Sunteți pe pagina 1din 11

Universitatea Academiei de tiine a Moldovei

Facultatea : tiinte ale Naturii


Specialitatea: Biologie Molecular

Referat la Transgeneza pe tema:

Vectori Plasmidiali

A efectuat : Paladi Ana-Maria


Profesor: D.Zgardan

Chiinu, 2014

CUPRINS

VECTORI DE CLONARE PLASMIDIALI


Cei mai cunoscuti si mai utilizati vectori de clonare sunt cei derivati de la plasmidele bacteriene.
Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare, plasmidele necesit o serie de caracteristici:

a) S nu conin gene tra, deci s nu genereze proces de conjugare bacterian i, ca atare,


s nu fie autotransmisibile. Aceast caracteristic este esenial att, pentru diversele etape de

cercetare, ct i pentru securitatea cercettorului (foarte muli vectori de clonare plasmidiali prezint
ca markeri de selectie gene de rezistent la antibiotice, iar dac vectorii ar fi autotransferabili ar
exista/crete riscul ca gene de antibiorezistent s ajung n diverse microorganisme patogene).
b) S conin situsuri unice pentru un numr ct mai mare de endonucleaze de restricie (la
acest nivel se efectueaz insertia ADN pasager).
c) Situsul de inserie s nu fie localizat n genele implicate n replicarea i partiia plasmidului.
d) S prezinte markeri genetici abseni n celula receptoare.
e) S aiba o greutate molecular mic, pentru a fi uor de izolat i de manipulat.
f) S prezinte ct mai multe copii per celul.
Primul plasmid natural care a fost folosit n experimente de clonare genetic este plasmidul Col E1
de la Escherichia coli (Fig.3.1.) Acest plasmid are o greutate molecular de 4.6 x 10 6 Da, este
neconjugativ, produce colicina E1 i confer gazdei imunitate la aceast colicin. Selecia celulelor
transformate (care au primit plasmidul) pe baza acestui marker (imunitatea la colicina) este o tehnic
dificil i, n final, reprezint un dezavantaj al folosirii acestui plasmid n experimentele de clonare
genetic. Pe de alt parte, plasmidul Col E1 poart i gene mob care i confer capacitatea de
transfer n trans, n prezena unui alt conjugon. Ca urmare, exist riscul diseminarii necontrolate a
plasmidului Col E1 recombinat.

Ulterior, au fost folosite alte plasmide naturale - pSC101 i pRS2124 - care, datorit genei de
rezisten la tetraciclin i, respectiv, rezisten la ampicilin, permit o selecie mai uoar a
transformanilor.
n urma unor asemenea testri a plasmidelor naturale, s-a concluzionat c este necesar construcia
unor plasmide artificiale, destinate exclusiv experimentelor de clonare.
n cele ce urmeaz vom prezenta cteva asemenea plasmide artificiale utilizate ca vectori de
clonare.

Tulpini bacteriene i vectori plasmidiali utilizai


O list cu tulpinile de microorganisme, plasmidele realizate i utilizate
pe parcursul experienelor efectuate, mpreun cu marker-ii fenotipici
relevani este prezentat n tabelul urmtor.
Tab. 1 Tulpinele bacteriene utilizate n experimentele realizate i markerii lor specifici.
Nr

Tulpina bacterian

Specificitate, Markeri fenotipici

Escherichia coli XL1 Blue

gyrA96 thi-1 hsdR1 supE44 relA1 lac [F' proAB lacIqZM15


Tn10
(Tetr)]

Escherichia coli
BL21(DE3)
Arthorbacter
nicotinovorans pAO1+
Arthorbacter
nicotinovorans pAO1-

3
4

F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB mB -)(DE3 [lacI lacUV5T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
Tipul slbatic, nic+, kanR
Nic-, kanR

Tab. 2 Plasmidurile utilizate i markerii lor specifici.


Nr
Plasmidul
1

pH6EX3

pH6EX3nboR

pH6EX3gfoR

pH6EX3aldH

pH6EX3kgdH

Markerii fenotipici
AmpR lacIQ
AmpR lacIQ, pH6EX3
coninnd NBOR intre
BamHI-SalI
AmpR lacIQ, pH6EX3
continand GFOR intre
HindIII-XhoI
AmpR lacIQ, pH6EX3
coninnd ALDH intre
BclI-SalI
AmpR lacIQ, pH6EX3
coninnd KGDH intre
BamHI SalI

Condiii de cretere utilizate


Tulpinile de Escherichia coli purttoare de vectori plasmidiali au fost
cultivate pe mediu Luria-Bertani (LB, 10 g NaCl, 5 g extract de drojdii (Roth,
Germania), 10 g pepton din cazein (Roth, Germania) la 1000 ml ap) (13),
suplimentat cu antibiotice conform tabelului 3. Pentru obinerea mediului
solid s-au adugat 16 g/ml agar (Roth, Germania).
Tab. 3. Concentraiile de antibiotice utilizate la cultivarea tulpinilor de
Escherichia coli
Nr

