Sunteți pe pagina 1din 18

5.

Genetica bacterian
5. 1. Suportul ereditii
Genetica bacterian studiaz ereditatea i variabilitatea la bacterii.
Suportul material al ereditii este reprezentat de ADN (acidul
dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conine codificat informaia ereditar,
care se exprim prin sinteza unor proteine i se transmite prin replicare i
diviziune la descendeni. Gena reprezint unitatea funcional a ereditii iar
noiunea de gen este cunoscut nc din anul 1909.
Dac nu au loc modificri genetice, toi descendenii unei bacterii vor fi
identici cu bacteria mam i identici ntre ei. O celul bacterian inoculat
pe un mediu de cultur (avnd la dispoziie nutrienii necesari) va produce
prin multiplicare n condiii prielnice (de pH, temperatur, umiditate etc.) o
colonie bacterian, o clon.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin
incorporarea unui fragment de material genetic exogen (prin procesul de
recombinare genetic), fie prin apariia spontan sau indus a unei mutaii
care poate consta n adugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii
unor baze n secvena ADN-ului.
Structura acidului dezoxiribonucleic
ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.
Unitatea structural este format dintr-o baz azotat purinic (adenina,
A; guanina, G) sau pirimidinic (timina, T; citozina, C), o pentoz
(dezoxiriboza) i acid fosforic.
Legturi fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboz
cu carbonul 3 al moleculei adiacente, formnd o caten lung
polinucleotidic. Prin analiza compoziiei n baze azotate a ADNului (provenit
din surse diferite) s-a demonstrat c exist o anumit compoziie care difer
la diversele specii.
Compoziia de nucleotide a ADN-ului este surprinztor de variabil. Suma
procentual a citozinei i guaninei variaz la bacterii de la 22% pn la 74%,
n timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrns (28 58%). La om variaz ntre 39-40% n funcie de tipul de esut (timus 39%;
ficat 39,4%). Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii
de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor n general i a omului n
particular.

Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i


microorganisme au fost folosite drept fundament n vederea stabilirii
relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice
(lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat
n medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi
nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n locuri mai
protejate.
Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este
diferit n funcie de specie, dar se pstreaz constant n cadrul unei
anumite specii.
Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De
exemplu acest raport difer la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este
26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5%
la Proteus vulgaris,51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani i67%
la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori,
compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1)
La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din
citoplasm. La bacteria intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de
baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2
nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda
lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de
bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene
polinucleotidice antiparalele i complementare rsucite n dublu helix. Cele
dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate
opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre
Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea
mai important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate
proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al
informaiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiene succesive, iniial
prin cercetrile lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare
bacterian, ulterior prin experiene care au confirmat rezultatele obinute de
Griffith, dar abia n 1944 Avery, MacLeod i Mc Carthy demonstreaz faptul c
ADN-ul este substratul chimic al ereditii i reprezint materialul genetic al
oricrei celule (funcie ndeplinit aa cum tim astzi de ARN, la
ribovirusuri).
La temperatura camerei ADN-ul este o structur stabil n condiii
fiziologice normale, datorit legturilor intercatenare (2 ntre A i T i 3 ntre

C i G). Dac temperatura depete 65C, stabilitatea punilor de hidrogen


ncepe s cedeze, dublul helix ncepe s se desfac i rezult dou catene
complementare (proces numit denaturare termic). Denaturarea devine
complet la temperaturi care depesc valoarea de 90C.
Renaturarea (reannealing) reprezint refacerea structurii bicatenare a
ADN-ului, iar prin acest proces se poate stabili relaia filogenetic ntre dou
specii (n funcie de procentul de renaturare). De exemplu dac se utilizeaz
ADN denaturat provenit de la E. coli i ADN denaturat provenit de
la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelai izotop (ex. C14), fraciunea de
ADN marcat i evaluat prin diferite tehnici va fi fraciunea din ADN care
este complementar pentru cele dou specii (aceste experiene au stat la
baza brevetrii tehnicilor de hibridare molecular). Renaturarea este un
proces mai lent dect denaturarea.
Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice
importante, folosite fie n tehnologia ADN-ului recombinant, fie n studierea
relaiilor filogenetice ntre diferite specii. Cu ct speciile sunt mai nrudite, cu
att secvenele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine
(lanurile lor monocatenare renatureaz mai rapid).

