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TRABAJOS ORIGINALES

Problemtica del diagnstico de la infeccin por retrovirus humanos

(HTLV-1/2) productores de leucemias/linfomas T y sndromes
neurolgicos degenerativos. Propuesta de un algoritmo alternativo.
Balangero Marcos (1), Barbs Mara Gabriela (2), Berini Carolina (3), Gastaldello Ren (1), Biglione Mirna (3), Gallego Sandra (1)
(1) Instituto de Virologa Dr. "J M Vanella" Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Crdoba.
(2) Laboratorio Central, Ministerio de salud de la provincia de Crdoba.
(3) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Departamento de Microbiologa, Parasitologa e Immunologa, Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

Resumen
Evaluamos la utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como una prueba confirmatoria adicional para
dilucidar el diagnstico de infeccin con HTLV-1/2 en individuos con perfiles de serolgicos indeterminados por la tcnica
de Western blot (Wb). Estos perfiles indeterminados son muy prevalentes y generan incertidumbre en el diagnstico. Fueron
estudiadas por IFI y PCR un total de 47 muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb, 71 muestras confirmadas
positivas para HTLV-1/2 por Wb y 63 muestras negativas para HTLV-1/2. 12,8% de las muestras indeterminadas por Wb
fueron confirmadas positivas por IFI y PCR y el 70% de las muestras fueron concordantemente negativas por IFI y PCR.
Adems, se encontraron resultados discordantes en el 17% de las muestras, resultando estas positivas por IFI pero negativas
por PCR. Basados en los resultados se propone un algoritmo alternativo para el diagnstico mediante el cual utilizando la IFI
se descartara rpidamente el alto porcentaje (70%) de los resultados indeterminados por Wb que corresponden a los casos en
los que no existe infeccin y evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a tcnicas moleculares para la definicin del
diagnstico y tambin la ansiedad que genera en el paciente la opcin de un seguimiento serolgico.
Palabras clave: HTLV-1/2 - IFI- Algoritmo.

Troublesome diagnosis of human retroviruses causative agents of T leukaemias/lymphomas and

degenerative neurological diseases (HTLV-1/2). Proposal of an alternative algorithm for diagnosis.
Summary
The present study shows the potential usefulness of IFA in elucidating the status of HTLV-1/2 infection in
individuals with indeterminate Wb profiles. These indeterminate Wb patterns are prevalent worldwide. 47 blood samples from
indeterminate Wb subjects, 71 samples confirmed positive for HTLV-1/2 by Wb and 63 negative samples for HTLV-1/2 by
Wb, were studied using IFA and Nested-PCR. 12, 8% of the indeterminate Wb samples were confirmed positive by IFA and
PCR and 70% of the samples were concordantly negative by IFA and PCR. Furthermore, discordant results were found in
17% of the samples. These samples were IFA positive but PCR negative.
Based on our results we propose an alternative algorithm using IFA to resolve the diagnosis in the high rate (70%)
of indeterminate Wb patterns not associated with HTLV-1/2 infection. Thus, it would not be necessary to use molecular assays
nor a serological follow-up of the patient.
Key Words: HTLV-1/2 - IFA- Algorithm.
Experiencia Mdica - Vol. 26 - N 1 - Pg. 7 a 13 - 2008.