1
2
3

Tulpina bacteriana sau


plasmidul

Antibiotic

Concentraia
soluiei stoc
(mg/ml)

Concentratia finala n
mediu (g/ml)

Escherichia coli XL1 Blue

Tetraciclin

10

20

Cloranfenicol

15

15

Ampicilin

50

50

Escherichia coli
BL21(DE3)
Tulpini de Escherichia
cu pH6EX3 sau ceilali
plasmide derivai de la

acesta

Tulpina Arthrobacter nicotinovorans pAO1+ (28) i cea pAO1(99) au


fost propagate pe mediu citrat cu adaos de minerale urmrind indicaiile lui
Eberwein i colab., 1965 (63) i Gloger i Decker, 1969 (78).
Astfel, pentru prepararea mediului citrat se dizolv n 1000 ml ap
distilat:
2 g citrat trisodic
2 g (NH4)2SO4
4,92 g Na2HPO4
3,06 g KH2PO4
5 g extract de drojdii (Roth, Germania)
Soluia obinut se sterilizeaz prin autoclavare i se pstreaz la
temperatura camerei. Dac este necesar obinerea de mediu solid, se adaug
16 g/L agar. nainte de utilizare, se adaug 5 ml/L soluie de minerale,
kanamicin (70 g/ml dintr-o soluie stoc 140 mg/ml) i, dup caz, 0,05 %
nicotin.
Soluia de minerale conine, pe litru:
0,75 g CaCl2
3,5 g ZnSO4.2H20
4,58 g H3BO3
0,22 g FeSO4.7H20
0,24 g MnSO4.7H20
0,1 g CuSO4.5H20
0,1 g CoSO4.7H20
2 g KH2PO4
2 g MgSO4.7H20 59
7,5 g EDTA
Dup dizolvarea complet a srurilor, soluia obinut se sterilizeaz
prin filtrare i se pstreaz la ntuneric. Dei iniial soluia are culoarea verde,
dup cteva zile devine roie. Aceasta nu afecteaz creterea celulelor.
Plcile cu mediul LB solid pentru cultivarea de Escherichia coli au fost
incubate la 370C peste noapte. Cele pentru cultivarea tulpinilor de
Arthrobacter coninnd mediu mineral citrat au fost incubate la 300C pentru
48 ore (s-au pn la obinerea de colonii distincte).
Pentru cultivarea tulpinilor de Escherichia coli n mediu lichid, o
colonie de pe o plac cu E. coli a fost inoculat n 20 ml de mediu LB (n flacon
de 50 ml) coninnd antibioticul corespunztor i incubat peste noapte la 370C
sub agitaie continu (190 rpm).
Culturile de Arthrobacter nicotinovorans s-au obinut prin inocularea
cu o colonie a 100 ml mediu citrat ntr-un flacon
Erlenmayer i incubarea sub
agitare continu (190 rpm) pentru 24 ore la 300C.
Vectorul pBR322
Fig.3.2. Vectorul pBR322.

Vectorul pBR322 (Fig.3.2.) este un vector plasmidial


cu o lungime de 4361 bp (2.6 x 106 D). n construcia

lui s-au folosit genele de replicare plasmidial din


ColE1, fapt pentru care acest vector desfoar o
replicare pe acelai model cu ColE1: replicare realizat
de ADN polimeraza I (i nu ADN polimeraza III, ca n
cazul replicrii cromosomului bacterian), n control
relaxat, cu reglaj realizat de molecule de ARN antisens
stabilizate de proteina Rop. Acest sistem prezint
avantajul c, atunci cnd tulpin gazd este cultivat n
prezen unei concentra ii mari de cloramfenicol (170
g/ml) - antibiotic ce inhib ntreaga proteosintez din
celula respectiv - replicarea cromosomului bacterian
este blocat (ntru-ct necesit biosinteza continu de
ADN polimeraza III), dar se poate desfaura replicarea
vectorului,

proces realizat de ADN pol I (aceast enzim este


prezent n mod continuu n celula n cantitate foarte mare). n acest mod, are loc de fapt o amplificare
genetic prin creterea numrului de copii plasmidiale per echivalent molar cromosomial.
Vectorul are 2 markeri genetici - 2 gene de rezisten la ampicilin i, respectiv, la tetraciclin, ce
sunt transcrise n direcie invers una de cealalt.
Situsurile de restricie importante
pentru experimentele de clonare
sunt: Pst I - n gena Apr
Hind III, BamH I, Sal I - n gena Tcr
Strategia de clonare n vectorul pBR322 i derivaii si (Fig.3.3.)

