Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE AGRICULTUR
Specializarea: Genetica i ameliorarea plantelor
Conductor tiinific
Prof. dr. Constantin Botez
CLUJ-NAPOCA
2011
CUPRINS
CAPITOLUL 1- IMPORTANA ECONOMIC ................................................................ 5
1.1
INTRODUCERE ............................................................................................................. 5
2.6
PARAMETRI
GENETICI
UTILIZAI
PENTRU
EVALUAREA
PARAMETRI
GENETICI
UTILIZAI
PENTRU
EVALUAREA
OBIECTIVELE
ACTIVITILE
DE
CERCETARE
TIINIFIC..12
CAPITOLUL 3 ACTIVITI DE CERCETARE PE TEREN ........................................ 13
3.1 PARTICULARITI I ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE .............................. 14
3.1.1 Populaii de Pinus silvestris din Romnia i Ungaria ..................................................... 14
CAPITOLUL 4 ACTIVITI DE CERCETARE N LABORATOR ............................. 15
4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI .......................................................... 15
4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI I PREPARAREA SOLUIEI DE AND ..................... 15
4.3
DETERMINAREA
SPECTROFOTOMETRIC
PURITII
REZULTATE
OBINUTE
LA
TRANSFERAREA
OPTIMIZAREA
reprezint puin sub 10% din suprafaa anual de mpdurit, care este de 10 - 16000 ha.
Activitile de mpdurire au fost reduse dup 1990.
1.1.4 Pinul Silvestru
Pinul este un component foarte important al vegetaiei, ocupnd cca. 143
milioane ha (37% din suprafaa mpdurit a globului, 70% din suprafaa mpdurit a
emisferei nordice (MIROV, 1967)). Este cel mai rspndit conifer din lume, dup
Juniperus communis.
1.1.4.1 Clasificarea tiinific a speciei Pinus sylvestris dup Ciocrlan
(CIOCRLAN, 2000)
Regnul: Plantae, ncrengtura: Pinophyta, Clasa: Pinopsida, Ordinul: Pinales,
Familia: Pinaceae, Sub-familia: Pinus, Genul: Pinus, Specia: P. sylvestris.
1.1.4.2 Varieti de Pinus sylvestris
Cea mai mare diversitate a genului l gsim n Mexic i California. Peste 100 de
varieti au fost descrise n literatura botanic, dar numai trei sau patru sunt acum
acceptate. Diferenele morfologice sunt minime, ns analiza genetic i a metaboliilor
secundari (compoziia rin) ne dezvluie diferene mai pronunate.
1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru
Face parte din genul Pinus, un mare gen n cadrul familiei Pinaceae
(Abietineae) din care fac parte arbori i arbuti venic verzi. Nativ pentru Europa,
Asia, America de Nord, America Central, Africa de Nord i insulele din apropiere
(DALLIMORE, 1948).
Pinul silvestru este un conifer venic verde care poate crete n nlime pn la
25 m, n mod excepional 35-45m n parcele foarte productive i cu diametrul
trunchiului matur de pn la 1 m.
Prezint dou ace n teac. Este un arbore cu cretere monopoidal, ramurile
sunt dispuse n spiral i nu prezint nici un mugure lateral ntre spirale. Creterea
monopodial nu este la fel de marcant ca n cazul Picea abies, iar forma general
variaz de obicei de la coroane nguste spiralate cu ax bine definit pn la formaiuni
stufoase fr nici un ax principal definit. (CARLISLE, 1968).
Arborele este hermafrodit unele exemplare sunt predominant de un anumit sex,
masculin sau feminin.
6
Pinii sunt specii de arbori cu ciclu de via foarte lung. Longevitate medie,
poate ajunge pn la 600 de ani. Cel mai btrn pin nc n via este considerat a fi
Pinus aristata ce are 2435 ani (BRUNSTEIN, 1992).
