilitatea diferita a
celor 3 subst in apa.
Astfel, aminofenazona este solubila in apa, luminalul este f greu solubil in apa iar cofeina este greu
solubila in apa.
Amestecul se trateaza cu o cantitatea mica de apa care dizolva numai aminofenazona. Apoi se adauga
cloroform care extrage cofeina.
Portiunea ramasa nedizolvata dupa extragere cu cloroform se trateaza cu eter care va extrage luminalul.
In multe cazuri asemenea separari sunt utile numai pentru reactiile de identif; pentru determinari
cantitative sunt necesare procedee suplimentare sau daca se utilizeaza procedeele de mai sus operatiunile
trebuie sa fie facute cu mare atentie si extragerea cu un solvent organic se repeta de cateva ori.
In unele cazuri asemenea amestecuri de SM care vin la analiza n-au o tehnica bine pusa la punct si este
necesara toata priceperea analistului pt stabilirea ei.
Sunt situatii cand stabilirea unor tehnici capata caracterul unei cercetari stiintifice.
Este cazul multor retete farmaceutice magistrale, preparate in farmacii care nu au stabilita metoda de
control si pentru stabilirea careia analistul trebuie sa recurga la toate cunostintele sale.
IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR NECUNOSCUTE DE NATURA ORGANICA
In acest caz este necesar sa se execute initial analiza elementara calitativa. Prin cunoasterea elementelor
care intra in compozitia subst organice se obtin indicatii asupra grupelor functionale pe care le contin subst de
analizat.
Iata un tabel sumar, dar orientativ:
- Grupa I care contine elementeleC si H fac parte hidrocarburile saturate, nesaturate si aromatice
- Grupa a II-a (C, H, X) fac parte derivatii halogenati ai hidrocarburilor
- Grupa a III-a (C, H N) cuprinde: amina, imina, nitril, izonitril, hidrazina, hidrazona, alcaloizi,
heterociclu cu N
- Grupa a IV-a (C, H,S) cuprinde mercaptan, tioeter, tiofen
- Grupa a V-a (C, H,S,N) cuprinde tiocianat, tiouree, tiosemicarbazone
Dupa ce se stabileste din care grupa face parte subst de analizat, se procedeaza la analiza functionala
incercand reactiile specifice pt fiecare functiune in parte prevazuta in grupa respectiva, pentru ca prin eliminare
sa se poata stabili gruparea functionala prezenta pe molecula subst de analizat.
32

Dupa stabilirea exacta a gruparilor functionale prezente pe molecula subst de analizat trebuie determinat
si produsul;
Pentru obtinerea unor rezultate, analiza organica elementara si functionala este corelata cu unele probe
preliminarii sau de tatonare.
Din acestea mentionam :
- Solubilitatea in apa ( la rece si la cald ), alcool , eter, acetona, hidroxizi alcalini, acizi
- Reactia solutiei
- Reactia de culoare cu FeCl3
- Extragerea cu solventi organici
EXTRAGEREA CU SOLVENTI ORGANICI
Subst organica de analizat se aciduleaza cu acid tartric si se extrage de 3 ori cu eter. Se separa prin
decantare. Extractul eteric A poate contine luminal, veronal, rezorcina, bromural, saliprina , fenacetina,a
spirina.
Solutia apoasa ramasa se extrage de 3 ori cu cloroform fierbinte ( cate 20 ml ). Se separa prin decantare.
Extractul cloroformic A poate contine teobromina, cafeina, aminofenazona.
Solutia apoasa ramasa se trateaza cu 20 ml eter si se alcalinizeaza cu putin NaOH diluat. Apoi se
extrage de 2 ori cu eter ( cate 20 ml); se separa prin decantare.
Extractul eteric B poate contine anestezina, antipirina, chinina, novocaina, atropina, stricnina.
In afara de aceste probe preliminarii, analistul poate utiliza si constantele fizico-chimice, precum si
metodele moderne fizico-chimice, in special spectofotometria de absorbtie in infrarosu.
METODE CROMATOGRAFICE UTILIZATE IN IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR CE
CONTIN SUNSTANTE ACTIVE ORGANICE
CSS (cromatografia in strat subtire )
Rezultatele spectaculoase obtinute in domeniul chimiei in ultimele decenii atat in cadrul cercetarii cat si
al multiplelor si variatelor aplicatii ale acesteia, se datoresc intr-o masura considerabila folosirii tehnicilor
experimentale si bagajului teoretic pe care fizica le-a pus la dispozitie. In aceasta directie aplicarea metodelor
fizice in analiza chimica, proces inceput de la constituirea acesteia ca disciplina stiintifica a condus la
elaborarea unor valoroase tehnici de laborator, cu mare potentialitate, printre care se inscrie si metoda
cromatografica cu diferitele sale variante.
CSS este una din noile metode de analiza, care alaturi de celelalte metode cromatografice si fizicochimice in general contribuie la studiul si identif subst chimice naturale si de sinteza
Limitari ale metodei CSS in ceea ce priveste identif subst active de natura organica :
Sensibilitatea este de multe ori limitata
Nu este adecvata pentru compusi volatili
Are nevoie de mai multa indemanare din partea operatorului decat in cazul HPLC
Cromatografia de gaze cu coloane capilare s-a dovedit a fi f folositoare in identif med din tesuturi si
lichide biologice. Imbunatatirea tehnicilor de introducere a probelor si de prelucrare a coloanelor capilare a
creat conditii de analiza prin cromatografie de gaze cu coloane capilare pt toate med analizate cu coloane
clasice cu umplutura.
Principalele avantaje ale cromatografiei de gaze sunt:
- Inalta frecventa de separare, chiar amestecurile complexe putand fi descompuse in componenti
33

