Sunteți pe pagina 1din 17

CAPITOLUL 1

BIOTEHNOLOGIILE: ISTORIC. PROCESE I PRODUSE BIOTEHNOLOGICE

1.1 Definiia biotehnologiei; evoluia n timp a biotehnologiei ca tiin tehnic


Descoperirile spectaculoase din domeniile biologiei, biochimiei, microbiologiei, geneticii,
enzimologiei, precum i necesitatea aplicrii acestor cunotine n practic au condus la apariia
unei noi tiine denumit generic biotehnologie. Caracterul interdisciplinar al biotehnologiei a
creat nc de la nceput probleme privind definirea i localizarea ei ca tiin de sine stttoare.
Dintre toate definiiile aceea dat biotehnologiei de ctre Federaia European de Biologie
(1978), pare a fi satisfctoare: "Utilizarea integrat a biochimiei, microbiologiei i ingineriei
n scopul obinerii unei aplicaii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor,
culturilor de celule i a prilor componente a acestora". Simplificnd, se poate spune c
biotehnologia presupune "utilizarea organismelor sau a produselor derivate de la acestea n
scopuri comerciale."
In esen, principalul scop al biotehnologiei este obinerea de produse sau servicii utile
activitii umane, cu ajutorul organismelor vii. Procesul de baz n biotehnologie este proces
biologic, dup cum procesul de baz n tehnologia chimic este procesul chimic. n tabelul 1.1
poate fi urmrit natura produselor comerciale obinute pe cale biotehnologic utiliznd diferite
tipuri de celule.
Produse majore obinute pe cale biotehnologic
Produse de fermentaie

Solveni organici
Etanol(nu pentru buturi)
Aceton/butanol
Biomas
Culturi starter i drojdii pentru
industria alimentar i agricultur
Proteine monocelulare
Acizi organici
Acid citric
Acid gluconic
Acid lactic
Acid itaconic

Tabelul 1.1

Tipul de organism utilizat

Producie
anual(n
lume)kg/an

Sacharomyces cerevisiae
Clostridium acetobutylicum

21010
2106

Bacterii lactice sau drojdii de panificaie


Pseudomonas methylotrophus sau Candida
utilis

5 108

Aspergillus niger
Aspergillus niger
Lactobacillus delbrueckii
Aspergillus itaconicus

0.5-1108
2-3108
5107
2107

Aminoacizi
Acid L-Glutamic
L-Lysin
L-Fenilalanin
L-Arginin
Ali aminoacizi
Transformri microbiene
Steroizi
D-Sorbitol la L-sorboz
(n producia de vitamina C)
Polizaharide extracelulare
Xanthan
Dextran
Nucleotide
5- Guanosin monofosfat
Enzime
Proteaze
-Amilaze
Glucoamilaze
Glucozizomeraz
Pectinaze
Renina
Vitamine
B12
Ribovlavina
Alcaloide Ergot
Pigmenti
-Carotene
Vaccinuri mpotriva:
-difteriei
-tetanosului
-pertussisului (tusea convulsiv)
-virusului poliomielitei
-rubeolei, etc
Proteine terapeutice
Insulina; Hormonul uman de cretere
Eritropoietina; Factorul VIII-C;
Interferonul-2, etc
Insecticide
Spori bacterieni

Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium flavum
Corynebacterium glutamicum
Brevibacterium flavum
Corynebacterium spp.

3108
3107
2106
2106
1106

Rhizopus arrhizus
Acetobacter suboxydans

4107

Xanthonomas campestris
Leuconostoc mesenteroides

5106

Brevibacterium ammoniagenes

1105

Bacillus spp.
Bacillus amyloliquefaciens
Aspergillus niger
Bacillus coagulans
Aspergillus niger
Mucor miehei sau drojdii recombinanta

6105
4105
4105
1105
1104
1104

Propionibacterium shermanii
Eremothecium ashbyii
Claviceps paspali

1104
5103

Blakeslea trispora

60

Corynebacterium diphtheriae
Clostridium tetani
Bordetella pertussis
Virusuri active atenuate cultivate in vitro

<50

Bacterii, drojdii sau cellule mamaliene


recombinate
Bacillus thuringienis

<20

Spori de fungi
Antibiotice
Peniciline
Cefalosporine
Tetracicline
Antibiotice macrolide
Antibiotice polipeptide
Antibiotice aminoglicoside
Antibiotice aromatice

Hirsutella Thompsonii

Anticorpi monoclonali

Celule de tip Hybridoma

Penicillinum chrysogenum
Cephalosporium acremonium
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces erythreus
Bacillus brevis
Streptomyces griseus
Penicillium griseofulvum

3-4107
1107
1107
2106
1106
<20

1.2. Dezvoltarea industriei biotehnologice; rolul cercetrii fundamentale n biotehnologie


Cunoaterea tiinific i strategia de dezvoltare economic actual se bazeaz pe o nou
abordare a fenomenelor, acestea conducnd la o adevrat revoluie biotehnologic. Se apreciaz
c n viitor cea mai mare parte a industriei se va baza pe procedee de fermentaie, inginerie
biochimic, biologie molecular, aceasta din urm imprimnd un salt tehnologic corespunztor.
Pe aceste baze, industria biotehnologic va lua un avnt considerabil. Ingineria genetic este
considerat a fi tehnica ideal capabil s amelioreze cantitativ i calitativ capacitatea de
biosintez a celulelor de microorganisme, animale sau vegetale, n scopul obinerii unor produse
utile. Natura interdisciplinar a biotehnologiei este evident dac se ine seama de etapele unui
proces biotehnologic complet. Dac se ia ca exemplu obinerea unui produs nou prin tehnologia
ADN-recombinant, cum ar fi insulina, hormonul de cretere sau interferonul, atunci de la idee
pn la obinerea unui produs comercial se parcurg o serie ntreag de faze care implic
cunotine aparinnd unor domenii tiinifice foarte diferite.
Prima treapt de dezvoltare a bioprocesului se refer la manipularea genetic a
organismului gazd; n acest caz, gena de interes este clonat ntr-o gazd specific (de ex.
Escherichia coli) i se stabiliesc o serie de parametrii, cum ar fistabilitatea tulpinii recombinate i
nivelul de expresie al produsului dorit. Dup clonare, caracteristicile de cretere i producie a
celulelor trebuie msurate n funcie de condiiile de cultivare, ceea ce necesit aplicarea
tehnicilor de cultivare obinuite n microbiologie n vederea stabilirii parametrilor optimi:
compoziia mediului, pH, temperatur, concentraie de oxigen dizolvat astfel nct productivitatea
n produsul urmrit s fie maxim. Se pornete prin cultivarea microorganismului la scara mic,
n flacoane agitate de 250 ml pn la un litru capacitate. Performanele organismului sunt descrise
prin calcularea ratei de cretere, productivitatea specific, randamentul n produs finit.
Dup cunoaterea condiiilor de cultivare n laborator se pornete procesul de ridicare la
scar pilot i industrial.
1. Prima treapt poate fi un bioreactor de 1, 2 sau 5 l echipat cu instrumente de msur
i control al temperaturii, pH, concentraie oxigen dizolvat, vitez de agitare. Culturile
pot fi monitorizate mai bine n bioreactor dect n flacoane agitate. Se pot culege mult