1.1.4.4. Distribuia geografic i pe altitudine
Pinul silvestru (Pinus sylvestris; familia Pinaceae) prezint cea mai mare
distribuie geografic, fiind nativ n cea mai mare parte a emisferei nordice, n Europa
i Asia.
Limita de nord a distribuiei pinului silvestru n Europa este la 7029'N n
Norvegia (CARLISLE, 1958) limita sudic este la 37N n sudul Spaniei. Limita
continental n partea de vest fiind la 7 W, n nord-vestul Portugaliei (CARLISLE,
1968) iar limita de est la aproximativ 138E, existnd civa arbori mai n est,
ajungnd pe coasta Pacificului (MALEV, 1955). Limita insular a Pinului silvestru
este n Scoia, la 538'W. O descriere mai detaliat a distribuiei P. sylvestris a fost
realizat de STEVEN n 1959.
1.1.4.5. Limitrile topografice i climatice ale habitatului.
Tolereaz o gam larg de condiii climatice, de la climatul arctic din nordul
Siberiei pn la climatul mediteranean din sudul Spaniei i de la poalele Alpilor
Liguriei, precum i climatul oceanic umed, de pe coasta de vest a Scoiei, pn la
climatul continental uscat din Europa Central i Asia. Limita de vest este determinat
de bariera creat de Oceanul Atlantic, iar limita de est de ctre Oceanul Pacific,
excepia fcnd nord-estul Rusiei, unde Munii Verhoiansk previn n mod eficient
migraia spre est. Limita de nord a pin scoian este probabil determinat de
temperatur, dei nu este clar pn la ce temperaturi acest arbore i desfoar ciclul
de via.
1.1.5 Utilizri
Uleiul volatil extras din pin a fost studiat nc din antichitate i este folosit n
special pentru beneficiile aduse n tratarea afeciunilor respiratorii, amelioreaz strile
de oboseal, este antiseptic i stimuleaz circulaia sanguin. Polenul de asemenea se
folosete n tratamente naturiste ca i energizant, n tratarea afeciunilor respiratorii,
este recomandat de asemenea pacienilor hipertensivi, n cazul afeciunilor renale sau
articulare. Acele, crengile i scoara tuturor speciilor de pin conin o rin lipicioas,
7
PARAMETRI
GENETICI
UTILIZAI
PENTRU
EVALUAREA
acestor parametri pentru mai multe populaii, dup care acestea se compar ntre ele cu
ajutorul datelor obinute.
2.7
PARAMETRI
GENETICI
UTILIZAI
PENTRU
EVALUAREA
13
Tab 1
Locaiile alese pentru recoltare.
Sites for sampling
Nr.
No.
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
3.1
3.2
ara
Country
Judeul
County
Localitatea
Location
Latitudine
Latitude
Longitudi ne
Longitude
Altitu
dine
Altitu de
Nr. probe
No.
samples
Romania
Alba
Baia de Arie
462433
232000
514m
20
Romania
Alba
Pianu de Sus
455332
233009
426m
20
Romania
Harghita
Toplia
465440
252035
750m
20
Romania
Mure
Gurghiu
464628
245116
609m
20
Romania
Mure
Reghin
465302
243142
484m
20
Romania
Sibiu
Agnita
460053
244547
557m
20
Romania
Braov
Zrneti
453359
251931
747m
17
Romania
CaraSeverin
Anina
450560
215141
615m
20
Romania
Hunedoara
Pui
453124
230605
476m
19
Romania
Suceava
Poiana
Stampei
472059
215112
917m
20
Romania
Timioara
Ndragu
453900
211100
850m
19
Romania
Vlcea
Voineasa
452812
235201
1240m
16
Romania
Vrancea
Tulnici
455518
263857
702m
20
Ungaria
Gyr-MosonSopron
Fenyf
47520
174547
264m
20
Ungaria
Vas
Velemr
464404
162235
213m
18
14
DETERMINAREA
SPECTROFOTOMETRIC
PURITII
CONCENTRAIEI DE ADN
n cazul probelor luate n studiu a fost folosit Spectrofotometru Nanodrop
ND-1000 i Fluorometrul Qubit.
