DETERMINACIN DE PROTENAS EN ALIMENTOS CON EL MTODO DE BIURET

CONCEPTOS PREVIOS:
Mtodos colorimtricos para la determinacin de protenas.
1.2. Mtodo de Biuret
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los
grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con
4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad
de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy
baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados
muy concentrados (por ejemplo en suero).
1.3. Mtodo de Bradford
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin
Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para
formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor
que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estnlos detergentes y las soluciones bsicas.
1.4. Mtodo de BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un
complejo prpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso
producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino
(reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un
mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros
mtodos.
OHProtena + Cu2+ Cu1+
Cu1+ + BCA complejo prpura BCA- Cu1+
1.5. Objetivos
Con esta prctica se pretende introducir al alumno en los diferentes
mtodos para la cuantificacin de protenas: su fundamento, sus ventajas e
inconvenientes. Se utilizarn tres mtodos (Biuret, Bradford y BCA), para cada
uno de ellos se realizar una curva estndar, se determinar el coeficiente de
extincin, el rango de sensibilidad, y se realizar la cuantificacin de dos
muestras problemas.
Mtodos para la determinacin de nitrgeno
Caractersticas de las protenas

INTRODUCCION
El termino protena fue utilizado por primera vez por el qumico alemn Gerardus Mulder, en
1838, tomo este nombre del vocablo griego PROTERIOS, que significa primordial nivel
primario.
Las protenas son un grupo de biopolmeros constituidos de aminocidos que exhiben una
amplia gama de estructuras y funciones.
Las protenas como un grupo de biomolculas, desempean una gran variedad de funciones,
algunas participan en la contraccin muscular y sirven para dar soporte estructural, otras
trasportan y almacenan molculas pequeas.
Los anticuerpos (molculas que sirven para como proteccin inmunolgica) son protenas al
igual que las enzimas (catalizadores biolgicos) y algunas hormonas.
Las protenas pueden llevar a cavo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de
combinaciones en la composicin y secuencia de aminocidos.
Las protenas tambin se clasifican segn su composicin, las que se forman solo de residuos
de aminocidos y no tienen otras biomolculas son PROTENAS SIMPLES; no todas las
protenas son solubles en agua, de hecho las protenas insolubles son esenciales para dar
soporte y mantener la integridad estructural de las clulas y organismos.
DETERMINACION DE PROTEINAS
I. OBJETIVOS:
* Determinar el nivel de protena que posee un alimento a travs del contenido de nitrgeno.
* El estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por los mtodos: Kjeldahl y
Sorensen.
* El estudiante se familiarizar con los equipos y el procedimiento del anlisis de protenas
para los mtodos de Kjeldahl y sorensen .
* El estudianteaprender a realizar los clculos pertinentes para la determinacin de nitrgeno
en protenas.
II. FUNDAMENTO TEORICO:
El problema que representa proporcionar protenas adecuadas a la poblacin del mundo es un
tanto secundario en el problema general de alimentacin mundial. Adems de su significado
nutritivo las protenas juegan un papel importante en las propiedades organolpticas de los
alimentos. Las protenas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos
provenientes de fuentes animales. El anlisis para la determinacin de protenas, a pesar de
no estar incluido generalmente como factor de clasificacin en los estndares de granos se
acepta como un factor comercial.
Las protenas existen en los alimentos en combinacin fsica o qumica con carbohidratos o
lpidos. Las glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las
soluciones alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes comestibles. El
"envejecimiento" de la carne est relacionado con cambios qumicos en las protenas. Las
protenas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullicin,
panificacin, asado) las cadenas laterales de aminocidos se degradan o interactan con
otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azcares reductores) para
conferir sabores tpicos. El calentamiento excesivo puede, por otro lado, reducir el valor
nutritivo.
El analista de alimentos comnmente desea saber el contenido proteico total de los alimentos,
aunque dicho contenido est conformado por una mezcla compleja de protenas. Actualmente
todos los mtodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de

naturaleza emprica. El aislamiento y pesado directo de la protena proporcionara un mtodo

absoluto, sin embargo, dicho mtodo es llevado a cabo slo a veces en investigaciones
bioqumicas pero es completamente imprctico para el anlisis de alimentos.
Metodos
MTODO MICRO KJELDAHL
La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado, convirtindose en CO2
y H2O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido como
sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad.
La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es
simultneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor.
La digestin de la muestra es la parte mas difcil de la determinacin, esta se acelera
mediante la adicin de catalizadores como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio
(HgO), el sulfato cprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4) o una
mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de
aumentar el punto de ebullicin y disminuir entonces el tiempo de digestin. Cuando la
totalidad de la materia orgnica ha sido digerida, se libera el amonaco por descomposicin
del sulfato de amonio con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y
recoleccin en un volumen de cido brico, como borato de amonio. El amonio se determina
por titulacin con solucin valorada de HCl 0,1 N en presencia de un indicador mixto
compuesto por una mezcla de rojo de metilo, el cual en medio cido se presenta de color
morado y en medio alcalino de color verde.
Resumen de las reacciones qumicas en el mtodo Micro-Kjeldahl
Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los
reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente frmula:
%N= G x N x 0.014 x 100M
Donde:
V = mL de HCl gastados en la titulacin.
N = normalidad de la solucin de HCl (0,1 N).
M=Peso de la muestra en gramos
Luego de calculado el porcentaje de nitrgeno, es necesario calcular el porcentaje de
protenas basndose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuacin;
%P=Nx F
Donde:
N=porcentaje de nitrogeno
F=FACTOR:
ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL: N*6.25
ALIMENTOS DE ORIGEN VEGETAL: N*5.70
LECHE Y DERIVADOS: N*6.38
III. MATERIALES Y METODOS:
* MATERIALES:
* Muestra.
* Destilador.
* Incinerador.

