Partie 1 Enzymo FEV 12

Module Biochimie / Biologie Molculaire
ENZYMOLOGIE
Semestre 4
Filire Fondamentale de la Licence
Sciences de la Vie
Pr Mohammed BEKKALI
Coordonnateur
www.uh2c.ac.ma/moodle
Enzymologie 2098/2010
Pr Mohammed Bekkali
Universit Hassan II Casablanca
Enzymes
ENZYMES
Pr Mohammed Bekkali
INTRODUCTION
Quand en 1883, Payen dcouvrit la diastase
et en 1849 Claude Bernard La lipase pancratique ;
Nul ne pouvait imaginer quil sagissait dj de

lbauche dune famille de biocatalyseurs qui
va rvolutionner la technologie 150 ans plus
tard.
Pr Mohammed Bekkali
Cest en effet la matrise scientifique

de fermentation qui a dmontr
lintrt dutiliser non plus le
microorganisme entier mais
seulement son principe actif pour
une ventuelle transformation
dune substance biochimique.
Pr Mohammed Bekkali
En raison de leurs proprits catalytiques ,

les enzymes participent :
Synthses de molcules biologiques
L acides amins; exhausteurs de got etc.
Technologie alimentaire (viande; lait; fromage,
boissons etc.)
Elaboration de nouvelles techniques analytiques
(lectrodes et capteurs enzymatiques) pour dtection
et dosage immdiat et donc de contrle en temps rel
dun produit donn
Lavenir des enzymes sera plus prometteur Ds

que la protine sera :
plus efficace,
plus stable , et
dune dure de vie plus longue
ce qui nous conduit parler de:
superenzyme
Pr Mohammed Bekkali
Pr Mohammed Bekkali
A+B
A-B
C+D
Raction en milieu aqueux, donc les molcules de
A et
B sont entoures deau, se dplacent dans tous les

sens cause de lagitation thermique avant de se
transformer en produits C + D. le complexe A-B dit de

collision doit passer par un tat de transition pour la
formation duquel une nergie dactivation est
ncessaire. Et comme un nombre faible de molcules
du complexe A-B atteint cette barrire, la vitesse de
raction est faible et do la ncessit de lenzyme.
Lnergie dactivation est ncessaire pour liminer les
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molcules deau.
Raction simple
Ce qui empche la conversion d'une substance chimique en une autre,
c'est la barrire nergtique qui les spare:
Entre les deux substances, il faut passer par un tat de transition particulirement dfavorable.
La vitesse de la raction de A B dpend de l'nergie d'activation (DEa1) ncessaire pour arriver

l'tat de transition (E.T.).
La vitesse de la raction de B A dpend de l'nergie d'activation (DEa2) ncessaire pour arriver l'tat de transition
L'nergie d'activation est fournie par l'agitation thermique. On peut donc acclrer une raction en chauffant.
L'quilibre de la raction de A B dpend de la diffrence d'nergie libre standard (DG0'),
mais pas de la hauteur de la barrire.
Pr Mohammed Bekkali
Modle: deux lacs de niveaux diffrents spars par une digue.
Le passage d'eau de gauche droite est dtermin par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac
de gauche, mais aussi par la frquence de vagues dpassant cette hauteur.
Le passage d'eau de droite gauche est dtermin par la hauteur de la digue en dessus du niveau moyen du lac
de droite, mais aussi par la frquence de vagues dpassant cette hauteur.
Des vagues plus hautes dues une agitation plus forte augmenteront le passage d'eau dans les deux sens et
aboutiront plus vite galiser le niveau des deux lacs.
Pr Mohammed Bekkali
Pr Mohammed Bekkali
HISTORIQUE
1823-BERZHELIUS formula le concept de catalyse et met en vidence son
rle dans la fermentation et dans la digestion.
1833 - (Payen & Persoz):Premire prparation enzymatique (extrait aqueux
d'orge germ). Par prcipitation alcoolique,le principe actif est concentr
dont une faible quantit suffit la conversion dune masse importante
damidon en sucre. Cette prparation est sensible la chaleur et porta le
nom de DIASTASE.
1878-kHNE proposa le nom denzyme (Du Grec, zyme:dans la levure),qui
en1940 devient universel.
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menu
1913 MICHAELIS donne la cintique