4.3.1 Tehnica PCR
Aceast metod a fost descoperit n anul 1988 de ctre Karl Mullis i
colaboratorii lui, pentru care a primit premiul Nobel pentru Chimie. Tehnica PCR
(Polymerase Chain Reaction), reacia de polimerizare n lan, are la baz o tehnologie
n vitro care imit capacitatea natural de replicare a ADN-ului i care const n
generarea rapid a unor copii multiple a unei secvene nucleotidice int (ADN sau
ARN) dintr-o gen de interes sau un patogen specific.
4.3.1.1 Caracteristici
Metoda este foarte sensibil la "contaminare" cu ADN strin; o cantitate ct de
mic de ADN provenit de la alt individ poate compromite rezultatul analizei genetice.
15
este
posibil,
adesea,
utiliznd
amorse
care
au
fost
16
REZULTATE
PRIVIND
EXTRACIA
ADN-ULUI
ESTIMAREA
REZULTATE
OBINUTE
LA TRANSFERAREA
OPTIMIZAREA
valori cuprinse ntre 0,26 n popluaia din Agnita i 0,37 n populaia din Suceava,
Romania. ). Toate populaiile studiate au prezentat o diversitate genetic substanial
ns i semene ale unei depresiuni demografice (bottleneck). Indicele FK este apropiat
de 0, evideniind faptul c toate populaiile sunt n echilibru Hardy-Weinberg, cu un
mic deficit de heterozigoi.
Indicele de difereniere FST
Acest indice a fost propus de WEIR i COCKERHAM (1984). Cu ct valoarea
acestuia este mai apropiat de 1, cu att populaiile respective sunt mai difereniate
genetic.
Cele mai mici diferenieri genetice (FST) au fost observate ntre populaiile
dintre Sebe i Velemr (-0.00119), cea mai mare difereniere a fost observat ntre
populaiile din Baia de Arie i Agnita (0.15761). ntre majoritatea populaiilor a fost
observat o difereniere semnificativ de peste 0,05.
5.4 STRUCTURA GENETIC SPAIAL N POPULAII NATURALE DE PIN
SILVESTRU
5.4.1 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice.
Pentru realizarea acestui obiectiv am folosit programul BAPS 5.3 (Bayesian
Analysis of Population Structure) (CORANDER, 2003) care funcioneaz pe baza
frecvenei alelelor markerilor moleculari i numrul de grupuri deviate din punct de
vedere genetic dintr-o populaie variabile alese aleatoriu. Acest program nu ia n
considerare barierele geografice.
Iniial am rulat programul considernd fiecare individ ca fcnd parte dintr-un
singur cluster, grupnd astfel indivizi. Au fost calculate 5, 10 i respective 15 clustere
de indivizi.
Distribuia indivizilor din clusterul 1 este n majoritatea populaiilor excepie
fcnd populaia din Vlcea. Cea mai mare pondere de indivizi din clusterul 1 fiind
regsit n populaia din Suceava. Indivizii aparinnd clusterului 2 sunt rspndii n
majoritatea populaiilor excepie fcnd populaiile din Agnita, Baia de Arie,
Hunedoara, Toplia i Timi. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup fiind
observat n cadrul populaiei din Fenyf. Indivizii aparinnd clusterului 3 sunt
distribuii n majoritatea populaiilor, singura excepie fiind populaia din Baia de
19
Arie. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup poate fi observat n populaia
din Agnita. Distribuia indivizilor aparinnd clusterului 4 este observat n 60% din
populaii, lipsind din populaiile din Baia de Arie, Braov, Cara-Severin, Reghin,
Vlcea i Vrancea. Cea mai mare pondere a indivizilor din acest grup poate fi
observat n populaia din Hunedoara.