1 - Insertia ADN pasager construcia vectorului recombinat


ADN pasager va fi inserat ntr-unul din situsurile de restric ie din cele 2 gene de antibiorezistent
(Apr, Tcr) : (1) ambele molecule (vector i ADN pasager) se supun digestiei cu o aceeai enzima de
restricie, ceea ce va conduce la obinerea de capete complementare; (2) se amestec cele 2 tipuri
de molecule (n anumite proporii molare) astfel digerate (n prealabil, vectorul linearizat este tratat cu
fosfataz alcalin pentru a evita recircularizarea lui); (3) se adaug i o ADN ligaza (de E.coli sau de
T4, funcie de tipul de capete obinute - netede sau coezive) ce va reface legturile fosfodiesterice
rezultnd vectorul recombinat .
n funcie de endonucleaza de restricie folosit la digestie, vectorul pBR322 recombinat va avea una
din cele 2 gene de rezisten (Tcr sau Apr) inactiv. Prin aceast inactivare inserional pot fi
deosebite moleculele de vector nerecombinat, fr ADN pasager (Ap r Tcr) de moleculele de vector
recombinat, cu ADN pasager inserat (Apr Tcs sau Aps Tcr).
2 - Propagarea vectorului recombinat n tulpini de E.coli i selecia celulelor transformate
Vectorul recombinat se introduce (prin tehnici de transformare genetic n vitro) ntr-o tulpin
bacterian ce trebuie s prezinte sensibilitate la ambele antibiotice (Ap s Tcs). Celulele transformate
vor prezenta fenotip Apr Tcs sau Aps Tcr.
Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian
Note de curs i tehnici de laborator

Fig.3.3. Schema clonarii moleculare


n vectorul pBR322.

n ultimii ani, principalele


tendine n construcia vectorilor
plasmidiali sunt: (I) reducerea la
maximum a dimensiunii vectorilor
i mrirea capacitii lor de a
accept ADN heterolog; (II)
creterea numrului de situsuri
de restric ie i distribuirea lor
ntr-un cluster = PolyCloning Site
(PCS); (III) ncorporarea n
vectori a unor secvene ce permit
identificarea celulelor cu vectori
reconbinani prin teste ct mai
simple i mai rapide : selecie
direct (sisteme ce permit numai
creterea clonelor recombinate)
sau
selecie
prin
teste
histochimice; (IV) introducerea
n vectori a unor secvene ce
permit generarea de molecule
monocatenare
necesare
tehnicilor de secveniere sau de
construcie de sonde ADN; (V)
introducerea n vectori a unor
secvene de tip promotori,
terminatori, enhanceri,ce permit
transcrierea n vitro a ADN clonat
(pasager).

Vectorii pUC 18/19


pUC 18/19 (Fig.3.4.) sunt vectori doar de clonare, nepermind i exprimarea ADN clonat. Au o
dimensiune de 2.69 kb.
Fig.3.4. Vectorul pUC 18/19.