Nivel f inalt de sensibilitate in identif componentilor ( de ex doar cateva mg de mostra sunt suficiente pt
o analiza completa)
Viteza de analiza rapida
Exactitate a rezultatelor
Functionarea si cheltuielile de exploatare nu necesita personal cu inalta calificare
Cost relativ redus al instalatiei
Viabilitate ridicata

Cromatografia de lichide de inalta performanta ( HPLC)


Acopera azi, in proportie aprox 80%, analiza subst moleculare: organice, organo-metalice si compusi cu
masa moleculara ridicata ( naturali sau sintetici). De aceea, impreuna cu cromatografia de gaze constituie punct
de sprijin important in analizele chimice moderne.
Analiza calitativa in IR
Identif compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale sau a celor speciale propuse de
societati sau edituri.
Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute plecand de la compusi aflati in
aceeasi stare fizica cu cei supusi identificarii.
Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu toate cele
care formeaza spectroteca considerata in vederea stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.
Analiza calitativa in UV-VIS
Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta ( sau transmitanta) cu ajutorul
spectrofotometrelor automatizate, inclusiv pt analiza multicomponent.
Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor analiti, din amestecuri cu mai
multe componente dupa prealabila lor separare prin cromatografia de lichide.
Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si 900 nm. Limita inferioara se
opreste la circa 185nm datorita aerului care devine opac sub aceasta limita.

CURS 8, 25.11.2013
Metode volumetrice utilizate in analiza medicamentului
Puterea rotatorie
[m]t=puterea rotatorie specifica;
D20(5)= puterea rotatorie specifica
[m]D20= puterea rotatorie specifica

a unui lichid;
a unuei substante in solutie
Puterea rotatorie se masoara cu ajutorul polarimetrului
Puterea rotatorie specifica rotatia planului luminii polarizate (rad) determinate de un strat cu grosimea
de 1 m dintr-un lichid sau o solutie care contine 1 kg de s.a. intr-un metro cub de solutie masurata la
temperature t si lungimea de unda lambda.
Unitatea de masura in SI este radian ori metro cub/kg
- In practica se foloseste ca unitate de masura milirad ori m cub/kg;
34

- FRX defineste aceste unitati conventionale (care se folosesc in practica);


Puterea rotatorie a unui lichid reprezinta unghiul de rotatie a planului luminii polarizate, ezprimata in grade,
la temperature de 20 C (plus minus 5) la o lungime de unda D=589,3 nm, corespunzatoare radiatiei D
monocromatice a Na ape un strat cu grosimea de 1 dm.
Un radian, avand simbolul rad, este o unitate de masura pentru masura unghiurilor.
- Un radian este egal 180C/pi;
- Lungimea unui arc de cerc este egala cu raza inmultita cu masura in radiani a arcului;
- Radianul face parte din SI.
-

Puterea rotatorie specifica a unei substante in solutie marimea unghiului de rotatie a planului
luminii polarizate, exprimat in grade la temperature de 20C plus minus 5, la o lungime de unda
corespunzatoare radiatiei D monocromatice a Na masurata pe Solutia substantei de analizat care
corespunde la 1 g/cm3 de substanta. Se exrpima in [1g/ml];

Puterea rotatorie specifica a unui lichid marimea unghiului cu care este rotit planul luminii
polarizate care corespunde radiatiei D monocromatice a Na la temperature de 20C masurata pentru un
strat cu lungimea de 1 dm raportat la masa volumica. Se exprima in [1g/cm3];
Dpdv al controlului medicamentului polarimetria permite determinarea cu o sensibilitate de plus minu
0,05 unitati de grad si cu o aproximatie de plus minus 0,05C.

Inainte de orice determinare polarimetrica, aparatul se aduce la punctul 0 cu tubul polarimetric inchis la
ambele capete;
In cazul unei solutii a unei substante aducerea aparatului la 0 se face cu tubul polarimetric umplut cu
solventul.
Daca substanta este solida se cantareste la balanta analitica o anumita cantitate de substanta in balonul
cotat;
Daca solutia nu este limpede se filtreaza, dupa care se fac determinarile pe solutia limpede;
Se fac 5 citiri la polarimetru dupa care se face media acestor citiri, notand cu plus/minus sensul de
rotire.
D20 = /l X 0 formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru lichide unde:
marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L = lungimea tubului polarimetric (dm);
0 = masa volumica la temperature de 20C exprimata in g/cm3;
D20= X 100/(l X c) = formula de calcul pentru puterea rotatorie specifica pentru substante in solutie,
unde:
= marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L = lungimea tubului polarimetric (dm);
C = concentratia solutiei in substanta de analizat (exprimata in procente de masa/volum);
C= X 100/l X D20 daca cunoastem puterea rotatorie specifica a unei substante intr-un anumit
solvent, la o anumita temperature, si o anumita lungime de unda putem afla concentratia unei substante
necunoscute, unde:
marimea unghiului cu care este rotit planul luminii polarizate;
L lungimea tubului polarimetric (dm);
D20= puterea sotatorie specifica (tabele);
35

