Sunteți pe pagina 1din 45

INVESTIGAII BIOCHIMICE ALE MARKERILOR FUNCIEI HEPATICE

Medicina secolului XXI se bazeaz mult pe investigaiile paraclinice,


scopul tuturor acestor investigaii fiind reducerea impreciziei examenului
clinic. Importana acestora variaz n funcie de caracteristicile examenului
respectiv i de situaia clinic. Deoarece controlul strii de sntate cost,
este absolut necesar selectarea judicioas a investigaiilor paraclinice i n
particular a celor de laborator. Un management corect i riguros al
investigaiilor de laborator ar trebui s contureze un profil biochimic,
imunologic, microbiologic etc. al fiecrui organ i sistem ce urmeaz a fi
investigat. Pornind de la acest principiu n prezentarea determinrilor
biochimice privind evaluarea funciei hepatice, am conturat un profil
biochimic

hepatic,

prezentnd

determinrile

biochimice

obligatorii

evaluarea funciei hepatice, dar i alte determinri suplimentare ce pot fi


efectuate innd cont de complexitatea reaciilor biochimice la nivel hepatic.
Datele de laborator care exploreaz afectarea hepatic sunt denumite
n mod obinuit teste funcionale hepatice (TFH). Acestea cuprind o baterie
de analize biochimice care susin diagnosticul de hepatopatie. Ficatul este
sediul unor multitudini impresionanate de procese biochimice, astfel nct
nu exist nici un test care s poat fi considerat indicator unic pentru
disfuncia hepatic.
nainte de a trece la interpretarea testelor funcionale hepatice
modificate, trebuie s menionm c pot aprea erori n interpretarea
testelor funcionale hepatice.

Unele TFH, cum ar fi msurarea nivelului aminotransferazelor sau a


activitii fosfatazei alcaline, nu reflect nemijlocit funcia hepatic, ci
exprim lezarea parenchimului hepatic sau leziuni obstructive biliare.
TFH nu identific un diagnostic specific, ci ne direcioneaz spre o
anumit categorie de alterare hepatic.
TFH sunt de obicei nespecifice. Astfel, modificrile TFH pot reflecta
afeciuni extrahepatice, localizate, de exemplu, la nivelul sistemului osos,
muscular sau cardiovascular.
TFH sunt frecvent lipsite de sensibilitate i, mai ales, de
specificitate. Totui, TFH rmn elemente de mare utilitate pentru medicul
practician. n primul rnd, TFH ofer posibilitatea evalurii noninvazive a
pacienilor

hepatici,

special

celor

asimptomatici,

anicterici

cu

hepatopatie care evolueaz subclinic, cum ar fi hepatita cronic viral i


ciroza hepatic compensat. Utilizate mpreun, TFH modificate pot
contribui la diferenierea tipurilor de disfuncie hepatic, cum ar fi, de
exemplu, obstrucia biliar de hepatit viral. TFH sunt utile, de asemenea,
n evaluarea severitii hepatopatiei, a prognosticului bolii, a rspunsului la
tratament i a eventualelor ajustri terapeutice.
Astfel n cadrul testelor funcionale hepatice un posibil profil biochimic
ar avea urmtoarea structur:
A. enzime hepatice: ALAT (alanin amino transferaza), ASAT (aspartat
aminotransferaza),

ALP

(fosfataza

alcalin),

GGT

glutamiltranspeptidaza), LDH (lactat dehidrogenaza) etc.


B. bilirubin seric
C. proteine totale
D. albumin
E. uree

(gamma

Determinrile suplimentare pot include: dozarea: 5'-nucleotidazei,


colinesterazei, leucin aminopeptidazei, glicemiei, colesterolului seric total.
Se poate concluziona c TFH au un rol important n depistarea unei
afeciuni hepatice, precum i n determinarea naturii i magnitudinii
disfunciei hepatice. Nici un test nu este strict specific sau patognomonic n
evaluarea unei hepatopatii. Combinaia ns, dintre mai multe teste, viznd
diferii parametri ai funciei hepatice, urmarite n dinamic, n timp i
interpretate

contextul

clinic,

pot

servi

cu

succes

la

precizarea

diagnosticului, a prognosticului, precum i a cursului evolutiv al disfunciei


hepatice.
Firete, nu sunt excluse, funcie de severitatea i complexitatea
afeciunii, testele hematologice, imunologice, microbiologice (dac se impun)
precum i alte explorri paraclinice suplimentare.
ntruct lucrarea de fa se adreseaz i studenilor, n tehnicile de
dozare ce le prezentm sunt incluse determinri ce au la baz metode
manuale de dozare (cele folosite n cadrul orelor de lucrri practice), dar i
tehnici de dozare specifice aparaturii semiautomate i automate. Trebuie s
menionam c metodele prezentate de noi reprezint o variant a tehnicilor
de dozare, iar fiecare laborator, n funcie de aparatura pe care o deine i de
firmele de reactivi cu care colaboreaz, folosesc tehnici specifice, dar care nu
difer din punct de vedere al principiului de baz. De aceea este absolut
necesar ca la efectuarea determinrilor biochimice se fie precizat intervalul
de valori de referin specific metodei de lucru folosite.

CAPITOLUL I

ENZIME HEPATICE CU ROL N DIAGNOSTIC


METODE DE DOZARE

I.1 Dozarea colorimetric a alanin aminotransferazei (ALAT) i a


aspartat aminotransferazei (ASAT)

I.2.
I.3.
I.4.
I.5.
I.6.
I.7.
I.8.