* Matraz Kjeldahl.
* matraz Erlenmeyer (250 ml)
* Bureta fina.
* Matraces de 100 y 1000 ml.
* Pipetas de 10 ml.
* Probetas de 25 ml.
* REACTIVOS:
* Acido sulfrico 98%.
* Mezcla catalizadora: 3 gr de oxido de titanio (TiO2), 3 gr de sulfato cprico (CuSO4) y 100 gr
de sulfato de potasio (K2SO4).
* Disolucin de hidrxido de sodio al 50%.
* Disolucin de acido clorhdrico (HCl) 0.1 mol/l.
* Indicador rojo de metilo.
* METODO DE KJELDAHL MODIFICADO:
* Este mtodo consta de 4 fases:
1. Digestin o ataque de la materia orgnica.
2. Destilacin del amoniaco.
3. Titulacin del borato de amonio. FASES DE DIGESTIN:
* Pesar 0.3 gr de la muestra seca.
* Agregar 3 gr dela mezcla catalizadora y 20 ml de cido sulfrico concentrado y unas perlas
de vidrio.
* Colocar el baln en posicin inclinada sobre una de las hornillas de digestin del multi
Kjeldahl.
* Se inicia con un calentamiento suave y mantener en ebullicin, a calor, el tiempo necesario
para que la solucin sea amplia y tenga un color ligeramente azul.
* FASE DE LA DESTILACIN DEL AMONIACO:
* Terminado la digestin enfriar el baln a temperatura ambiente (tener cuidado).
* Agregar con cuidado agua destilada (aproximadamente 40 ml).
* Pasar a un baln de destilacin y completar hasta 150ml con agua destilada, lavar el baln
Kjeldahl con agua destilada.
* Se aade 10ml de disolucin de hidrxido de sodio al 40%.
* Colocar el baln en una de las hornillas para destilacin y conectarlo al tubo condensador
correspondiente mediante un bulbo de seguridad de vidrio, ajustar bien las uniones.
* Colocar en un Erlenmeyer o Beacker de 400 ml, 50 ml de acido brico al 4% para retener los
gases de amoniaco y dos gotas del indicador rojo de metilo.
* Luego el Erlenmeyer o Beacker se coloca en la parte inferior del tubo condensador de tal
manera que el extremo se encuentre sumergido en el acido borico.
* Hacer circular el agua de cao por el condensador de Kjeldahl y comenzar la destilacin a
temperatura controlada.
* Continuar la disolucin hasta que se haya eliminado el amoniaco, comprobar con papel de
tornasol o fenolftalena.
* Retirar el Erlenmeyer lavando con un poco de
agua destilada el extremo del tubo.
* FASE DE TITULACION
* Titular el contenido de Erlenmeyer con una solucin de cido clorhdrico (HCl) al 0.1N (cada

ml de esta solucin equivale a 1.4008 mg de Nitrgeno) hasta que vire de color (amarillo a rojo
o verde a azul) esto depende del indicador que se adiciona. Efectuar los clculos de acuerdo a
la muestra utilizada y el factor de conversin de acuerdo a la muestra.
* FACTOR DE CONVERSIN DE NITRGENO EN ALIMENTOS
* Avena, cebada y centeno 5.83
* Arroz 5.95
* Trigo, harina refinada 5.70
* Trigo, grano entero 5.83
* Almendras 5.18
* Soya 5.71
* Leche y sus productos 6.40
* Otros(carne, Huevos, maz) 6.25
El contenido porcentual de protena P de la muestra se calcula:
P=a-b1.4008FM
* a: gasto en ml de la disolucin del acido clorhdrico (0.1mol/l), en la muestra.
* b: gasto en ml de la solucin de acido clorhdrico (0.1mol/l), en el blanco.
* F: factor de conversin para calcular el contenido proteico.
* M: peso en gramos de la muestra.
1.4008mg de Nitrgeno por cada ml de gasto de disolucin valorada en cido clorhdrico.
* MTODO VOLUMTRICO DE SORENSEN POOL
Fundamento:
Se basa en que el formaldehido va a actuar bloqueando los grupos aminos, dando como
resultado la liberacin de los grupos carboxilos con el consiguiente aumento de la acidez, la
cual se valora con NaOH al 0.1N.
Procedimiento:
* Medir 10 de leche neutralizar con HCl al 0.1 N
* Agregar 20 ml de formaldehido neutro (neutralizado con NaOH 0.1N), se agrega el
formaldehido a la leche y desaparece el color rosado.
* Titular nuevamente con NaOH al 0.1 N
Clculos:
%P=G x 0.1909 x 5
IV. CALCULOS Y RESULTADOS:
* PORCENTAJE DE PROTENAS POR EL MTODO KJELDAJL DE HARINA:
%P= G x N x 0.014 x F x 100M
%P=23 x 0.02 x 0.014 x 100x 5.700.3
%P=12.24%
* PORCENTAJE DE PROTENAS POR EL MTODO SORENSEN POOL.
* Determinacin de acidez de leche

