Sunteți pe pagina 1din 69

Metode de mrire a

contrastului
vs.
Tehnici microscopice
(I)

Metode de mrire a contrastului

Iluminare n cmp luminos (Bright Field)


Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)
Intensificarea culorilor
Folosirea filtrelor
Microscopie n lumin polarizat
Contrast de faz
Contrast interferenial
Microscopie de fluorescen
Iluminare oblic
Creterea contrastului prin modificarea temperaturii probei
Microscopie optica de baleiaj ce folosesc lasere
2

Principiu

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)

contrastul n eantion este cauzat de diferena de absorban a componentelor


luminii transmis prin zonele de densiti optice diferite ale probei;
se produce o imagine ntunecat pe un fundal luminos.

Caracteristici
iluminarea probei este prin transmisie (proba
este iluminat de jos si observat de sus sau
invers n cazul microscopului optic inversat);
are mai multe lentile obiectiv;
sistem optic (microscop) parfocal - rmne
aproximativ focalizat atunci cnd este schimbat
mrirea (cnd obiectivele sunt schimbate);
mrire total - produs de mriri a lentilelor
ocular i lentil obiectiv.

http://en.wikipedia.org/wiki/Bright_field_micro
scopy

Seciune transversal a esutului


vascular printr-o tulpina de plant.

Nu sunt necesare componente suplimentare, fa de configurarea unui


microscop optic obinuit!

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)
Performane
Microscopia n cmp luminos este o tehnic standard de microscopie optic i prin
urmare mrirea este limitat de puterea de rezoluie posibil, dependent de
lungimea de und a componentelor luminii vizibile.

Cu ct lungime de und este mai mic cu att rezoluia este mai mare!
Contrast sczut n cazul probelor care au aceeai absorban pentru toate
componentele acesteia.
cmp luminos

lumin polarizat

cmp ntunecat

contrast de faz

Compararea tehnicilor de iluminare prin transmisie utilizate pentru a genera contrast ntr-un
4
eantion de hrtie

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)
optimizarea imaginii: adncimea de cmp i adncimea de
focalizare
Natura ondulatorie a luminii i implicit
fenomenul de difracie determin ca imaginea
unui obiect punctual s fie un disc cu diametrul
de difracie finit (disc Ainry).
Aceleai legi stabilesc c discul are o grosime
msurabil de-a lungul axei z (axa optic a
microscopului).
Adncimea de cmp Z n planul obiect se
refer la grosimea seciunii optice de-a lungul
axei z n care obiectele din prob sunt
focalizate, adncimea de focalizare
reprezentnd grosimea planul imagine.

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)
optimizarea imaginii: un compromis ntre rezoluie spaial i
contrast
Astfel,
- cu ct este mai mare unghiul de
deschidere (apertura numerica, NA,
este mai mare),
cu att mai mai mare va fi mrirea;
cu att mai mai mic va fi puterea de
rezoluie;
-cu ct mai mai mic va fi distana
focal
cu att mai mai mare va fi profunzimea
(adncimea) cmpului vizual.
Conceptul de adncime de cmp este evident n cazul folosirii unei camere foto.
Lentilele cu distana focal mic i raport focal <f / 4 (rapide), au o adncime a
cmpului redus, n timp ce lentilele cu distana focal mare i raport focal f/16 6
(lente), au adncime a cmpului relativ mare.

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)
optimizarea imaginii: un compromis ntre rezoluie spaial i
contrast - Microscopie optica de baleiaj ce folosesc lasere

La cealalta extrem s-a dezvoltat tehnica pinhole orificiu ac, care are NA infinit de
mic i o adncime de cmp infinit de mare. In acest caz extrem toate obiectele, att
din apropiere ct i cele deprtate, sunt simultan focalizate. Tehnica este utilizat in
7
microscopia confocal.