Genom. Genotip. Fenotip


Genomul reprezint suma genelor unui organism.
Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de
genotip n interaciune cu mediul ambiant se numete fenotip.
Funciile ADN-ului ca material genetic sunt:
- conservarea informaiei genetice;
- replicarea;
- transcrierea i traducerea materialului genetic;
- protejarea materialului genetic propriu (self);
- reglarea i controlul activitii celulare.
Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente
Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantitii de
material genetic urmat de diviziune.
Replicarea ADN const n sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu
molecula parental i identice ntre ele, pe baz de complementaritate
(replicare semiconservativ). Dup ruperea legturilor de hidrogen i
separarea celor 2 catene, fiecare caten servete drept matri pentru

sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante
reacii din lumea vie. Watson i Crick au fost primii care au propus modelul
semiconservativ de replicare a ADN.
n celula care se dezvolt rapid, exist posibilitatea ca nainte de
terminarea primei replicri s se iniieze nc o replicare. n acest caz celula
bacterian va putea fi merodiploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt
copiate de mai multe ori dect n mod normal) sau chiar poliploid (tot
cromozomul a fost copiat de mai multe ori dect n mod normal).
n general, dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea
celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula
bacterian existena cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari
(n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit, pentru c ei
reprezint copii ale cromozomului iniial (deci sunt identici cu acesta).
Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)
In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite ntr-o unitate
de replicare independent numit replicon. Indiferent dac celula are mai
muli cromozomi (celula eucariot este diploid) sau un singur cromozom
(celula procariot), tot genomul trebuie s fie replicat.
Repliconul bacterian este bicatenar i circular, caracterizat prin:
- o secven nucleotidic specific marcnd nceperea replicrii;
- gene care codific sinteza unor proteine specifice numite iniiatori;
- o secven nucleotidic semnal pentru terminarea replicrii.
Exemple de repliconi:
- cromozomul i plasmidele bacteriene;
- genomul bacteriofagilor.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de
repliconi. O gen structural din cromozom are toat informaia necesar
sintezei iniiatorului replicrii (o protein complex). Dup ce replicarea a
nceput, nu mai poate fi oprit pn n momentul cnd se ajunge la
dedublarea cromozomului.
Cromozomul bacterian funcioneaz ca un replicon, fapt dovedit de
experiena n care fragmentele de ADN introduse ntr-o celul bacterian (de
ex. prin conjugare) nu se pot replica dac rmn libere n citoplasm, dar
vor putea fi replicate odat cu ntregul cromozom n cazul n care sunt
integrate n cromozomul bacterian.
Replicarea corect este controlat de un mecanism foarte precis care
identific apariia de nucleotide libere, mperecheate eronat i n momentul

apariiei unui astfel de eveniment nucleotidul este tiat iar polimerizarea se


oprete (corectitudinea citirii este realizat cu ajutorul ADN-polimerazei I).