I.1.1 Dozarea enzimatic a ALAT (GPT) (metoda Merck)


I.1.1.2 Dozarea enzimatic a ASAT (GOT) (metoda Merck)
Dozarea gamma-GT (-GT) (metoda cinetic)
Dozarea lactat dehidrogenazei (LDH) (metoda cinetic)
Dozarea fosfatazei alcaline (ALP) (metoda cinetic)
Dozarea leucin-aminopeptidazei (LAP)
Dozarea activitii 5-nucleotidazei (5-NT)
Dozarea activitii colinesterazei (CHE) (metoda colorimetric
cu reactiv Ellman)
Dozarea activitii ornitin carbamil transferazei (OCT)

CAPITOLUL I

ENZIME HEPATICE CU ROL N DIAGNOSTIC


METODE DE DOZARE
I.1 DOZAREA COLORIMETRIC A ALANIN AMINOTRANSFERAZEI
(ALAT) I A ASPARTAT AMINOTRANSFERAZEI (ASAT)
Principiul metodei:
Enzimele ALAT (GPT) i ASAT (sau GOT) din clasa transaminazelor
catalizeaz transferul unei grupe -NH2 de pe un aminoacid pe un -cetoacid,
rezultnd un nou aminoacid i un nou cetoacid n cadrul urmtoarelor
reacii:
COOH

COOH

C=O

CH3

CH2

CH

CH2

COOH

NH2

ALAT

COOH
Acid -cetoglutaric
COOH
CH2
CH2
C=O
COOH
Acid -cetoglutaric

NH2

COOH

CH2

C=O

CH2

CH3

COOH
Alanin

Acid glutamic
COOH

COOH
ASAT

CH2
CH

Acid piruvic

NH2

CH2

COOH

CH2

CH2

HC

COOH

NH3

COOH

Acid aspartic

Acid glutamic

C=O
COOH
Acid oxalacetic

Piruvatul i respectiv oxalacetatul rezultai reacioneaz n mediul


alcalin

cu

2,4-dinitrofenilhidrazina

formnd

2,4-dinitrofenilhidrazona,

compus de culoare brun. Intensitatea coloraiei este direct proporional cu


cantitatea de piruvat respectiv oxalacetat format i poate fi colorimetrat la
520 nm.

Aparatur:
Spectrofotometru
Baie de apa la 37oC
Reactivi:
1. Soluie tampon fosfat 0,l M pH=7,4
2. Substrat ALAT: alanin 200 mM, -cetoglutarat 2 mM n tampon
fosfat
3. Substrat ASAT: L-aspartat 100 mM, -cetoglutarat 2 mM n tampon
fosfat
4. Reactiv de culoare 2,4-dinitrofenilhidrazin 10 mM
5. Soluie NaOH 0,4 N
Mod de lucru:
Pentru fiecare prob se face un blanc al probei.
Reactivi
Substrat ALT(ml)
Substrat AST (ml)

Proba
1
-

ALAT
Blanc proba
1
-

ASAT
Proba
Blanc proba
1
1

Se introduce n baie de ap la 37 C timp de 5 minute


Ser nehemolizat (ml)
0,2
0,2
Se amestec i se
Se amestec i se
incubeaz 30 minute la incubeaz 60 minute la
37C
37C
Ser nehemolizat (ml)
0,2
0,2
Reactiv de culoare (ml)
1
1
1
Se las n repaus la temperatura camerei 20 de minute
NaOH (ml)
10
10
10

1
10

Se agit i dup 5 minute se citete absorbana probei fa de blanc la


520 nm n cuva de l cm.
Calcularea rezultatelor:
Valorile absorbanelor

obinute sunt convertite n UI cu ajutorul

tabelelor:
Tabelul I : Valorile pentru ALAT n UI (calculate conform
absorbaei citite)
Absorban
a
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
Tabelul II

UI

Absorban
a
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38

UI

3
55
5
61
8
68
12
75
15
83
19
93
23
27
31
35
40
45
50
: Valorile pentru ASAT n UI (calculate conform

absorbaei citite)
Absorban
a
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16

UI
3
6
10
14
18
23
28
34

Absorban
a
0,24
0,26

UI
72
86

0,18
0,20
0,22

41
50
60

1 Unitate Internaional enzimatic (UI) reprezint cantitatea de


enzim ce transform 1 mol de substrat n timp de 1 minut n condiii
standard.
1 miliunitate (mU) = l/1000U
Intervale de referin:
ALAT (GPT): 2,5-17 U/l
ASAT (GOT): 2-19 U/l
Pentru valori mai mari de 73 U/l se recomand diluarea serului: 1
parte ser cu 4 pri soluie ser fiziologic. n acest caz rezultatul se nmulete
cu 5.
I.1.1 DOZAREA ENZIMATIC A ALAT (metoda Merck)

Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ALAT) catalizeaz urmtoarea reacie:
COOH

COOH

C=O

COOH

CH2

CH

CH2

COOH

NH2

ALAT

COOH
Acid
-cetoglutaric

NH3

COOH

CH2

C=O

CH2

CH3

COOH
Alanin

Acid glutamic

Acid piruvic

Piruvatul format este transformat n lactat de ctre NADH+H + n


reacia catalizata de LDH (lactat dehidrogenaz) conform reaciei:

CH3

COOH

LDH
NADH+H+

CH3
NAD

CH

COOH

OH

Acid piruvic

Acid lactic

Se msoar viteza de diminuare a concentraiei NADH+H + pe msur


ce trece n NAD+, prin scderea absorbiei n UV. Ea este direct proporional
cu concentraia n ALAT.
Aparatur:
Spectrofotometru
Cronometru

Reactivi:
1.

Soluie substrat; L-alanina 800 mM in tampon fosfat

100 mM i pH=7,4
2.

Amestec de: -cetoglutarat 10 mM, NADH++H+ 0,2

mM, LDH 10mg/l n tampon fosfat 100 mM, pH=7,4


Mod de lucru:
n momentul nceperii determinrilor se amestec soluia 1 cu 2 (4
pri reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ).