Experiencia Mdica - Vol. 26 - N 1 - 2008

Introduccin

de screening requieren la confirmacin de la presencia de

anticuerpos especficos para HTLV-1/2 por otras
metodologas. El Western blot (Wb) es la tcnica de
referencia para la confirmacin de la infeccin y es la que
define un resultado positivo o negativo para los
anticuerpos anti-HTLV-1/2. Sin embargo, una proporcin
importante de ELISAs reactivos para HTLV-1/2 resulta en
un patrn de bandas insuficiente por Wb (17, 18, 19). Los
individuos que presentan estos resultados son
categorizados serolgicamente como indeterminados para
HTLV-1/2. Estos perfiles indeterminados por Wb han sido
descritos en todo el mundo siendo ms frecuentes en reas
tropicales (18, 19, 20). El agente o los agentes causales y
la trascendencia mdica del estado de indeterminado para
HTLV-1/2 estn en la actualidad poco claros. Varias
explicaciones potenciales han sido sugeridas, incluyendo
(I) la reactividad cruzada con otros agentes infecciosos
(por ejemplo., Plasmodium sp.) (21) (II) infeccin con
partculas de HTLV-1 defectivas (22, 23), (III) infeccin
con retrovirus nuevos que tienen alta homologa con
HTLV-1 (24), (IV) e infeccin con HTLV-1 en individuos
que presentan cargas virales que estn debajo del alcance
de los mtodos que se utilizan para la deteccin.
Diferentes secuencias de genes de HTLV-1 pueden
ser amplificadas por PCR en los linfomonocitos de sangre
perifrica (PBMCs) de casi todos los individuos infectados
con HTLV-1. Se ha publicado que la mayora de los
individuos indeterminados para HTLV-1/2 son negativos
por PCR para las secuencias de genes del virus (18, 19, 25).
El objetivo de esta investigacin es evaluar la
utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como
una prueba confirmatoria adicional para el diagnstico
rpido de la infeccin con HTLV-1/2 en individuos con
perfiles de Wb indeterminados.

El virus HTLV-1 ha sido identificado como el

agente causante de la leucemia/linfoma a clulas T del
adulto y de la paraparesia espstica tropical (TSP / HAM)
(1, 2). Adems, ha sido demostrado que el virus HTLV-1
est relacionado con otras enfermedades inflamatorias
incluyendo varias enfermedades autoimmunes, como
artropata inflamatoria crnica y sndrome de Sjgrens. El
virus HTLV-1 se asocia tambin a polimiositis, uvetis,
alveolitis y dermatitis infecciosa (3). El virus HTLV- 2 ha
sido relacionado con neoplasias de clulas T y casos de
enfermedad neurodegenerativa (4).
La transmisin de los virus HTLV-1/2 podra
ocurrir por transfusin de sangre, por va sexual, de la
madre infectada al nio por va vertical y por el uso drogas
endovenosas. El contacto de clula-clula es necesario
para una transmisin eficiente del virus HTLV-1 (5) y la
transmisin requiere contactos frecuentes entre
individuos. Fue demostrado que el riesgo de la infeccin
aumenta con los periodos ms prolongados de
amamantamiento (> 6 meses) (6, 7) y que el riesgo de
transmisin sexual se incrementa en relacin con un
mayor nmero de parejas sexuales (8, 9).
La infeccin con HTLV-1/2 ha sido ampliamente
documentada en el mundo en zonas endmicas en el sur
de Japn, el Caribe, frica sub- sahariana y pases de Sud
Amrica incluyendo Brasil, Colombia, Argentina, Per,
Guayana Francesa y Chile (10, 11, 12, 13,14). El HTLV-2
es endmico entre los amerindios de Amrica del norte,
centro y sud Amrica y est diseminado entre
consumidores de drogas intravenosas (15, 16).
El diagnstico de las infecciones por HTLV-1/2
se realiza por la deteccin de anticuerpos especficos en
suero o plasma usando ensayos de screening:
inmunoensayo ligado a enzimas (enzime linked
immunoassay, ELISA) o aglutinacin de partcula (AP).
Todas las muestras repetidamente reactivas por las pruebas

Materiales y mtodos
Fueron analizadas un total de 181 muestras de
sangre perifrica correspondientes a personas de diferentes
regiones de la Argentina (Buenos Aires, Crdoba, Jujuy).
Los pacientes firmaron un consentimiento
informado previo a la toma de muestra de sangre. Setenta y
una muestras eran positivas para anticuerpos contra los virus
HTLV 1/2 (66 HTLV-1 y 5 HTLV-2), 63 muestras eran
negativas para HTLV 1/2 y 47 eran reactivas por el ensayo de

