Sunteți pe pagina 1din 3

EVIDENIEREA CARACTERULUI KILLER LA DROJDII

Drojdiile reprezint un grup de microorganisme eucariote cu organizare unicelular.


Dintre drojdii, un model experimental pentru majoritatea studiilor biologice este Saccharomyces
cerevisiae.
Una dintre caracteristicile multor tulpini de drojdii, asociat cu un determinism genetic
extracromosomal, este sinteza unor toxine glicoproteice capabile de a omor alte tulpini nrudite
(caracterul killer) fa de care tulpina productoare este imun. Fenomenul a fost descoperit
pentru prima oar n 1963 la S. cerevisiae, ulterior fiind descris i la alte genuri i specii de
drojdii. n prezent se cunosc 11 tipuri de toxine killer biochimic diferite, produse de diverse
genuri de drojdii. Activitatea killer la S. cerevisiae a fost mprit n trei tipuri: K1 (specific
tulpinilor de laborator), K2 i K3 (specifice tulpinilor utilizate n procesele tehnologice de
fabricare a berii i vinului).
n cazul tulpinilor de S. cerevisiae ce manifest acest fenotip, s-a dovedit c ele conin n
citoplasm una sau mai multe specii moleculare de virusuri ARN dublu catenar (ARN d.c.).
Aceste molecule prezint foarte multe similariti cu virusurile ARN d.c. de la organismele
eucariote superioare, motiv pentru care virusurile de acest tip de la S. cerevisiae constituie un
model de studiu pentru descifrarea mecanismelor ce guverneaz replicarea viral, transcrierea
ADN-dependent precum i relaiile dintre funciile virale i cele ale gazdei .
Virusurile ARN d.c. de la drojdii includ 3 familii de genomuri ARN d.c.: L-A, L-BC i
M. Particulele M codific pentru toxina killer i factorul de imunitate, iar particulele L codific
pentru proteinele capsidale M i L, polimeraze necesare replicrii ambelor tipuri de genomuri i
au i rol de helper n procesele de infecie. Particulele killer de la Saccharomyces cerevisiae sunt
alctuite din genom ARN dublu catenar ncapsidat n particule de tip viral - virus like.
Toxina killer este sintetizat sub forma unui precursor format din trei subuniti: , , .
Subunitile i vor forma toxina killer, iar subunitatea va forma factorul de imunitate.
Dup sintez, precursorul toxinei este este transportat la nivelul reticulului endoplasmic unde au
loc modificri post-translaionale de tipul glicozilrii. n cursul transportului, precursorul este
fragmentat n subunitile corespunztoare sub aciunea unor proteaze specifice.

Modul de aciune al toxinei killer


1

Proteina killer recunoate i se leag la nivelul unui receptor specific localizat la suprafaa
peretelui celular al celulelor sensibile. La acest nivel toxina este scindat proteolitic n cele dou
subuniti, n interiorul celulelor ptrunznd numai subunitatea .
Efectul letal al toxinei se datoreaz formrii unor pori ireversibili la nivelul membranei
plasmatice prin care celula pierde o serie de constitueni eseniali.
Semnificaia biotehnologic a fenomenului killer
Caracterizarea taxonomic a anumitor specii sau tulpini de drojdii - biotipare;
Caracterul killer poate constitui factor de selecie n experimentele de transfer de material
genetic, inclusiv n fuziunile de protoplati;
Pentru protecia proceselor de fermentaie pentru obinerea vinului.

Protocol de lucru
Pentru evidenierea caracterului killer la S. cerevisiae se utilizeaz:
-

tulpini de S. cerevisiae X141 i 17 /17 - standard sensibile la toxina killer;

tulpini de testat (poteniale killer) de S. cerevisiae: SMR, 9714 i X208.

Tulpinile sensibile (obinute dup o cultivare pe mediu YPG lichid timp de 24 h la 30 0 C)


se nsmneaz n pnz, pe mediu K ce conine:
-

tampon citrat fosfat 0,1 M, pH 4,8;

glucoz 2 % ;

extract de drojdie 1%;

pepton 1%;

agar 2%;

albastru de metilen, 0,03 0,07 %.

Apoi , pe aceleai plci, se nsmneaz n spot tulpinile poteniale killer. Se noteaz pe


plci numele tulpinilor. Plcile se incubeaz 48 de ore la 20 22

C (la temperaturi mai mari

toxina killer de la S. cerevisiae se inactiveaz).


Interpretarea rezultatelor: n jurul tulpinilor killer tulpina sensibil nu se dezvolt; la
limita zonei de inhibiie, se observ o zon n care celulele tulpinii sensibile se coloreaz n
albastru nchis deoarece sunt moarte, fapt ce permite ptrunderea colorantului.

Celulele vii sunt albe (incolore) deoarece metabolizeaz colorantul, n timp ce celulele
moarte sunt albastre pentru c nu pot degrada colorantul.

Mod de lucru
1. Se utilizeaz diferite tulpini de S. cerevisiae, crescute n mediu YPG lichid, timp de 18 ore la
30C ;
2. Se inoculeaz tulpina sensibil prin inundare, 1ml suspensie n plci Petri cu mediu selectiv,
agarizat (conine colorant vital - albastru de metilen). Se aspir excesul;
3. Plcile inoculate dup ndeprtarea surplusului de suspensie sunt meninute 15 minute la
temperatura camerei pentru ca suprafaa mediului s se usuce;
4. Tulpinile considerate killer se inoculeaz cu ansa n striuri;
5. Plcile inoculate sunt meninute la temperatura camerei, deoarece toxina killer este
termolabil;

S-ar putea să vă placă și