mai multe informaii referitoare la necesarul de oxigen al microorganismului sau la


caracteristicile de spumare ale mediului sau ali parametrii. De asemenea pot fi
identificate limitrile impuse de tipul bioreactorului.De exemplu, dac acesta nu poate
asigura necesarul de oxigen, celulele sunt nfometate. n mod similar, dac agitarea
mediului de cultur nu este adecvat, aceasta poate conduce la spargerea celulelor i
devierea procesului de cultivare. In bioreactor se stabilesc condiiile pentru o anumit
activitate a celulelor. In aceast faz se calculeaz diferii parametrii cum ar
fi:coeficienii de transfer de mas, timpul de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului,
puterea de agitare i muli alii. Aici se decide dac cultura de celule poate fi operat
cel mai bine n sistem "batch", semi-continuu sau continuu. De asemenea pot fi
ncercate diferite tipuri de bioreactor. Se realizeaz de asemenea un calcul economic
de fezabilitate.
2. Urmtoarea treapt de ridicare la scar este aceea de bioreactor pilot. n aceast faz
se implic specialistii instruii n ingineria bioproceselor i n ridicarea la scar
industrial a acestora. In prezent se construiesc vase de 100-1000 l dup specificaiile
prototipului de laborator. Scopul fazei pilot este acela de a examina raspunsul
celulelor cultivate la o scar mai mare. n aceast treapt de operare, rezultatele pot fi
mai bune sau mai sczute fa de cele obinute n bioreactorul laborator. n funcie de
aceste rezultate se hotrte dac se trece la producia industrial sau nu. Aceast parte
a procesului tehnologic aparine n ntregime ingineriei bioproceselor: se proiecteaz
att bioreactorul industrial ct i facilitile auxiliare: echipamente de sterilizare aer i
mediu, generator de abur, utilaje necesare preparrii mediilor de cultur, sistem de apa
de racire, aparatura de automatizare i control. O importan deosebita se acorda
faptului ca instalaia trebuie s asigure conditii aseptice pe ntreg fluxul de productie.
3. O parte important a unui proces biotehnologic o constituie faza de recuperare a
produsului din mediul de producie i anume izolarea si purificarea acestuia pna la
produsul finit. Aceast faz este adesea foarte dificil pentru produsele rezultate prin
tehnologia ADN recombinant, astfel nct costurile reprezint 80-90% din costul total
al bioprocesului. Procedeul aplicat pentru izolare i purificare depinde de natura
produsului i cuprinde metode fizice, chimice, biologice. Multe metode ncercate n
laborator i care au dat rezultate bune, nu pot fi aplicate la scara industrial. n aceast
faz, biochimitii, inginerii chimiti, tehnologii au o contribuie important n
recuperarea i purificarea substanei active. Procedeele elaborate includ: filtrri
,centrifugri pentru separarea celulelor de lichid, metode mecanice de distrugere a
membranei celulare, dac produsul este intracelular, extracii cu solventi, metode
cromatografice, separri prin membrane, cristalizri i uscri.Toate aceste procedee
sunt testate mai nti la scara mic i apoi la scar pilot i industrial.
Dupa ce produsul a fost purificat pn la standardele cerute de normele internaionale,
acesta poate fi ambalat i vndut. In cazul produselor farmaceutice noi este necesar i testarea
eficacitii acestora, mai nti pe animale i apoi pe oameni. Pentru produsele uz alimentar sunt
cerute alte teste specifice.
4

Pentru toate produsele obinute pe cale biotehnologic se cer avize oficiale conforme cu
standardele existente pentru fiecare tip de produs. Din acest exemplu se poate vedea c ntr-un
bioproces sunt implicate multe discipline diferite att tehnice ct i discipline fundamentale.
Specialitii din domeniul biotehnologiei se confrunt n mod constant cu probleme aparinnd
domeniilor: biologie, chimie, fizic, inginerie i uneori medicin.
1.3.Aplicaii ale biotehnologiei n medicin, agricultur, industria alimentar, industria
farmaceutic
Sfera domeniilor de aplicabilitate a biotehnologiilor este foarte mare, dat fiind varietatea
proceselor biotehnologice.
Principalele direcii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate n primul
rnd de descoperirile recente din domeniul biologiei moleculare dar i de cerinele societii fa
de anumite aspecte cu care se confrunt n prezent: criza energetic, epuizarea rezervelor de
hran de pe planet, probleme ecologice i de bioremediere.
ncercnd o clasificare a diferitelor tipuri de biotehnologii, n funcie de domeniul n
care se aplic sau tipul de celule utilizate, observm c este greu s realizm o delimitare. Orice
manipulare a viului n folosul societii, nseamn biotehnologie. Indiferent dac aceasta se
realizeaz la nivel laborator avnd un caracter de cercetare fundamental sau se realizeaz la
nivel industrial avnd un caracter aplicativ, scopul final i n general tehnicile sunt asemntoare
i incluse n aceeai sfer larg a biotehnologiei.
1. n funcie de tipul de celule cu care se lucreaz, deosebim: biotehnologii : microbiene,
vegetale i animale.
2. n funcie de domeniul n care i gsesc aplicaii produsele obinute pe cale
biotehnologic deosebim:
Biotehnologii industriale (acestea cuprinznd biotehnologii farmaceutice,
alimentare i biotehnologii de depoluare).
Biotehnologii agricole (care cuprind dou mari domenii: biotehnologii
vegetale i biotehnologii n zootehnie)
Biotehnologii medical-veterinare
Biotehnologiile industriale cuprind procedee de obtinere a unor produse de larg interes,la
nivel industrial,utiliznd microorganisme sau enzime.n categoria biotehnologiilor farmaceutice
intr:
producerea de biomas proteic
biosinteza antibioticelor
producia de acizi organici
producia de aminoacizi, enzime, obinerea de probiotice, hormoni, vitamine,
polizaharide.
n funcie de gradul de puritate, produsele obinute pot fi utilizate att pentru consumul
uman ct i animal.