Aplicatii in controlul medicamentului


- Identitate;
- Puritate;
- Dozare.
Daca cunoastem puterea rotatorie specifica D20 intr-un lichid, masurand unghiul de rotatie, putem afla
concentratia substantei analizate.
Indicele de refractie
- Cand un fascicul de lumina monocromatica patrunde dintr-un anumit mediu cu o anumita densitate
optica intr-un alt mediu cu o alta densitate optica, radiatia monocromatica poate suferi 2 fenomene
diferite: o reflexie (se intoarce inapoi sub acelasi unghi unghiul de incidenta i) si o refractie (strabate
mediul si se apropie de normal (unghi de refractie r);
- n = sini/sinr viteza luminii in vid/ viteza luminii in substanta de analizat;
- n = indicele de refractive;
- i = unghiul de incidenta;
- r = unghiul de refractie;
- Daca i = 90 grade si sini =1 => marimea unghiului de refractive este maxima. Dupa acest principiu este
construit un refractometru.
- Reprezinta criteriu de identitate, puritate si poate fi valorificat pentru determinari cantitative;
- Indicele de refractive este o caracteristica pentru fiecare substanta;
- La o anumita temperature (20C) si o anumita lungime de unda (589,3 nm); FRX noteaza indicele de
refractive cu nD20.
- Indicele de refractive depinde:
De temperatura;
Lungimea de unda;
Presiune;
Natura substantei;
Natura solventului.
-

In cazul unei solutii daca mentinem toti factorii de mai sus constant, singura variabila este concentratia
s-a constatat ca exista proportionalitate intre valorile indicelui de refractive si concentratie =>
constanta poate fi utilizata ca si criteriu de identitate, puritate si dozare.
Indici oficinali FRX
Indicele de aciditate numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii liberi din 1 g proba de
analizat;
Indicele de ester = numarul de mg KOH necesar pentru a neutraliza acizii grasi rezultati din
saponificarea a 1 g proba de analizat;
Indicele de hidroxil numarul de mg KOH echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1 g
proba de analizat;
Indicele de iod = numarul de g I2 fixat de 100 g proba de analizat;
36

Indicele de peroxide = numarul de ml de Na2S2O3 ori 10-2 M oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric
prin actiunea peroxizilor din 1 g proba de analizat;
Indice de saponificare nr de mg KOH necesar pentru neutralizarea tuturor acizilor, a acizilor liberi si a
celor rezultati prin saponificarea a 1g proba de analizat.
Principalele metode de analiza utilizate in laborator. Consideratii teoretice si practice
2.1.Metode titrimetrice volumetrice
2.1.1. Principiu
Metodele titrimetrice volumetrice, numite in continuare volumetrice, reunesc metodele chimice de
analiza in care analitul din solutia de analizat se determina cantitativ prin masurarea volumului de
reactive de concentratie cunoscuta, care se aduce in cantitate stoechiometrica peste acesta.
aA + bB -> cC + dD + . => volum de echivalenta;
stoechiometria reactiei ori concentratie titrant, volum de echivalenta => concentratia probei.
La baza oricarei metode chimice de analiza sta o reactie chimica:
xX + yY + uU + vV + .
Care, pentru a putea fi utilizata in volumetrie, trebuie sa indeplineasca mai multe conditii:
Sa fie cantitativa transformarea, practic totala, a partenerilor de reactie (X, Y) in produsi de reactie (U,
V etc);
Reactia sa fie simpla, cu mecanism cunoscut, fara reactii secundare;
Sa aiba viteza mare de reactie;
Evidentierea neta a punctului final de titrare;
In cursul reactiei chimice are loc practic un transfer al unei particule P (ioni, molecule, electroni) intre
analit si titrant:
X -> U + P;
Y + -> V;
X + U - > U + V.
Reactivii in volumetrie
Standardul primar folosit in titrimetrie trebuie sa aiba urmatoarele proprietati:
Puritate mare;
Masa molecular mare pentru ca erorile de cantarie sa fie cat mai reduse;
Stabilitate in aer si in solutie;
Nehigroscopic;
Solubil in solventul folosit la titrare;
Sa reactioneze rapid si stoechiometric cu analitul de interes, fara reactii secundare;
Cost cat mai redus;
Numarul substantelor cu aceste proprietati (tabelul 2.2) este redus, in practica folosindu-se substante
care indeplinesc cele mai multe dintre conditiile enumerate;
In titrimetrie se folosesc urmatoarele tipuri de titranti;
Solutii standard primar se obtin prin cantarirea directa a unui standard primar;
Solutii standard secundar se obtin din substante chimice care nu corespund criteriilor specifice
unui standard primal, dar sunt standardizate cu ajutorul unui standard primar;
37

Substante ca hidroxidul de sodium sau acidul clorhidric nu pot fi folosite la obtinerea unor solutii
standard primar avand o puritate variabila.
Din acestea se obtin solutii standard secundar care, dupa standardizare, pot fi folosite la
standardizarea altora.
Solutii standard diluate sunt obtinutte prin diluarea solutiilor standard primare si seucndare
standardizate.
Standarde primare si utilizarea lor in titrimetrie
Standard primar
Ftalat acid de potasiu
Iodat de potasiu

Tipuri de titrimetrie
Acido bazica
Redox

Zinc metalic
Colura de sodiu

Complexometrie
Prin reactii de precipitare

Utilizare
Standardizarea
solutiei
de
hidroxid de sodium si de acid
percloric in mediu de acid acetic
glacial;
Standardizarea
solutiei
de
tiosulfat de sodiu
Standardizarea solutiei de EDTA
Standardizarea solutiei de azotat
de argint

Detectia in titrimetrie
- Sesizarea Punctului de echivalenta se poate face prin mai multe metode, cele mai des intalnite fiind
metodele vizuale.
-

Metode vizuale (volumetria chimica) > metode instrumentale (volumetria fizico-chimica) >
modificarea unei insusirii fizice a participantilor la reactia chimica.