enzymatique sa forme mathmatique.
S
V Vmax .
Km S
1926
(Sumner) Cristallisation de l'urase.
Dtermination de la nature protique des

enzymes
Pr Mohammed Bekkali
1930 Environ 80 enzymes sont isoles

1947 Dbut des techniques de filtration
sur gel de Sephadex et lectrophorse.
Et donc plus de 200 enzymes isoles.
1968 Plus de 1300 enzymes isoles.
1980 Grce la Chromatographie
d'affinit, plus de 2000 enzymes
purifies.
De nos jours , environ 3500 enzymes
purifies.
Pr Mohammed Bekkali
Dfinition
Enzyme Nom suggr en 1878
par le physiologiste allemand
KHNE.
Lenzyme est une Substance

protique, qui agit comme catalyseur
biologique dans la rgulation de la
vitesse de nombreuses ractions
thermodynamiquement possibles (sans
modifier leur tat dquilibre) .
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STRUCTURE
Exemple de la glutamine transfrase
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Pourquoi des enzymes?

A. Acclration
Un(e) enzyme est un catalyseur biologique, donc elle acclre une raction qui serait
beaucoup trop lente sans elle (sans lenzyme).
Trois proprits importantes des enzymes:
Acclration de la raction dans les deux sens

Equilibre inchang
Saturation
1- Acclration mais quilibre inchang:
Concentrations de A et B en fonction du temps, en commenant avec
[A]o =10 et [B]o = 0
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Keq = 2.4 , [A]eq =2.94 et [B]eq =7.06

traits fins: sans enzyme,
traits pais: avec enzyme (acclration 10x)

(En fait, une enzyme acclre souvent une raction plus de 1'000'000'000 x !)
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Acclration de la raction inverse et quilibre inchang:

mmes constantes mais en commenant avec [A]o =0 et [B]o = 10
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. Canalisation
Parmi plusieurs ractions possibles, cest la raction catalyse qui aura lieu.
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Cintique
Pour une raction simple, la vitesse de formation de B (ou de disparition de

A)
est proportionnelle la concentration de A:
Vitesse de raction:
d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A]
(K1 = constante de vitesse)
Pr Mohammed Bekkali
Comme la raction inverse a aussi lieu,

le changement de [B] dpend de la diffrence
des deux vitesses de raction:
d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] - k-1[B]

Equilibre: d[B]/dt = - d[A]/dt = 0
Donc, l'quilibre: k1[A]eq = k-1[B]eq
[B]eq / [A]eq = k1/ k-1 = Keq (constante d'quilibre)
Pr Mohammed Bekkali
vitesse initiale
Concentrations de A et B en fonction du temps,
en commenant avec [A]o =10 et [B]o =0
k1 =0.3, k-1 =0.125, Keq = 2.4
Pr Mohammed Bekkali
Les deux concentrations s'approchent de

leurs valeurs d'quilibre,
[A]eq =2.94 et [B]eq =7.06
Pr Mohammed Bekkali
La vitesse de raction est difficile mesurer en prsence de A et B, surtout lquilibre !

On mesure donc en dsquilibre total, cest--dire la vitesse initiale:
[B] = 0 ; d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] , ou
[A] = 0 ; d[A]/dt = - d[B]/dt = k-1[B]
Graphiquement, la vitesse initiale est la pente de l'asymptote de la courbe pour t=0:
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la catalyse enzymatique passe par la formation d'un site

actif "cl-serrure", grace a la struc tertiaire. le site actif est
une rgion qui interagit avec les substrats qui seront
transforms en produits.le site actif est constitu d'acides
amins dont les groupements fonctionnels qui sont peu
nombreux interviennent dans la transformation des
substrats.
ENZYME
SUBSTRAT
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MODELE DE FISHER
Modle de la cl dans la serrure
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PROPRIETES
De tous les catalyseurs, les enzymes sont:
Les plus efficaces:
De trs petites quantits dE (micromoles) sont
capables dacclrer la raction un million de fois
Les plus spcifiques

