ESCUELA DE VERANO 2012 UCM

FACULTAD DE MEDICINA / UCM / MADRID

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HEPATOCITOS

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HEPATOCITOS

JOSE A. ZUECO

INTRODUCCIN
FUNCIONES HEPTICAS
TEJIDO HEPTICO HUMANO
TIPOS DE CLULAS HEPTICAS
AISLAMIENTO DE HEPATOCITOS
PURIFICACIN DE HEPATOCITOS
CARACTERIZACIN DE HEPATOCITOS
CULTIVO CELULAR DE HEPATOCITOS

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

FACULTAD DE MEDICINA

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE HEPATOCITOS

HIGADO HUMANO

TIPOS DE SUSTRATOS PARA CULTIVO

DE HEPATOCITOS
AISLAMIENTO DE HEPATOCITOS
HUMANOS
CULTIVO Y CARACTERIZACIN DE
HEPATOCITOS HUMANOS
TRANSPLANTE DE HEPATOCITOS
HUMANOS
APLICACIONES CLINICAS DEL HIGADO
BIOARTIFICIAL

HIGADO HUMANO IN SITU

ESFAGO
LOBULO HEPATICO
DERECHO

LOBULO HEPATICO
IZQUIERDO

CONDUCTO
HEPTICO
COMN

VESCULA
BILIAR

CONDUCTO
CSTICO
CONDUCTO
BILIAR COMN

INTESTINO
DELGADO

DUODENO

LOBULO HEPATICO
DERECHO

VENA
HEPTICA

PLORO

PNCREAS

HIGADO

VENA CAVA INFERIOR

VENAS HEPTICAS

CONDUCTO
HEPTICO
IZQUIERDO

CORAZN

ARTERIA HEPTICA

HIGADO

CONDUCTO
HEPTICO
DERECHO
PNCREAS

CONDUCTO
HEPTICO
COMN
VESCULA BILIAR

CONDUCTO
PANCRETICO

CONDUCTO
CSTICO

CONDUCTO
BILIAR
COMN

CONDUCTOS
HEPTICOS

VENA PORTA
HEPTICA

BILIS

SANGRE POBRE EN O2
RICA EN NUTRIENTES

ARTERIA
HEPTICA
SANGRE
RICA EN O2

VENA PORTA
HEPTICA
ESFINTER
DE ODDI

PRINCIPALES FUNCIONES HEPTICAS

SANGRE
RICA EN O2
INTESTINO DELGADO

PRINCIPALES FUNCIONES HEPTICAS

---- FUNCIONES METABLICAS:

METABOLISMO DE GLCIDOS
METABOLISMO DE LPIDOS
METABOLISMO DE AMINOCIDOS

---- SNTESIS DE PROTENAS PLASMTICAS:

ALBMINA, GLOBULINAS,
FACTORES DE COAGULACIN, ETC.

---- DEGRADACIN DE PROTENAS:

HORMONAS, FACTORES DE CRECIMIENTO, ETC

----ALMACENAMIENTO Y DEGRADACIN

DE VITAMINAS:

-- METABOLISMO DEL COLESTEROL Y LIPOPROTENAS

-- METABOLISMO DE BILIRRUBINA Y ACIDOS BILIARES
-- ACLARAMIENTO DE TOXICOS Y FARMACOS
-- ALMACENAMIENTO DE METALES (HIERRO / COBRE)
-- FUNCIN INMUNOLGICA
-- RESERVORIO DE SANGRE
-- CONTROL DE LA VOLEMIA

A, K, D3, B2, ACIDO FLICO, ETC.

TEJIDO HEPTICO HUMANO

ESQUEMA DE UN ACINO HEPATICO

Celulas
Kuppfer

Vena
Central

Hepatocitos
Sinusoides
Canaliculos
biliares
Arteria
heptica
Conductos
biliares
CONDUCTO
BILIAR