Iluminare n cmp luminos


(Bright Field)
nbuntirea imaginii
Micorarea/mrirea intensitii luminii, prin intermediul
diafragmei iris.
Observarea probelor folosind tehnica "n imersie", folosind
obiective de imersie n ap sau ulei i respectiv ap/uleiuri
de imersie adecvate cu preteniile analizei.
Dac uleiul de imersie are indicele de refracie egal cu cel al
lamelei ce acoper proba se va mbuntii rezoluia!
Utilizarea de metode de colorare a probelor;
Utilizarea filtrelor de culoare (de obicei albastru);
Utilizarea filtrelor de polarizare a luminii pentru a evidenia
caracteristici care nu sunt vizibile n lumin alb.
8

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)


Principiu
contrastul n eantion este realizat prin iluminarea probei cu raze de lumin care
nu vor fi colectate de lentila obiectiv i prin urmare nu vor face parte din imagine;
se produce aspectul clasic al unui ntuneric - fundal aproape negru, cu obiecte
luminoase.

Drumul optic
Un disc special blocheaz razele, provenite de la
sursa de iluminare pe direcia axei optice a
microscopului, permind trecerea luminii numai
printr-un inel exterior.
Lentila condensor concentreaz lumina spre
proba.
Lumina intr n eantion. Cele mai multe raze sunt
transmise direct, n timp ce unele sunt mprtiate de
eantion.
Lumina mprtiat (difuz) intr n lentil obiectiv,
n timp ce lumina transmis direct nu este colect.
Numai lumina difuz (undele difractate de ordinul
nti i cele de ordin superior) particip la formarea
imaginii, n timp ce lumina transmis direct (undele
difractate de ortinul zero) lipsesc.

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)


Pentru a se asigura c razele care provin de la condensor cad ct mai oblic posibil
pe prob, trebuie s se ridice condensorul ct mai sus sub prob i diafragma
obiectiv s fie deschis la capacitate maxim.
Pentru aceasta se lucreaz n imersie cu ap sau ulei ntre condensor i lamela de
sticl ce acoper proba.
Datorit refraciei, la trecerea din lamel razele de lumin vor fi deviate la ungiuri
mai mari dect cele de inciden, dac lamelal are indicele de refracie mai mare
dect cel al apei/uleiului.
Apa este folosita pentru mai mult confort; imersia n ulei este folosit pentru o
rezoluie mai bun.

10

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)


Microscopia in camp intunecat este cea mai potrivit pentru contururi
revelatoare i margini (limitate de obiecte). Este mai puin util pentru
detalii revelatoare interne din celule, cu excepia cazului n care exist o
mulime de organite foarte refractile ntr-un citosol relativ transparent.
Cu ct razele de lumin cad mai oblic pe prob cu att mai uor este de
a detecta prezena obiectelor foarte mici.

cmp luminos

cmp ntunecat

11

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)

Seciune transversal a unui bulb de srm de cupru pe aluminiu decapat;


imagine in camp intunecat.
12

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)

Seciune aliaj Cu-Au decapat; imagine in camp intunecat.


13

Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)


De multe ori
Microscopia in
camp intunecat
se utilizeaz
pentru a
vizualiza
particule a cror
dimensiune este
mult mai mic
dect limita de
rezoluie.
Cum este posibil
acest lucru?
Nu lungimea de
unda a luminii
limita
dimensiunea
unei particule pe
care o putem
vedea?

Nanoparticule de aur.

R: Nanoparticulele metalice imprastie lumina ce cade pe ele, acestea formand


un hallow de 100 de ori mai mare decat dimensiunea lor.

14

Filtre pentru reglarea intensitii i a lungimii


de und a radiaiei de iluminare
Sunt calibrate n uniti de absorban sau densitate optic (DO):
unde, T este de coeficientul de transmisie:
T = I/ I0 (intensitatea luminii transmise / intensitatea luminii incidente).

Flux incident (I0)

Flux transmis (I)

Tipuri:
filtre neutre (gri) - au densitatea optic neutr (nu depinde de lungimea de
und). Sunt de absorbie sau reflexie i atenueaz uniform (regleaz)
intensitatea luminii;
filtre colorate (densitatea optic depinde de lungimea de und) i
filtre de interferen, sunt folosite pentru a izola anumite culori sau benzi cu
anumite lungimi de und.

