TEHNICA IZOLRII

BACTERIILOR N
CULTUR PUR

 Din materialul patologic din care se fac nsmnri

n vederea precizrii diagnosticului, se izoleaz deseori
mai multe specii bacteriene (infecii cu evoluie mai
lung cnd peste germenul primar se supune flor de
asociaie; infecii asociate; probe vechi, invadate de
flor de putrefacie; recoltare necorespunztoare a
probelor).
La acestea se adaug i efectuarea incorect a nsmnrilor
cnd mediile se pot contamina cu germeni din mediul exterior.
n asemenea situaii este important a se obine n cultur pur
fiecare dintre aceti germeni i a stabili care din ei prezint
potenial patogen i poate fi incriminat ca agent etiologic al
unei mbolnviri.
Izolarea n cultur pur se poate obine prin procedee
mecanice, fizice, chimice i biologice.

Metode mecanice de
izolare
Se bazeaz pe mprtierea (dispersia) materialului cu
flor bacterian mixt pe suprafee ct mai mari de mediu
solid astfel nct s se obin colonii izolate. Dispersia se
poate face pe suprafaa agarului nclinat din tuburi sau n
plcile Petri.
n tuburi cu agar nclinat - se procedeaz la nsmnarea
primului tub prin plimbarea ansei n zig-zag pe suprafaa mediului
pornind de la partea inferioar spre cea superioar. Fr a steriliza
ansa, se nsmneaz n mod identic nc 2-3 tuburi pn la
epuizarea materialului de nsmnat.
n cazul agarului din plcile Petri, se procedeaz la efectuarea
mai multor linii paralele pe ntreaga suprafa sau executarea de
linii dense urmrind laturile unui pentagon imaginar. n acest mod
de lucru, pe primele laturi coloniile vor fi dense, iar pe celelalte
laturi din cauza epuizrii materialului patogen se pot obine colonii
izolate. Dup incubaie, acestea pot fi uor examinate i repicate n
alte medii de cultur, permind obinerea unei culturi pure pornind
de la o colonie izolat.

 Dup alte metode:

se recurge la o diluare a materialului de examinat n
mai multe tuburi cu bulion sau ser fiziologic steril
efectund diluii succesive. Din ultimul tub (diluia
cea mai mare) se fac nsmnri pe medii solide
(agar nclinat sau plci Petri).
n aceste condiii prin epuizarea materialului n anumite
zone se vor obine colonii izolate. Metodele mecanice nu
dau rezultate bune cnd dispersia nu s-a efectuat
satisfctor sau cnd n culturi sunt specii invadate ca
Proteus vulgaris care au tendina de a invada suprafaa
mediului fcnd imposibil izolarea altor germeni.

Diferite modaliti
de efectuare a dispersiilor

Efectuarea dispersiei dup diluarea materialului biologic

Numrtor electronic de colonii

Metode fizice de izolare

Se folosesc pentru izolarea bacteriilor sporulate.
materialul de examinat se nsmneaz ntr-un mediu
favorabil sau n ser fiziologic steril.
Tubul se nclzete la 70-800C timp de 15-20 min. la o baie de
ap, timp n care se inactiveaz bacteriile nesporulate (formele
vegetative) rezistnd cele sporulate. Dac nclzirea s-a fcut
n ser fiziologic, din acesta se fac nsmnri pe medii de
cultur. Tuburile se introduc la termostat la 370C timp de 18-24
ore.
Dac mediile rmn sterile nseamn c n materialul examinat
au existat numai forme vegetative care s-au distrus prin nclzire
Dac n materialul au existat i forme sporulate, acestea au
rezistat procesului de nclzire i fiind puse n condiii prielnice de
mediu s-a transformat n forme vegetative care s-au multiplicat
rezultnd cultura.

Metode chimice de izolare

Au n vedere capacitatea unor germeni
de a supravieui n contact cu unele
substane chimice care sunt nocive
pentru alte grupe de microorganisme.
Aceast proprietate o au ndeosebi bacteriile
din genul Mycobacterium care sunt acidoalcoolo-rezistente.
Tratarea materialului patologic se poate
face dup mai dup mai multe tehnici:

 Metoda Saenz Costil.

Din materialul suspect se iau 1-2g care se tritureaz
ntr-un mojar steril.
Se adaug 2-3 ml acid sulfuric diluat, care se las n
contact cu materialul de cercetat timp de 20-30
min.,
Se face neutralizarea cu NaOH, n prezena tincturii
de turnesol (steril) ca indicator.
nsmnrile se fac imediat dup neutralizare pe
mediul Lowenstein Jensen folosind 10-15 picturi
pentru un tub.