5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici


Reacia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorit
complementaritii nucleotidelor (structura primar). Prin aceast tehnic se
poate demonstra nrudirea sau eventual identitatea a dou microorganisme,
pe baza gradului (procentului) de omologie a secvenelor nucleotidice.
Din punct de vedere tehnic, cultivm o bacterie de referin (cunoscut)
n aa fel nct s putem marca ADN-ul cromozomial (ns uneori aceste
experiene se fac prin marcarea ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o
variant poate fi reprezentat de cultivarea n mediu cu timidin tritiat,
astfel nct rezult marcarea radioactiv a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul extras
din fiecare microorganism este tratat pentru a obine fragmente
monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface, dac fragmentele de ADN
(int) ale bacteriei testate au secvene nucleotidice complementare cu
fragmentele ADN (sond molecular) de referin. Cu ct gradul de
complementaritate dintre sonda molecular i int este mai mare, cu att
structura hibrid format va fi mai stabil i mai greu de disociat.
Actualmente sondele moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.
Utilitatea hibridizrii acizilor nucleici
Aceast tehnic se utilizeaz n taxonomia microbian i st la baza
funcionrii sondelor nucleotidice, care depisteaz rapid i cu foarte mare
sensibilitate microorganisme sau numai unii determinani genetici ai
acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea sondei
utilizate. Se apreciaz, c pentru a elimina riscul unei hibridizri
ntmpltoare, sonda nucleotidic ar trebui s aib cel puin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea genetic
conceptul amplificrii cantitii de acizi nucleici a fost introdus n 1983 de
ctre Mullis, dar anul 1955, odat cu descoperirea ADN polimerazei I, a
reprezentat un moment crucial. Folosind ADN-polimeraza i dou secvene
scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un test repetitiv de
sintetizare a ADN-ului care a fost numit Reacia de polimerizare n lan
(Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabil s conduc la sinteza unui al doilea lan de
ADN, ntotdeauna orientat 5-3, folosind ca substrat patru nucleotide
trifosfat, un lan de ADN ca matrice (model) i un fragment scurt de ADN
complementar utilizat drept primer (amors). Pentru un lan polinucleotidic,
vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru dou
secvene specifice i diferite ale ADN-ului int.
Iniierea sintezei de ADN va putea avea loc numai dup ce ADN-ul dublu
catenar este denaturat (termic). Urmeaz o etap de rcire, permind astfel
ataarea primerilor (care sunt furnizai n exces) de fragmentele de ADN
complementar. Sinteza de ADN mediat de ADN-polimeraz va produce dou
molecule dublu catenare. Dac procesul se repet, vor rezulta patru molecule
de ADN. ADN-ul se multiplic exponenial (dublndu-se de fiecare dat) ori de
cte ori se repet reacia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de
ADN pornind de la o singur molecul la 1.000 de copii, dac procesul se
repet de 10 ori i la circa un milion de copii, dac procesul se repet de 20
de ori. Acest proces poate avea loc automat ntr-un aparat numit termociclor;
aparatul repet ciclul constnd n denaturarea prin cldur (la 94-96C),
ataarea primerilor (la 40-60C) i sinteza ADN-ului (la 65-75C), folosind
ADN-polimeraza termostabil (Taq-polimeraza) izolat de la o bacterie, care
triete n izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus
aquaticus.
Aplicaiile tehnicii de amplificare genetic
PCR a nceput s fie aplicat n numeroase domenii ale cercetrii
medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum i de metoda de
extragere i de recuperare a ADN-ului. Datorit sensibilitii extrem de mari a
procesului, contaminarea datorat manipulrii produselor de amplificare PCR
obinute anterior n acelai laborator poate reprezenta o problem deosebit
de serioas. Contaminarea se poate realiza fie ntre probe, n timpul
desfurrii protocolului de lucru, fie datorit diferitelor manipulri. Prima
variant este mai uor de evitat, astfel nct sursa major de contaminare n

laboratorul de biologie molecular rmne eventuala contaminare a


reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice
reacie PCR, printr-o reacie de control (control negativ) la care nu se adaug
ADN. Aceast problem a contaminrii nu este superpozabil cu cea a
rezultatelor fals-pozitive. O contaminare ntre probe este mult mai dificil de
identificat. Principalele msuri de precauie ar fi reprezentate de: utilizarea
unor camere de lucru separate pentru manipularea produselor care conin
ADN i respectiv pentru prepararea celorlali reactivi, folosirea micropipetelor
(dou seturi de micropipete, pentru produse cu i fr ADN), utilizarea
conurilor cu filtru, lucrul ntr-o ni special amenajat i dotat cu hot cu flux
laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul c lumina ultraviolet are capacitatea de a
inactiva ADN-ul dublu catenar contaminant.
Alte modaliti de a elimina (diminua) riscurile contaminrii sunt
reprezentate de: includerea unei nucleotide modificate n PCR (nlocuirea
deoxiuridinei-P cu deoxitimidin-3P) i respectiv folosirea enzimelor de
restricie pentru ndeprtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere
invers).
Utilizarea PCR n diagnosticul bolilor infecioase
PCR poate fi util n diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau
parazitare.
n infecia cu HIV, PCR i-a dovedit utilitatea att n diagnostic (secvenele
HIV-1 sunt detectabile n 100% din cazuri atunci cnd virusul este cultivabil i
n 64% din cazuri n situaia unor culturi negative), ct i n stabilirea
prognosticului. n cazul infeciilor cu citomegalovirus (CMV), PCR poate
detecta ADN viral n snge cu 7-10 zile mai devreme dect sunt identificate
antigenemia sau viremia. n mod asemntor, PCR este util n identificarea
altor ageni etiologici (n contextul general epidemiologic, clinic i paraclinic)
precum virusurile hepatitei B i C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau
a unor enterovirusuri.
Diagnosticul infeciilor bacteriene poate beneficia de asemenea de
tehnicile moleculare prin amplificare genic. Actualmente sunt puse la punct
protocoalele de lucru utile identificrii agenilor etiologici ai tusei convulsive
(Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella pneumophila), pneumoniei
atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium
tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis),
gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei
(Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor i ulcerului
(Helicobacter pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene

(Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme


(Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dac n cazul
majoritii bolilor enumerate exist alternative bacteriologice sau
imunologice clasice decisive, atunci cnd sunt implicate microorganismele
aparinnd genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae) se ridic anumite probleme. n tuberculoz, agentul
etiologic se izoleaz relativ dificil din produsele patologice, se multiplic lent,
coloniile vizibile aprnd pe mediile de cultur dup 2-8 sptmni, iar
testele necesare identificrii fenotipice clasice necesit 2-6 sptmni
suplimentare i nu au relevan n 100% din cazuri. Pe de alt
parte,Mycobacterium leprae nu se multiplic pe nici un tip de mediu de
cultur. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile i specifice este
foarte necesar.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile n scopul diagnosticrii
infeciilor grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacieni
imunodeprimai (Pneumocystis carinii), meningitei cu Cryptococcus
neoformans sau al unor infecii cuCoccidioides immitis (ex. la persoane
infectate cu HIV), pentru a enumera cteva din aplicaiile biologiei moleculare
n domeniul afeciunilor produse de fungi.
n domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate
de diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de
origine parazitar (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei
(Plasmodium falciparum) sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma
gondii).
Actualmente s-au pus la punct i alte metode de amplificare genetic
utile n diagnosticul sau n identificarea agenilor etiologici ai maladiilor
transmisibile. n mod suplimentar dorim s menionm faptul c dac iniial
tehnicile de baz ale biologiei moleculare (hibridizarea molecular, utilizarea
sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea
genic) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale
cuprind combinaii de tehnici, din ce n ce mai complexe i mai subtile. Pe de
o parte, exist i o ntreg serie de variante tehnice ale reaciei de
amplificare genic, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care
nu este cunoscut secvena, dar zonele nvecinate au secvene cunoscute);
LCR (ligase chain reaction) n care este necesar s cunoatem integral
secvena ADN-ului int; RT-PCR (PCR nainte de care are loc o reverstranscriere, pornind de ex. de la ARNm i obinnd ADNc); Nested PCR (n
care are loc o amplificare dubl a acidului nucleic folosind 2 perechi de
primeri diferii) etc. Pe de alt parte, tehnica PCR este utilizat din ce n ce

mai frecvent ca o completare esenial a unei alte tehnici (de exemplu RFLP,
restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double
repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR, single
universal primer-PCR; spoligotyping etc).

5. 4. Organizarea genomului
bacterian
PLASMIDELE:
Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de determinani
genetici:

1. genele eseniale, localizate n structura cromozomului bacterian i


2. genele accesorii extracromozomale prezente n structura:
- plasmidelor i
- elementelor genetice transpozabile.
Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de
replicare fizic independent de cromozom (replicon), dar depinznd de factori
codificai de nucleul bacterian. Conin informaie genetic neesenial pentru
viaa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generaiilor.
Dimensiunea plasmidelor variaz ntre 1kb i circa 200 kb. Majoritatea sunt
alctuite din molecule de ADN circular, dar exist i plasmide liniare (ex.
la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar exist i
plasmide de ADN monocatenar (se consider c plasmidele de ADN
monocatenar reprezint de fapt o situaie intermediar n cursul procesului
de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus).
Unele plasmide (numite i epizomi) pot exista alternativ n stare
autonom (libere n citoplasm) sau integrate n cromozomul celulei gazd
(de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide
persist indefinit numai n stare autonom (de exemplu plasmida R, Col, F
etc).
Clasificarea plasmidelor
n raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica n:
1. plasmide care codific rezistena la ageni antibacterieni:
- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpin de Shigella
dysenteriae);
- plasmidele de rezisten la UV etc.
2. plasmide care codific sinteza unor ageni antimicrobieni:
- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate
antibiotic) etc.
3. plasmide de patogenitate care codific sinteza de:
- hemolizine;
- factori de colonizare;
- enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codific enzime ale unor ci metabolice particulare:
- n anumite condiii, unele bacterii pot utiliza ca surs de C diferite
substane cu potenial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care
permit supravieuirea i dezvoltarea n aceste condiii se numesc plasmide
degradative;

5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celul


care deine respectivul plasmid (F) la alta, putnd fi transmis inclusiv
plasmidul (factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice
exprimate.
Plasmidele R
Plasmidele R (de rezisten la antibiotice) confer celulei purttoare
rezistena la unul sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structur
genetic complex, fiind alctuite din:
- gene care asigur proprietatea de rezisten la antibiotice;
- gene care formeaz factorul de transfer al rezistenei (RTF).
Asigur capacitatea de replicare autonom i de transfer prin conjugare
(cele dou tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacterian sau prin
transducia mediat de bacteriofagi.
Plasmidele Col
Plasmidele Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora
substane antibiotice de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine,
vibriocine, piocine etc).
Plasmidele Col sunt transferabile de la tulpinile Col + la tulpini Col- prin
transformare genetic, transducie fagic sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (fa
de specia omolog), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia
productoare.
Factorul F (factorul de sex, factorul de fertilitate)
Factorul F controleaz capacitatea unor bacterii de a aciona ca donoare
de material genetic n procesul de conjugare. Factorul F codific structurile
(de exemplu pilul F) i enzimele necesare transferului de ADN.
n funcie de prezena plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul
bacterian i de modul n care faciliteaz transferul de material genetic,
bacteriile se pot grupa n patru categorii distincte: bacterii F -; bacterii F+;
bacterii Hfr; bacterii F.
Bacteriile FBacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule
femele care se comport ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ dein factorul F autonom n citoplasm. Sunt echivalente
unor celule masculine, donoare de material genetic, capabile s transmit
factorul F.

Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)


Bacteriile Hfr (cu mare frecven de recombinare) dein factorul F integrat
n cromozomul bacterian. Se comport ca donoare de material genetic, au o
mare frecven de conjugare i recombinare. De obicei prezena factorului F
integrat determin transferul unui numr variabil de gene cromozomale i
mai rar, chiar transferul factorului F.
Bacteriile F
Bacteriile F dein o structur plasmidic de tip special (factor de
fertilitate recombinant) care a fost anterior integrat n structura unui
cromozom i s-a desprins din acesta, ncorpornd n structura sa unele gene
cromozomale. Aceste bacterii au caracter de mascul i se comport ca
donoare de material genetic (factorul F).
Elemente genetice transpozabile
O anumit secven specific de ADN constituie un element genetic
transpozabil dac i menine integritatea fizic, structural i genetic,
funcional n cursul translocaiei de la o poziie la alta n acelai genom,
replicon (intramolecular) sau n genomuri diferite (intermolecular). De obicei
fenomenul de transpoziie poate avea loc la nivelul oricrui replicon, la
ntmplare, dar exist i situaii n care un transpozon are anumite zone
specifice unde se va insera (zone calde).
Pe baza complexitii lor, elementele care ndeplinesc aceast condiie se
pot grupa n trei categorii:
- secvene de inserie (IS);
- transpozoni (Tn);
- bacteriofagi.
Secvenele de inserie (IS)
Secvenele de inserie nu conin nici o gen i nu au nici o alt funcie
(cunoscut) n afar de cea de inserie. Sunt cele mai simple elemente
transpozabile. Dup inseria lor pot aprea modificri n expresia unor gene
sau modificri n rata incidenei deleiilor n regiunile adiacente situsului lor
de inserie.
Exist anumite secvene de inserie care au intrat n istoria practic
medical datorit importanei n diagnosticul anumitor afeciuni. De ex.
IS6110 se ntlnete n una sau mai multe copii n genomul Mycobacterium
tuberculosis i poate fi pus n eviden prin reacia PCR pornind fie de la
cultur, fie chiar i de la produsul patologic, permind un diagnostic mai
rapid.
Transpozonii (Tn)

