Homenagens e agradecimentos

Os responsveis pela implantao do TELELAB empenharam toda sua capacidade profissional para tornar
este projeto digno da qualidade tcnica e cientfica e da eficincia que nossa coordenadora geral sempre imprimiu
s realizaes do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministrio da Sade.
Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues, exemplo de coragem e liderana, dedicamos este trabalho.
Maringela Batista Galvo Simo

Agradecimentos:
s equipes da:
Faculdade de Higiene e Sade Pblica - Universidade de So Paulo;

Ao Laboratorio ControlBio, So Paulo; e

Hospital Universitrio Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC

Tcnicas de colorao de Gram

Introduo
O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o mtodo de Gram. A bacterioscopia, aps
colorao pelo mtodo de Gram com diagnstico presuntivo de triagem, ou at mesmo confirmatrio em alguns
casos, constitui pea importante e fundamental na erradicao e no controle das Doenas Sexualmente Transmissveis (DST). Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de resoluo, permitindo o correto diagnstico
em cerca de 80% dos pacientes em carter de pronto atendimento em nvel local.
Os custos com investimento e manuteno so consideravelmente baixos diante da eficcia alcanada com
os resultados imediatos dos testes. Essa tcnica requer instalao simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de gua e gs, onde dever ser instalado um balco com pia e um bico de Busen, eventualmente substitudo por uma lamparina ou espiriteira.
So ainda necessrios: microscpio com objetiva de imerso e bateria para a colorao de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo prprio laboratrio ou por um laboratrio habilitado que assegure a qualidade do
produto.
Finalmente, e mais importante, so necessrios tcnicos de laboratrio treinados, responsveis e conscientes
do valor do seu trabalho.
As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tamanho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser influenciadas
por vrios fatores, incluindo idade da cultura (esfregao de cultura), meio de cultivo utilizado, atmosfera e incubao e presena de substncias inibidoras.
A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o mdico dinamarqus Hans
Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com
diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas
de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.
Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modificao foram feitas. Neste curso voc vai conhecer
a tcnica, os corantes e os procedimentos para a correta realizao da colorao de Gram, recomendados pelo
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministrio da Sade.

Tcnicas de colorao de Gram

Quais as modificaes feitas ao mtodo de Gram?

O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um outro tipo de cristal violeta, a violeta-demetila. importante ressaltar que a soluo de violeta-de-metila, em sua preparao, j contm fixador qumico.
Devido a isso, a fixao do esfregao em chama caiu em desuso e atualmente contra-indicada.
O diferenciador h 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o lcool etlico (99,5 Gay-Lussac). Esse mais seguro do que o lcool - acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador
para que no ocorresse a hiperdescolorao. Alm do que, no permitia uma boa reprodutibilidade da tcnica.
Entretanto, a modificao mais importante foi a do corante secundrio, tambm chamado de corante de
fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituda pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a
fucsina pela safranina.
A safranina mantm-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactrias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da colorao de fundo, que assume a cor vermelho-claro.
Veja a figura 1:

fucsina

safranina
violeta

violeta

Figura1: representao, no espectro de cores, da distncia da cor violeta entre as cores safranina e fucsina.

Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?

Tcnicas de colorao de Gram

Safranina

Fucsina

Corante cido

Corante Bsico

Pertencente ao Grupo das

Triarilpirazinas

Pertencente ao Grupo das

Triarilmetanos

Solvel em gua

Insolvel em gua

O que preciso para preparar os corantes de Gram?

1 copo de Becker de 500 ml

violeta de metila

1 copo de Becker de 1 litro

lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)

1 balana gramatria ou eletrnica

2 bastes de vidro
1 proveta de 200 ml
1 proveta de 500 ml
1 esptula ou uma colher de caf

lcool metlico (99,5 Gay-Lussac)

2xalato de amnia
iodeto de potssio
iodo metlico
safranina
gua destilada

Como preparar a violeta de metila?

A) Primeira soluo:
Frmula:
Violeta-de-metila............................................................................2,0g
lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)...........................................

100,0 ml

lcool metlico (99,57 Gay-Lussac)......................................

100,0 ml

Modo de preparo:
Se voc utilizar uma balana gramatria ou eletrnica, coloque o papel de pasagem no prato e pese o
papel. Adicione a este valor 2 gramas de violeta de metila. Siga atentamente as instrues contidas no
manual do equipamento.
Transfira a violeta de metila para o copo de Becker de 500 ml, junte 100 ml de lcool etlico e, em seguida,
100 ml de lcool metlico. Misture lentamente com o auxlio do basto de vidro. Deixe descansar por alguns
minutos e repita o procedimento de mistura vrias vezes, at conseguir a completa dissoluo do corante.
B) Segunda soluo:
Frmula:
Oxalato de amnia.........................................................................
gua destilada.........................................................................