Amestec de reactivi 1+2 (ml)


Ser (ml)

1
0,25

Se agit bine i se citesc extinciile la lungimea de unda de 366 nm n


cuve de l cm. Citirea se face din minut n minut timp de 3 minute la 25 C

Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul
de minute citite. Se noteaz cu (A/min).
Concentraia ALAT n UI/l = (A/min) x 1520
Observaii: dac valoarea (A/min) crete mai mult de 0,08 se
recomand diluarea a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul
cu 10. Citirile se pot efectua i la 30 C i 37 C.
Intervale de referin:
25 C
Brbai
Femei

pn la 22 UI/l
pn la 17 UI/l

30 C
pn la 29 UI/l
pn la 22 UI/l

10

37 C
pn la 40 UI/l
pn la 31 UI/l

I.1.2. DOZAREA ENZIMATIC A ASAT (GOT) (metoda Merck)

Principiul metodei:
Alanin aminotransferaza (ASAT) catalizeaz urmtoarea reacie:
COOH

COOH

COOH

CH2

ASAT

CH2

CH2

CH

C=O

NH2

Acid
cetoglutaric

COOH

CH2

CH2

HC

COOH

COOH

CH2

C=O

NH3

COOH

COOH

Acid
aspartic

Acid
glutamic

Acid
oxalacetic

Oxalacetatul format este transformat n malat de ctre NADH ++ H+ n


reacia catalizat de MDH (malat dehidrogenaz) conform reaciei:
COOH

COOH
C=O
CH2

HC

MDH
NADH+H+

NAD

OH

CH2
COOH

COOH
Acid oxalic

Acid malic

Se msoar viteza de diminuare a cantitii de NADH+H + pe msur ce


trece n NAD+, prin scderea absorbiei n UV. Ea este direct proporional cu
concentraia n ASAT.
Aparatur:

11

Spectrofotometru
Cronometru

Reactivi:
1.

Soluie substrat: aspartat 200 mM n tampon fosfat 100 mM i

pH =7,4
2.

Amestec de: -cetoglutarat 12 mM, NADH++H+ 0,2 mM, LDH

10mg/l, MDH 10 mg/l n tampon fosfat 100 mM pH=7,4


Mod de lucru:
n momentul nceperii determinrilor se amesteca soluia 1 cu 2 (4
pri reactiv 1 cu 1 parte reactiv 2 ).
1
Amestec de reactivi 1+2 (ml)
Ser (ml)
0,25
Se agit bine i se citesc extinciile la lungimea de und de 366 nm n
cuve de 1 cm. Citirea se face din minut n minut timp de 3 minute la 25 C
Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la
numrul de minute citite. Se noteaz cu (A/min). Concentraia ALAT n
U/l = (A/min) x 1520.
Observaii:
Dac valoarea (A/min) crete mai mult de 0,08 se recomand
diluarea a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10.
Citirile se pot efectua i la 30C i 37C.
Intervale de referin:
Brbai

25 C
pn la 18 U/l

30 C
pn la 25 U/l

12

37 C
pn la 37 U/l

Femei

pn la 15 U/l

pn la 21 U/l

pn la 31 U/l

Interpretarea rezultatelor:
Permeabilitatea membranei celulare hepatice crete gradat funcie de
suferin. Investigaiile biochimice evideniaz creteri n ser a unor enzime
celulare (ALAT, ASAT, LDH, etc.).Nivelul seric al acestor enzime de leziune,
variaz n funcie denumrul de hepatocite afectate, de gravitatea lezrii
fiecrei celule, de viteza cu care s-a produs leziunea i de viteza de eliminare
din ser (t 1/2) a enzimelor respective.

Dozarea ALAT i ASAT rmne cea mai util i sensibil investigaie


biochimic

caz

de

afectare

hepatocelular

acut

(viral,

toxic,

medicamentoas), valori 500 U/l sugernd acest diagnostic.

Valori crescute:

cele mai mari creteri 100-2000 U/l apar n hepatitele virale,


intoxicaia

cu

tetraclorur

de

carbon,

leziuni

induse

de

medicamente.

creterea rapid i marcant a ASAT i ALAT (>600 U/l i adesea


>2000 U/l) urmat de o scdere brusc n primele 12-72 de ore de la
debut este considerat specific pentru obstrucia acut a ductelor
biliare.

creteri importante ale ASAT i ALAT asociate cu creteri ale


fosfatazei alcaline indic icter hepatocelular.

ASAT crescut (300 U/l) i ALAT (200 U/l) se nregistreaz n


obstrucia biliar complet. Enzimele revin la normal n decurs de o
sptmn de la ndeprtarea obstruciei.

o stare patologic particular caracterizat prin creterea marcant

13

enzimelor

hepatice

(ALAT,

ASAT,OTC),

celor

musculare

(creatinkinaza CK), precum i a -amilazei i lipazei pancreatice se


ntlnete n sindromul Reye.

creteri moderate al ALAT i ASAT, asociate cu creteri ale fosfatazei


alcaline sugereaz icter colestatic.

valori mai ridicate de 150 U/l apar n hepatitele alcoolice (mai ales
dac pacientul are i delirum tremens).

valori 100 UI/l apar n ciroza alcoolic, nivelul ALAT este normal n
50 % din cazuri, iar ASAT n 25% din cazuri.

creteri abia schiate ale ALAT i ASAT apar n procesele neoplazice


ale ficatului, cnd leziunile celulare hepatice se produc pe arii limitate
n jurul infiltratului malign.(ASAT>ALAT).

ALAT i ASAT cresc n urma transplantului hepatic, dup reperfuzia


alogrefei (de 4-5 ori limita superioar a intervalului de referin).
Creterile persistente sau tardive se pot datora rejeciei, infeciilor
virale, abcesului hepatic sau ocluzia arterei hepatice.

creteri moderate ale ALAT i ASAT se evideniaz n infeciile cu


virus Epstein-Barr, precum i n mononucleoza seric.

Alturi de creterile individuale ale enzimelor celulare se produc i


modificri ale raportului dintre ele. Astfel raportul ASAT/ALAT
(raport de Ritis) la subiecii normali este 1,3, dar poate fi modificat n
funcie de afeciune.

ASAT/ALAT<1 apare n hepatitele virale.

ASAT/ALAT >2, cu ALAT <300 U/l sugereaz hepatit alcoolic.

ASAT/ALAT 3 la pacieni cu ciroz hepatic sau cu hipertensiune


portal sugereaz ciroz biliar primar.

Valori sczute :

14

deficit de piridoxal fosfat ce apare n sarcin, afeciuni hepatice


secundare consumului de alcool.

neoplazii

infecii urinare

n majoritatea afeciunilor hepatice sunt necesare dozri seriate ale


enzimelor, valoarea acestora indicnd evoluia clinic .