0.14-0.18%Rango de acidez en la leche

%A=V x N x F x 100M
%A=3.4 x 0.1 x 0.09 x 10020
%A=0.152%
* Determinacin de protena de la leche:
2.8-3.4%Rango de proteinas en la leche
V1=2.4 ml
%P=G x 0.1909 x 5
%P=2.4 x 0.1909 x 5
%P=2.2908%
V2=3.2 ml
%P=G x 0.1909 x 5
%P=3.2 x 0.1909 x 5
%P=3.0544%
V. DISCUSIONES:
* Para la determinacin de protenas en leche por el mtodo de Sorenser, comparando
nuestros resultados con los de , en primer lugar con el V1 nos damos cuenta de que el % de
protena obtenida no se asemeja al de la bibliografa por lo que podemos darnos cuenta de
que la leche fue adulterada o alterada por algn agente, por lo que realizamos nuevamente el
proceso, obtuvimos un V2 con el que dio como resultado un % de 3.0544 que si est dentro
del rango estipulado en .
* Este problema de los volmenes lo asumimos por el viraje en l titulacin, que depende de la
vista de la persona encargada del trabajo.
VI. CONCLUSIONES:
* El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado,
formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el que se
destila recibindolo en:
a) Acido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con
hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o
b) Acido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico.
* Es importante el anlisis de protenas para: la determinacin de la actividad biolgica en
alimentos ejemplos: pectinasas durante la maduracin de frutos; investigacin sobre
propiedades funcionales. Ejemplos: gliadina y gluteninas para la elaboracin del pan; para el
etiquetamiento nutricional del producto final, etc.
* Existe una gran necesidad del anlisis de protenas con el fin de obtener el contenido
proteico total, composicin de aminocidos contenido de alguna protena particular, contenido
proteico durante el aislamiento y purificacin de una protena, nitrgeno no proteico y valor
nutritivo relacionados con un alimento especfico a analizar.
* Constituyen fuentes de error en del mtodo de Kjeldahl son: la inclusin de nitrgeno no
proteico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno durante la digestin, la digestin
incompleta de la muestra.

* Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido (para
elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por calor y la
consecuente prdida de amonaco; generalmente se recomiendan temperaturas de digestin
de 370-410C.
* Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado titanio o la temperatura
de la digestin no se controla cuidadosamente; las condiciones son an ms crticas que con
el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores.
* Ventajas del mtodo de Kjeldahl:
* Apropiado para varios tipos de productos. Alta fiabilidad.
* Usado como mtodo de referencia.
* Desventajas del mtodo de Kjeldahl:
* Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
VII. CUESTIONARIO:
* Qu es una protena bruta?
El nitrgeno total o protena bruta (N x 6,25) se determina por el mtodo de Kjeldahl, que
consiste en convertir todo el N orgnico (de las protenas en su mayora) en N amoniacal
(como NH4SO4), destilar el amoniaco (en medio bsico) y valorarlo con una disolucin cida
contrastada. El % de protena se calcula multiplicado el % de N por el factor de 6,25.
* Seale los grupos de alimentos y los factores de conversin que se usa para el clculo de
protena total.
* Trigo-harina entera 5,83
* Harinas (excepto la entera) 5,70
* Salvado 6,31
* Arroz 5,95
* Cebada, avena, centeno 5,83
* Maz 6,25
* Soya 5,71
* Nueces-cacahuates, nueces del Brasil 5,41
* Almendras 5,18
* Otras nueces 5,30
* Leche y productos lcteos 6,38
* Gelatina 5,55
* Todos los otros alimentos 6,25
* Cuando se denomina nitrgeno proteico y nitrgeno no proteico.
Se denomina nitrgeno no proteico a los compuestos de nitrgeno que pueden se convertidos
en protenas por algunos organismos vivos.
Muchos organismos superiores no pueden obtener aminocidos de otras formas, ms que
absorbindolos de la dieta. A los sumo pueden convertir algunos aminocidos en otros
diferentes.
Los compuestos que forman el NNP son los que contienen amonaco, nitritos y nitratos y otros
como la urea, el biuret o el cido rico.
Los organismos que puede utilizar el NNP son los hongos, las plantas y algas, bacterias y
organismo que viven en simbiosis con ellos

VIII. BIBLIOGRAFIA:
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* http://es.wikipedia.org/wiki/Nitr%C3%B3geno_no_proteico