Filtrele colorate i filtrele de interferen


Exist dou clase de filtre
care selecteaz lungimea de
und a radiaiei transmise:
1. filtre de margine
trece jos
trce sus
2. filtre de band
Filtrele de band sunt descrise prin specificarea lungimi de und de vrf i prin
semilrgimea benzii de trecere (FWHM).
Filtru cu band de trecere la 630 nm

Sursa de lumin alb

Lumin transmis

FWHM 620 -640 nm

Filtrele colorate i filtrele de interferen


520 nm Filtru trece-sus
Surs de lumin

Lumina transmis

>520 nm Lumina

575 nm Filtru trece-jos


Surs de lumin

Lumina transmis

<575nmLumina

Filtrele colorate i filtrele de interferen


510 LP oglinda dicroic

Filtre Dichroice/Oglinda la 45
Surs de lumin

Lumina transmis

Lumin reflectat

Microscopie n lumin polarizat


Lumin plan i circular polarizat

Vectori
E

Polarizor

O surs de lumin este de obicei alctuit dintr-o


multitudine de emitori orientai aleator, iar
lumina emis este o grupare de unde cu toate
orientrile posibile ale vectorilor E.
Lumina plan polarizat se poate obine prin
trecerea luminii printr-un polarizor care transmite
lumina orientat dup un singur plan, de exemplu
las s treac doar unde care au direcia vectorului E
orientat paralel cu axul polarizorului.
Lumina circular polarizat: Vectorii E a dou
unde electromagnetice cu din lungimea de und
sunt defazate i perpendiculare. Vectorul care este
suma celor doi vectori E ai undelor se rotete astfel
nct vrful lui urmeaz o traiectorie helicoidal.

Microscopie n lumin polarizat


Examinarea interaciunii luminii plan-polarizat cu materia este posibil cu
ajutorul microscopiei n lumin polarizat.
Formarea imaginii n microscopia cu lumina liniar polarizata se bazeaz pe
capacitatea unic a luminii polarizate de a interaciona cu legaturile chimice din
molecule ce prezinta un anumit grad de ordonare.
Perturbatiile undelor de lumin polarizat datorita ordonarii moleculare au ca
rezultat intarzierea de faz a fascicolului ce strabate proba, care, la rndul su,
permite modificri n amplitudinea maximelor de interferenta n planul imaginii.
Astfel, formarea imaginii va contine informatii referitoare la modul de realizare a
conditiilor de difracie i interferen si suplimentar, informatii cu privire la
existena unor mecanisme moleculare ordonate.
Gradul de ordonare al ansamblurilor moleculare
variaz de la structuri cu ordonare aproape
perfecta (domenii cristaline) la zone dezordonate
(domenii amorfe) ale asociaiilor de molecule
asimetrice sau ansambluri moleculare.
20

Microscopie n lumin polarizat

Microscopul cu lumina polarizata este un


microscop optic compus care in principal
contine suplimentar un sistem de 2 polarizori
intercalati in drumul optic al fascicolului de
lumina intre sursa si condensor (polarizorul)
si intre obiectiv si oculare (analizorul) avand
posibilitatea sa se roteasca unul in raport cu
celalalt.
21

Microscopie n lumin polarizat


Analizor

Polarizor
(tub intermediar)

(controler pentru
lentilele Bertrand)

(vernier gradat
pentru orientarea
polarizorului)
(compensator plat)

(fata lentilei)

(lentile Bertrand)
(polarizor)

(controler
polarizor)

(controlul numeric
al aperturii)

(controlerul de (polarizor)
orientare
a polarizorului)

(apertura
diafragmei)

22

Microscopie n lumin polarizat


(tuburi de observare)

(ocular)
(lentile Bertrand)

(tuburi intermediare)
(cadru)

(analizor)

(buton pentru
pornire/oprire)

(mas rotativ)

(control pentru reglarea


intensitii lmpii)

(condensor)
(polarizor)
(lentil de focalizare)

(buton pentru
reglarea focalizrii)

(lamp de halogen
cu tungsten)
(asiu)