Correspondencia:
Dr. Marcos Balangero
Juan Ramirez de Velazco 760
Crdoba. Argentina
TE: 0351-4732723
E-mail:marcosbalangero@yahoo.com.ar

Recibido: 4 de enero de 2008

Aceptado: 14 de febrero de 2008

PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNSTICO DE HTLV-1/2

screening e indeterminadas por Wb para estos virus. Todas las

muestras fueron ensayadas por ELISA (Vironostika HTLV1/2 Organon Teknika), Aglutinacin de Partculas de Gelatina
(Serodia HTLV-1 Fujirebo Inc., Tokio, Japn) y
posteriormente confirmadas por Western blot (HTLV Blot
2.4, Genelabs, Singapur). Todos los ensayos fueron realizados
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de
los ensayos de Wb fueron interpretados segn los estrictos
criterios de Genelabs Diagnostics. El Wb fue considerado
positivo para HTLV-1 solo si la banda para las protenas gag
(p19 y/o p24) y dos protenas env (GD 21 y rgp 46 I) estaban
presentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV2 cuando estaban presentes las bandas para las protenas gag
(p24 y/o p19) y dos protenas env (GD21 y rgp 46 II). El test
fue considerado indeterminado si bandas especficas para
HTLV estaban presentes pero no cumplan con el criterio
suficiente de positividad. Las muestras fueron consideradas
negativas cuando no presentaban ninguna banda especfica
para protenas de HTLV-1/2.
Inmunofluorescencia Indirecta
Todas las muestras de suero fueron probadas por
medio de una Inmunofluorescencia Indirecta "in house".
Los vidrios fueron preparados utilizando linfocitos T
humanos trasformados (MT-2 y Mo-T) e infectados con los
virus HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente. Estas clulas
expresan antgenos virales en su superficie y en su
citoplasma. La lnea celular no infectada Molt-3 fue incluida
en los vidrios como control de inespecificidad. La IFI fue
realizada siguiendo el procedimiento descrito previamente
por Gallego et al (26). Brevemente, se colocan 10-20 ul
(dilucin 1:4) de las muestra de suero y de los sueros control
en los pocillos que contienen las clulas infectadas y las
clulas no infectadas. Las muestras son incubadas por 30
minutos a 37 C en cmara hmeda. Luego el vidrio es
lavado tres veces con PBS y posteriormente secado, 10ul de
una dilucin 1:100 de FITC-conjugado anti IgG humana
(Kallestad TM fluorescein conjugated antiserum/Sanofi
Diagnostics Pasteur) fue posteriormente agregado a cada
pocillo e incubado a 37 C en cmara hmeda por 30
minutos. Luego del ltimo lavado una solucin de buffer
glicerol (pH:8) fue utilizada para el montaje de los vidrios.
Los sueros fueron considerados positivos para anticuerpos
anti HTLV-1/2 cuando presentaban la fluorescencia
caracterstica en el citoplasma de las clulas infectadas y
ausencia de fluorescencia en las clulas no infectadas.

Nested-PCR.
Las clulas mononucleares de sangre perifrica
(PBMCs) fueron separadas de muestras de sangre entera por
Ficoll-Hypaque. Las clulas de la interfase fueron recolectadas
y lavadas con buffer fosfato (PBS). Las alcuotas conteniendo
1x106 clulas fueron resuspendidas en 100 ul de buffer de lisis
conteniendo 5 mM Tris CLH, 0,5% Twen 20, 0,5% Triton y 80
ug/ml de proteinasa K (Fungal 100mg, Gibco).
Se hizo la digestin con proteinasa K por 1 h a 60
C y luego la enzima se inactiv por 10 min. a 95 C. Los
lisados fueron mantenidos a 20 C hasta ser utilizados.
Una secuencia de -actina fue amplificada como
control de calidad del DNA extrado en las muestras (27).
A partir de los PBMCs de todas las muestras
extradas se realiz una Nested-PCR para la amplificacin
de secuencias del provirus de HTLV-1 y HTLV-2. Una
secuencia de la regin tax/rex, una secuencia genrica del
gen tax y una secuencia del gen pol fueron amplificadas en
ensayos de Nested-PCR diferentes.
Una muestra fue considerada positiva para HTLV1 o HTLV-2 cuando se amplificaron al menos dos
secuencias de genes.