Observnd distribuia indivizilor aparinnd clusterului 5 putem spune ca
acetia sunt regsii n toate populaiile neexistnd excepie. Cea mai mare pondere a
acestor indivizi se regsete n populaia din Timi. Inexistena unei structuri clare n
distribuia indivizilor din clusterele mai sus menionate se datoreaz fluxului de gene
puternic. Acesta este datorat polenizrii libere existente la pin i nu se poate fi
observat o reducere a variabilitii n populaii. De asemenea recombinarea la nivelul
AND-ului nuclear a adus un aport semnificativ n diversitatea populaiilor, la nivelul
markerilor nucleari.
De departe cteva populaii se difereniaz datorit proporiilor de indivizi din
diferitele clustere. Populaia din Agnita, care prezint o proporie foarte ridicat a
indivizilor din clusterul 3 de indivizi (peste 75%) ns compenseaz prin prezena de
indivizi din alte 3 clustere. Populaia din Baia de Arie, datorit lipsei de variabilitate
prin prezena indivizilor din doar 2 clustere, ns aceste doua clustere sunt cele mai
rspndite, compensnd astfel. Populaia din Suceava, datorit proporiei mari de
indivizi din clusterul 1 (peste 60%) i variabilitatea mare n populaie datorit
prezenei indivizilor din toate clusterele ntr-o proporie mai mare sau mai mic. i nu
n ultimul rnd populaiile din Vlcea i Hunedoara cu o proporie mare de indivizi din
clusterul 3 (50% i respectiv 45%) i prezena indivizilor din alte dou clustere.
Gruparea indivizilor n 10 sau 15 clustere a dovedit o mare variabilitate n
populaii fiind observai indivizi cu genotipuri unice care formeaz clustere unice.
Utiliznd n analiz, n loc de indivizi unici, populaiile ca unitate structural
am obinut rezultate similare. Cernd gruparea populaiilor n maxim 5 clustere am
obinut un numr de 3 clustere.
Primul cluster, conine o singur populaie, populaia din Agnita, evideniind
diferene puternice ntre aceast populaie i restul. Aceste diferene se regsesc n
frecvena genelor (prezentate n subcapitolul anterior) i mai ales n prezena alelelor
20
populaie fiind inclui indivizi din doar dou clustere. Acest lucru se poate datora
managementului forestier, datorit folosiri de puiei, provenii din aceeai surs de
semine, la nfiinarea acestei suprafee forestiere.
Fornd gruparea populaiilor n dou clustere observm alipirea populaiei din
Baia de Arie la clusterul coninnd restul populaiilor, rmnnd un alt cluster
coninnd populaia din Agnita. Acest lucru se datoreaz faptului ca populaia din Baia
de Arie conine indivizi din cele dou cele mai frecvente clustere de indivizi, de aici
i similaritatea ridicat, comparativ cu populaia din Agnita.
Analiza grupului de populaii din exteriorul Arcului Carpatic, impunnd
formarea de 5 clustere, am obinut un maxim de 3 clustere. Primul cluster coninnd
populaia din Suceava, aceasta datorndu-se variabilitii mari ntlnite la nivelul
acestei populaii. Acest lucru poate fi observat prin prezena n aceast populaie a
indivizilor din toate cele 5 clustere de indivizi, dar separarea se datoreaz i prezenei
unui numr mare de indivizi din primul cluster, mai mare comparativ cu populaia din
Vrancea, acest grup de indivizi neregsindu-se n populaia din Vlcea. Al doilea
cluster grupeaz populaiile din Vrancea i Velemr, datorit similaritii distribuiei
alelelor. Al treilea cluster conine populaia din Vlcea, despre diferenierea creia am
discutat deja.
Fornd formarea a numai 2 clustere, se observ gruparea populaiei din
Suceava n clusterul format anterior de populaiile din Vrancea i Velemr. Populaia
din Vlcea rmne n continuare n cluster diferit.