Biotehnologiile alimentare cuprind procedee industriale de prelucrare a legumelor i


fructelor, a laptelui i produselor lactate, a crnii, viznd n general aspectele fermentative ce stau
la baza obinerii acestora.
n cadrul biotehnologiilor de depoluare a mediului sunt incluse toate metodele i tehnicile
de epurare biologic a apelor uzate sau poluate, a aerului sau ale solurilor degradate, extracia de
minereuri cu ajutorul microorganismelor sau metodele de bioremediere cu ajutorul plantelor sau
microorganismelor.
Biotehnologiile agricole vizeaz un domeniu larg de aplicare i presupun att utilizarea
aspectelor tradiionale de ameliorare a plantelor i animalelor ct i cele moderne, bazate pe
manipularea genetic controlat a informaiei genetice a celulelor vegetale (biotehnologii
vegetale) sau a celor animale (biotehnologii animale cu aplicaii n zootehnie sau medical
veterinare). Biotehnologiile vegetale vizeaz utilizarea culturilor celulare vegetale precum i a
tehnicilor de inginerie genetic n scopul obinerii de noi soiuri cu rezisten la atacul agenilor
patogeni, tolerante/rezistente la factori de mediu defavorabili, la implementarea de sisteme
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole i obinerea de noi hibrizi
cu proprieti mbuntite etc.
Biotehnologiile din domeniul zootehniei se refer n special la nutriia animal, creterea
rezistenei animalelor la atacul factorilor patogeni, biotehnici de reproducie artificial i de
predeterminare a sexului la animale, conservarea resurselor genetice animale.
Biotehnologiile medical veterinare au ca scop, n principal, crearea unor sisteme de
diagnostic rapid i eficient a maladiilor sau dereglrilor funcionale la animale sau la om,
producerea unor sisteme biologice de combatere a bolilor (anticorpi monoclonali, vaccinuri,
ageni de biocontrol), realizarea de studii n vederea clarificrii mecanismelor implicate n
producerea unor procese patologice sau n rezistena la diverse boli etc.
Saltul tiinific nregistrat n fiecare din domeniile biotehnologiei enunate mai sus nu ar fi
fost posibil far aplicarea tehnicilor noi de biologie molecular, legate de transferul de gene i
clonarea molecular pentru obinerea unor noi tipuri de celule si organisme; astfel este posibil
obinerea de linii celulare noi cu proprieti utile pentru medicin, agricultur, zootehnie,
industria alimentar. Incorporarea unor gene dorite, utile, conduce la obinerea unor produse noi
de interes medical sau industrial.
CAPITOLUL 2
ETAPELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC
Elaborarea i industrializarea unei tehnologii de biosintez presupune parcurgerea mai
multor faze ce pornesc de la cercetrile la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul
pilotului i, n final, la nivel industrial. Aceste cercetri permit transpunerea procedeului de
biosintez de la o faz la alta, cu optimizarea factorilor implicai n derularea fiecrei faze n
parte.

2.1. Faza de laborator


Cercetrile de obinere a unui produs prin biosintez ncep cu lucrri de laborator care
constau n: izolarea i selecia oragismelor (microorganismelor) de interes; ntreierea tulpinilor
cu proprietile dorite; realizarea culturilor inocul.
Izolarea i selecia unui mare numr de microorganisme cunoscute din literatura de
specialitate ca productori ai compusului ce urmeaz a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate n acest
scop sunt specifice pentru fiecare microorganism, cele mai multe referindu-se la tehnica diluiilor
i tehnica granulelor de sol.
Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide,
astfel nct s fie posibil punerea n eviden a unor caracteristici fiziologice. n prima etap se
urmrete realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei,
diluii succesive), dup care se stabilete o metod de triere (screening) adecvat scopului
urmrit.
De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plci Petri, pe medii solidificate cu agaragar. In cazul n care se urmrete selectarea unor microorganisme productoare a unui anumit tip
de enzim se realizeaz teste de identificare care pot fi calitative sau cantitative. n cazul
enzimelor se aplic de obicei metode de identificare calitativ prin includerea substratului
specific n mediul solid pe care se cultiv microorganismele (de ex.amidon n cazul amilazelor,
casein n cazul proteazelor, celuloz n cazul celulazelor). Dup dezvoltarea coloniilor izolate,
enzimele difuzeaz n gelul de agar-agar, atacnd substratul inclus n mediu i astfel zona
respectiv poate fi vizualizat, n cazul n care devine transparent sau cu un reactiv specific. In
cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultiv pe medii
specifice dup care se utileaz fie lichidul de biosintez fie extracte din culturile respective.
Produsele respective sunt prelucrate n scopul dozrii cantitative prin metode spectrofotometrice,
fluorescen, titrimetrice, polarimetrice. n urma acestor teste se rein numai cteva tulpini care
au dat cele mai bune rezultate n ceea ce privete biosinteza enzimei.
ntreinerea tulpinilor productoare. Dup faza de izolare i selecie, tulpinile
productoare se supun unor teste de caracterizare dup criterii morfologice, biochimice,
fiziologice, imunologice sau toxicologice; tulpina astfel caracterizat se nregistreaz ntr-o
colecie de microorganisme, n vederea protejrii sale i a utilizrii ulterioare.
Tinnd cont c scopul este de a obine un anumit produs la nivel industria este necesar ca
nivelul biosintezei s fie ridicat; de aceea se optimizeaz parametrii de biosintez sau tulpina
microbian de interes este supus unor teste de ameliorare prin metode clasice (mutagenez) sau
moleculare (inginerie genetic).
Conservarea microorganismelor de interes, att tulpinile parentale, ct i tulpinile
modificate genetic (mutante sau recombinate) se face prin metode speciale, aa cum sunt
liofilizarea i conservarea n azot lichid. Tulpinile din colecie utilizate n lucrrile de biosintez
curente se pstreaz sub diferite forme i formeaz aa numita cultur stoc de la care se
pornete procesul de biosintez. Cultura stoc este pstrat la frigider, pe mediu agarizat, n tuburi.
Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator, se pornete de la o astfel de cultur vegetativ.
7