Transpozonii difer de secvenele de inserie prin complexitate i prin


faptul c poart gene care confer bacteriilor funcii noi, detectabile, de
exemplu:
- rezistena la antibiotice;
- capacitatea de sintez a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafa (de exemplu K 88 la E. coli);
- sinteza unor factori de colonizare intestinal etc.
Exist transpozoni compui, care pe lng funcia de transpoziie includ i
o serie de determinani genetici i transpozoni compleci. Dintre acetia din
urm, transpozonul Tn3 a fost identificat la o tulpin de E. coli. El codific 3
elemente: tnpA- cu activitate de transpozaz, rezolvaza tnpR i betalactamaza (produsul genic notat bla) cu activitate beta-lactamazic.
Bacteriofagii
Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezult prin prescurtarea
mutator, pentru c a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli)
are un genom de 30kb i o structur linear. Dup infectarea celulei
bacteriene, bacteriofagul Mu se inser n cromozom la ntmplare i ulterior
n diferite poziii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic
Mu. Atunci cnd structura genetic Mu va prsi genomul bacterian va prelua
o parte din structura genetic bacterian (circa 100-150 pb)

5. 5. Mecanismele de variabilitate
bacterian
Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepiile prezentate
anterior), au un singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a
genomului este necesar transferarea de material genetic de la o tulpin
(donoare) la tulpina receptor (acceptoare). n mod clasic poate avea loc
un transfer pe orizontal ntre tulpini care fie fac parte din aceeai specie
fie fac parte din specii foarte nrudite, chiar dac genotipic sunt diferite.
Relativ recent a fost demonstrat posibilitatea unor schimburi genetice ntre
tulpini din specii diferite (ex. n ecosistemul intestinal). Variabilitatea
bacterian presupune modificarea la un moment dat a comportamentului
celulei bacteriene sau a descendenilor ei i pot exista n principiu dou
variante:
- variabilitatea fenotipic i
- variabilitatea genotipic;
Variaiile fenotipice reprezint modificri morfologice sau fiziologice de tip
adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaiile genotipice reprezint modificri definitive ale materialului
genetic (cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenilor.
Mecanismele variaiei genotipice sunt reprezentate de:
- mutaie;
- transfer genetic urmat de recombinare genetic.
Mutaia
Mutaia reprezint o modificare accidental n secvena nucleotidic a
unei gene, ducnd la modificri ale mesajului genetic.
Mutaiile pot aprea la nivelul materialului genetic prin:
- substituii;
- inversii;
- inserii;

- deleii.
Mutaia spontan
Mutaiile care apar n condiii de mediu obinuite i fr intervenia unui
factor decelabil se numesc mutaii spontane.
Mutaia indus
Mutaiile care se produc sub aciunea unor factori fizici (de exemplu raze
UV, radiaii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenii alchilani), care
acioneaz ca ageni mutageni, se numesc mutaii induse.
Rata mutaiilor induse este semnificativ mai mare dect rata mutaiilor
spontane.
Mutaia punctiform are ca substrat alterarea unui singur nucleotid,
respectiv a unui singur codon.
Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon,
putnd afecta secvene mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie
poligenic).
Mutaiile regresive (retromutaii) afecteaz celule mutante, determinnd
revenirea acestora la tipul iniial, restabilind secvena nucleotidic originar.
Mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o
modificare a secvenei bazelor nucleotidice persist.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o
bacterie donor la o bacterie receptor sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducia);
- conjugarea.
Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria
accept ADN liber provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria
receptor trebuie s fie competent n a accepta ADN-ul de la bacteria
donor.
Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n
experimente referitoare la virulena pneumococilor fa de oarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza
staionar a ciclului celular. Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN
exogen poate nlocui (prin recombinare genetic) o secven nucleotidic
omolog, bacteria receptoare dobndind un caracter genetic nou (de
exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care
nu sunt natural competente, pentru a putea realiza fenomenul de