chaque type de substrat correspond un enzyme.
Les enzymes possdent la capacit de rgulation.
Pr Mohammed Bekkali
Ils interviennent dans tous les processus

biologiques
Un quelconque dficit enzymatique peut

tre fatal pour la cellule vivante.
Les enzymes sont utilises en:
agroalimentaire, pharmacie,
mdecine, environnement, en
biotechnologie etc
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E ne figure pas parmi les produits de

la raction et nest donc pas consomm
E ne modifie pas la nature de la
raction ni son quilibre (la raction
est possible sans E).
E modifie la vitesse de raction (10

fois)
11
Il ne faut surtout pas penser que la

matire vivante fonctionnerait sans les
E mais avec une vitesse lente.
Pr Mohammed Bekkali
Pr Mohammed Bekkali
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CYCLE CATALYTIQUE
1.Diffusion des molcules dans le milieu
2.Reconnaissance spcifique enzyme

substrat
3.Mcanisme catalytique
4.Expulsion des produits.
-9
Un tel cycle est de lordre de 10 - 10 seconde

-8
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EVOLUTION DUNE CINETIQUE ENZYMATIQUE
Pr Mohammed Bekkali
S = cte et E = variable;
E = cte et S
variable
Pr Mohammed Bekkali
Pr Mohammed Bekkali
REACTION ENZYMATIQUE
Pr Mohammed Bekkali
Du fait que la vitesse est dtermine juste aprs le dbut de raction, cd

vo vitesse initiale, la probabilit de formation de ES partir de P et de E
est ngligeable parce que la concent de P est trs petite.
1. Ltat dquilibre est atteint trs rapidement pour lintermdiaire ES
(Briggs et Haldane), cd vf de ES = vd ES, autrement dit ES est
constant dans le temps.
vf .ES vd.ES ES const

vf .ES K 1E
. S
vd.ES K 2.ES K 3ES
Pr Mohammed Bekkali
V formation de ES
v disparition de ES
K 1E S K 3ES K 2ES 1
La concentration totale de lenzyme est:
ET EL ES 2
Pr Mohammed Bekkali
Si lon considre que vf de P partir de ES sexprime comme suit:
K
3
ES
E P
vf .P vo K 3.ES 3
Pr Mohammed Bekkali
Vmaximale est atteinte quand ES est maximale, cd tout E fait partie

de ES (Elibre=0), E satur par S.
ES max ET V max K 3.ES max

doncV max K 3ET 4
Pr Mohammed Bekkali
A ltat stationnaire,cd quand vf et vd de ES est la mme, on

obtient:
K 1E S K 3ES K 2ES 1
dES/dt = 0
Tout lenzyme est libre ,
K 1EL S K 2 K 3.ES 0maisEL ET ES

K 1ET ES S K 2 K 3.ES 0
ET
. S
ES
5
S K 2 K 3 K 1
On remplace le rapport (K2+K3/K1) par Km
(la constante de michaelis)
Pr Mohammed Bekkali
On multiplie le tout par K3
K 3.ET
. S
K 3.ES
S Km
maisK 3.ET V max etK 3.ES vo
V max .S
vo
S Km
Pr Mohammed Bekkali
d ' aprs 3
V max .S
vo
S Km
Pr Mohammed Bekkali
Raction catalyse par une enzyme
Il y a au moins trois ractions simples:

1.Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)
2.Transformation du substrat li (ES) en produit li (EP)
3.Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)
Pour chaque raction il y a une diffrence d'nergie libre

et une barrire d'activation franchir.
Pr Mohammed Bekkali
A chaque constante de vitesse correspond une nergie d'activation