In titrimetria chimica detectarea PE are la vaza o reactie secundara intre titrant si a subsantei numita
indicator adaugata sistemului, reactie care are loc dupa consumarea completa a analitului. Indicatorul va
suferi o schimbare care poate fi detectata (de exemplu, modificarea culorii):
Analit + titrant -> PE (cantitate stoechiometrica);
Indicator + titrant -> PF punct final
Culoare 1
culoare 2

La PF sesizarea schimbarii se face dupa ce a reactionat o cantitate suficienta de indicator cu titrantul,


ideal aceasta cantitate trebuie sa fie foarte mica;
In titrimetria fizico-chimica se masoara cu ajutorul instrumentelor o insusire fizica a sistemului, cum ar
fi: diferenta de potential, conductibilitate, intensitate de curent, absorbanta etc; corelata cu modificarea
concentratiei analitului sau produsului de reactie in timpul titrarii. Curba de titrare permite determinarea
directa a PE si reprezinta variatia semnalului masurat in functie de volumul de titrant adaugat. In cazul
multor instrumente, aceasta se inregistreaza automat pe masura ce are loc titrarea.
Titrarile bazate pe modificarea unei insusiri fizice a solutiei in cursul reactiei chimice sunt rare (de
exemplu, reactia dintre acidul oxalic si permanganat de potasiu cand are loc modificarea culorii datorita
consumarii permanganatului);
38

Clasificarea metodelor volumetrice


Clasificarea metodelor titrimetrice volumetrice se realizeaza dupa mai multe criterii (modul de executie
al titrarilor, reactia chimica, modul de detectie a punctului de echivalenta, natura solventului in care are
loc reactia);
In continuare, tratarea metodelor volumetrice se va face in principal tinand cont de clasificarea in
functie de reactia chimica, intr-o abordare coroborata cu celelalte principii de clasificare, accentuand
metodele cu aplicabilitate in laborator.
In functie de reactia chimica, metodele titrimetrice se impart in:
Titrimetria prin reactii cu formare de combinatii complexe (complexometria);
Titrimetria prin reactii de diazotare (nitritometria);
Titrimetria prin reactii de precipitare;
Titrimetria prin formare de compusi greu disociati;
Titrimetria prin reactii redox (redoxometria);
2.1.2. Volumetria prin reactii acido-bazice (protometria)
2.1.2.1 volumetria prin reactii acido-bazice in mediu apos
se bazeaza pe reactii de neutralizare a acizilor cu baze, respectiv, a bazelor cu acizi din medii apoase;
titrosubstante
ca titrosubstante, in volumetria acido-bazica se utilizeaza:
acidul oxalic;
biiodatul de potasiu;
acid benzoic;
carbonatul de sodiu;
boraxul;
iodatul de potasiu.
Indicatori acido-bazici (de pH):

Se disting mai multe grupe de indicatori:


-

indicatori de culoare;
indicatori de fluorescenta;
indicatori turbidimetrici (precipitare);
indicatori de adsorbtie.
Indicatori turbidimetrici
sunt indicatorii care-si schimba brusc solubilitatea in functie de pH-ul solutiei. In general acestia sunt
substante coloidale care la punctul de echivalenta coaguleaza. Se utilizeaza in cazul solutiilor colorate
sau la dozarea acizilor si bazelor slabe. Intervalul lor de viraj este ingust si puternic influentat de
temperatura (ex: izonitrozoacetil p-aminobenzen);

39

Indicatori de adsorbtie sunt substante care se adsorb (desorb) pe (de pe) suprafata unor coloizi ce se
formeaza in timpul titrarii concomitent cu schimbarea culorii la punctul de echivalenta (exemplu, galben
de tiazol);

Indicatorii de fluorescenta sunt acei indicatori care la o anumita valoarea a pH-ului, in lumina UV
devin fluorescenti sau isi pierd fluorescenta si sunt utilizati in cazul solutiilor puternic colorate sau a
celor netransparente (ex: tetrabromfluoresceina, albastru de timol etc.)

Aplicatii ale protometriei in mediu apos metoda se bazeaza pe o reactie cu schimb de protoni, folosind
fie o solutie titrata de acid pentru dozarea substantelor cu functie bazica fie o solutie titrata de baza tare
pentru determinarea substantelor cu functie acida;

Se aplica s.m. care sunt acizi sau baze relativ tari, solubile in apa sau in solventi miscibili cu apa;
Dozarea acizilor tari: HCl, acid sulfuric, acid azotic;
Dozarea bazelor tari: hidroxizi alcalini, hidroxizi alcalino-pamantosi;
Acizi organici: acid acetic, benzoic, boric, nicotinic, barbituric etc;
Baze organice: amoniac, urotropina, meprobamat etc.