VENA
PORTA

AREA
PORTAL

CONDUCTOS
BILIARES

ZONAS: PERIPORTAL / CENTRAL / PERIVENOSA

Vena
Porta

TEJIDO HEPTICO HUMANO

ZONA PERIVENOSA

ZONA
CENTRAL

ZONA PERIPORTAL

PARENQUIMA HEPATICO Y VENA CENTRAL

TEJIDO HEPTICO HUMANO

TEJIDO HEPTICO HUMANO

DRENAJE DE LOS ACINOS HEPATICOS

VIAS:
VENA CENTRAL
TRIADA PORTAL

CELULA ENDOTELIAL FENESTRADA

CLULAS HEPTICAS Y MATRIZ EXTRACELULAR

-- EL 80% DEL TEJIDO HEPTICO CONSTITUIDO POR
CINCO TIPOS DE CLULAS

CANALCULO
BILIAR
CLULA DE
KUPFFER

-- EL 65% DEL TOTAL CELULAR SON CLULAS

PARENQUIMTICAS LLAMADAS HEPATOCITOS
QUE TIENEN GRAN ACTIVIDAD METABLICA.

-- EL 20% DEL TEJIDO HEPTICO TIENE UNA

MATRIZ EXTRACELULAR MUY COMPLEJA:
-- CONTIENE CINCO TIPOS DE COLAGENO
-- PROTEOGLICANOS Y GLICOSAMINOGLICANOS
-- MODULA EL FENOTIPO Y LA DIFERENCIACIN
CELULAR.

ERITROCITO EN SINUSOIDE

HEPATOCITO

TEJIDO HEPATICO AL MICROSCOPIO ELECTRONICO

CLULAS HEPTICAS Y MATRIZ EXTRACELULAR

SINUSOIDE
-- CLULAS ENDOTELIALES FORMAN ENDOTELIO
FENESTRADO DE LOS SINUSOIDES VENOSOS
-- PARTICIPAN EN EL INTERCAMBIO DE FLUIDOS

HEPATOCITO

-- CLULAS DE KUPFFER MACROFAGOS SITUADOS

EN LA LUZ SINUSOIDAL
-- MODULAN METABOLISMO DE OTRAS CLULAS
-- SECRETAN CITOQUINAS
-- REALIZAN FAGOCITOSIS ELIMINANDO DESECHOS
CELULARES, ERITROCITOS SENESCENTES Y OTROS
RESTOS MICROBIANOS

SINUSOIDES

ENDOTELIO FENESTRADO

Sinusoids

Celulas endoteliales
fenestradas

IMAGEN DE MICROSCOPIA ELECTRONICA DE SCANNING

CELULA DE KUPFFER
ESPACIO PERISINUSOIDAL

CLULAS HEPTICAS Y MATRIZ EXTRACELULAR

-- CLULAS DE ITO (PERISINUSOIDALES)-- ALMACENAN GRASA

SINUSOIDE

-- ALMACENAN Y LIBERAN VITAMINA A

-- SINTETIZAN FACTORES DE CRECIMIENTO

CELULA DE
KUPPFER

-- SECRETAN MATRIZ EXTRACELULAR

-- MANTENIMIENTO HEPTICO

NUCLEO DE
HEPATOCITO

-- CL. EPITELIALES DE CONDUCTOS BILIARES

-- CONTACTAN CON HEPATOCITOS
-- CREAN CANALES PARA EL DRENAJE BILIAR

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE SCANNING

METODOS PARA EL AISLAMIENTO DE HEPATOCITOS

MECANICOS

Ec: ERITROCITO
DS: ESPACIO DISSE
H: HEPATOCITO

BC: CANALICULO BILIAR

S: SINUSOIDE
Mv: MICROVILLI

PUNCIN

QUMICOS

PERFUSIN

AISLAMIENTO DE HEPATOCITOS DE RATA ADULTA

HIGADO
IN SITU

FRAGMENTOS DE
TEJIDO HEPTICO

PROCEDIMIENTO QUIRURGICO

INTESTINO
HGADO

RATA ADULTA 180-200 g

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN
INTESTINO

HEPATOCITOS
PURIFICADOS

SUSPENSIN CELULAR

ESQUEMA DE LA PERFUSION HEPATICA

TROCAR Y CNULA

FIJACIN

CNULA DE
SALIDA
CAJA
TORCICA

CORAZN

ATRIO DERECHO
VENA CAVA
INFERIOR
RIN
CAVIDAD
ABDOMINAL

LIGADURA
HGADO
LIGADURA
CNULA

VENA CAVA
INFERIOR
CNULA DE
ENTRADA

TROCAR

FIJACIN

INSERCIN DE LA CNULA PORTAL

COMPOSICION DE LAS DISOLUCIONES

KREBS-RINGER-BICARBONATO

LOBULOS
HEPTICOS
LEVANTADOS
VENA PORTA
LIGADURA

PUNTO DE ENTRADA
CNULA
KRB-I (120 ml): KRB ( Ca 2+ / Mg 2+) + EDTA (0,30 mg/ml)
TROCAR

KRB-II (190 ml): KRB + (Ca 2+) (Mg 2+) + Colagenasa (0,3-0,6 mg/ml)
(aadida antes de la perfusin)
KRB-III (260 ml): KRB ( Ca 2+ / Mg 2+) .