15

I.2. DOZAREA GAMMA-GT (-GT) (metoda cinetic)

Principiul metodei:
Determinarea activitii -GT se face folosind ca substrat L-- glutamil3-carboxi-4-nitroanilida. Reacia este urmtoarea:

HOOC

CH

CH2

CH2

NH2

C=O
NH

H 2N

NO2

CH2

C=O
HN

L-Gama-glutamil p-nitro-anilida

HOOC

CH

CH2

NH2

CH2

COOH

Glicil-glicina

C=O
NH

CH2

H2N
CH2

C=O
HN

L-Gama-glutamil glicil-glicina

NO2

CH2

COOH

p-nitro-anilina

Citirile se efectueaz la 405 nm. Creterea absorbanei 4-nitroanilinei


pe msur ce se formeaz este direct proporional cu activitatea -GT.
Aparatur:
Spectrofotometru
16

Cronometru

Reactivi:
1.

Soluie glicilglicina in tampon TRIS pH=8,25, 100 mmol

2.

Soluie

substrat

L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida,

de

concentraie 2,9 mmol/1


Mod de lucru:
1. Prepararea soluiei de lucru:
Se amestec 5 pri reactivul 1 cu o parte reactiv 2. Aceast soluie
este stabil 7 zile la temperatur de 20-25 C sau 28 de zile la 2-8 C.
2. Dozarea propriu-zis:
Soluie de lucru (l)
500
Ser (l)
50
Se agit i citesc absorbantele la 1, 2 i 3 minute

Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire i se mparte la numrul
de minute citite. Se noteaz cu (A/min). Concentraia -GT (U/l) = (A/min)
x 1152.
Intervale de referin:

Brbai
Femei

25 C

30 C

37 C

6-28 U/l
4-18 U/l

8-38 U/l
5-25 U/l

11-50 U/l
7-32 U/l

Observaii:

17

Serul folosit trebuie s fie proaspt i nehemolizat, iar recoltarea se


face pe citrat, oxalat sau EDTA.
Linearitatea reaciei se menine pn la valori de 280 U/l. Peste aceste
valori se recomand diluarea a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete
rezultatul cu 10.

Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:

Dozarea -GT este cel mai sensibil indicator i un test de screening


folosit uzual pentru determinarea alcoolismului. n acest caz
creterea -GT o depete pe cea a celorlalte enzime hepatice
dozate n mod curent. Gradul de cretere a -GT la un alcoolic
variaz de la caz la caz i depinde mai mult de persistena
ndelungat a consumului dect de cantitatea ingerat. S-a
demonstrat c o ncrcare suplimentar cu alcool la un caz de
alcoolism cronic produce n decurs de 24 de ore o cretere mult mai
accentuat a activitii serice a -GT (3,5x LSN), comparativ cu o
acceai ncrcare cu alcool la un subiect sntos consumator
ocazional de alcool.

Pacienii alcoolici tratai cu anticonvulsivante au valori ale -GT de


50

de

ori

valoarea

normal.

La

pacienii

tratai

cu

anticonvulsivante, dar care nu consum alcool creterile pentru GT sunt modeste.

n icterul obstructiv creterile pentru -GT sunt mai rapide i mai


importante dect cele pentru ALP i LAP.

n colestaza mecanic i viral -GT crete cam n aceeai proporie


cu ALP i LAP, pe cnd n colestaza medicamentoas creterea

18

pentru -GT este mult mai mare.

n neoplasmul hepatic nivelul -GT crete progresiv de la o


examinare la alta.

n ciroza biliar primar valorile pentru -GT sunt de aproximativ


13x LSN

n hepatita acut creterile sunt mai puin marcante dect a


celorlalte enzime hepatice, dar este ultima care revine la normal,
indicnd covalescena.

n hepatita cronic activ valorile pot atinge 7x LSN. n stadiul


asimptomatic al bolii poate fi singura enzim hepatic ce prezint
valori serice crescute.

-GT reprezint markerul cel mai sensibil al rejectului (dup


transplant hepatic), nivelul enzimei crete precoce naintea ALP i
bilirubinei.

-GT prezint creteri importante alturi de cele ale ALP n


leptospiroza icterohemoragic (boala Weil).

Valori crescute se nregistreaz n tumori primitive sau metastatice


ale ficatului

intoxicaia

cu

clorpromazin

semnificativ.

19

valorile

pentru

-GT

cresc

I.3. DOZAREA LACTAT DEHIDROGENAZEI (LDH) (metoda cinetic)

Principiul metodei:
Lactat dehidrogenaza catalizeaz urmtoarea reacie:

CH3

LDH

COOH

NADH+H+

CH3
NAD

este

COOH

OH

Acid piruvic

Piruvatul

CH

Acid lactic

transformat

lactat

de

ctre

LDH

(lactat

dehidrogenaz) n mediu neutru.


Se msoar viteza de diminuare a concentraiei NADH ++H+ pe msur
ce trece n NAD+ la 340 nm, prin scderea absorbiei n UV, care este
proporional cu activitatea LDH.
Aparatura:
Spectrofotometru
Cronometru
Reactivi:
1. Piruvat 0,6 mmol/l n tampon fosfat pH=7.5 (50 mmol/l)
2. NADH++H+ pH = 9,6

0,18 mmol/l

20

3. Ser sau plasma (recoltare pe heparin sau EDTA). Nu se folosete


ser hemolizat.

Mod de lucru:
1. Prepararea soluiei de lucru:
Se amestec 4 pri reactiv 1 cu o parte reactiv 2. Soluia este stabil
5 zile la 2-8C sau 8 ore la 15-25C. Se va feri de lumin.
2. Dozarea propriu-zis:
Soluie de lucru (l)
Ser (l)
Se agit i citesc absorbantele la 1, 2 i 3 minute

1000
20

Calcularea rezultatelor:
Activitatea LDH (U/l) = (A/min) x 8095
Valori de referin:
LDH=95-150U/l.
Observaii:
Testul

este

realizat

pentru

a determina

activitile

LDH care

corespund unei A/min., maxime de 0.15. Peste aceast valoare se


recomanda diluarea a 0,1 ml proba cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul
cu 10.
Nu s-au observat interferene pentru urmtoarele substrate: acid
ascorbic pn la 30 mg/dl, bilirubin conjugat pn la 60 mg/dl, bilirubin
neconjugat pn la 25 mg/dl, trigliceride pn la 2000 mg/dl. Hemoglobina
interfer deoarece LDH este eliberat de eritrocite.
21

Limita minim de detecie este de 4 U/l.