CURS 9, 02.12.2013
Volumetria prin reactii acido-bazice in mediu neapos
- Apa prezinta ca mediu de reactie o serie de dezavantaje:
Multe s.m. sunt insolubile in apa;
Este un solvent care niveleaza taria acizilor tari si a bazelor tari facand imposibila titrarea
acestora din amestecuri utilizand metode directe;
Nu poate releva functiile acide sau bazice ale unor substante in asa fel incat sa fie titrabile, dozarile
directe de acizi sau baze;
Protometria in solutii neapoase este indicata ca metoda cantitativa in determinarea substantelor
medicamentoase inca din 1955 (Farmacopeea US XV);
Protometria in mediu neapos, pe langa faptul ca a extins posibilitatile de determinare cantitativa la
un numar foarte mare si divers de substante, a adus si o interpretare progresista a acestor procese;
- Teoriile protonica si electronica considera ca fiecare substanta se caracterizeaza printr-o aciditate sau
bazicitate proprie, intrinseca dependenta de structura moleculara a substantei polare, independenta de
solvent;
- Proprietatile acide sau bazice ale substantei sunt relevate in solutie, solventul consituind prin actiunea sa
de modificare a aciditatii sau bazicitatii intrinsece, un factor extrinsec.

Protometria in mediu neapos


Avantaje pot fi titrate substante medicamentoase:
Acizi sau baze slabe, sau foarte slabe;
Neutre in apa;
Din amestecuri complexe de substante cu polaritati bazice sau acide apropiate;
40

Permite titrarea directa a principiilor active din formele farmaceutice fara sa fie necesara o separare
prealabila.
-

Erori de titrare mai mici datorita tensiunii superficiale scazute a solventilor organici;
Titrarea unor cantitati mai mici de substanta;
Temperatura nu are o influenta majora asupra titrarii;

Dezavantaje:
Solventi organici toxici CI sa se inhaleze mult timp aceste substante;
Toxicitate;
Manualitate trebuie manipulate mai cu grija, experienta;
Cost crescut comparativ cu apa.

Protometria in mediu neapos


Caracterul acido-bazic al unei substante depinde de:
Aciditatea/bazicitatea intrinseca
Dependenta de structura chimica: aciditatea grupari carboxil, fenolice; bazicitatea grupari aminice;
Independenta de solvent.
Aciditatea/bazicitatea ionica sau aparenta a substantei
Se manifesta in solutii
Dependenta de afinitatea relativa fata de protoni a substantei si a solventului;
In functie de solvent, o substanta poate manifesta fie proprietati acide, fie bazice.
Solventii neaposi:
Proprietatile acide/bazice ale substantei sunt evidentiate prin dizolvare intr-o baza/acid;
Echilibre in mediul neapos:
Solvent cu proprietati bazice/SM cu caracter acid:
SH + H-A SH2+ + A-;
H-A acidul, SH solvent bazic; SH2+ - solvent solvatat, A- - baza conjugata.
Cresterea bazicitatii solventului va duce la deplasarea echilibrului spre dreapta (disocierea completa a
bazei);
Solvent cu proprietati acide/SM cu caracter bazic
SH + B S- + HB+
SH solvent acid, B baza; S- - anionul solventului, HB+ - acidul conjugat
Clasificarea solventilor neaposi
Dupa natura lor:
Solventi inerti (aprotici); benzen, toluen, CHCl3, CCl4, acetat de etil;
Solventi protici
+ protofilici NH3, etilendiamina (EN), dimetilformamida (DMF), pridina (Py), dioxan, cetonele
(acetona, metil-etilcetona), nitrili (acetonitril), dimetilsulfoxid (DMSO);
+ protogenici acizi carboxilici (acetic glacial, formic, propionic etc);
+ amfiprotici alcooli (metilic, etilic, etilenglicol etc)

41

Dupa capacitatea de a modifica taria acizilor/bazelor dizolvate:


Solventi de nivelare: protogenici, protofilici
+ niveleaza functia acida sau bazica;
Vor exalta caracterul acid sau bazic al substantelor
CH3 (CH2)2-NH2 + CH3COOH CH3-(CH2)2-NH3+ + CH3-COOPiridina + acid acetic piridinaH+ + CH3COO

Solventi denivelatori: aprotici


+ determina o diferentiere neta in taria acizilor si bazelor;
+ nu au caracter acid sau bazic -> substantele sunt foarte putin disociate;
+ transferul protonului se va face direct de la acid la baza fara interventia solventului.

Mecanismul de interventie al solventului


1. Capacitate de dizolvare dependenta de proprietatile fizice ale solventului si capacitatea de
solvatare a ionilor sau moleculelor SM;
2. Efectul prototropic caracterul donor sau acceptor de protoni;
3. Constanta dielectrica (epsilon) rol in disocierea ionica a substantei dizolvate.