Cultura inocul. Inoculul reprezint o cultur microbian n curs de multiplicare pe un


substrat nutritiv corespunztor i n anumite condiii de dezvoltare (pH, temperatur, agitare,
aerare) specifice. Inoculul constituie materialul de nsmnare al mediului de biosintez propriu
zis, din etapa urmtoare. Transferul culturii inocul n mediul de biosintez se realizeaz n
condiii aseptice, dup o perioad de dezvoltare bine stabilit (vrst, cantitate, aspect
microscopic).
2.2. Faza de staie pilot
Faza de biosintez propriu-zis se realizeaz n echipamente speciale, numite
bioreactoare, care pot avea diferite capaciti (10 l, 100 l, 1 m3, 10 m3, 100 m3), alegerea unuia
sau a altuia depinznd de scopul cercetrilor.
Faza de biosintez este precedat de operaii de sterilizare a aparaturii utilizate i a
mediului de cultur stabilit ca fiind optim la nivel de laborator. nceputul fazei de biosintez este
considerat momentul transferului culturii inocul n mediul de cultur sterilizat i rcit la
temperatura de cultivare a microorganismului productor. Cnd raportul ntre capacitatea de
inocul i cantitatea de mediu de fermentaie (numit raport de inoculare) nu permite pregtirea
culturii inocul n laborator este necesar introducerea unei trepte intermediare de cultivare,
numite cultura intermediar.
n faza de staie pilot tehnologia elaborat la nivel de laborator este verificat i
optimizat pe instalaii de biosintez de capacitate medie (pilot). Pe baza datelor de cercetare
obinute la nivel pilot se elaboreaz aa numitul proces tehnologic pilot dup care urmeaz o
faz de experimentare industrial i apoi producia propriu zis probusului urmrit (enzim,
antibiotic etc). Datele furnizate de tehnologia pilot elaborat, constituie elemente de proiectare
pentru instalaiile industriale.
2.3 Medii de cultur utilizate n procesel biotehnologice
n procesele biotehnologice, mediile de cultur sunt constituite din suporturi nutritive
sterilizate care permit dezvoltarea i studiul unui microorganism n afara niei ecologice naturale.
Compoziia mediilor de cultur are o mare importan asupra reproductibilitii i eficienei
tehnologiei respective.
n funcie de consisten, compoziie, scopul utilizrii, mediile de cultur se clasific
astfel:
dup consisten:
o medii lichide
o medii solide
o medii semisolide;
dup compoziie:
o medii naturale, care conin elemente nutritive, de origine vegetl sau
animal;
8

o medii sintetice care conin numai compui cu structur chimic


cunoscut care pot fi dozai;
dup tipul respirator al microorganismelor cultivate se deosebesc:
o medii pentru microorganisme aerobe
o medii pentru microorganisme anaerobe;
dup scaopul i frecvena ntrebuinrii deosebim:
o medii de uz curent;
o medii speciale utilizate n general n studiile de izolare a
microorganismelor la nivel de laborator. Acestea pot fi la rndul lor:
elective, selective, de mbogire, de conservare, de identificare;
dup faza de biosintez la care este utilizat mediul de cultur poate fi mediu
laborator, pilot sau mediu de cultur industrial;
dup destinaia final a culturii dezvoltate mediile pot fi:
o medii pentru cultura inocul;
o medii pentru cultura de regim numite i medii de fermentaie sau medii
de biosintez.
n biotehnologie se utilizeaz n mod curent mediile naturale avnd la baz subproduse
agroalimentare, cumr ar fi: rot de floarea soarelui, de soia, fin de porumb, tre de gru,
extractul de porumb. Aceste medii conin n general elemente nutritive necesare dezvoltrii
microorganismelor, la care se adaug de obicei cantiti mici de sruri minerale.
Mediile naturale sunt n general mai ieftine dar prezint dezavantajul variabilitii
compoziiei, ceea ce nu permite o standardizare corespunztoare i n consecin nu permite
reproducerea procesului de biosintez cu un randament constant. Spre deosebire de mediile
naturale, mediile sintetice sunt perfect reproductibile la scar industrial.
Un mediu de cultur utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie s conin
ntodeauna:
sursa de carbon (n general glucide: glucoz,amidon, lactoz, zaharoz, etc.)
sursa de azot care poate fi organic (aminoacizi, proteine,uree), sau anorganic (NH3,
(NH4)2SO4, etc. )
sursa de fosfor (H3PO4, (NH4)3PO4, KH2PO4 , etc)
oligoelemente: K (din KCl sau K2HPO4); Mg ( din MgSO4); Fe (din FeCl3)
factori de cretere: aminoacizi, proteine, vitamine, coenzime.
Compoziia mediului nutritiv specific pentru un microorganism se stabilete n laborator,
prin cultivarea acestuia, alegndu-se astfel, n funcie de scopul urmrit, mediul optim de
cultivare. Uneori, pentru creterea randamentului n faza de biosintez, se adaug la mediu
precursori care sunt substane avnd poriuni structurale ale moleculei produsului de biosintez.
n procesele de biosintez, sursa principal de energie o constituie sursa de carbon,
respectiv glucidele. n procesele catabolice, prin oxidarea biochimic a glucozei se elibereaz o
mare cantitate de energie, din care o parte este nmagazinat n compuii macroergici (ATP), iar
restul este preluat de mediul de cultur cu ajutorul sistemelor de termostatare ale bioreactoarelor.