4,0 g
400,0 ml

Modo de preparo:
Pese 4 gramas de oxalato de amnia. No copo de Becker de 1 litro, junte o oxalato de amnia metade da
gua destilada (200 ml). Misture lenta e constantemente como na 1 soluo, at conseguir a completa
dissoluo, observando se no restaram resduos no fundo do copo de Becker. Voc observar que o
preparo dessa soluo vai desencadear uma reao endotrmica, isto , a soluo ficar ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de dissoluo do sal, voc pode aquecer em banho-maria a 37 C. Reserve
200ml de gua destilada para o preparo final.
C) Preparo final:
Junte as solues, a primeira e a segunda, e utilize o restante da gua destilada (200 ml) para recuperar
os resduos da violeta de metila no copo de Becker. Deixe descansar por 24 horas e filtre em papel de filtro comum, acondicionando o corante em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.
Tcnicas de colorao de Gram

Como preparar o lugol?

Frmula:
Iodeto de potssio...........................................................................4,5g
Iodo metlico..................................................................................3,0g
gua destilada...........................................................................450,0ml

Modo de preparo:
Para preparar essa soluo, pese 4,5 gramas de iodeto de potssio. Transfira o iodeto de potssio para um
bquer contendo 450 ml de gua destilada. Com o auxlio de um basto de vidro, misture at a completa dissoluo.
Em seguida, pese 3 gramas de iodo metlico e junte soluo de iodeto de potssio. Continue misturando at a
completa dissoluo. Armazene em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.

Como diluir o lugol para uso?

Antes de usar, dilua a soluo preparada 1/20 em gua destilada. Por exemplo, em um frasco conta-gotas
escuro, junte 2 ml de lugol concentrado com 38 ml de gua destilada.

Como preparar a safranina?

Frmula:
Safranina..........................................................................................2,5g
lcool etlico a 95%.................................................................250,0mL

Modo de preparo:
Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o p em 250 ml de lcool etlico 95%, prossiga retirando 10 mL
desta soluo e diluindo em 90 mL de gua destilada, misturando bem at conseguir a completa dissoluo. Guarde
em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.

Ateno
A boa prtica laboratorial recomenda a identificao de todos os seus
reagentes. Voc deve incluir o nome do corante, a concentrao, a data de
preparao e o prazo de validade.

Como armazenar os corantes?

Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor mbar-escuro, pois, de forma geral, as substncias corantes sofrem ao da luz, produzindo alteraes variadas. Os corantes devem ser colocados em frascos de 1 litro e distribudos
em frascos conta-gotas com cerca de 100 ml de capacidade, para uso dirio. Sempre que os frascos conta-gotas forem reabastecidos, filtre o corante. Esse procedimento evitar os inconvenientes advindos da precipitao do corante.

Tcnicas de colorao de Gram

Como fazer a colorao de Gram?

Antes de iniciar a colorao, assegure-se de que o esfregao esteja seco. No fixe o esfregao em chama, pois
esse processo promove a desi dratao brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-de-metila j
contm fixador qumico.
No se pode deixar de destacar que a colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til quando for corretamente realizada (tecnicamente) e interpretada por profissionais experientes.

Para fazer a colorao, siga os seguintes passos:

1 - cubra o esfregao com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;
2- adicione igual quantidade de gua sobre a lmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por mais 45 segundos;
3- escorra o corante e lave em um filete de gua corrente. Cubra a lmina com lugol diludo (1/20) e deixe agir por
aproximadamente 1 minuto;
4- escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente;
5 - adicione lcool etlico (99,5 GL) sobre a lmina, descorando-a, at que no desprenda mais corante;
6 - lave em um filete de gua corrente;
7 - cubra a lmina com safranina ou (fucsina bsica 0,1 a 0,2%) e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8 - lave em um filete de gua corrente;
9 - deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxlio de um papel de filtro limpo;
10 - coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao; e
11 - leia em objetiva de imerso (100 X).