II. efectul prototropic


Solventii:
Reactioneaza cu substantele dizolvate;
Pot transforma o legatura covalenta in una ionica
S-H + B S-- HB+ (efect prototropic)
S-- HB+ S- + HB+ (constanta dielectrica)
S-H + B S-- HB+ S- + HB+
Ionizare
disociatie ionica (constanta dielectrica)
(efect prototropic)

III. Constanta dielectrica


Disocierea unei substante ionice
A+B- A+ + BClasificarea solventilor:
Putin disocianti: epsilon < 10-15; ex: benzenul (2,28);
Mediu disocianti: 15<epsilon<40;
Puternic disocianti: epsilon>40; ex: apa (80,4)
Constanta de disociere ionica a unei substante este cu atat mai mare cu cat constanta dielectrica a
solventului este mai mare;
Exemple de interventie a solventului
Solventi protogenici acid acetic glacial
R-NH2 + acid acetic -> R-NH3+ + CH3COOR-NH2 + CH3COO- -> R-NH3+ + CH3COO-

42

R-NH2 + acid acetic -> R-NH3+-CH3COO- -> R-NH3+ + CH3COOIonizare (efect prototropic) disociatie ionica (constanta dielectrica)
Solventi protofilici DMF
R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH3)2NHCHO+
R--(CH3)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
R-H + (CH3)2NCHO -> R--(CH2)2NHCHO+ -> R- + (CH3)2NHCHO+
Ionizare
disociatie ionica
Exemple de interventie a solventului
In protometria in mediu neapos, cresterea caracterului acid sau bazic al SM se realizeaza:
In cazul bazelor prin dizolvarea in solventi protogenici (acizi);
In cazul acizilor prin dizolvarea in solventi protofilici (bazici);
Cresterea caracterului acid/bazic este cu atat mai mare cu cat diferenta dintre valoarea pKa (pKb) ale
solventului si pKa (pKb) a substantei este mai mare;
Solutii titrate
Titrarea substantelor bazice
Solutia titrata: acid percloric 0,1N;
Acid percloric in acid acetic sau dioxan;
Titru stabilit cu ftalat acid de potasiu.
Titrarea substantelor acide
Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1 N;
Metoxid de sodiu in benzen;
Titru stabilit cu acid benzoic.
Indicatori acido-bazici in mediu neapos
Se aleg astfel incat erorile posibile sa fie cat mai reduse -> se va tine seama de:
Mediul de reactie (solvent);
Natura substantei care se dozeaza;
Nuantele prin care trece indicatorul in jurul punctului de echivalenta.
Alegerea indicatorului
Solventi acizi (acid acetic glacial, anhidrida acetica, acid propionic)
Cristal violet in acid acetic glacial;
Solventi bazici (DMF, piridina);
Albastru de brom-timol in DMF;
Solventi neutri (acetona, dioxan, benzen);
Galben de metanil in dioxan.
Mecanismele schimbarii culorii indicatorilor
Cristal violet clasa indicatorilor trifenil metanici
Violet H+ - albastru verde H+ galben.
43

Concluzii
SM cu caracter bazic:
Solventi: protogenici (acizi);
Solutia titrata: acid percloric 0,1N in acid acetic glacial sau dioxan;
Indicator: cristal violet in acid acetic glacial; sau galben de metanil in dioxan.
SM cu caracter acid:
Solventi: protofilici (bazici);
Solutia titrata: metoxid de sodiu 0,1N in benzen;
Indicator: albastru de bromtimol in DMF

Aplicatiile protometriei in mediu neapos


- SM cu grupari functionale bazice:
Amine primare, secundare, tertiare;
Amide;
Compusi azotati heterociclici: fenazona, aminofenazona, antibiotice, alcaloizi, baze purinice,
antihistaminice;
Saruri organice si anorganice (prin partea lor bazica);
Saruri de alcaloizi.

Observatii
Pentru alegerea conditiilor optime de reactie este necesara o evaluare a:
Structurii substantei:
Existenta unei singure grupari bazice slabe sau foarte slabe;
Prezenta in aceeasi molecula a doua sau mai multe polaritati bazice mai mult sau mai putin apropiate
ca tarie;
Amestecului din care face parte substanta:
Substanta in care polaritatile acide sau bazice se neutralizeaza sau compenseaza (ex: clorhidratii,
sulfatii, azotatii);
Amestecuri de baze tari si slabe sau amestecuri cu polaritati apropiate;
Forme farmaceutice.

SM cu o singura grupare bazica:


Baze: codeina, reserpina, efedrina, papaverina;
Saruri alcaline ale acizilor organici: salicilati de sodiu, benzoat de sodiu, citrat de sodiu, gluconat de
potasiu;
Saruri ale bazelor organice cu acizi organici sau anorganici: fosfat de codeina, propionat de
eritromicina, malea de prometazina.

SM cu o singura grupare bazica:


Dizolvare in acid acetic glacial
Titrare cu acid percloric 0,1N in prezenta cristalului violet;
44

La papaverina si codeina.
SM cu doua sau mai multe grupari bazice titrabile
Hidrazida izonicotinica H.I.N;
Procaina;
Tetracaina;
Chinina;
Vitamina B1;
Aminofenazona;
Fenazona.
Bazicitatea scade R2NH>R-NH2->R3N>N heterociclic > Ar-NH2

Chinina 2 atomi de azot cu polaritati slabe si apropiate, in apa se comporta ca o baza monovalenta, in acid
acetic glacial se comporta ca o baza bivalenta (acidul acetic echivaleaza ambii atomi de azot).
Vitamina B1 tiamina 4 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza amina primara si azotul tertiar din
ciclul tiazolic; ceilalti doi atomi de azot nu interfera titrarea;
Aminofenazona 3 atomi de azot, in acid acetic glacial se titreaza bazicitatea azotului alifatic si bazicitatea
partiala a celor 2 azot din ciclu; dizolvare in acid acetic + dicloretan sau in cloroform -> titrarea azotului din
catena laterala;
-

Saruri ale bazelor cu acizi minerali tari:


In cazul halogenurilor, sulfatilor si azotatilor bazelor organice, bazicitatea este slava -> titrarea se
face doar dupa indepartarea anionilor Cl-, SO42-, NO3-;
Halogenuri
2BH + X- + Hg(CH3COO)2 -> HgX2 + 2CH3COOH + 2BH;
Ex: efedrina clorhidrat, procaina clorhidrat;
Sulfati se indeparteaza cu solutie de benzidina (ppt.);
Azotati reducere cu acid ascorbic si indepartarea vaporilor de azot;

Determinarea SM dupa transformarea in baze


Eliberarea gruparilor aminice dupa hidroliza acida bazica
Titrarea gruparii aminice cu acid percloric 0,1N;
Ex: fenacetina care prin hidroliza (mediu acid ) se transforma in p-fenetidina si acid acetic.