Sursa de carbon furnizeaz de asemenea necesarul de oxigen i hidrogen necesar dezvoltrii


microorganismului.
De exemplu, mediile de cultur utilizate n producia de enzime trebuie s conin
elementele eseniale: carbon, azot, sulf, oxigen, fosfor, magneziu, calciu i numeroase alte
elemente n cantiti foarte mici (urme): fier, cupru, cobalt, zinc, mangan, molibden - care sunt
necesare funciilor celulare de baz. De cele mai multe ori este ns nevoie s se utilizeze un
mediu de producere a enzimei ct mai ieftin i posibil de reprodus o perioad ct mai lung de
timp. Aceasta conduce la utilizarea unor substrate ct mai ieftine i mai accesibile n conjunctura
economic respectiv; nlocuirea unui component din compoziia mediului nutritiv conduce la
variaii n randamentul de producere al enzimei, astfel nct studiul aprofundat al influenei
diferitelor componente ale mediului de cultur asupra biosintezei enzimei, constituie un element
important al cercetrilor n domeniul produciei de enzime.
Sursa de carbon utilizat n compoziia mediilor de cultur pentru enzime este suplinit n
mod obinuit de glucide de o anumit puritate sau de un material natural coninnd un amestec de
glucide. Astfel, melasa de sfecl sau de trestie este folosit n multe cazuri drept surs de
zaharoz. Alte surse de carbon utilizate n producia de enzime: siropul de glucoz, amidonul de
porumb sau de cartofi, hidrolizatul de amidon de cereale (gru, orez, porumb) sunt n mod
frecvent folosite ca surse de glucoz, zerul ca surs de lactoz.
Sursa de azot poate fi reprezentat n diferite forme de surse anorganice, cum ar fi:
amoniacul, srurile de amoniu sau amestecuri complexe de tipul extractului de drojdie, a celui de
porumb, pepton, fin de soia sau distilate solubile. Fosforul, sulful i cationii eseniali sunt, n
general, suplinii de srurile anorganice. Uneori se adaug elemente specifice n cantiti mici,
dar de obicei acestea sunt aduse de ap sau de alte componente ale mediului. Dintre factorii de
cretere, tiamina i biotina sunt necesare pentru creterea microorganismelor.
2.4. Influena factorilor de mediu asupra cresterii microorganismelor
Creterea microorganismelor ntr-un bioreactor este influenat de o serie de factori de
mediu, dintre care cei mai importani sunt:
concentraia substratului
calitatea i cantitatea inoculului
temperatura
pH-ul mediului de biosintez
agitarea
concentraia O2-ului dizolvat
2.4.1. Influena concentraiei substratului asupra procesului de biosintez
Celula microbian, datorit volumului ei redus, este extrem de sensibil la variaiile
parametrilor procesului de biosintez, n special la variaiile concentraiei de substrat. Mrirea

10

concentraiei de substrat n mediul de cultur poate conduce la sporirea numrului de celule


microbiene, dar numai pn la anumite limite, multiplicarea acestora fiind ncetinit, de procese
de inhibiie care au loc la nivelul celulei. Aciunea unui inhibitor asupra celulei microbiene se
poate exercita prin:
modificarea potenialului chimic al substratului, intermediarilor metabolici sau
a produsului finit;
modificarea permeabilitii peretelui celular i reducerea transportului
substanelor nutritive;
modificarea activitii enzimelor implicate in procesul metabolic;
disocierea agregatelor metabolice;
modificarea parametrilor funcionali ai celulei microbiene (capacitatea de
multiplicare, mobilitatea, biosinteza unor metabolii).
Mecanismele prin care se realizeaz inhibiia sunt:
reacie chimic cu una sau mai multe componente celulare;
adsorbia sau complexarea unor enzime sau coenzime;
intervenia n secvene a reaciilor biochimice;
intervenia n disocierea complexelor enzimatice;
modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintez (pH, trie
ionic, constant dielectric, capacitate de solvatare);
intervenia n funciile celulare de control.
Datorit acestor fenomene concentraiile mari de substrat inhib dezvoltarea
microorganismelor ntr-un anumit grad ajungnd chiar la inhibiie total, motiv pentru care,
pentru un sistem de biosintez se stabilete concentraia optim a substratului att n momentul
iniial ct i pe parcurs. De exemplu, pentru foarte multe bacterii concentraia de 10-15% n surs
de C (glucoz, zaharoz) este inhibitoare, ele dezvoltndu-se bine la valori ale sursei de carbon
sub 10%.
Acesta este motivul pentru care n soluii foarte concentrate de zahr (de exemplu
dulceuri, siropuri) microorganismele n general nu se dezvolt, acestea putnd fi conservate pe o
lung perioad de timp.
2.4.2. Influena dimensiunii inoculului
Calitatea i cantitatea inoculului joac un rol important pentru obinerea unor metabolii
cu randamente dorite de biosintez. Cel mai adesea se utilizeaz o cantitate mare de inocul pentru
a determina o declanare rapid a dezvoltrii culturii concomitent cu reducerea riscului de
contaminare. In majoritatea cazurilor este necesar ca dimensiunea inoculului s se situeze ntre 3
10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie n parte se stabilete aa numitul
raport optim de inoculare care definete dimensiunile optime ale inoculului.
Pentru asigurarea unei productiviti i msurarea densitii inoculului se extrag probe din
cultura aflat ntr-un anumit stadiu de evoluie optim pentru obinerea unei producii maxime a