23

Microscopie n lumin polarizat


Analizorul nlturat din
drumul optic = lumin
plan polarizat;
d probei
culoare adevrat
Analizorul intercalat n Fibr de poliester n
drumul optic = polarizori lumin plan-polarizat
n cruce;
d probei
culoare de interferen

Fibr de poliester n
lumin eliptic-polarizat

24

Microscopie n lumin polarizat


mbuntirea contrastului probei prin
intensificarea culorilor
Ex: Fibre vegetale colorate

25

stnga - colorate;

dreapta - lumina polarizata

Microscopie n lumin polarizat


Birefringena

Ex:
Calcitul produce dou imagini atunci cnd este plasat peste un creion albastru.
Una dintre imagini apare n mod normal, ca atunci cnd se privete un obiect prin
sticl clar. Cealalt imagine a creionului apare deplasat din cauza naturii luminii
care este dublu refractat.
Atunci cnd cristalele anizotrope refract lumina, razele rezultate sunt polarizate i
se deplaseaz cu viteze diferite.
Una din raze se deplaseaz cu aceeai vitez n toate direciile prin cristal i este
denumit raz ordinar.
Celelalte raze se deplaseaz cu o vitez care depinde de proprietile structurale
ale cristalului i este denumit raz extraordinar.
26

Microscopie n lumin polarizat


Multe substane
cristaline sunt
birefringente

Analiza medico-legal a
componentelor solului

Multe fibre
sintetice sunt
birefringente

Analiza medico-legal a
fibrelor naturale/artificiale
27

Microscopie n lumin polarizat

Seciune transversal a unui cablu de aluminiu; imagine in lumin


polarizata
28

Metode de mrire a
contrastului
vs.
Tehnici microscopice
(II)

Metode de mrire a contrastului

Iluminare n cmp luminos (Bright Field)


Iluminare n cmp ntunecat (Dark Field)
Intensificarea culorilor
Folosirea filtrelor
Microscopie n lumin polarizat
Contrast de faz
Contrast interferenial
Iluminare oblic
Microscopie de fluorescen
Creterea contrastului prin modificarea temperaturii probei
Microscopie optica de baleiaj ce folosesc lasere
30

Iluminare n contrast de faz (Phase contrast)


Principiul contrastului de faz - obiecte amplitudine i obiecte faz
n iluminare monocromatic, folosind un filtru de
culoare complementar culorii obiectului
(specimenului) pe care dorim sa-l punem n
eviden, de exemplu, un obiect albastru examinat
printr-un filtru galben, razele de lumin provenite
de la obiect sunt semnificativ mai reduse n
amplitudine, rezultnd o imagine cu contrast
ridicat. Astfel de obiecte sunt numite obiecte
amplitudine, deoarece acestea produc n mod
direct diferenele de amplitudine n imagine, care
sunt detectate cu ochiul ca diferenele n
intensitate.
Dei specimenele biologice transparente nu absorb
lumina, ele cauzeaza o schimbare de faz n
razele de lumina care trec prin ele ce va influena
intensitatea maximelor de difracie a acestora,
astfel, acestea sunt numite obiecte faz.
31

Iluminare n contrast de faz (Phase contrast)


Terminologie i importana coerenei n cazul fenomenului de interferen
La trecerea printr-un obiect faza, frontul de
und incident este mprit n dou
componente: (1) o und nedeviat (de ordinul
zero), care trece prin prob, dar nu
interacioneaz cu ea (unda S), i (2) o und
deviat sau difractat (unda D), care este
mprtiat n mai multe direcii. Doar o
minoritate de unde incidente sunt difractate de
punctele obiect. Ambele unde S i D sunt
colectate de lentila obiectiv i focalizate n
planul imagine n punctul corespunztor cu
imaginea obiectului, unde vor fi supuse
interferenelor i vor genera o und rezultant
(unda P).

Doar atunci cnd amplitudinile


undelor P i S sunt n mod
semnificativ diferite n planul
imagine putem vedea obiectul
n microscop.

Aceast condiie este de mare importan practic pentru microscopia in contrast


de faz, pentru c formarea imaginii prin interferen constructiv i distructiv
necesit iluminare coerent, astfel nct: (1) o relaie de faz cert trebuie sa
existe ntre undele S i D, i (2) relaia de faz trebuie s se pastreze (sa fie
conservata) ntre obiect i imagine.