SM cu grupari functionale acide:


Derivati cu hidroxil alcoolic:
+ alcooli primari alifatici;
+ alcool cetilic;
+ colesterol;
+ polioli: glicerina, zaharoza, dextroza.
Derivati cu OH fenolic
+ fenol, vanilina, morfina.

Acizi carboxilici si derivati


45

Acid benzoic, salicilic, nicotinic, nalidixic;


Saruri ale acizilor organici citrati, tartrati;

Compusi cu grupari
Imidice: -CO-NH-CO Amidice - -NH-CO-NH- (derivati barbiturici, sulfamide).
Fenobarbital (titrare cu metoxid de sodiu)

AVANTAJELE DOZARII IN SOLVENTI NEAPOSI


Majoritatea SM (acizi sau baze foarte slabe putin sau insolubile in apa) pot fi titrate (dozate) cu acizi sau
baze relativ tari in solventi neaposi anhidri in care, de obicei, sunt mai solubile;
Titrarea poate fi extinsa si la substantele care in solutii neapoase sunt neutre;
Cel mai important este solventul;
Prin utilizarea corecta a unor amestecuri de solventi neaposi pot fi dozate amestecuri de substante
organice medicamentoase cu polaritati acide sau bazice apropiate;
Metoda poate fi aplicata si la dozarea sm slab acide sau bazice din forme farmaceutice;
Solventii neaposi avand o tensiune superficiala mica, picaturile care se strang din biureta au volum mic > erori mici de titrare;
Dozarile in mediu neapos permit titrari la diferite temperaturi cu evidentierea punctului de echivalenta
cu ajutorul indicatorului sau prin metode fizice (potentiometric, voltametric).

46

CURS 10, 09.12.2013


Electroforeza capilara
Introducere
- Electroforeza capilara este o metoda separativa de analiza care s-a dezvoltat datorita experientei
dobandite in HPLC si procedeelor mai vechi de electroforeza. Ea permite separarea atat a
biomoleculelor pentru care HPLC este mai putin performanta cat si a compusilor cu mase moleculare
mici, dificil de studiat prin procedeele clasice de electromigrare pe suport.
- Electroforeza capilara de inalta performanta (HPCE) si-a facut debutul in laboratoarele de biochimie de
la inceputul anilor 1990 alaturi de o alta metoda numita electrocromatografia capilara.

Principii de baza in electroforeza capilara


Electroforeza capilara corespunde unei adaptari particulare a metodei generale de electroforeza. Aceasta
metoda separativa se bazeaza pe migrarea speciilor purtatoare de sarcini electrice globale din proba
aflata in solutie sub efectul unui camp electric si in contact cu un suport corespunzator.
In tehnica clasica obisnuita, larg utilizata in domeniul bioanalitic, se utilizeaza benzi de material plastic
acoperite cu o substanta poroasa impregnata cu un electrolit. Capetele sunt imersate in 2 rezervoare
independente, continand acelasi electrolit si cuplate la electrozii unui generator de tensiune continua.
Proba este depusa sub forma unui strat subtire transversal pe banda, eventual presarata intre 2 placi
izolante. Speciile hidratate prezente migreza intr-un timp variabil cuprins intre cateva secunde pana la
cateva ore spre una dintre extremitatile benzii. Fiecare compus se diferentiaza prin mobilitatea sa.
Detectia speciilor prezente dupa migrare se efectueaza in general prin transferul acestora printr-un
procedeu de contact pe o membrana unde sunt relevate cu ajutorul unor reactivi specifici. Prelucrarea
datelor se face ca si in CSS.
In electroforeza capilara suportul plan din tehnica clasica este inlocuit de un tub capilar deschid la
ambele capete, din sticla de siliciu cu diametrul variind intre 15 si 150 microni. Acest capilar cu
lungimea 20-80 cm este umplut cu un electrolit tampon.
Mobilitatea electroforetica si fluxul electroosmotic
Particulele aflate in suspensie intr-un lichid la fel ca si moleculele solvatate pot fi incarcate cu o sarcina
electrica a carei marime si semn depind de natura lor si a electrolitului si, in particular, de pH.
Aceasta sarcine provine din fixarea pe suprafata lor a ionilor continuti in electrolitul tampon. Sub efectul
diverselor fenomene (agitare, temperatura, vascozitate, diferenta de potential) aceste particule vor avea
viteze de migrare cu atat mai mari cu cat ele sunt mai mici si au sarcina mai mare.
Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de migrare este rezultatul echilibrului intre forta electrica F
care se exercita intr-un camp electric E cu particule de sarcina q si fortele de frecare care decurg din
vascozitatea (niu) a mediului.
Separarea depinde de asemenea de raportul volum/sarcina ionului hidratat. Speciile neutre se separa
greu fiind necesara adaugarea unui agent ionic in electrolit care sa se asocieze cu acesta si sa provoace o
antrenare diferentiata a lor.
Speciile prezente in proba sunt supuse la doua fenomene principale care se manifesta atat pentru ioni cat
si pentru molecule: este vorba, pe de o parte, de mobilitatea electroforetica proprie lor iar, pe de alta, de
fluxul electroosmotic.