11

metabolitului dorit i se determin parametrii specifici (numrul de germeni pe unitatea de


volum, sau coninutul n biomas uscat raportat la unitatea de volum). Efectele determinate de
mrimea i vrsta inoculului sunt specifice pentru diferite microorganisme.
De exemplu, la bacterii, mrimea inoculului la bacterii are influen pronunat asupra
stadiilor ulterioare ale culturii, determinnd diferite stri fiziologice ale celulelor n funcie de
care variaz capacitatea de biosintez a metabolitului dorit. Cnd se utilizeaz o cantitate mare de
inocul, se micoreaz faza de lag datorit formrii i acumulrii unor metabolii intermediari
eseniali care pot difuza n celule i n mediul de cultur mai rapid dect n cazul utilizrii unui
inocul mic. Uneori ns, cantitile mari de inocul determin apariia unui fenomen de
autoinhibiie datorat sensibilitii celulelor bacteriene fa de unii produi metabolici intermediari.
Pe de alt parte, cnd mrimea inoculului este ns prea mic, faza de lag poate fi prelungit la
infinit i aceasta nu poate conduce la o dezvoltare normal a culturii de microorganisme. S-a
observat c n cazul bacteriilor, pentru iniierea dezvoltrii unui inocul este necesar prezena n
mediul de cultur a unei concentraii critice de metale grele. De exemplu pentru un inocul de
Bacillus subtilis este necesar prezena n mediul de cultur a unei concentraii minime de
mangan, n vederea iniierii dezvoltrii. Aceste cercetri subliniaz importana ionilor metalelor
grele pentru faza de lag la bacterii.
n cazul levurilor cantitatea de inocul poate influena de asemenea durata fazei de lag sau
stadiile ulterioare de dezvoltare, similar cu cele descrise n cazul bacteriilor.
n cazul fungilor, importana standardizrii inoculului vegetativ este hotrtoare: pentru
obinerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar s se utilizeze un inocul sub form de
suspensie de spori. De asemenea poate s apar fenomenul de autoinhibiie sau autostimulare a
germinrii sporilor datorit prezenei unor substane produse n timpul germinrii sau n fazele
ulterioare. In cazul fungilor cantitatea de inocul influeneaz mrimea i forma miceliului precum
i randamentul n metabolii. Raportul de inoculare trebuie s fie stabilit astfel nct cantitatea de
miceliu dezvoltat ulterior s nu fie prea mare n detrimentul secreiei metabolitului dorit. O
dezvoltare abundent a masei miceliene conduce n acelai timp la un consum mare de surs de
carbon, cultura fiind astfel ineficient.
2.4.3. Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelor productoare de
enzime
Temperatura mediului n care are loc procesul de biosintez este un factor extrem de
important pentru dezvoltarea i activitatea microorganismelor. Temperatura este un factor care
acioneaz n mod direct asupra microorganismelor, diferena ntre temperatura mediului
nconjurtor i cea din interiorul celulei trebuind s fie nul. Pentru un proces de biosintez
industrial, temperatura poate fi considerat unul dintre parametrii fizici cei mai importani care
este implicat profund, prin efectele sale n optimizarea procesului.
Variaiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului n
produsul dorit, asupra cerinelor nutritive ale microorganismului i compoziiei biomasei obinute
precum i asupra vitezei de cretere microbian. n funcie de domeniul de temperatur n care

12

microorganismele, ating viteza maxim de cretere, acestea se clasific n : criofile, mezofile i


termofile. Microorganismele industriale sunt n general mezofile, astfel nct acest domeniu este
plasat n intervalul 25 35C.
Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelor se explic prin faptul c aceasta
afecteaz multe procese metabolice din celul precum i compoziia biomasei n proteine i
lipide, coninutul n ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidic a membranei celulare s se
modifice continuu n funcie de variaiile de temperatur, astfel nct membrana s-i menin
funcia reglatoare.
2.4.4. Efectul pH-ului asupra creterii microorganismelor
Valoarea pH-ului este, alturi de temperatur, un parametru important n procesele de
biosintez. Influena valorii pH-ului asupra dezvoltrii culturilor microbiene se poate urmri n
cteva direcii:
In general microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, n care viteza
specific de cretere atinge valoarea maxim. De exemplu, pentru anumite specii de
drojdii domeniul optim de pH se situeaz ntre valorile de pH 4 i 5. Exist ns i specii
de drojdii care cresc la valori de pH n jur de 2 sau, dimpotriv, la valori ridicate ale pHului n jur de 8 (de exemplu drojdiile din genul Rhodotorula folosite pentru biosinteza
fenilalaninei). Cultivarea microorganismelor la valori sczute ale pH-ului (pH 3 4)
prezint avantajul unui risc mai sczut de contaminare, ceea ce este apreciat n mod
deosebit n cazul unei cultivri industriale.
Efectul valorii pH-ului asupra randamentului de conversie a substratului la un anumit
produs. Formarea produsului dorit n urma procesului de biosintez poate s fie legat de
desfurarea bioprocesului ntr-un domeniu foarte strict de pH. n timpul dezvoltrii unei
culturi microbiene apar deviaii ale pH-ului de la valoarea considerat optim care pot
avea urmri nedorite asupra procesului de biosintez. Aceste modificri se pot datora fie
consumrii unui nutrient (consumarea sursei de carbon sau consumarea sursei de azot, fie
producerii unui acid organic de ctre microorganism). Pentru corectarea pH-ului la
valoarea prescris se adaug diverse substane chimice (acizi sau baze) alese n funcie de
mai muli factori.; n cazul n care valoarea pH-ului este sub cea prescris, se pot folosi,
pentru corecie, soluii de NaOH sau KOH n funcie de compoziia chimic a mediului i
de necesarul n ionii de Na+ i K+ al microorganismului; n acelai scop este mult
rspndit utilizarea amoniacului gazos sau soluie. n situaia n care valoarea pH-ului
este peste cea recomandat se poate aduga acid clorhidric, acid sulfuric sau acid azotic n
funcie de caracteristicile microorganismului (ionul Cl s nu inhibe creterea), de
compoziia chimic a mediului (adugarea de acid sulfuric ar putea conduce la formarea
unor sruri greu solubile) precum i de materialul de construcie al vaselor de reacie i al
bioreactoarelor (probleme de coroziune).

