Replicacin de ADN

Replicacin de ADN. La doble hlice es desenrollada y cada hebra hace de

plantilla para la sntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa aade los
nucletidos complementarios a los de la cadena original.
El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite al ADN
duplicarse (es decir, sintetizar una copia idntica). De esta manera de una
molcula de ADN nica, se obtienen dos o ms "clones" de la primera. Esta
duplicacin del material gentico se produce de acuerdo con un mecanismo
semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN
original, al separarse, sirven de molde cada una para la sntesis de una nueva
cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble
hlice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la
complementacin entre las bases que forman la secuencia de cada una de las
cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente,
lo que permite que la informacin gentica se transmita de una clula madre a
las clulas hijas y es la base de la herencia del material gentico.
La molcula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes
de hidrgeno entre las bases complementarias puntos determinados: los
orgenes de replicacin. Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de
nucletidos especficas en esos puntos y facilitan la fijacin de otras protenas
que permitirn la separacin de las dos hebras de ADN formndose una
horquilla de replicacin.
Caractersticas

La replicacin del DNA es semiconservadora. Cada Cadena de DNA

acta como molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado
son dos molculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y
otra vieja. Este proceso se denomina replicacin semiconservadora.
La sntesis del DNA progresa invariablemente en direccin 5' 3 y por
lo tanto es semidiscontinua.
La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de
forma bidireccional formando una doble horquilla
La replicacin es muy precisa. La replicacin tiene lugar con un grado
extraordinario de fidelidad. En E. coli se comete un error cada 1010
nucletidos incorporados.
El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Se conocen numerosos
tipos de Polimerasas tanto en procariotes como en eucariotes, pero su
mecanismo de accin es similar en todos los casos: todas ellas actan
sintetizando una doble cadena complementaria a la doble cadena de
DNA preexistente y todas ellas requieren un cebador inicial, cadena
corta de RNA, para poder proceder a la sntesis de DNA.

Semiconservadora
En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas originales,
y por eso se dice que la replicacin del ADN es semi conservadora. Hasta que
finalmente se pudo demostrar que la replicacin es semiconservadora, se
consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicacin:

Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las molculas

hijas se conserva una de las cadenas originales.

Conservadora. Se sintetiza una molcula totalmente nueva, copia de la

original.

Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de

la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

Experimento de Meselson y Stahl.

El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permiti demostrar que el
mecanismo real se ajusta a la hiptesis de replicacin semiconservadora. Para
ello se hicieron crecer clulas de Escherichia coli en presencia de nitrgeno-15,
un istopo del nitrgeno ms pesado de lo habitual. En consecuencia, el
istopo se incorpor a las cadenas de ADN que se iban sintetizando,
hacindolas ms pesadas.
Una vez conseguido el primer objetivo, las clulas fueron transferidas a un
medio que contena nitrgeno-14, es decir, un medio ms ligero, donde
continuaron su crecimiento (divisin celular, que requiere la replicacin del
ADN). Se purific el ADN y se analiz mediante una centrifugacin en gradiente
de cloruro de cesio, en donde hay msdensidad en el fondo del tubo que en la
parte media del mismo.
La banda intermedia o hbrida representa una molcula de ADN que contiene
una cadena pesada (original) y otra ligera (recin sintetizada).
El hecho de que cada vez haya ms molculas ligeras y se mantenga el
nmero de molculas intermedias demuestra que la replicacin del ADN es
semiconservadora. Si fuera conservadora, aparecera siempre una banda
pesada y el resto ligeras (figuras 1.a, 1.b, 1.c) . Si fuera dispersante slo
apareceran bandas hbridas de densidad intermedia en todas las
generaciones.1
Secuencial y bidireccional desde puntos fijo
Los orgenes de replicacin son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva
cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con
forma de horquilla. Por otro lado, la replicacin se lleva a cabo
bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos
cadenas en ambos sentidos.