ESQUEMA DEL CIRCUITO DE PERFUSION

PERFUSIN HEPTICA EN CIRCUITO CERRADO

OXIGENADOR

BOMBA
RESERVORIO
BOMBA
PERISTALTICA

BAO
TERMOSTATIZADO

CNULA

DEPOSITO
COLECTOR

INYECCIN DE LA CNULA

PERFUSIN HEPTICA

HIGADO PERFUNDIDO SITUADO EN PLACA PETRI

BAO
TERMOSTATIZADO

HIGADO PERFUNDIDO SITUADO EN PLACA PETRI

FILTRACIN / CENTRIFUGACIN / SUSPENSIN CELULAR

FRAGMENTOS HEPATICOS
ROTURA DE CAPSULA
DE GLISSON

AGITACION

SUSPENSION CELULAR
HEPATOCITOS

AGITACION
Y
DISPERSION

ENDOTELIALES

FILTRACIN EN
MALLA DE 50 m
RESUSPENSION
EN 50 ML KRB-III

KUPFFER

CENTRIFUGACION
1000 RPM / 15 SEG

CENTRIFUGACION
1000 RPM / 15 SEG

FIBROBLASTOS
ERITROCITOS

DISOLUCIN
DE KRB-III

SUSPENSIN CELULAR
HETEROGENEA

HEPATOCITOS VIABLES Y NO VIABLES

FILTRADO
EN MALLA
DE 80 m

ANALISIS DEL RENDIMIENTO Y VIABILIDAD CELULARES

HEPATOCITOS AISLADOS DE RATA ADULTA

COLAGENASA (0,5%)

HIGADO
FETAL

TROCEADO DEL
TEJIDO HEPTICO

FILTRACIN

CULTIVO CELULAR

CENTRIFUGACIN

PURIFICACIN
DE HEPATOCITOS

PURIFICACION DE HEPATOCITOS

PURIFICACION DE HEPATOCITOS

LAS SUSPENSIONES CELULARES DE HEPATOCITOS ADULTOS SON

ENRIQUECIDAS MEDIANTE CENTRIFUGACIN EN PERCOLL ISOOSMOTICO

DENSIDAD
FINAL :1,06 g/ml

25 ml DE
SUSPENSION
DE
HEPATOCITOS
VIABLES Y
NO VIABLES

HEPATOCITOS
NO VIABLES EN
SOBRENADANTE

HEPATOCITOS
VIABLES /
PARTICULAS DE
PERCOLL

CENTRIFUGACION
1000 RPM / 5 MIN

25 ml DE PERCOLL ISOOSMOTICO:
9 VOL PERCOLL STOCK ESTERIL
+ 1 VOL DE SOLUCION SALINA
ESTERIL (10x)

CENTRIFUGACION
1000 RPM / 1 MIN

ANALISIS DEL RENDIMIENTO

Y
VIABILIDAD CELULARES

HEPATOCITOS VIABLES
PURIFICADOS
MICROSCOPIA OPTICA
EN CAMPO CLARO

ENSAYO DE EXCLUSION DEL AZUL TRIPAN AL 0,2%

HEPATOCITOS
VIABLES EN
SEDIMENTO

RECUENTO : CAMARA NEUBAUER (0.0024 mm2 /0.1 mm)

PERCOLL: PARTICULAS AC. SILCICO-POLIVINIL-PIRROLIDONA

RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR

CMARA DE NEUBAUER

SUSPENSION DE HEPATOCITOS AISLADOS

(AZUL TRIPAN Y MICROSCOPA OPTICA (x 205)