13

Prin efectul de disociere a acizilor i bazelor, pH-ul acioneaz asupra caracteristicilor


suprafeei celulei, modificnd proprietile ei de aderare la diferite materiale (sticl,
metale) precum i cele de floculare.
2.4.5. Concentraia de oxigen dizolvat

n culturile aerobe, este esenial s se realizeze dizolvarea n mediu a ntregii cantiti de


oxigen necesare microorganismului n orice moment al fermentaiei, prevzndu-se n general un
oarecare exces fa de nevoi. De aceea se urmrete n general obinerea unor aerri ct mai
eficiente, transferul de oxigen din faza gazoas n faza lichid (mediul de fermentaie) avnd loc
cu viteze mari. n cazul n care procesul de biosintez se desfoar n laborator la flacoane
agitate, aerarea depinde de urmtorii parametrii: viteza de rotaie sau translaie a agitatorului,
mrimea flacoanelor Erlenmayer, volumul de mediu de cultur din flacon, creterea turbulenei
prin icane.
Eficiena aerrii unui mediu de cultur este reflectat de concentraia de oxigen dizolvat.
Alegerea parametrilor sistemului de aerare este determinat de necesitatea furnizrii unei cantiti
de oxigen suficient pentru a asigura o valoare maxim a activitii metabolice n reactoarele de
biosintez; n acest caz, un anumit microorganism i un anumit mediu de cultur se caracterizeaz
printr-o rat de utilizare a oxigenului specific. Pentru conducerea unui proces este esenial
cunoaterea exact a modului de variaie n timp a necesarului de oxigen i a ratei consumului de
oxigen.
Rata consumului de oxigen sporete rapid pn la o valoare maxim nc din primele
stadii ale procesului de biosintez, scznd apoi. Valoarea maxim a ratei de consum a
oxigenului coincide de obicei cu momentul atingerii unei concentraii ridicate de celule
microbiene. Necesarul de oxigen al culturii este influenat de mediul de biosintez utilizat (de
sursa de carbon. De exemplu, la fungii din genul Penicillium, necesarul de oxigen este dublu la
utilizarea glucozei ca surs de carbon fa de zaharoz.
Ali factori care influeneaz transferul de O2 sunt :
Agenii tensioactivi din mediul de cultur determin o micorare a coeficienilor de
transfer;
Densitatea celular: la concentraii ridicate vscozitatea mediului crete iar eficiena
sistemului de aerare scade, bulele tinznd s circule prin canale prefereniale, cu rezisten
redus la naintare ;
Sistemul de agitare al bioreactorului influeneaz sensibil concentraia oxigenului
dizolvat: o agitare eficient a mediului de cultur conduce la o dispersie corespunztoare
a bulelor de aer i deci la mrirea coeficientului de transfer a oxigenului;
Echipamentul de aerare utilizat permite obinerea unei dispersii uniforme a bulelor de aer;
Suprapresiunea favorizeaz mrimea concentraie de oxigen n mediul de cultur: n
general procesele biotehnologice sunt conduse la suprapresiuni cuprinse ntre 0,5 1 atm
(n scopul micorrii riscului de infecie).

14

CAPITOLUL 3
PRELUCRAREA MEDIILOR DE CULTURA IN SCOPUL IZOLARII SI PURIFICARII
PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

nainte de a fi purificate, substanele organice obinute pe cale biotehnologic sunt izolate


din lichidul de cultur (dac sunt extracelulare) sau din biomas (dac sunt intracelulare) ntr-o
form parial purificat aplicnd metode de separare general valabile pentru toate produsele de
biosintez.
Prelucrarea primar a mediilor de biosintez cuprinde o serie de operaii cum ar fi:
filtrarea, centrifugarea, decantarea, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor, extracia,
uscarea, atomizarea, precum i procese mai specifice de tipul precipitrii cu solveni sau cu sruri
anorganice, purificrii i concentrrii prin ultrafiltrare.
Echipamentele industriale implicate sunt complexe i specifice. Schema de flux variaz
de la un preparat la altul, n funcie de tehnologie.
Separarea produselor din lichidul rezultat din fermentaie, constituie o problem dificil,
indiferent de procedeul aplicat. Dificultile provin din faptul c produsele biologic active
obinute n general prin biosintez sunt substane termolabile, ceea ce impune evitarea degradrii
sau modificrii chimice a acestora. Pentru a alege cea mai adecvat metod de separare a
produselor biosintetizate, este necesar s se cunoasc proprietile fizico chimice a acestora i
anume:
Solubilitatea :
o n ap sau n soluii diluate de sruri ;
o n solveni polari (metanol, etanol, aceton) ;
o n solveni slab polari (cloroform, hidrocarburi) ;
Stabilitatea n soluie :
o n funcie de pH ;
o efectul temperaturii ;
o efectul soluiilor tampon ;
o efectul solvenilor organici ;
Stabilitatea n stare solid n funcie de temperatur precum i efectul umiditii asupra
produsului ;
Proprieti fizice :
o dializabilitate prin membrane ;
o adsorbia pe suprafee solide ;
o migrarea n cmp electric ;
o sedimentarea n ultracentrifuge ;
Proprieti chimice :
o stabilitatea fa de diverse enzime ;
o stabilitatea la aciunea unor ageni chimici.
Pentru separarea produsului din mediile de biosintez se aplic n general urmtoarele
metode: extracia cu solveni organici; separarea pe schimbtori de ioni; cromatografie; adsorbia.
In industria de biosintez exist ns metode de prelucrare integral a mediului de
cultur prin aplicarea diferitelor metode de uscare, produsul rezultat fiind utilizat ca atare. Acest
mod de prelucrare a mediilor de biosintez este mult aplicat n tehnologia aditivilor furajeri
(coninnd aminoacizi, enzime, vitamine).