Discuii:
Deoarece LDH are o mare rspndire n diferite organe i esuturi,
determinarea acestei enzime confer informaii limitate datorit specificitii
mici. LDH este un tetramer format din patru subuniti, iar acestea sunt de
dou subtipuri, H caracteristic inimii i M de provenien muscular.
Combinaia acestor subuniti formeaz cele 5 izoenzime: LDH 1 (H4),
LDH2 (H3M), LDH3 (H2M2), LDH4 (HM3), LDH5 (M4). Organele i esuturile
conin proporii diferite din aceste izoenzime (de exemplu ficatul conine mai
ales LDH5 pe cnd inima LDH1 i LDH2). Din punct de vedere clinic este
important determinarea izoenzimelor pentru stabilirea specificitii leziunilor,
mai ales pentru diagnosticarea infarctului de miocard.
Metoda preferenial pentru determinarea izoenzimelor LDH este
separarea electroforetic pe agaroz sau acetat de celuloz.
Intervale de referina: (exprimare procentual)
LDH1 = 16-28%, LDH2 =29-37%, LDH3 = 17-23%, LDH4 = 9-15% i
LDH5 =8-20 %.
Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:

n leziunile toxice ale ficatului (tetraclorur de carbon, diverse


tipuri de ciuperci), ciroz hepatic, icter obsctructiv.

Valori crescute ale LDH (3x valoarea normal) apar n unele leziuni
metastatice i granulomatoase ale ficatului. Raportul LDH4/LDH5
<1,05 indic carcinom hepatocelular, iar un raport LDH4/LDH5 >
1,05 indic metastaze hepatice

Valori crescute ale LDH alturi de ALP (fosfataza alcalin) cu valori


22

normale pentru ALAT, ASAT i bilirubin sugereaz obstrucia unui


duct hepatic sau o afeciune infiltrativ a ficatului
Trebuie precizat c o afeciune hepatic n sine nu determin creteri
importante ale LDH total sau LDH5.
Cu excepia situaiilor de mai sus determinarea LDH n snge pentru
investigarea bolilor hepatice nu i gsete o utilitate real deoarece
izoenzimele LDH4 i LDH5 specifice ficatului se elimin rapid din snge.
Creteri ale LDH total sau ale izoenzimelor LDH specifice fiecrui esut
mai pot aprea n :

Afeciuni cardiace- mai ales infarct miocardic (IMA)

Afeciuni hematologice- anemie hemolitic

Afeciuni pulmonare-embolie i infarct pulmonar

Tumori maligne

Afeciuni musculare- eforturi fizice epuizante, arsuri, traumatisme

Afeciuni renale-sindrom nefrotic, glomerulonefrit, infarct renal

Pancreatit acut

Ocluzie intestinal

Afeciuni ale SNC- meningit bacterian, hemoragii cerebrale.

Valori sczute:

Post iradiere

23

I.4. DOZAREA FOSFATAZEI ALCALINE (ALP) (metoda cinetic)

Principiul metodei:
Fosfataza alcalina (ALP), n mediu alcalin (pH=8,6), catalizeaz
hidroliza

p-nitrofenilfosfatului

p-nitrofenol

fosfat.

Reacia

este

urmtoarea:
OH
O

OH

OH
ALP
H 2O
NaOH

O
HO

OH

OH

NO2

NO2

p-nitrofenilfosfat

Acid fosforic

p-nitrofenol

Creterea absorbanei la 405 nm a p-nitrofenolului pe msur ce se


formeaz este direct proporional cu activitatea ALP.
Aparatura:
Spectrofotometru
Cronometru
Reactivi:
1. 2-amino-2-metil-1-propanol, pH 10,4; 0,90 mol/L
Acetat de magneziu 1,6 mmol/L
Sulfat de zinc

0,4 mmol/L

2. p-nitrofenilfosfat

16 mmol/L

24

3. Ser sau plasma (recoltate pe heparin)

Mod de lucru
1. Prepararea soluiei de lucru: se amestec 4 pri reactiv 1 cu o
parte reactiv 2. Aceast soluie este stabil 5 zile la temperatur de 20-25 C
sau 28 de zile la 2-8 C.
2. Dozarea propriu-zisa:
Reactivi (l)
Soluie de lucru
Ser
Ap distilat
Se agit i citesc absorbanele la

Prob (l)
100
20
1, 2 i 3 minute

Blanc (l)
100
20

Calcularea rezultatelor:
Se face diferena ntre prima i ultima citire att pentru prob ct i
pentru blanc i se mparte la numrul de minute cronometrate. Se noteaz
cu (A/min prob) i (A/min blanc). (A/min)=(A/min prob)-(A/min
blanc).
Activitatea ALP (U/l) = (A/min) x 2757
Intervale de referin:
Aduli:
ALP (U/l)
42-98
53-128
53-141
56-119

Femei 20-50 ani


Brbai 20-50 ani
Femei > 60 ani
Brbai > 60 ani
Copii:

25

Fete
Biei
1-30 zile
1 lun-1 an
1-3 ani
4-6 ani
7- 9 ani
10-12 ani
13-15 ani
16-18 ani

ALP (U/l)
48-106
75-319
124-341
82-383
108-317
104-345
96-297
93-309
69-325
86-315
51-332
42-362
50-162
74-390
47-119
52-171

Observaii:
Testul este realizat pentru a determina activitile ALP care corespund
unei A/min., maxime de 0.25. Peste aceasta valoare se recomand diluarea
a 0,1 ml prob cu 0,9 ml ser i se nmulete rezultatul cu 10.
Nu s-au observat interferene pentru urmtoarele substrate: acid
ascorbic pn la 30 mg/dl, bilirubin conjugat pn la 60 mg/dl,
bilirubin neconjugat pn la 25 mg/dl, trigliceride pn la 2000 mg/dl.
Limita minim de detecie este de 2 U/l.

Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:

obstrucie biliar (este considerat cel mai bun marker al


obstruciei biliare, dar nu difereniaz colestaza intrahepatic de
obstrucia extrahepatic). n boala hepatobiliar obstructiv nivelul
seric al ALP crete n paralel cu cel al 5-NT (5 nucleotidazei) i
LAP (leucin aminopeptidazei).

creteri ale ALP n paralel cu -GT i 5-NT apar n ciroza biliar


primar.

26

raportul -GT/ALP5 susine


alcoolic.

Creteri

ale

-GT

diagnosticul de
determinate

boal hepatic
de

alcool

sau

anticonvulsivante nu sunt nsoite de creterea ALP.


Stabilirea cauzei creterii ALP este extrem de util n vederea
diferenierii diagnosticului.
Enzima
seric
ALP
5-NT
LAP
-GT

Obstrucie
biliar
C
C
C
C

Afeciune
osoas
C
N
N
N

Copilrie

Sarcin

C
N
N
N

C
N
C
N

Unde: C = valori crescute; N = valori normale

nivelul ALP crete naintea apariiei icterului

nivele marcat crescute ale ALP apar la sugarii cu atrezie biliar


intrahepatic, dar mult mai sczute n caz de atrezie extrahepatic.

creteri modeste (cam de 3 ori valoarea normal) sunt specifice i


pot fi ntlnite n orice afeciune hepatic (hepatit viral, hepatit
cronic, ciroz hepatic, afeciuni hepatice infiltrative), dar i n alte
boli cu interesare hepatic (ex. insuficiena cardiac congestiv).

n afara afeciunilor hepatice se impune s menionm c valori


crescute ale ALP mai apar n:

rahitism, cnd creterea nivelului seric al enzimei precede cu 30-45


zile apariia semnelor clinice. Scderea valorilor dup tratamentul
cu vitamin D indic nceperea procesului de vindecare.

Boala Paget (osteita deformant)-creterea nivelului seric al enzimei


este direct proporional cu severitatea i extinderea bolii.
Valori sczute:

27

Scderi ale ALP apar n glicogenoza de tip I (deficit de glucozofosfataza).

28

I.5. DOZAREA LEUCIN-AMINOPEPTIDAZEI (LAP)

Leucin-aminopeptidaza

este

enzim

proteolitic

localizat

citoplasma celulelor din diferite organe (pancreas, rinichi, intestin subire),


dar mai ales n ficat. Este o enzim specific pentru ficat, deoarece organele
anterior menionate nu pot antrena creterea nivelului seric al enzimei dect
prin participarea ficatului. Enzima catalizeaz reacia:
H 3C
CH

CH2

H 3C

CH

CO

NH

CH2

COOH

H 2O

LAP

NH2
L-leucin-glicina
H3C
CH
H3C

CH2

CH

COOH

H2N

CH2

COOH

NH2
Glicina

Leucina

Principiul metodei:
Reacia folosit universal pentru dozarea LAP const dintr-o hidroliz
a leucil-p-nitroanilidei :
Leucil-p-nitroanilida + H2O = Leucina + p-nitroanilina
Aparatura:
1. Spectrofotometru
2. Cronometru
Reactivi:

29

1.

Tampon fosfat 0,1M, pH=7,2

2.

Substrat: leucin-p-nitroanilid (63 mg leucin-p-nitroanilid (25

mM) se dizolv n 10 ml metanol p.a). Se pstreaz 6 luni la frigider.


3.

Ser nehemolizat

Mod lucru
Se pipeteaz n eprubete de lucru:
Soluie tampon (ml)
3
Substrat (ml)
0,1
Se agit i se in n repaus 5 minute la 30C.
Ser (ml)
0,1
Se agit i se citesc absorbanele din 2 n 2 minute, timp de
10 minute la 405 nm.
Calcularea rezultatelor:
Activitatea LAP (U/l) = (A/min) x 3232
Intervale de referin:
LAP = 11-30 U/l
Interpretarea rezultatelor
Valori crescute:
Creteri fiziologice:
- valori mai crescute se observ la brbai.
- LAP poate fi moderat crescut pe toata perioada sarcinii.
Creteri patologice:
- n obstrucii biliare deoarece se secret n canalele biliare.
- n neoplasme hepatice.
- n pancreatite acute.
Observaii:

30

Dei creterile LAP sunt paralele cu cele ale ALP, creterea celei dinti
este mai util a fi luat n considerare n stabilirea diagnosticului, deoarece
este mult mai labil i mai sensibil.

31

I.6. DOZAREA ACTIVITII 5-NUCLEOTIDAZEI (5-NT)

Principiul metodei
Sub aciunea 5-nucleotidazei din ser se elibereaz fosfor anorganic
(Pa) din adenozin-5-P utilizat ca substrat. Aceast reacie este catalizat i
de o fosfataz alcalin nespecific astfel c Pa eliberat din substrat
reprezint o activitate combinat a ambelor enzime.
Dac reacia este efectuat n prezena ionilor de Ni 2+, 5-nucleotidaza
este inhibat, iar Pa eliberat provine doar din aciunea fosfatazelor
nespecifice. Diferena dintre Pa eliberat din AMP n absena i n prezena
ionilor Ni2+, inhibitori, reprezint Pa eliberat din reacia catalizat de 5nucleotidaz. Concentraia Pa astfel obinut reprezint activitatea 5nucleotidazei.