Iluminare n contrast de faz (Phase contrast)


Principiul contrastului de faz
Unde S i P, a cror intensitate relativ
determina contrastul vizual, sunt prezentate
ca linii continue, iar unda D (niciodat
observat n mod direct), este indicata cu
linie punctat.
Unda D este mai mic n amplitudine dect
unda S, pentru c exist mai puini fotoni
care genereaza unda D fata de cei care dau
unda S in punctul imagine. Observai c unda
D este ntrziat n faz cu / 4 n raport cu
unda S, datorit interaciunii sale cu particula
obiect. Unda P care rezult din interferena
ntre D i S este relativ retardata in raport cu
S, cu o cantitate mic ( / 20) i are o
amplitudine apropiata cu cea a undei S.
Deoarece undele S si P au aproape aceeai
amplitudine n microscopie in camp luminos,
nu exist nici un contrast n imagine i
obiectul rmne invizibil.

Daca lumina directa S i cea


difractata, D, pot fi spaial separate
n planul de difracie, exista
posibilitatea de a modifica selectiv
faza fie a undei S sau D ceea ce
va conduce la marirea contrastului.
33

Iluminare n contrast de faz (Phase contrast)


Sistemul optic al microscopului cu contrast de faz
Obiective: (1) de a izola razele S i D provenite de la
prob, astfel nct ele sa ocupe diferite locaii in planul de
difracie in spatele lentilei obiectiv, i (2) sa se devanseze
faza i sa se reduca amplitudinea undei S, n scopul de a
maximiza diferenele de amplitudine ntre obiect i fond n
planul imaginii.
Mecanismul pentru generarea intarzierii de faza este un
proces n dou etape: undele D sunt retardate cu / 4 de
catre punctele obiect, n timp ce undele S sunt devansate
n faz de ctre o lama de faz, poziionata n apropierea
sau n planul de difractie din spatele lentilei obiectiv.
Sunt necesare 2 componente:
- inelul de faza poziionat n faa condensorului, astfel
nct proba este iluminata de fasciculul de lumina ce
provine de la inelul transparent;
- lama de faz, este o plac de sticl cu un inel
(corodat) de grosime redusa pentru a avansa selectiv
faza undei S cu / 4. Acelai inel este acoperit cu un
strat de metal ce absoarbe parial lumina pentru ai
reduce amplitudinea cu 70 -75%.

34

Iluminare n contrast de faz (Phase contrast)


Sistemul optic al microscopului cu contrast de faz

35

Iluminare n contrast interferenial


(Interference contrast)
Principiul contrastului interfernial
Dac dou razele de lumin, ce provin de la aceeai surs punctual (unde
coerente) sunt suprapuse, are loc fenomenul de interferen.
Un interferometru imparte fasciculul de lumin incident provenit de la o surs
punctual n dou sau mai multe fascicule, care sunt suprapuse dup ce au
parcurs drumuri optice diferite.
Distingem dou moduri de contrast interfernial:
modul franjelor de interferena;
modul de contrast interferenial Nomarski (DIC).

36

Iluminare n contrast interferenial


Modul franjelor de interferena
n cazul unei probe omogene perfect plan i grosime constant, prin interferen
se obine un sistem de franje de egal lime i egal distan.
Orice modificare a grosimii probei, sau a indecelui de refracie, va produce o
modificare a drumului optic i implicit a diferenei de faz a undelor care interfer.
Efectul conduce la apariia unor modificri locale a limii franjelor de interferen
i a echidistanei dintre ele.

(a) = 0;

(b) = mare;

(c) = foarte mare.


37

Iluminare n contrast interferenial


Modul de contrast interferenial Nomarski
Realizeaz o nbuntire a definiiei zonelor cu contrast sczut.

O prism dubl de cuar (4) este plasat pe vertical ntre lentila obiectiv i
Iluminator. Polarizatorul i analizorul sunt plasate la 90o.
Cele dou fascicule create de ctre prisma interfera coerent n planul imaginii i
produc dou imagini uor deplasate n faz (diferite ca faz), care produc astfel o
38
cretere a contrastului.