El origen de replicacin

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un nico origen de

replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin.
El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos
eucariticos, la replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay
uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay varios replicones.2
Experimento de Cairns.
Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia
coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de
replicacin a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los
experimentos consistan en mantener un cultivo deE. coli creciendo en un
medio que contena timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el
ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una
autorradiografa. A continuacin se observaba al microscopio. Los resultados
indicaban que la replicacin en E. coli se iniciaba en un punto concreto (OriC).3
Secuencialidad
Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genticos de complementacin
demutaciones que permitieron determinar que desde los orgenes la replicacin
avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible
obtener cultivos sincronizados de forma que todas las clulas del cultivo
estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El mtodo consista en
la conjugacin bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces
de sintetizar determinados aminocidos. Conociendo la localizacin de
los genes que codifican las protenas implicadas en la sntesis de los diferentes
aminocidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias
receptoras en un "medio mnimo" (donde slo pudiesen crecer las que hubieran
recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se
observ que, tras la ltima extraccin apareca con mayor frecuencia el gen
implicado en la sntesis de uno de los aminocidos (el correspondiente a la
"posicin 1"), que el gen adyacente implicado en la sntesis de otro aminocido
("posicin 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posicin 3" apareca
con menor frecuencia que el que ocupaba la "posicin 2", y as sucesivamente.
Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora seran los
primeros en transferirse, el experimento permiti demostrar, a partir de las
frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la
replicacin sigue un orden (es secuencial).
La replicacin avanza en forma de horquilla
Debido a que en la clula ambas cadenas de la doble hlice de ADN se
duplican al mismo tiempo, stas deben separarse para que cada una de ellas
sirva de molde para la sntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicacin
avanza con una estructura en forma de horquillaformndose una burbuja u ojo
de replicacin (tambin llamada estructura cuando el ADN es circular debido
a la similaridad entre la letra griega y la forma que adopta el cromosoma
bacteriano en estados intermedios de replicacin, no obstante pudiendo
aparecer estructuras alternativas),3 que avanza en direccin a la regin de ADN

no duplicado dejando atrs los dos moldes de ADN de cadena simple donde se
est produciendo la replicacin.2
Bidireccionalidad
El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayora de los casos, es
decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.
Esto ocurre en la mayora de los organismos, pero se dan excepciones en
algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicacin que tienen
lugar dependen de la propia estructura de su material hereditario (si el ADN es
circular, lineal, bicatenario o monocatenario).3 As, en casos particulares como
el ADN mitocondrial, algunos plsmidos y algunos genomas monocatenarios
de fagos pequeos, la replicacin se da unidireccionalmente pudiendo haber
uno o dos orgenes de replicacin.
Distincin entre la replicacin unidireccional y la bidireccional mediante el
recuento de copias degenes marcadores. O es el origen de replicacin y A, B,
C, D, E son genes marcadores.
En la mayora de los casos la replicacin es bidireccional.
No obstante, la replicacin se puede considerar, de forma general,
bidireccional.
La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN
viene dada por una tcnica basada en el marcaje radiactivo del ADN
usando timidina marcada con tritio. Primero se aade timidina sin marcar y
luego marcada con tritio; siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dnde se
ha replicado la molcula de ADN.3 Tambin se puede, mediante el recuento de
copias de genes marcadores, determinar si la replicacin es unidireccional o
bidireccional. Otras tcnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de
replicacin hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal
mediante enzimas de restriccin).
Fragmentos de Okazaki
Okazaki descubri que una de las cadenas nuevas de DNA se sintetiza en
forma de trozos cortos, denominados fragmentos de Okazaki.
De modo que una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de
modo discontinuo.
La cadena continua o cadena conductora, es aquella cuya sntesis en direccin
5 3' transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla de
replicacin.
La cadena discontinua, o cadena rezagada, es aquella cuya sntesis en
direccin 5' 3' transcurre en direccin contraria a la direccin del movimiento
de la horquilla.
Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud desde algunos pocos
centenares hasta unos pocos millares de nucletidos, segn el tipo celular.

Sin embargo, la sntesis de la hebra conductora y de la hebra rezagada estn

estrechamente coordinadas

La replicacin es semidiscontnua.
La replicacin siempre se produce en sentido 5' 3', siendo el extremo 3'-OH
libre el punto a partir del cual se produce la elongacin del ADN. Esto plantea
un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultneamente a pesar
de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5'
enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas
debera ser sintetizada en direccin 3' 5'.
Este problema lo resolvieron los cientficos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko
Okazakien la dcada de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de
ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se
denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y
2000 nucletidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucletidos en eucariontes.
La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de
replicacin se denomina hebra adelantada (en ingls, leading strand, que a
veces se traduce por lder o conductora) y se sintetiza de forma continua por
la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al
avance se denomina hebra rezagada o retrasada (en ingls, lagging strand),
cuya sntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la
horquilla de replicacin avance para disponer de una cierta longitud de ADN
molde.2
DNA Polimerasas

La replicacin del DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidas con

el nombre de DNA polimerasas dirigidas por DNA o simplemente como
DNA polimerasas.
Estas enzimas utilizan el DNA de hebra sencilla como molde sobre el
que catalizan la sntesis de la hebra complementaria, a partir de los
desoxinuclesidos trifosfato adecuados.