Populaia din Vlcea pare sa fie cea mai diferit populaie dintre cele luate n
studiu n cadrul acestei populaii au fost observate att frecvene alele alelelor mult
diferite fa de medie ct i prezena unui numr mare de alele private. Urmtoarea
populaie care se difereniaz de restul populaiilor este cea din Agnita i este urmat
de populaiile din Baia de Arie i Suceava.
5.4.2 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice i a domeniilor
teritoriale.
Acest tip de algoritm se bazeaz pe teselaia liber, i se numete aa deoarece
poligoanele sunt independente de situl de prelevare a probelor. Ideea central este ca
indivizii vecini au o probabilitate mai mare sa fie similari. Analiza datelor prin aceast
22
metod necesit dou etape. Prima, definirea vecinilor, n cazul teselaiei, vecintatea
indivizilor se bazeaz pe vecintatea poligoanelor de care aparin. A doua, modelarea
probabilitii ca indivizii vecini sa fie i similari. Rezultatul analizei este reprezentarea
grafic a poligoanelor n diferite culori. Fiecare culoare reprezint aparinerea
populaiei sau a populaiilor, din acel poligon, unui cluster. Aceast metod este greoi
de interpretat i necesit experien, deoarece fiecare grafic este generat diferit n
funcie de schema de recoltare a probelor.
Se poate observa lipsa unei structuri, ntre populaiile luate n studiu. Clustere
unice au fost observate la nivelul populaiilor din Timi, Hunedoara, Sebe,Vlcea,
Agnita, Vrancea, Suceava i Baia de Arie. Aceste Rezultate susin rezultatele obinute
n urma analizei distribuiei spaiale cu ajutorul programului BAPS. Populaiile
menionate mai sus prezentnd diferenieri profunde la nivelul frecvenelor alelelor.
5.4.3 Analiza distribuiei spaiale pe baza metodelor de coordonare
Cea mai popular metod este PCA (principal components analysis). Metoda
transform un set de observaii a unor variabile posibil corelate n valori necorelate
numite componente principale care ulterior pot fi ordonate (JOMBART et al., 2009
review).
Analiza PCA a componentelor principale calculate pe baza frecvenei alelelor a
dovedit existena unei zone cu frecvente sczute, i anume populaiile din Baia de
Arie, Sebe, Hunedoara i Vlcea. n aria de studiu pot fi observate i dou zone unde
PCA a determinat o frecven foarte ridicat, prima zon fiind n centrul rii i
cuprinde populaiile din Agnita, Gurghiu, Reghin i Toplia, a doua zon cuprinde
populaia din Timi i Cara-Severin. Cu valori medii ale frecvenei alelelor s-au
prezentat populaiile din Braov, Fenyf, Velemr, Suceava i Vrancea. n cadrul
acestei analize observam formarea a 5 clustere, dou cu frecvene alelice ridicate, dou
cu frecvene alelice medii, i un cluster cu frecvena alelic sczut.
5.4.4. Testul Mantel
Testele Mantel (MANTEL, 1967) sunt folosite, de obicei, pentru a evalua
corelaia dintre asemnrile i diferenele ntre matrici (MANTEL 1967; SOKAL i
ROHLF 1995).
23
24
26
27
Bibliografie selectiv
Selective references
1.
AUCKLAND L.D., BUI T., ZHOU Y., SHEPHERD M., WILLIAMS C.G.
2002. Conifer Microsatellite Handbook. College Station, TX, USA Texas A & M .
University
3.
DOYLE J.J.D. I DOYLE J.L., 1987, A rapid DNA isolation procedure for
MILLER M.P. 2005. Alleles In Space: Computer software for the joint analysis
NAYDENOV
K.D.,
M.K.
NAYDENOV,
F.
TREMBLAY,
A.
vol.106,pp. 291-296.
9.
OSZLANYI J., GRODZINSKA K., BADEA O., SHPARYK Y., 2004, Nature
conservation n Central and Eastern Europe with a special emphasis on the Carpathian
Mountains. Environ Pollut 130: 127-134.
10.
WANG J., 2007 Triadic IBD coefficients and applications to estimating parwise
28
12.
29