Differential Interference Contrast


(DIC) (Nomarski)
In cazul microscopiei cu contrast diferential interferntial cele dou unde sunt
deplasate lateral cu o distan care este mai mica dect puterea de rezoluie a
lentilei.
Prin producerea celor dou deplasari laterale ale undelor coerente, microscopul cu
contrast diferntial interferenial este capabil de a converti gradientul drumului optic n
variaii ale intensitatii luminoase.
Variatiile de gradient ale drumului optic apar fie luminoase sau ntunecate, n
funcie de semnul gradientului, n timp zonele care drum optic uniform apar gri.
Gradieni n lungimea drum optic sunt matematic
echivalent cu prima derivat a drumului optic.
Metoda DIC poate fi de asemenea, folosita pentru a schimba gradienti ai drumului
optic n cazul obiectelor transparente, n diferene spectaculoase de culoare.
Dac cele dou imagini separate lateral sunt suprapuse (n aliniere perfect),
contrastul introdus ar disprea i imaginea unui obiect transparent ar fi invizibila.

Differential Interference Contrast


(DIC) (Nomarski)
Detector de lumina
(spectru vizibil)

Polarizor

Prima prisma Wollaston


Cele mai multe
microscoape de contrast
diferenial, utilizeaza prisme
birefringente pentru a
mpartii i recombina cele
doua imagini.

DIC Condenser
Proba(Specimen)
Objective

A-II-a Prisma Wollaston

Drum Optic

Analizor

Contrast interferenial vs contrast n cmp


luminos

Sus: cmp luminos


Jos: contrast interferenial
Stnga: probe decapate de
Ti-6Al-4V n 0,5% HF
Dreapta: probe ne-decapate de
-plutoniu (Pu)

41

Fluorescenta
Jablonski Diagram
Singlet States

Triplet States
Vibrational energy levels
Rotational energy levels
Electronic energy levels

ENERGY

S2

S1

IsC

ABS

FL

fast
S0

I.C.

T2

T1
Triplet state

PH
IsC

slow (phosphorescence)
Much longer wavelength (blue ex red em

[Vibrational sublevels]

ABS - Absorbance
FL - Fluorescence
I.C.- Nonradiative Internal Conversion

S 0.1.2 - Singlet Electronic Energy Levels


T 1,2 - Corresponding Triplet States
IsC
- Intersystem Crossing
PH - Phosphorescence

Diagrama Jablonski simplificata


S1
S1

hvex

S0

hvem

Fluorescenta
Deplasare Stokes (Stokes Shift)

Fluorescence Intensity

este diferena de energie dintre cea mai


mica energie din spectrul de excitare
(absorbie) i de cea mai mare energie din
spectrul de emisie
Fluorescein
molecule

Stokes Shift is 25 nm
495 nm

Wavelength

520 nm

Fluorescenta
Cromoforii sunt componente de molecule, care
absorb lumina
de exemplu, fluorescena la proteine se
datoreaza in mare parte inelului indolic de la
reziduuri de triptofan
Cromoforiisunt, n general, contin structuri cu
dubla legatura

Microscopul cu fluorescen
Arc Lamp
EPI-Illumination

Excitation Diaphragm
Excitation Filter
Ocular

Dichroic Filter

Objective
Emission Filter

Microscopul cu fluorescen
upright

inverted

Camere foto i filtre de emisie


Camera
goes here

Camera foto CCD Color nu are nevoie de filtre optice pentru a colecta toate lungimile de
und, dar dac dorii s colecteze fiecare lungime de und de emisie optim, este nevoie
de un aparat de fotografiat monocrom cu filtre de emisie separate. Alternativele includ
filtre AOTF sau cu cristale lichide.