Resultados
Fueron estudiadas por IFI y PCR un total de 47
muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb,
71 muestras confirmadas positivas para HTLV-1/2 por Wb
y 63 muestras negativas para HTLV-1/2.
Las 71 muestras positivas y las 63 negativas fueron
positivas y negativas para anticuerpos anti HTLV-1/2 por
IFI, respectivamente, existiendo una completa concordancia
entre los resultados de la IFI y el Wb. Por IFI fueron
negativas 33/47 (70,2%) de las muestras indeterminadas por
Wb, y 14/47 (29,8%) de las muestras indeterminadas por
Wb pero positivas por IFI presentaron bajos ttulos de
anticuerpos por esta ultima tcnica (rango 1:4 a 1:64).
Se obtuvieron los PBMCs a partir de 181 muestras
de sangre entera y la presencia del provirus de HTLV 1/2
fue investigada en ellas. Los resultados se muestran en la
Tabla 1. Todas las 71 muestras positivas fueron positivas
para HTLV-1/2 por PCR. As, fueron amplificadas en estas
muestras secuencias de 128 pb del gen tax/rex, 219 pb del
gen tax (secuencia genrica) y 198 pb o 132 pb del gen pol.
Las 63 muestras negativas fueron negativas para todas las

Experiencia Mdica - Vol. 26 - N 1 - 2008

secuencias del virus evaluadas por PCR. De las 47 muestras

indeterminadas por Wb, 6 fueron positivas para al menos
dos secuencias virales. De estas ltimas fueron tipificadas
por PCR 5 como HTLV-1 y 1 como HTLV-2.
Se realiz el anlisis de los patrones por Wb de
las 14 muestras positivas por IFI. De ellos 7 fueron gag
indeterminados, 4 env indeterminados y 3 gag/env
indeterminados. De las 47 muestras indeterminadas por
Wb, 14 fueron positivas por IFI y 6 de ellas fueron
concordantemente positivas por PCR. Tres de estas 6
muestras mostraron reactividad contra las protenas gag y

env y dos contra protenas de gag (Tabla II). De las 3

muestras con reactividad contra gag y env, 2 fueron
positivas para HTLV-1 (bandas para P21, P24, P28, P32) y
(bandas para GD21, P24) y 1 muestra fue positiva para
HTLV-2 (bandas para GD21 y P24). Una de las 2 muestras
con reactividad para gag fue positiva para HTLV-1 (p19 y
p24) y la otra para HTLV-2 (p19) (Tabla II).
Todas las muestras con reactividad para las
protenas del gag (p36, p32, p28, p26, p19 o p36, p28, p26,
p19 o p24 solamente) o protenas env (solamente GD21)
fueron negativas por PCR.

Tabla I: Presencia de anticuerpos para HTLV-1/2 y de secuencias del provirus en las muestras de sangre
correspondientes a las diferentes categoras estudiadas.
Patrones de Wb

PCR
a
b
POL I TAX I POL II c TAX II d Tax generice

IFI

Muestras

positivas PCR vs. IFI

HTLV-1 positivo

66

66

66

66

66

66/66

HTLV-2 positivo

5/5

Indeterminado

47

14 33

6/14

Negativo

63

63

63/63

Total

181

71

71

77

85

96

a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30).

b- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1) (28).
c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30).
d- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6 pb (perfil HTLV-2) (28).
e- gen tax 219 pb (genrica, HTLV-BLV) (29).