NH2

NH2
N

N
N

O
O

CH2
H

5'-NT (pH=6,6 - 7,8)


-H3PO4 (Pa)
P OH

OH

N
O
H

HO OH

CH2
H

HO OH

5-AMP

Adenozin

Aparatur

32

OH

Spectrofotometru

Reactivi
1. Acid tricloracetic
2. Soluie MnSO4 , pentru activarea enzimei, 0,32 g% n ap bidistilat
3. Soluie NiCl2 . 6 H2O, pentru eliberarea enzimei, 2,4 g% n ap
bidistilat
4. Substrat AMP 0,01 M (347 mg n 18 ml NaOH 0,1 N adus la 100 ml
cu ap bidistilat)
5. Tampon barbituric pH= 7,8
6. Etalon fosfat 0,4394 g KH2PO4 n 1000 ml ap bidistilat
7. Soluie etalon de lucru: 1 ml etalon stoc la 10 ml ap bidistilat
(1 ml = 10 g Pa/ml)
8. Acid molibdic
9. Acid ascorbic 1% n HCl 0,1 N
Mod de lucru
1. Reacia de eliberare a Pa
n dou eprubete de centrifug se pipeteaz:
Reactivi (l)
Blanc (l)
Sol.tampon
1300
MnSO4
100
NiCl2
200
Produs biologic (ser)
200
Se incubeaz la 37C, timp de 5 minute. Se adaug:
Substrat AMP
200
Se adaug acid tricloracetic:
Acid tricloracetic
2000

33

Prob (l)
1500
100
200
200
2000

Se centrifugheaz la 3000 t/minut, timp de 5-10 minute. Se pstreaz


supernatantul pentru a efectua reacia de culoare.

2. Reacia de culoare

Reactivi (l)
Supernatant blanc
Supernatant prob
Soluie etalon
Acid molibdic
Acid ascorbic
Ap bidistilat

Blanc (l)
1000
1000
500
2500

Etalon (l)
1000
1000
500
2500

Prob (l)
1000
1000
500
2500

Se las n repaus 10 minute


Se citesc absorbiile etalonului i probelor fa de martor la 620 nm.
Calcularea rezultatelor:
Exprimarea activitii 5-nucleotidazei se face n U.I. (micromoli Pa
eliberai pe minut la 1 litru de ser la 37C i pH 7,8.
Se ine cont c incubarea s-a efectuat 30 minute, c etalonul conine
10 g Pa/ml i c n prob i martor se dozeaz Pa din 1000 l ser.

U.I./l =

AP - AM
10
x
AE - AM
31

1000
x 1
30
0,1
107,6

U.I./l =

AP - AM
x 107,6
AE - AM

34

Intervale de referin: 1,6 1,7 mU/ml


Observaii:
Determinarea

activitii

5-nucleotidazei

este

mult

afectat

de

capacitatea unor fosfataze acide i alcaline de a hidroliza esteri fosfai.


Aceast problem esenial nu a fost pe deplin rezolvat, toate metodele
propuse pentru dozarea ei avnd imperfeciunile lor.

Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
Chiar dac distribuia 5-nucleotidazei (5NT) este similar cu a
fosfatazei alcalinei (ALP), creterea primei enzime este mult mai specific
bolilor hepatobiliare (creterea 5-nucleotidazei fiind observat la 70-92%
dintre pacienii cu boli hepatobiliare).

Valori crescute mai apar n icter extrahepatic, ciroz primar


biliar i metastaze hepatice.

Spre deosebire de fosfatza alcalin, 5-nucleotidaza nu este


afectat de graviditate sau adolescen. Acest argument indic
dozarea 5-nucleotidazei la copii i adolescenii cu cretere
rapid

pentru

diferenierea

hepatobiliare.

35

afeciunilor

osoase

de

cele

36

I.7. DOZAREA ACTIVITII COLINESTERAZEI (CHE)


(metoda colorimetric cu reactiv Ellman)

Colinesteraza face parte din grupul carboxilesterazelor. Exist mai


multe tipuri de colinesteraze cu localizri diferite. Funcie de topografia
enzimei i a substratului asupra cror acioneaz, acestea pot fi prezentate
astfel:
Tabel nr.1 Clasificarea tipurilor de colinesteraz (dup G.H.Manle i
colab., 2005, modificat)

Tipul colinesterazei

Acetilcolinesteraza

Distribuia n
esuturi
- terminaii
nervoase colinergice

Aciunea fiziologic
Influeneaz transmiterea
impulsului nervos

- celulele Kupffer
-colinesteraza
(colinesteraz specific)
Pseudocolinesteraza
(cu 5 izoenzime)

- eritrocite

Rol n metabolismul hematiei

- hepatocite

Rol n metabolismul proteic

Principiul metodei:
Esterii

acetilcolinei

sunt

hidrolizai

reacia

catalizat

de

colinesteraz, iar tiocolina format reacioneaz cu DTNB (acid 5-5-ditiobisnitrobenzoic) sau reacia Ellman, formnd 5-MNBA (acid 5-mercapto-2nitrobenzoic), un compus colorat n galben, fotocolorimetrabil la 412 nm.
Intensitatea coloraiei este direct proporional cu activitatea colinesterazei.

37

Reacia este urmtoarea:

CH3
H3C

CH3
CH3

(CH2)2
+ HOH

S ChE

H3C

O
CH3

C O
(CH2)2

(CH2)2

C O

SH

CH3

Tiocolina

Butirat

(CH2)2
CH3
Butiriltiocolina
(ester de acetilcolina)

CH3
HOOC

NO2

H3C

CH3
H3C

CH3

(CH2)2
CH3

(CH2)2

HOOC

SH

O2N

S
5'-MNBA
(compus colorat n galben)

SH
Tiocolina

HOOC NO2
HOOC NO2
DTNB

Disulfur mixt

38

Aparatur
Spectrofotometru

Reactivi:
1. Substrat (butirilcolina) 6,6 mM. Se dizolv 1 comprimat din test
n 5 ml ap bidistilat. Soluia este stabil 2 sptmni.
2. Reactiv Ellman: 20 mg DTNB dizolvat n 180 ml ap bidistilat i
completat cu alcool etilic 95% pn la 250 ml. Soluia este stabil 2
sptmni.
3. Ser (diluat 1/11 cu ser fiziologic )
Mod de lucru
Reactivi (l)
Blanc (l)
Substrat
200
Ser diluat
Incubare la 25C timp de 10 minute
Reactiv de culoare - Elleman
2000
Ser diluat
20

Prob (l)
200
20
2000
-

Se las n repaus timp de 10 minute.