15

3.1. Filtrarea mediilor de biosintez


Fa de filtrarea substanelor chimice, filtrarea mediilor de biosintez ridic adesea
probleme datorit compoziiei chimice deosebit de complexe a mediilor i apariia materialului
biologic (bacterii, fungi) care complic fenomenul. Operaia de filtrare a mediilor de biosintez
este adeseori uurat prin utilizarea adjuvanilor de filtrare care formeaz n cursul operaiei
straturi microporoase micornd diametrul aparent al porilor i implicit mrind eficiena de
colectare prin reinerea unor particule de diametru mai sczut. Utilizarea lor industrial conduce
la mrirea vitezei de filtrare i reducerea consumurilor de materiale.
O variant a operaiei de filtrare mult utilizat n biotehnologie este filtrarea sterilizant.
La prelucrarea suspensiilor se execut nti o prefiltrare grosier, urmat de filtrarea sterilizant
propriu zis. Pentru filtrarea sterilizant se monteaz n filtru plcile (din acetat de celuloz,
azbest sau polimeri sintetici) cu diametru redus al porilor, executnd apoi n mod normal operaia
de filtrare.
3.2. Dezagregarea celulelor de microorganisme
Cnd substanele biologic active care intereseaz i care s-au format n cursul procesului
de biosintez sunt intracelulare este necesar distrugerea membranei celulare semipermeabile i a
peretelui protector n vederea recuperrii componentelor respective. Aceast operaie se
realizeaz prin procedee de dezagregare. Dup natura agentului de dezagregare utilizat,
procedeele de dezagregare ale celulelor microbiene se clasific n :
- procedee mecanice
- procedee fizice nemecanice
- procedee chimice
- procedee enzimatice.
Procedeele mecanice cuprind dezagregarea celulelor n mori coloidale sau n mori
vibratoare, meninnd un anumit raport de recirculare, pn la dezagregarea total a celulelor
microbiene; n timpul operaiilor de dezagregare mecanic are loc o cretere a temperaturii
materialului biologic. Evitarea acestui fenomen i meninerea sistemului la o temperatur
acceptabil se efectueaz prin circulaia unui agent de rcire prin mantaua aparatului.
Dezagregarea celulelor de microorganisme prin procedee fizice nemecanice se poate
efectua prin decomprimare rapid, prin ngheare lent (datorit sporirii volumului apei la
trecerea n stare solid) sau prin oc osmotic. Un procedeu deosebit de eficace este aplicarea de
vibraii ultrasonice suspensiei de celule. Vibraiile cu frecvene de cca. 20.000 Hz determin
dezintegrarea celulelor microbiene.
Dezagregarea celulelor microbiene prin procedee chimice cuprinde distrugerea
componentelor lipoproteice ale membranei celulare prin aciunea detergenilor cationici sau
anionici sau a solvenilor organici, determinnd trecerea n faza lichid a unora din componentele
biologic active.
Dezagregarea celulelor microbiene poate fi efectuat i prin tratarea acestora cu diferite
preparate enzimatice. Astfel, liza celulelor bacteriene poate fi indus prin atacul enzimatic
specific al legturilor -1,4 dintre moleculele de N-acetilglucozamin i acidul N-acetilmuramic.
Dezintegrarea biologic enzimatic este una din cele mai vechi metode de obinere a
omogenatelor celulare. Cel mai cunoscut exemplu este cel al descompunerii autolitice a drojdiei
de bere uscat la 30C, timp de 23 zile. Dezintegrarea celulelor de Micrococcus lysodeikticus
poate fi realizat cu suc pancreatic; distrugerea esutului muscular poate fi produs cu enzime
16

proteolitice izolate din Bacillus subtilis, iar dezintegrarea biologic a E.coli poate fi realizat cu
bacteriofagi litici.
3.3. Concentrarea mediilor de biosintez a enzimelor
Mediile de biosintez se concentreaz prin operaii specifice industriei chimice, cu
deosebirea c este necesar protejarea lichidelor biologice datorit permeabilitii acestora. Se
utilizeaz adeseori evaporarea n vacuum care permite efectuarea operaiei la temperaturi relativ
sczute (25 50C). In ultimul timp se practic cu succes procedeele de concentrare atermic,
ultrafiltrarea i osmoza invers.
Concentrarea prin ultrafiltrare. Ultrafiltrarea reprezint procesul de separare a
componentelor unei soluii datorit diferenelor de volum molecular cu ajutorul unei membrane.
Ultrafiltrarea este un procedeu de separare i purificare a substanelor biologic active, avnd
urmtoarele avantaje:
permite efectuarea concentrrii la temperaturi sczute micornd fenomenele de
autodigerare i pierderile n activitate prin denaturarea termic.
nu necesit modificri de faz (evaporri, condensri).
nu utilizeaz substane chimice.
permite purificarea soluiilor biologic active prin ndeprtarea unor componente cu
volum molecular inferior.
Cercetrile privind introducerea proceselor cu membrane, urmresc n general, stabilirea
posibilitilor de utilizare eficient a unor tipuri de membrane la concentrarea i purificarea
produselor biologic active, n cadrul elaborrii tehnologiilor de obinere a acestora. Dintre
aplicaiile ultrafiltrrii, cele din domeniul biotehnologiei ocup un loc major, metoda fiind
utilizat ades la concentrarea i purificarea enzimelor de origine microbian.
De exemplu, n procesul de izolare i purificare a enzimelor, una din etape o constituie
demineralizarea soluiei enzimatice; aceast operaie are loc n paralel cu concentrarea prin
ultrafiltrare ntruct ionii anorganici avnd volum mic trec prin membrana de ultrafiltrare; astfel,
aplicarea metodei de concentrare prin ultrafiltrare a soluiilor enzimatice conduce la eliminarea
operaiei de dializ, efectuat n mod obinuit ntr-un flux de purificare.
Uscarea prin atomizare a mediilor de fermentaie cu activitate enzimatic. Uscarea
prin pulverizare se folosete pentru materialele care n faza iniial sunt lichide (soluii, suspensii,
paste subiri). Acestea, n vederea uscrii sunt pulverizate n particule de dimensiuni mici. Prin
pulverizare la dimensiuni mici se nelege obinerea unei suspensii de lichid constituit din
particule de dimensiuni ntre 2 i 200 m.
Dat fiind dimensiunile particulelor, operaia a fost denumit i atomizare; n usctoarele
cu pulverizare, uscarea are loc foarte repede, astfel nct, materialul nu are timp s se nclzeasc
peste limita admisibil i temperatura lui este apropiat de temperatura de evaporare a lichidului.
Materialul uscat se obine sub form de pulbere i nu este necesar o mrunire ulterioar.
Metoda este aplicat n general n condiionarea enzimelor de mare tonaj, utilizate n hrana
animalelor ca aditivi furajeri (proteaze, amilaze, celulaze) i se realizeaz prin atomizarea
integral a mediului de cultur fr o alt purificare.

17