Tabla II: Reactividad por Western Blot y PCR de las muestras positivas por IFI.
N

IFI

Patrones de reactividad por Wb

PCR
a
b
POL I TAX I POL II c TAX II d

1
1
1
1
2

+
+
+
+
+

Wb Indeterminado (p36, p32, p28, p26, p19)

Wb Indeterminado (P36, P28, P26, P 19)
Wb Indeterminado (GD 21, P24, P28, P32)
Wb Indeterminado (GD 21, RGP46I, RGP46II )
Wb Indeterminado (GD21 ,P24)

2
3
1
2

+
+
+
+

Wb
Wb
Wb
Wb

Indeterminado (p19, p24)

Indeterminado (GD 21)
Indeterminado (P24)
Indeterminado P19)

+
+
1/2
1/2
-

+
+
1/2
1/2
-

1/2
1/2

1/2
1/2

a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30).

b-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1 ) (28).
c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30).
d-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6bp (perfil HTLV-2) (28).
e-gen tax 219pb (generica, HTLV-BLV) (29).

10

PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNSTICO DE HTLV-1/2

Discusin

por Wb no est claro hasta el momento. Algunos autores

argumentan que la presencia de dichos perfiles en reas no
endmicas sugiere que los individuos no estn infectados
con HTLV-1 o HTLV-2 ya que la mayora no portan el
provirus (32, 33, 34, 35).
Sin embargo, otros autores sugieren que estos
datos pueden indicar que la prevalencia del virus est muy
subestimada en ciertos grupos poblacionales (36, 34).
Estudios recientes en Buenos Aires, Argentina
(25) mostraron que 5/34 individuos indeterminados por
Wb estudiados fueron positivos para HTLV-1 por PCR y
4/5 tenan un perfil de Wb con reactividad para protenas
del env (GD21 o rgp 46II), sugiriendo que la reactividad
principalmente con la protena del env GD21 podra ser
indicativa de infeccin por HTLV-1/2. En este estudio
hemos encontrado varios diferentes perfiles de Wb
indeterminados en el grupo de individuos positivos por
PCR. As, en estas muestras evaluadas no hemos
encontrado patrones especficos que puedan ser sugeridos
como indicativos de infeccin por HTLV-1/2. Adems, en
este estudio el 50% de las muestras positivas por PCR no
tenan reactividad contra la protena GD21 y todas las
muestras que solo presentaban reactividad contra la
protena GD21 fueron negativas por PCR (Tabla II). En
estudios realizados en otros pases tampoco se encontr
asociacin entre algn perfil de indeterminado por Wb y la
infeccin confirmada con HTLV-1/2 (37). Sin embargo,
sera interesante poder realizar en Argentina estudios
multicntricos para seguimiento de cohortes mayores de
estos individuos seroindeterminados a fin de clarificar si es
posible determinar uno o ms patrones de Wb
indeterminados que sean tiles como indicativos de
infeccin. Adems, en este tipo de estudios prospectivos
otros factores deberan ser considerados tales como
conductas y factores de riesgo ambientales, tal como fue
realizado previamente en otros grupos poblacionales de
Brasil. (38)
En estudios previos realizados por nuestro grupo
demostramos que la IFI tiene sensibilidad y especificidad
comparable con el Wb (39) y que puede entonces ser
utilizada como una sencilla tcnica alternativa para la
confirmacin de la infeccin por HTLV-1/2. Los resultados
obtenidos en este trabajo corroboran esto ltimo ya que la
IFI detect correctamente las 71 muestras positivas (66