transformare este necesar tratarea chimic a acestora, de ex. cu ioni de


calciu.
Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:
- transducie;
- conversie lizogenic.
Transducia reprezint transferul unui fragment genetic (cromozomial
sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui
bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numete transductor.
Bacteria receptoare se numete transductant.
Transducia specializat (restrictiv) este caracteristic fagilor
transductori care au proprietatea de a transfera numai un numr restrns de
gene bacteriene situate n imediata apropiere a situsului de legare a
profagului n cromozomul bacterian.
Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din
genele cromozomului bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi
ncorporate n mod accidental n particula viral matur pentru a forma un
fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare. Transducia
generalizat poate fi realizat de un mare numr de fagi neintegrai n
cromozomul bacterian atunci cnd acetia intr n ciclul litic.
Conversia lizogenic reprezint apariia unui caracter nou la bacteriile
care gzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este
realizat numai de ctre C. diphtheriae purttor al fagului temperat (profagul
care deine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibil
numai n cazul n care Streptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat.
Exist i fagi care sunt integrai n regiuni care codific un anumit produs din
genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integreaz ntr-o gen care
codific leucina).
Conjugarea bacterian reprezint un proces de transfer de material
genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei
legturi intercelulare directe. Este condiionat de prezena factorului F n
celula donoare.
Receptorii specifici
Pentru realizarea legturii intercelulare este necesar existena unor
receptori de suprafa att la celula donoare, ct i la celula receptoare.
Acetia vor permite recunoaterea reciproc.
Fiziologia conjugrii bacteriene
Dup un numr de alipiri ntmpltoare, bacteriile F + formeaz cu
bacteriile F- perechi de recombinare i ntre celulele alturate se formeaz
un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizeaz

transferul unidirecional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate


fi apoi integrat parial sau total n genomul celulei receptoare, ducnd la
apariia unor proprieti noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevrat
Folosirea cunotinelor din domeniul geneticii, n munca de detectiv
mbinarea examinrii foarte detaliate a secvenelor genomice microbiene
cu o cunoatere aprofundat a evoluiei bacteriilor poate fi util att n
obinerea unor diagnostice de mare precizie, ct i n aplicarea unor teste de
diagnostic relevante n medicina legal.
Spre exemplu, dorim s amintim situaia creat n 2001 n urma
atentatelor teroriste din SUA, cnd o serie de instituii, dar i persoane
particulare, au primit plicuri avnd un praf alb sau maroniu, care n unele
cazuri (au existat i alarme false) s-a dovedit a conine spori de Bacillus
anthracis. Cteva elemente concrete cu privire la situaia din acea perioad
vor fi prezentate n capitolul dedicat genului Bacillus.
Dup cartografierea genomului de B. anthracis s-au evideniat ca fiind
posibile circa 3.500 de mutaii nucleotidice unice. n funcie de acestea se
tie actualmente, c tulpinile cunoscute pot fi mprite n 8 grupe, fiecare
grup fiind la rndul su divizat n mai multe subgrupe. Toate aceste grupe
studiate sunt foarte stabile privind o posibil variaie genetic (nu exist
cross-link-uri ntre grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis s reprezinte
un candidat ideal pentru studii de biologie molecular folosite n scopul

punerii la punct a unor teste, care s identifice cu mare finee o anumit


tulpin, inclusiv originea acesteia.
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu c
tulpina de B. anthracis folosit n atacurile teroriste fcea parte din grupul
Ames. Aceast ncadrare a putut s fie stabilit prin evidenierea a 6 mutaii
specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la nivelul plasmidului
pX01 i una la nivelul plasmidului pX02).
Aadar, iat cum, pentru o bacterie stabil din punctul de vedere al unei
posibile variaii genetice, se poate realiza o adevrat munc de detectiv i
prin metode specifice de laborator se poate stabili originea i apartenena sa,
pornind de la caracteristicile genetice.