Aceti vectori au regiunea ori din Col E1, cu


diferena ca a fost scoas gena rop. Ca atare,
aceti vectori sunt prezeni n mod obi nuit ntrun numr foarte mare de copii per celul i
prezint un potenial crescut de amplificare prin
tratament cu cloramfenicol.
Aceti vectori au 2 tipuri de markeri genetici:
gena Apr - caracter pe care se bazeaz
selecia iniial (screeningul) a celulelor ce
poart vector;
gena lacZ- este o gen defectiv ce
exprim doar captul NH2-terminal al
galactozidazei;
Aceast gen incomplet este
capabil de complementaie intra-alelic cu o
alt form defectiv a genei lacZ (ce codific
captul COOH-terminal al - galactozidazei)
dintr-o gazd bacterian adecvat. n urma
procesului de
complementaie, tulpina bacterian defectiv dar purttoare a vectorului nerecombinat este capabil
s refac integral galactozidaza. Sub inducia IPTG (isopropil-tio - D-galactosid, care este un
inductor al genei lacZ), o asemenea tulpin formeaz colonii albastre pe un mediu ce contine X-gal (5Br-4-Cl-3-indolil- D-galactosid).
Inseria unui ADN heterolog n situsul de policlonare (PCS, MCS) - care este inclus n
promotorul lui lacZ - determin imposibilitatea exprimrii genei lacZ i, ca atare, gena lacZ defectiv
din cromosomul gazdei nu mai este complementat de cea din vectorul recombinat i, ca urmare, nu
se mai formeaz galactozidaza activcare s scindeze complexul X-gal cu formarea compusului
indolic albastru. Coloniile ce poarta vectorul recombinat au culoarea alb. Este cea mai folosit
variant histochimic de selectie a clonelor recombinate.
Vectorii pUC18/19 reprezint prima familie de vectori de clonare la care situsurile pentru
endonucleazele de restricie au fost grupate ntr-o singura zon a vectorului, denumita situs de
policlonare (PCS = PolyCloning Site ; MCS = MultiCloning Site). n pUC18/19, PCS contine situsuri
pentru 10 endonucleaze de restricie i pentru 3 enzime izoschizomere. PCS este n orientare invers
n pUC19 fa de pUC18.
Clonarea n acest situs determin tot o inactivare insertional (o gen din vector nu se mai exprim),
diferen ns fa de vectorii de clonare anteriori (pBR322, pBR325, pUB110) constnd n
posibilitatea identificrii rapide, directe, a clonelor recombinate, pe baza diferenei de culoare dintre
colonii (colonii albastre = celule ce poart vector nerecombinat ; colonii albe = celule ce poart vector
recombinat).
Vectorii a cror derivai recombinai se bazeaz pe acest sistem de identificare histochimic
(complementaia intra-alelica ntre 2 gene defective lacZ, una cromosomial i cealalt pe vector),
necesit a fi introdui n gazde bacteriene adecvate, care s aibe pe cromosom o gen lacZ defectiv
ce codific capul COO - terminal al galactozidazei.
Strategia de clonare n vectorii pUC18/19 i derivaii si
a Inser ia ADN heterolog n situsul de policlonare se realizeaz prin aceleai etape ca i n cazul
vectorilor anteriori: digestia vectorului i a ADN heterolog cu aceeai endonucleaz de restricie (sau
cu enzime izoschizomere), amestecarea fragmentelor i, respectiv, adugarea unei ADN-ligaze;
b - Introducerea vectorului recombinat n tulpini bacteriene adecvate (au pe cromosom o gena lacZ
defectiv ce complementeaz gena lacZ .
Selectarea clonelor celulare cu vector recombinat se realizeaza n 2 etape:
1 - cultivare pe mediu cu Ap i screeningul clonelor ce poart vector (Ap r)
2 - cultivarea acestor clone celulare pe mediu cu IPTG i X-gal i selecia coloniilor ce poart vector
recombinat (= colonii albe)

VECTORII pGEM

Fig.3.5. Vectorul pGEM 3/4.

Vectorii pGEM (Fig.3.5., Fig.3.6.) sunt vectori


plasmidiali de exprimare care confer, deci, i
posibilitatea analizei exprim rii ADN heterolog. n
structura lor intr urmtoarele regiuni:
(1) regiunea ori din plasmidul Col E1, ce
controleaz replicarea vectorului;
(2) Apr = gena de rezistena la ampicilin, pe
baza creia sunt selecionai transformanii;
(3) regiunea PCS care conine situsuri pentru
10 endonucleaze de restricie + 3 enzime
izoschizomere;
(4) doi promotori, din fagii SP6 i T7, care
flancheaz regiunea PCS i care sunt n
orientare invers unul fat de celllt,
permind transcrierea ambelor catene ale
ADN heterolog.
Vectorii pGEM 3/4 (Fig.3.5.) au o dimensiune de
2.87 kb i difer intre ei prin orientarea situsurilor de restricie n cadrul regiunii PCS. Vectorii pGEM
3Z/4Z (Fig.3.6.) conin n plus fa de variantele 3/4 i o gen defectiv lac Z identic cu cea din
vectorii pUC 18/19, permind deci selecia histochimic a clonelor recombinate.

Fig.3.6. Vectorul pGEM 3Z/4Z.

NOTA: 1. INCEARC S GASESTI INFORMATII DSPRE UTILIZAREA LOR IN CARTE SCRIE CA


SUNT UTILIZATI PENTRU CLONAREA FRAGMENTELOR DE and PENTRU CREAREA
BIBLIOTECILOR DE GENE O SA VEZI MAI PE SCURT
2. si VECTORII DE ALTE TIPURI CARE AU FOST CREATI PE BAZA VECTORILOR
PLASMIDIENI (ACOLO IN CARTE ESTE SCRIS CA IATA FAGIMIDELE SAU COSMIDELE SAU BAC
SAU YAC CA AU FRAGMENTE CARE PROVIN DE LA VECTORII PLASMIDIENI SA TE UITI IN
CARTE DE EXEMPLU TOTI VECTORII CARE AU SECVENTA ORI APOI SUNT DERIVATI DE LA
VECTORII PLASMIDIENI)

Bibliografie

Genetica microorganismelor i inginerie


genetic microbian Note de curs i tehnici
de laborator;
Coculescu B.I., Taubner C.L. Tehnologia
ADN recombinat baz a clonrii genei;
Duca M., Zgardan D. UnAM, Transgeneza
la animale.