(plus DEa est grande, plus k est petite):
La diffrence d'nergie libre (DG) entre substrat et produit ne dpend pas

de l'enzyme.
L'quilibre n'est donc pas modifi par l'enzyme!
Pr Mohammed Bekkali
Ici aussi, la vitesse de raction est difficile

mesurer en prsence de S et P,
surtout lquilibre!
On mesure donc de prfrence en dsquilibre total,
cest--dire la vitesse initiale vo:
En dbut de raction, il n'y a pas de P,
Pr Mohammed Bekkali
et on prsume que le complexe EP se dissocie plus vite qu'il ne se forme partir de ES,
c'est--dire que k3 > k2, k-2 . La raction qui limite la vitesse de formation de P est la
raction k2. Dans ces conditions, le schma se simplifie:
Pr Mohammed Bekkali
Leonor Michaelis et Maud Menten ont dduit de ce modle

en 1913 une quation qui prdit la vitesse initiale (de formation de P )
en fonction de la concentration du substrat:
Vitesse initiale de la raction: vo = d[P]/dt = k2[ ES ]
La vitesse de raction dpend de la concentration
du complexe enzyme-substrat ES.
V = f([ES])
Il faut donc calculer la concentration de ES:
Pr Mohammed Bekkali
ES se forme partir de E + S
et se dcompose
soit en E + S ,
soit en E + P .
Vitesse de formation de ES: vf = k1[ E ][ S ]
Vitesse de dgradation de ES: vd = (k-1+ k2)[ ES ]
[ ES ] atteint rapidement une valeur constante
(condition dite de "steady state"),
donc vd = vf
Pr Mohammed Bekkali
vf ES = k1[ E ][ S ]
vd ES = (k-1+ k2)[ ES ]
donc vd = vf
(k-1+ k2)[ ES ] = k1[ E ][ S ]
[ ES ] = [ E ][ S ] k1/ (k-1+ k2) =
= [ E ][ S ] / Km
Km = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis -Menten)
Il faut maintenant connatre

la concentration de l'enzyme libre [ E ].
Pr Mohammed Bekkali
[ E ]libre = [ E ]T - [ ES ]
o [ E ]T est la concentration totale d'enzyme.
On a donc: [ES]= [ E ][ S ] / Km
[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])[ S ] / Km =
= [ E ]T[ S ] / Km - [ ES ][ S ] / Km
[ ES ] + [ ES ][ S ] / Km = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ]( 1 + [ S ] / Km) = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ](Km + [ S ]) / Km = [ E ]T[ S ] / Km
[ ES ](Km + [ S ]) = [ E ]T[ S ]
[ ES ] = [ E ]T[ S ] / (Km + [ S ])
On multiplie par K2
Pr Mohammed Bekkali
On peut introduire ce terme dans l'quation pour la vitesse initiale:

vo = k2[ ES ] = k2[ E ]T[ S ] / (Km + [ S ]) =
=Vmax[ S ] / (Km+ [ S ])
Pr Mohammed Bekkali
Cas spciaux ou extrmes
vo = vmax[ S ] / [ S ]
[ S ] >> Km
vo = vmax
vo indpendante de
[ S ],
saturation,
asymptote
dpendance
linaire de [ S ],
substrat limitant,
asymptote
[ S ] << Km
vo = vmax[ S ] / Km
[ S ] = Km
vo = vmax Km / 2 Km demi-saturation de
v = v / 2 l'enzyme
max
Pr Mohammed Bekkali
Courbe de Michaelis-Menten:
vo en fonction de [ S ]
Pr Mohammed Bekkali
Vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la raction

lorsque l'enzyme est sature de substrat,
c'est--dire lorsque [ E ]T = [ ES ].
Km est la concentration de substrat qui sature l'enzyme moiti et pour
laquelle vo = Vmax/2.
Vmax = K2 . [E]T
k2 (= Vmax/ [ E ]T) est souvent appele constante catalytique kcat,
Cest une vitesse et reprsente le nombre de

cycles catalytiques par seconde (nombre de rotations)
dont est capable l'enzyme.
Pr Mohammed Bekkali
Le rapport kcat/Km est souvent aussi donn comme mesure de

l'efficacit catalytique, car il correspond une constante
de vitesse pour de basses concentrations de substrat
( [ S ] << Km, donc [ E ] = [ E ]T)
vo = Vmax[ S ] / Km = kcat[ E ] [ S ] / Km =
vo=[ E ] [ S ] kcat/Km
Pr Mohammed Bekkali
Linarisation de l'quation de Michaelis-Menten