 Metoda Petroff.
Materialul de examinat (1-2g) se tritureaz ntr-un
mojar steril n pri egale cu o sol. de hidrat de sodiu
timp de 30 min. la 370C.
Amestecul se centrifugheaz pentru mbogire, iar
depozitul se neutralizeaz cu acid clorhidric 10-15%
n prezena unui indicator (tinctur de turnesol sau
soluie de albastru de bromtimol).
Se nsmneaz mai multe tuburi de cultur cu
mediul Lowenstein Jensen.

 Metoda Targnet.
Inactivarea materialului patologic se face cu NaOH,
dar n amestec cu lauryl sulfat de sodiu.
Amestecul se centrifugheaz, iar depozitul se
neutralizeaz cu un amestec steril preparat din 1,5
ml acid fosforic i 2 ml bromcrezol purpur la 1000 ml
ap distilat.
Dup neutralizare se face o nou centrifugare, iar
din sediment se vor efectua nsmnrile.

 Metoda flotaiei.
Se procedeaz la omogenizarea materialului
patologic ntr-o soluie de NaOH.
Dup inactivare, amestecul se introduce ntr-un
balon Erlenmayer i se omogenizeaz cu 1-2 ml
toluen sau xilol agitnd bine.
Se adaug NaOH pn cnd nivelul amestecului
ajunge la gtul balonului, solvenii ridicndu-se la
suprafa antreneaz i mare parte din bacilii aflai
n suspensie.
Se las n repaus 1-2 ore, apoi cu pipeta Pasteur se
aspir material de la limita de contact dintre solvent
i sol. de NaOH, se efectueaz nsmnri n mai
multe tuburi.

Metode biologice de
izolare
inocularea cu flor mixt la un animal receptiv,
animalul ndeplinete rolul unui filtru biologic reuind s
distrug la poarta de intrare bacteriile saprofite nepatogene.
nu sunt mpiedicate bacteriile patogene care reuind s
nving starea de rezisten a organismului provoac
modificri la poarta de intrare, urmate sau nu de generalizarea
procesului infecios.
n unele cazuri se produce moartea animalului inoculat.

Precizm c trebuie inut seama de sensibilitatea la

infecia respectiv a animalului ales pentru inoculare,
de calea de inoculare i doza de material patogen
administrat.
Dup moartea animalului, prin examen bacteriologic
trebuie s se reizoleze pe medii de cultur germenul
respectiv aceasta fiind dovada patogenitii sale.

Metode de izolare bazate pe

unele particulariti
fiziologice ale bacteriilor
Metoda Gray.
folosit pentru izolarea Listeriei monocytogenes.
Metoda se bazeaz pe constatarea c germenul
este criotolerant, multiplicndu-se n mod lent la
+40C, temperatur la care alte bacterii nu se
multiplic.
n aceste condiii, materialul patologic se stocheaz
la rece timp de 1-3 sptmni interval n care se
mbogete n listerii. nsmnrile efectuate la
diferite intervale de timp permit izolarea listeriilor.

 Metoda termotoleranei.
identificarea diferitelor specii de Campylobacter,
dar are aplicaii i la alte specii.
pentru C. jejuni/coli, creterea optimal se obine la
42-430C, ndeosebi la izolare. Pentru ntreinerea
ulterioar se poate face incubarea i la 370C,
speciile amintite nu cresc la 250C.
Alte specii cum ar fi C. fetus i C. veneralis nu se
dezvolt la 42-430C, dar se multiplic i dau cultur
vizibil prin incubare la 370C i la 250C.

 Metoda bazat pe capacitatea diviziunii

accelerate.
Unele bacterii cum ar fi Pasteurella multocida, Cl.
perfringens, Vibrio cholerae au capacitatea de
multiplicare rapid, durata unei generaii fiind de 5-6
minute, n timp ce majoritatea bacteriilor efectueaz
o diviziune la 20-30 minute.
Pentru a izola germenul cu multiplicare rapid, se
vor efectua re-transplantri la fiecare 4-6 ore ceea
ce va permite izolarea acestuia n cultur pur.

Metode de izolare bazate pe

folosirea unor substane cu
rol inhibant sau selectiv
Aceste metode se bazeaz pe capacitatea inhibant
sau selectiv a unor substane (chimice, sulfamide,
aminoacizi, colorani) care adugate mediilor de cultur
n anumite concentraii pot favoriza sau pot inhiba
dezvoltarea unor bacterii permind astfel izolarea n
cultur pur a celor care tolereaz sau au nevoie de
unele din acele substane.
EX.
Clorura de sodiu se adaug n mediile pentru izolarea
stafilococilor,
factorul X i/sau V favorizeaz creterea hemofiliilor,
cistina este un factor esenial pentru dezvoltarea franciselelor,
niacina este absolut necesar pentru campilobacter,
penicilina se introduce n mediile pentru izolarea micoplasmelor,
unele substane colorante n mediile pentru izolarea brucelelor
etc.