Markeri pentru Proteine


Marker

FITC
PE
APC
PerCP
Cascade Blue
Coumerin-phalloidin
Texas Red
Tetramethylrhodamine-amines

CY3 (indotrimethinecyanines)
CY5 (indopentamethinecyanines)

Excitare

488
488
630
488
360
350
610
550
540
640

Emisie

525
575
650
680
450
450
630
575
575
670

Markeri pentru Acizii Nucleici

Hoechst 33342 (AT rich) (uv)


DAPI (uv)
POPO-1
YOYO-1
Acridine Orange (RNA)
Acridine Orange (DNA)
Thiazole Orange (vis)
TOTO-1
Ethidium Bromide
PI (uv/vis)
7-Aminoactinomycin D (7AAD)

346
359
434
491
460
502
509
514
526
536
555

460
461
456
509
650
536
525
533
604
620
655

Markeri pentru Ioni

INDO-1
QUIN-2
Fluo-3
Fura -2

Ex350
Ex350
Ex488
Ex330/360

Indo-1

Em405/480
Em490
Em525
Em510

INDO-1: 1H-Indole-6-carboxylic acid, 2-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2- [(acetyloxy)methoxy]-2-oxoetyl]amino]-5methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-, (acetyloxy)methyl ester [C47H51N3O22 ] (just in


case you want to know.!!)
FLUO-3: Glycine, N-[4-[6-[(acetyloxy)methoxy]-2,7- dichloro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl]-2[2-[2- [bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxyethyl]amino]-5- methylphenoxy]ethoxy]phenyl]N-[2- [(acetyloxy)methoxy]-2-oxyethyl]-, (acetyloxy)methyl ester

Markeri pentru Organite celulare


Probe

BODIPY
NBD
DPH
TMA-DPH
Rhodamine 123
DiO
diI-Cn-(5)
diO-Cn-(3)

Site

Excitation

Golgi
Golgi
Lipid
Lipid

505
488
350
350
Mitochondria 488
Lipid
488
Lipid
550
Lipid
488

BODIPY - borate-dipyrromethene complexes


nitrobenzoxadiazole
DPH diphenylhexatriene
trimethylammonium

Emission

511
525
420
420
525
500
565
500
NBD TMA -

Flow-karyotyping of DNA integral


fluorescence (FPA) of DAPI-stained pea
chromosomes. Inside pictures show
sorted chromosomes from regions R1
(I+II) and R2 (VI+III and I), DAPI-stained;
from regions R3 (III+IV) and R4 (V+VII)
after PRINS labeling for rDNA
(chromosomes IV and VII with secondary
constriction are labeled)

A-B): metaphases of Feulgen-stained pea (Pisum


sativum L.) root tip chromosomes (green ex),
Standard and reconstructed karyotype L-84,
respectively. C) and D): flow-karyotyping histograms
of DAPI-stained chromosome suspensions for the
Standard and L-84, respectively. Capital letters
indicates chromosome specific peaks, as assigned
after sorting

Microscopie Confocala Laser


1957 Marvin Minsky Confocal Patent focal Scanning Microscope: U. S. Patent
3013467

Microscopie Confocala Laser


Limitarea campului vizual prin introducerea unui sistem optic confocal
si a unei diafragme de tip orificiu ac (pinhole)

Sistem confocal: iluminarea i imaginea probei sa se gaseasc in acelasi punct.

Microscopie Confocala Laser


Schema de principiu

Iluminarea si
imaginea sunt rnd
pe rnd puncte
individuale ntr-un
plan. Imaginea
rezultat devine
apoi o "felie", din
proba, aflata de
obicei, la o distan
de civa microni n
interiorul probei.

Microscopie Confocala Laser


Schema de principiu

Pentru a obine o imagine


tridimensional foarte
clara a probei se
reconstituie imaginea din
seturi (sau stive) de felii
preluate (scanate) la
adncimi diferite.

Microscopie Confocala Laser


Schema de principiu
Capul de scanare este n
centrul sistemului confocal si
conine intrri de la sursele
laser externe, seturi de filtre
de fluorescen i oglinzi
dicromatice, un sistem de
oglinzi de scanare n rastru
acionate galvanometric,
aperturi pinhole variabile n
scopul generrii imaginii
confocale, detectori tub
fotomultiplicator acordabili
pentru diverse lungimi de
und de fluorescen.