Il est difficile de placer correctement la main
une hyperbole dans un graphe.
On se trompe trs facilement sur la hauteur de Vmax
. Pour simplifier l'valuation des rsultats, on utilise une transformation
de l'hyperbole en droite.
La plus connue est la transformation en double-rciproque
de Lineweaver et Burck ou
les inverses:
1 / vo = 1 / Vmax + (Km / Vmax ) 1 / [ S ]

Cette quation reprsente une droite qui a pour pente
pente = Km / Vmax
Pr Mohammed Bekkali
Reprsentation de Linweaver Burck
L'intersection sur l'axe vertical est = 1 / Vmax
et sur l'axe horizontal = 1 / Km.
Pr Mohammed Bekkali

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Nul ne pouvait imaginer quil sagissait dj de

Cest en effet la matrise scientifique

En raison de leurs proprits catalytiques ,

Lavenir des enzymes sera plus prometteur Ds

Raction en milieu aqueux, donc les molcules de

B sont entoures deau, se dplacent dans tous les

transformer en produits C + D. le complexe A-B dit de

La vitesse de la raction de A B dpend de l'nergie d'activation (DEa1) ncessaire pour arriver

Modle: deux lacs de niveaux diffrents spars par une digue.

1913 MICHAELIS donne la cintique

(Sumner) Cristallisation de l'urase.

Dtermination de la nature protique des

1930 Environ 80 enzymes sont isoles

Lenzyme est une Substance

Pourquoi des enzymes?

Acclration de la raction dans les deux sens

[A]o =10 et [B]o = 0

Keq = 2.4 , [A]eq =2.94 et [B]eq =7.06

traits pais: avec enzyme (acclration 10x)

Acclration de la raction inverse et quilibre inchang:

Pour une raction simple, la vitesse de formation de B (ou de disparition de

Comme la raction inverse a aussi lieu,

d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] - k-1[B]

Les deux concentrations s'approchent de

La vitesse de raction est difficile mesurer en prsence de A et B, surtout lquilibre !

la catalyse enzymatique passe par la formation d'un site

Modle de la cl dans la serrure

Les plus spcifiques

Ils interviennent dans tous les processus

Un quelconque dficit enzymatique peut

E ne figure pas parmi les produits de

E modifie la vitesse de raction (10

Il ne faut surtout pas penser que la

2.Reconnaissance spcifique enzyme

Un tel cycle est de lordre de 10 - 10 seconde

EVOLUTION DUNE CINETIQUE ENZYMATIQUE

Du fait que la vitesse est dtermine juste aprs le dbut de raction, cd

vf .ES vd.ES ES const

Si lon considre que vf de P partir de ES sexprime comme suit:

Vmaximale est atteinte quand ES est maximale, cd tout E fait partie

ES max ET V max K 3.ES max

A ltat stationnaire,cd quand vf et vd de ES est la mme, on

Tout lenzyme est libre ,

K 1EL S K 2 K 3.ES 0maisEL ET ES

(la constante de michaelis)

On multiplie le tout par K3

Raction catalyse par une enzyme

Il y a au moins trois ractions simples:

Pour chaque raction il y a une diffrence d'nergie libre

A chaque constante de vitesse correspond une nergie d'activation

La diffrence d'nergie libre (DG) entre substrat et produit ne dpend pas

Ici aussi, la vitesse de raction est difficile

Leonor Michaelis et Maud Menten ont dduit de ce modle

Il faut maintenant connatre

On peut introduire ce terme dans l'quation pour la vitesse initiale:

Cas spciaux ou extrmes

Vmax est la vitesse maximale que peut atteindre la raction

Cest une vitesse et reprsente le nombre de

Le rapport kcat/Km est souvent aussi donn comme mesure de

Linarisation de l'quation de Michaelis-Menten

1 / vo = 1 / Vmax + (Km / Vmax ) 1 / [ S ]

Reprsentation de Linweaver Burck

L'intersection sur l'axe vertical est = 1 / Vmax