Como funciona a colorao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, vrios pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o
mecanismo envolvido no mtodo de colorao. Conceitos diversos tm sido apresentados, tais como:
1 - a existncia de um substrato Gram-positivo e especfico;
2 - as bactrias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primrio
cristal de violeta; e
3 - a existncia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gramnegativos.
Este ltimo o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimenses dos espaos intersticiais, por exemplo, dimetro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da colorao de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares so cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram
em roxo. Com a adio do lugol, tambm chamado de mordente, ocorre a formao do completo iodo-pararosanilina. Essa reao tem a propriedade de fixar o corante primrio nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a
cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como lcool etlico, enquanto outras perdem sua
cor mais lentamente ou no perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.
As bactrias que tm a parede celular composta por murena (peptdeoglicano - peptdeo de cido n-acetil
murmico), durante o processo de descolorao com lcool etlico, retm o corante. J as bactrias com parede
celular composta predominantemente por cidos graxos (lipopolissacardeos e lipoprotenas) perdem o complexo
iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.

Veja as figuras 1 e 2.

Tcnicas de colorao de Gram

Figura 1. Esquema da parede das bactrias Gram-positivas

Tcnicas de colorao de Gram

Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas.

Como fazer o controle de qualidade do mtodo de colorao de Gram?

O controle de qualidade uma atividade obrigatria da rotina diria. Para realizar o controle de qualidade dos
corantes e da colorao de Gram, voc precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva dever ser a Streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture collection - n 19.615 e a Gram-negativa dever ser a Escherichia coli ATCC
n 25.922. Cocos Gram-positivos apresentam colorao roxa e Cocos Gram-negativos apresentam colorao rosa.
Para se evitar a evaporao dos reagentes que pode afetar sua eficcia recomenda-se que as solues de
trabalho sejam trocadas regularmente, dependendo da demanda. Deve-se tambm fazer manuteno preventiva
e limpeza nos microscpios e sistema de reviso dos resultados do Gram. A reviso de lminas por um supervisor
poder determinar a necessidade de treinamentos e adicionar informaes de relevncia clnica. Pode-se tambm
comparar os resultados da cultura com leitura do Gram.

Como fazer a manuteno das cepas-padro?

Para manter as cepas bacterianas do controle de qualidade em seu laboratrio, voc dever repic-las, a cada
15 dias, em gar nutriente (tubo com gar inclinado). O controle da pureza das cepas bacterianas dever ser realizado a cada 2 meses. As cepas devero ser repicadas em placas (mtodo do esgotamento por estrias) e identificadas
segundo procedimentos microbiolgicos tradicionais. Aps confirmao da pureza das cepas, estas devero voltar
a ser estocadas em tubos com gar nutriente.

Como preparar as lminas de controle de qualidade para uso dirio?

Prepare uma suspenso de Streptococcus pyogenes e Escherichia coli. Para isso, pipete 2 ml de soluo salina
estril em um tubo de ensaio limpo e estril. Junte uma alada do Streptococcus pyogenes e outra de Escherichia
coli. Muita ateno com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana durante a execuo. Flambe a ala
bacteriolgica antes e aps a utilizao com cada uma das cepas bacterianas. No se esquea de esfriar a ala aps
a flambagem.
Prepare 30 lminas para utilizar durante 1 ms, pipetando uma gota da suspenso bacteriana sobre cada
uma das lminas de vidro, limpas, secas e desengurduradas. Deixe as lminas secarem naturalmente. Estoque-as
em um porta-lminas em temperatura ambiente. Lembre-se de identificar o porta-lminas.

Ateno
O controle de qualidade dever sempre ser realizado ao trmino
da preparao dos corantes, mesmo no caso da diluio do lugol.

Figura 1. Esquema da parede das bactrias Gram-positivas

Tcnicas de colorao de Gram

Figura 2. Esquema da parede das bacterias Gram-negativas.

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Crditos e autoria

MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
Unidade de Laboratrio - D-DST/AIDS-HV
Mirian Franchini
Coordenadora de Produo do Projeto TELELAB

Autores:
Claudia Renata Fernandes Martins
Jos Antnio Pinto de S Ferreira
Luiz Alberto Peregrino Ferreira
Luiz Fernando de Ges Siqueira
Maria Luiza Bazzo
Miriam Franchini
Oscar Jorge Berro
Slvio Valle
Assessoria Pedaggica:
Maria Lcia Ricciotti Ribinik
Martistela Arantes Marteleto
Tcnica de Colorao de Gram
Braslia: Ministrio da Sade, Departamento de DST, Aids e
Hepatites Virais. 1997.
64 p.il. (Srie TELELAB)
I. Gram I. Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais (Brasil). II.
Srie TELELAB
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