Se citete absorbia probei fa de martor la 412 nm.
Activitatea colinesterazei UI/l = AP x 8978
O unitate de activitate enzimatic este corespunztoare cantitii de
enzim care hidrolizeaz 1 mol butiriltiocolin n timp de 1 minut la 25C.
Intervale de referin:
3000 8000 UI/l (25oC)

39

4000 12000 UI/l (37oC)


Interpretarea rezultatelor:
Valori sczute:
Scderi fiziologice:
Fiziologic nivelul seric al pseudocolinesterazelor scade n sarcin

Scderi patologice:

intoxicaia cu organo-fosfarate (din insecticide mai ales) nivelul


seric al pseudocolinesterazelor este cu 50% mai redus datorit
inhibiiei colinesterazei de ctre pesticidele ce conin fosfai
organici.

reducerea valorilor serice cu 40% la apariia primului simptom de


ingestie acut.

reducerea valorilor serice cu 80% n momentul apariiei efectelor


neuromusculare

pacienii cu expunere cronic la doze sczute pot fi asimptomatici


chiar la nivele sczute ale colinesterazei.

Observaii: muncitorii care sunt expui la organofosforate nu trebuie


s-i reia lucrul pn cnd valoarea colinesterazei nu crete la 75% din
normal. (colinesteraza seric se regenereaz ntr-un ritm de 25% n 7-10 zile
i revine la nivelul bazal n 4-6 sptmni).

ciroze hepatice decompensate

metastaze hepatice

distrofii musculare
40

Studii statistice arat c valoarea seric a pseudocolinesterazei se


coreleaz cu nivelul albuminei i cu cel al protrombinemiei. Reducerea
progresiv, n mod paralel a cotei albuminemiei i a nivelului seric al
pseudocolinesterazei este un element care indic constituirea leziunilor
hepatice ireversibile.

41

I.8. DOZAREA ACTIVITII ORNITIN CARBAMIL TRANSFERAZEI


(OCT)

Principiul metodei:
Ornitin carbamil transferaza (OCT) catalizeaz reacia de transfer a
grupei carbamil de pe carbamil fosfat pe ornitin cu formarea citrulinei.
Reacia are loc la nivelul mitocondriei hepatice. Dozarea OCT n ser este
extrem de util n investigarea ficatului, datorit faptului c provine doar de
la acest organ.
Reacia:
O

NH2
NH2

CH2

C=O

(CH2)2

O PO3H2

CH

NH
OCT

NH2

CH2
(CH2)2

NH2

CH

COOH
Carbamil fosfat

NH2

COOH

Ornitina

Citrulina

Metoda de dozare const n adugarea ureazei pentru a elimina ureea


din prob, iar apoi citrulina va reaciona cu diacetilmonoxima i antipirina
formnd un complex fotocolorimetrabil la 460 nm. Intensitatea coloraiei este
direct proporional cu activitatea ornitin carbamil transferazei.
Aparatur
Etuva
Spectrofotometru

42

Reactivi:
1. Tampon

trietanolamina,

pH=7,7.

Se

dizolv

74,2

de

trietanolamina n 900 ml ap. Se ajusteaz pH-ul la 7,7 cu soluie


de NaOH 1N, iar apoi se aduce la 1000 ml cu ap distilat.
2. Ureaza. 200 mg ureaz, 5000U/g, se dizolv n 200 ml tampon de
trietanolamina.
3. Soluie carbamilfosfat 50mM. Soluia se prepar extemporaneu prin
dizolvarea a 150 mg carbamilfosfat sare de litiu n 20 ml tampon
trietanolamina.
4. Soluie diacetilmonoxima. Se dizolv 10,1g n 1000 ml de ap
distilat.
5. Soluie antipirina. Se dizolv 12,2 g antipirina i 3,4 g FeCl 3 6H2O
ntr-un amestec format din 625 ml acid fosforic 85% i 375 ml ap
distilat.
6. Standard de citrulina 15 mM. Se dizolv 263 mg citrulina n 100 ml
ap distilat.
7. Acid tricloracetic 22 g%.
Mod de lucru:
Reactivi (ml)
Tampon (1)
Ornitina
Ser

Blanc (ml)
Proba (ml)
Proba martor (ml)
0,1
0,4
0,4
0,4
0,1
0,1
Incubare 5 minute la 37
Carbamil fosfat
0,4
0,4
Ureaza
0,4
Se agit i se incubeaz la 37 C 30 de minute
Acid tricloracetic
1
1
1
Se agit, se centrifugheaz 10 minute la 5000 rot/min
Reacia de culoare:
Reactivi (ml)

Blanc (ml)

43

Proba (ml)

Proba martor (ml)

Supernatant martor
Supernatant proba
Supernatant proba martor
Antipirina
Diacetilmonoxima
Se las 20 minute

1
1
4
4
1
1
pe baie de ap, se rcete

1
4
1

Se citesc la 460 nm proba i proba martor fa de martor.


Pentru standardizare se folosete etalonul de citrulina n diluie de
1/50 i 1/100 i se lucreaz la fel ca probele. Valorile sunt de 150 i
respectiv 300 moli/l.
O unitate a activitii enzimei se definete prin cantitatea de OCT ce
produce 1mol de citrulina/min/l sau 30 moli de citrulina/min/l. Cele
dou valori standard vor corespunde la 150/30=5 U/l, 300/30=10 U/l.
Intervale de referin:
0-5 U/l
Interpretarea rezultatelor:
Valori crescute:
Datorit valorilor sczute ale enzimei n ser la pacienii sntoi orice
cretere a valorilor enzimei ofer indicii asupra strii de funcionare a
ficatului. Creteri marcante ale activitii OCT se ntlnesc n hepatitele
virale acute i alte forme de necroz a ficatului.
Valori moderat crescute apar n:
-

Icter obstructiv

Ciroz

Carcinom metastatic

44

Infarct miocardic n condiiile unei complicaii congestive hepatice.

Valori sczute:
Deficitul de OCT este o afeciune recesiv X-linkat ce determin:
-

La nou nscut hiperamonemie sever cu alcaloza respiratorie.

La adult valorile amonemiei sunt de 2-10 X valori normale.

Scderea OCT poate aparea dupa o infecie bacterian sau viral,


determinnd confuzii cu sindromul Reye.

45