Contar clulas en 1 mm2

VESICULADA
NO
VIABLE

VIABLES
SI EL NMERO MEDIO ES 110

110 X 10.000

1,1 X 106 CELULAS / ML
SI SE MEZCLA 50 l DE AZUL TRIPAN Y 50 l DE SUSPENSIN CELULAR


EL FACTOR DE DILUCIN ES: 2

2 X (1,1 X 10 6 CELULAS / ML ):

DOBLETE
CELULAR

2,2 x 10 6 CELULAS / ML EN LA SUSPENSIN ORIGINAL

HEPATOCITOS AL MICROSCOPIO OPTICO CON LUZ TRANSMITIDA

(A Y C) Y CONTRASTE DE INTERFERENCIA (B, D Y E). (X 1000)

HEPATOCITO
OVALADO
INTACTO

HEPATOCITOS AISLADOS / MICROSCOPIO DE BARRIDO

HEPATOCITO
VESICULADO

HEPATOCITO
MULTIPLES
VESICULAS

HEPATOCITO
HINCHADO

HEPATOCITOS ESFERICOS INTACTOS

HEPATOCITO AISLADO INTACTO

HEPATOCITO AISLADO DAADO

TAPIZADO DE MICROVILLI Y CON MORFOLOGA ESFRICA MUY

DIFERENTE DE LA FORMA DEL HEPATOCITO IN SITU. (M.E. BARRIDO X 3000)

MULTIPLES VESICULAS SUPERFICIALES SIN MICROVILLI

MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (X 3750)

IMGENES DE HEPATOCITOS AISLADOS

HEPATOCITOS AISLADOS DAADOS

A) HEPATOCITO INTACTO (M.E. BARRIDO X 4000)

B) HEPATOCITO ALTERADO:PERDIDA DE MICROVILLI. DAOS EN
MEMBRANA PLASMATICA, CITOESQUELETO Y MITOCONDRIAS

ULTRAESTRUCTURA DEL HEPATOCITO IN SITU

HEPATOCITOS ANTES DE PERFUSION CON COLAGENASA

MORFOLOGIA ULTRAESTRUCTURAL INTACTA. (M.E. X 3750)

CLULA SINUSOIDAL
ERITROCITO EN
EL ESPACIO
SINUSOIDAL

MITOCONDRIA
RETCULO
ENDOPLSMICO
LISO
RETCULO
ENDOPLSMICO
RUGOSO

COMPLEJO
DE GOLGI
CANALCULO
BILIAR

ESPACIO
DE DISSE
NCLEO

HEPATOCITOS IN SITU ANTES DE PERFUSIN

GLUCOGENO EN CITOSOL DEL HEPATOCITO

NUCLEO

MITOCONDRIAS
UNIN
INTERCELULAR

CANALCULO
BILIAR

RETICULO ENDOPLSMICO RUGOSO (RER)

HEPATOCITOS AL INICIO DE LA PERFUSION

HEPATOCITOS AL FINAL DE LA PERFUSIN

UNIONES INTERCELULARES, NUCLEO, R.E.R., GLUCOGENO,

MITOCONDRIAS Y MEMBRANA PLASMTICA INTACTOS. (M.E.X 3750)

ALGUNAS CELULAS PRESENTAN DAOS. INCLUSIONES LIPIDICAS.

VACUOLAS DILATADAS Y ORGANULOS CON ESTRUCTURA INTACTA (X 3750)

10

DOBLETE DE HEPATOCITOS AISLADOS CON COLAGENASA

ORGANULOS EN HEPATOCITOS AISLADOS VIABLES

A) MITOCONDRIA RODEADA DE AGREGADOS DE GLUCOGENO.
B) APARATO DE GOLGI CON PARTICULAS DE LIPOPROTEINAS (


)
VESICULA (CV) Y PEROXISOMA (P).
C) NUCLEO CON MORFOLOGIA NORMAL. (X 21.000)

ESTRUCTURA DE LOS HEPATOCITOS VIABLES

RETCULO ENDOPLASMICO (RER. SER). INCLUSIONES DE GLUCOGENO (G).
PARTICULA DE LIPOPROTEINA (


). MITOCONDRIAS. UNA MITOCONDRIA
HINCHADA (S) INDICA ANOXIA Y AUTOFAGOCITOSIS DE ORGANULOS. (x 27000)

HEPATOCITO DAADO IRREVERSIBLEMENTE

A) MITOCONDRIAS ALTERADAS Y VESICULACIN DEL RETICULO (X 18000)
B) EXTRUSION DE GRANDES VESICULAS DE CITOPLASMA RICO EN RE (X 6000)

11