47

Electromigrarea
Toti compusii incarcati electric se deplaseaza in electrolit cu o viteza v care depinde de conditiile
experimentale si de mobilitatea lor electroforetica.
Mobilitatea electroforetica se poate obtine plecand de la electroforegrama, calculand viteza
electroforetica a compusului intr-un camp E si tinand cont de viteza electrolitului.
Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor este curgerea electrolitului numit flux electroosmotic caracterizat prin mobilitatea electro-osmotica.
Electroosmoza
Pentru calcularea mobilitatii electro-osmotice trebuie determinata viteza electroosmotica. Viteza
electroosmotica este raportul intre lungimea capilarului parcursa de un marker neutru in timpul t. Se
utilizeaza ca marker o molecula organica nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care este usor
detectabila prin absorbtia in UV apropiat.
Fluxul electroosmotic aflat la originea deplasarii tuturor speciilor prezente in proba depinde de natura
peretelui intern al tubului capilar.
Acest perete de silice este captusit de grupari silanice care se ionizeaza daca pH-ul este mai mare de 3,
formand o suprafata cu pozitii anionice fixe ce creeaza un potential negativ (potential zeta) alaturi de un
strat cationic.
In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca migrarea cationilor spre catod. Acesti ioni sunt
solvatati si antreneaza moleculele de apa din electrolit dirijiandu-le spre catod. Anionii se deplaseaza
intr-o maniera contra-electroosmotica. Daca se trateaza peretele capilar cu un surfactant de tipul
tetraalchilamoniu, polaritatea se inverseaa, ceea ce conduce la o inversare a fluxului electroosmotic.
In general o suprafata a peretelui capilar negativa provoaca un flux electroosmotic dirijat spre catod si
invers, o suprafata pozitiva provoaca o dirijare a acestuia spre anod.
Cunoasterea fluxului electroosmotic este esentiala pentru practica EC pentru obtinerea de rezultate
reproductibile.

Aparatura utilizata in electroforeza capilara


A. Modul de injectare
- Pentru introducerea unui microvolum de proba care nu trebuie sa depaseasca 1% din lungimea utila a
capilarului, pentru a nu diminua rezolutia, se utilizeaza procedeele:
a) Injectarea hidrodinamica consta in aplicarea unei diferente de potential intre cele doua extremitati
ale capilarului. Procedeul poate fi ameliorat prin crearea unei presiuni de circa 50 mbar in solutia de
proba.
b) Injectare electrocinetica se utilizeaza in electroforeza pe gel si consta in aplicarea unei diferente de
potential intre extremitatile capilarului pentru crearea unei diferente de polaritate.
c) Injectarea prin gravitatie bazata pe diferenta de inaltime intre capetele capilarului.
B. Metode de detectie
a) Detectie UV/VIS;
b) Detectie prin fluorescenta;
c) Cuplarea cu un spectrometru de masa;
48

d) Detectie electrochimica.

Tehnici electroforetice
Tehnicile electroforetice sunt urmatoarele:
A. Electroforeza capilara de zona;
B. EC micelara;
C. EC pe gel:
D. EC prin izofocalizare;
E. EC capilara
EC de zona
Se mai numeste si electroforeza in solutie libera si este procedeul electroforetic cel mai frecvent utilizat.
In acest procedeu capilar este parcurs de electrolit intr-un mediu tampon fie acid (fosfat sau citrat) fie
bazic (borat) sau amfolit (molecule posedand o functie acida si una bazica). Fluxul electro-osmotic
creste cu pH-ul fazei lichide sau poate ramane neutru.
Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii, apoi ansamblul neutru si la sfarsit anionii. Tehnica nu
permite separarea speciilor neutre unele de altele.
EC micelara
Se mai numeste si EC electrocinetica micelara.
In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un compus cationic sau anionic pentru formarea de micele
incarcate electric;
Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb compusii neutri mai mult sau mai putin eficace printro afinitate de tip hidrofil/hidrofob;
Acest tip de electroforeza se aplica moleculelor care au teninda de a migra fara separare (polipeptidele).
EC pe gel
Consta in transpunerea electroforezei pe gel de poliacrilamida sau agaroza. Capilarul este umplut cu un
electrolit continand un gel care produce efect de filtrare ce retine moleculele mari si reduce fenomenul
de difuziune.
Metoda se preteaza la separarea a trei clase mari de biomolecule: polipeptide, oligonucleotide
(fragmente de ADN sau ARN) mono si polizaharide.
EC prin izofocalizare
Aceasta tehnica cunoscuta in egala masura ca electroforeza pe suport consta in crearea unui gradient de
pH liniar intr-un capilar cu peretele tratat cu amfolit. Capilarul este introdus in acid fosforic la anod si in
hidroxid de sodiu la catod, fiecare compus migreaza si se focalizeaza la pH-ul care are aceeasi valoarea
cu potentialul lui izoelectric.
Electrocromatografia capilara
Acest tip de separare asociaza electromigrarea ionilor, proprie electroforezei si procesele de repartitie
intre faze prezente in cromatografie.

49

50