Los patrones indeterminados por Wb para HTLV1/2 son muy frecuentes en todo el mundo con prevalencias
que varan considerablemente de acuerdo al pas: Francia
(0,033 por mil) (25), Estados Unidos (0,035%) (26, 28),
Camern (11% en poblacin rural) (29) y en Congo (3% en
poblacin de mujeres embarazadas) (30). Adems los
patrones de Wb indeterminados persistentes son muy
frecuentes en poblacin de bajo riesgo como los donantes
de sangre, en los cuales para resolver el diagnstico debe
recurrirse a un seguimiento serolgico prolongado o a la
definicin del diagnstico por tcnicas moleculares.
La evaluacin de tcnicas serolgicas alternativas
para ser utilizadas en la confirmacin de la infeccin por
HTLV-1 y en la resolucin de perfiles serolgicos
indeterminados, adquiere importancia en los pases en
desarrollo con zonas endmicas para el virus donde los
recursos son limitados y, por ello, las tcnicas moleculares
no pueden ser usadas masivamente en el diagnstico. Esta
ltima es la situacin de la mayora de los pases de
Amrica incluyendo Argentina. El presente estudio
demuestra la utilidad de la tcnica de inmunofluorescencia
indirecta (IFI) para resolver el diagnstico serolgico de la
infeccin por HTLV-1/2 en individuos con perfiles
indeterminados por Wb.
En este trabajo demostramos que 14 (29,8%) y 33
(79,2%) de los 47 individuos con Wb indeterminados
fueron positivos y negativos respectivamente por IFI para
HTLV 1/2.
Seis de las 14 (12,8%) muestras positivas por
IFI fueron tambin positivas por PCR. Estos resultados
muestran claramente que la mayora de los individuos
con Wb indeterminados no estn infectados con HTLV-1
o HTLV-2. Sin embargo 4/6 (66,7%) y 2/6 (33,3) de estos
individuos estn infectados con HTLV-1 y HTLV-2
respectivamente (Tabla I y II), siendo la frecuencia global
de positividad entre los indeterminados de 12,o %
(HTLV-1 (8,5 %) y HTLV-2 (4,3 %). Nuestros hallazgos
son concordantes con lo descrito por autores de otros
pases que encontraron tasas de positividad por PCR de
15 % a 31 % en grupos de individuos con perfiles
indeterminados (31).
El significado de estos perfiles indeterminados

11

Experiencia Mdica - Vol. 26 - N 1 - 2008

HTLV-1 y 5 HTLV-2) y las 63 muestras negativas.

Adems, la IFI mostr ms sensibilidad que el Wb debido
a que detect 6 muestras positivas entre las 47 muestras
indeterminadas por Wb. Estas 6 muestras positivas por IFI
fueron concordantemente positivas por PCR (Tabla I).
Las principales conclusiones se basan en los
siguientes resultados: 12,8 % de las muestras
indeterminadas por Wb fueron confirmadas positivas por IFI
y PCR y el 70 % de las muestras fueron concordantemente
negativas por IFI y PCR. Adems, se encontraron resultados
discordantes en el 17 % de las muestras, resultando estas
positivas por IFI pero negativas por PCR.
Basados en nuestros resultados proponemos que
sean utilizados una combinacin de ensayos serolgicos
para la confirmacin de la presencia de anticuerpos contra
HTLV-1/2. Bsicamente proponemos que todas las
muestras indeterminadas por Wb sean probadas por IFI.
Todas las muestras que resulten negativas por IFI
demostraran ausencia de anticuerpos contra HTLV-1/2 y
todas las muestras que resulten positivas por IFI debern
ser estudiadas por PCR.
As, las muestras concordantemente positivas por
IFI y PCR confirman una infeccin por HTLV-1/2,

mientras que el porcentaje muy bajo de los individuos con

resultados discordantes (positivos por IFI y negativos por
PCR) deberan ser estudiados en un seguimiento
serolgico.
Este esquema propuesto permitira realizar un
diagnstico confirmatorio rpido de la infeccin por
HTLV-1/2, descartando rpidamente el alto porcentaje
(70%) de los resultados indeterminados por Wb que
corresponden a los casos en los que no existe infeccin y
evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a tcnicas
moleculares para la definicin del diagnstico y la
ansiedad que genera en el paciente la opcin de un
seguimiento serolgico.

Bibliografa

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Agradecimientos
Las autores agradecen a las Dras. Lisa Sen y
Andrea Mangano del laboratorio de Biologa Celular y
Retrovirus, Hospital Nacional de Pediatra "J. P.
Garrahan", Buenos Aires, Argentina por haber cedido
amablemente muestras con patrones indeterminados por
Wb para la infeccin con HTLV-1/2, las cuales fueron
utilizadas en este estudio.

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