Los nuevos nucletidos se seleccionan por su capacidad para

aparearse, segn la complementariedad demostrada por Watson y
Crick, con las bases de la molcula molde, de modo que la hebra recin
sintetizada forma una doble hlice con la hebra molde.
Todas las DNA polimerasas pueden aadir el nucletido aportado por un
desoxinuclesido trifosfato nicamente al grupo 3'-OH libre de un
polinucletido preexistente, que tiene sus bases apareadas, de forma
que la hebra de DNA se extienda slo en la direccin 5 3'

DNA Polimerasas Procesividad

La procesividad de las DNA polimerasas es muy baja.

Esto significa que solo unos pocos nucletidos sern incorporados en la
cadena creciente del DNA antes de que la Polimerasa se disocie de su
sustrato.
Una procesividad adecuada es conferida mediante la asociacin de una
protena de forma anular, llamada abrazadera deslizante de la DNA
Polimerasa (tambin llamada factor de procesividad), que rodea al DNA
y acta como un factor de movimiento sobre la unidad cataltica de la
DNA activando notablemente su procesividad.
Esta abrazadera deslizante en eucariotes se conoce como Antgeno
Nuclear de Proliferacin Celular (PCNA).
La abrazadera deslizante no puede auto-ensamblarse alrededor del
DNA y requiere para ello la ayuda de un complejo proteico, conocido
como cargador (o ensamblador) de la abrazadera (llamado tambin
Complejo Accesorio de la Polimerasa) que en los eucariotes se conoce
como RFC

Elementos que intervienen

Para que se lleve a cabo la replicacin del DNA en las clulas se requieren los
siguientes elementos:
DNA original que servir de molde para ser copiado.
Topoisomerasas, helicasas: enzimas responsables de separar las hebras de la
doble hlice.
DNA-polimerasa III: responsable de la sntesis del DNA.
RNA-polimerasa: fabrica los cebadores, pequeos fragmentos de RNA que
sirven para iniciar la sntesis de DNA.
DNA-ligasa: une fragmentos de DNA.
Desoxirribonucletidos trifosfato, que se utilizan como fuente de nucletidos y
adems aportan energa.
Ribonucletidos trifosfato para la fabricacin de los cebadores.

Mecanismo
Aunque existen pequeas variaciones entre procariotas y eucariotas, el
mecanismo bsico es bastante similar:
El DNA se desenrolla y se separan las dos hebras de la doble hlice,
deshacindose los puentes de hidrgeno entre bases complementarias, por la
accin de helicasas y topopisomerasas.
En el DNA eucariota se producen muchos desenrollamientos a lo largo de la
molcula, formndose zonas de DNA abierto. Estas zonas reciben el nombre
de HORQUILLAS O BURBUJAS DE REPLICACIN, que es donde comenzar
la sntesis.
La RNA-polimerasa fabrica pequeos fragmentos de RNA complementarios del
DNA original. Son los llamados "primers" o cebadores de unos 10 nucletidos,
a los cules se aadirn desoxirribonucletidos, ya que la DNA-polimerasa slo
puede aadir nuclotidos a un extremo 3 libre, no puede empezar una sntesis
por s misma.
La DNA-polimerasa III aade los desoxirribonucletidos al extremo 3' (sentido
5'-3'), tomando como molde la cadena de DNA preexistente, alargndose la
hebra.
En las horquillas de replicacin siempre hay una hebra que se sintetiza de
forma continua en el mismo sentido en que se abre la horquilla de replicacin,
la llamada HEBRA CONDUCTORA, y la otra que se sintetiza en varios
fragmentos, los denominados FRAGMENTOS DE OKAZAKI y que se conoce
como HEBRA SEGUIDORA o RETARDADA, ya que se sintetiza en sentido
contrario al de apertura de la horquilla.
Terminacin (de los genomas lineales)
El final de la replicacin se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra
con una secuencia de terminacin. Se produce entonces el desacople de todo
el replisoma y la finalizacin de la replicacin.