Microscopie Confocala Laser


Schema de principiu
Sistemul laser ca (sursa
de excitare) va emite
lumina coerent ce
trece printr-o apertur
pinhole care este situat
n planul (confocal) cu
punctul de scanare de
pe prob. O a doua
apertur pinhole este
poziionat n faa
detectorului (un tub
fotomultiplicator).

Microscopie Confocala Laser

Laboratorul de Microscopie Confocala din cadrul Scolii de Stiinte Biologice


a Universitatii din Manchester

Imaginile reprezinta 20 de sectiuni optice proiectate pe un plan unic dupa achizitie.In imagine este
redata retina umana marcata cu Von Willebrands factor(A) si Colagen IV (B).Achizitia s-a efectuat
cu o lentila x16, imersata in ulei. Studiul face parte dintr-o analiza asupra retinei la diabetici, initiat
de The Guide Dogs for the Blind.

Laboratorul de Microscopie Confocala din cadrul Scolii de Stiinte Biologice


a Universitatii din Manchester

Imaginile reprezinta 20 de sectiuni optice proiectate pe un plan unic dupa achizitie.In imagine este
redata retina umana marcata cu Von Willebrands factor(A) si Colagen IV (B).Achizitia s-a efectuat
cu o lentila x16, imersata in ulei. Studiul face parte dintr-o analiza asupra retinei la diabetici, initiat
de The Guide Dogs for the Blind.

Exemple preluate de pe pagina web Bio-Rad

Paramecium marcat cu un
anticorp antitubulinic prezinta
mii de cili si structuri
microtubulare interne.
Image Courtesy of Ann
Fleury, Michel Laurent &
Andre Adoutte, Laboratoire
de Biologie Cellulaire,
Universit, Paris-Sud, Cedex
France.

Larva de Peste Zebra


marcat cu Acridina
Portocalie, Albastru
Evans Si Eosina
Image Courtesy of Dr.
W.B. Amos,
Laboratory of
Molecular Biology,
MRC Cambridge U.K.

Exemple preluate de pe pagina web Bio-Rad

Proiectie a 25 sectiuni optice a


insulelor lui Langerhan la sobolan,
triplu marcate, achizitionate cu
laser cu krypton/Argon Image
courtesy of T. Clark Brelje, Martin
W. Wessendorf and Robert L.
Sorenseon, Dept. of Cell Biology
and Neuroanatomy, University of
Minnesota Medical School.

Imagine a proiectiei la
luminozitate maxima a
neuronilor marcati Golgi.

Laboratorul de Microscopie Confocala din cadrul Scolii de Stiinte Biologice


a Universitatii din Manchester

Imaginile prezinta un folicul de par (C) si o glanda sebacee (D) localizate pe scalpul
uman. Mostrele au fost marcate cu Eosin si achizitionate folosind setarea slow scan
a aparatului. Eosin actioneaza ca un marker de embosare(ridicare a suprafetei) si deci
functia slow scan este folosita pentru a colecta cat mai multa informatie structurala.
References
Foreman D, Bagley S, Moore J, Ireland G, Mcleod D, Boulton M
3D analysis of retinal vasculature using immunofluorescent staining and confocal laser scanning microscopy, Br.J.Opthalmol.
80:246-52

SINTEF Unimed NIS


Norway
http://www.oslo.sintef.no/ecy/7210/confocal/micro_gallery.html

Imaginea prezinta o sectiune x-z


printr-o suprafata acoperita cu lac
metalic.In imagine se observa
particulele metalice situate la
aprox. 30 microni sub suprafata
lacului.

Imaginea prezinta o sectiune x-y in acelasi


lac metalic

http://www.vaytek.com/

Material from Vaytek Web site


Imaginea prezinta o singura celula
ovariana de hamster in perspectiva
axiala si laterala.Imaginea a fost
reconstruita din sectiuni optice a mostrei
marcata cu actina, folosindu-se softul
VayTek VoxBlast. Image courtesy of
Doctors Ian S. Harper, Yuping Yuan, and
Shaun Jackson of Monash University,
Australia. (see Journal of Biological
Chemistry 274:36241-36251, 1999)

http://www.vaytek.com/vox.htm