Sunteți pe pagina 1din 29

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR CLUJ-NAPOCA
COALA DOCTORAL
FACULTATEA DE AGRICULTUR
Specializarea: Genetica i ameliorarea plantelor

Ing. LAURA TEFANA GANEA


REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

STUDIUL DIVERSITII I DISTRIBUIEI SPAIALE


A FONDULUI GENETIC N POPULAII DE PIN SILVESTRU (PINUS
SYLVESTRIS L. ) N VEDEREA AMELIORRII

Conductor tiinific
Prof. dr. Constantin Botez

CLUJ-NAPOCA
2011

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

CUPRINS
CAPITOLUL 1- IMPORTANA ECONOMIC ................................................................ 5
1.1

INTRODUCERE ............................................................................................................. 5

1.1.1 Scurt istoric a pdurilor din Europa .................................................................................. 5


1.1.2 Pdurile din Romnia ........................................................................................................ 5
1.1.3 Managementul forestier n Romnia ................................................................................. 5
1.1.4 Pinul Silvestru ................................................................................................................... 6
1.1.4.1 Clasificarea tiinific a speciei Pinus sylvestris dup Ciocrlan(CIOCRLAN, 2000) 6
1.1.4.2 Varieti de Pinus sylvestris ........................................................................................... 6
1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru ............................................................................................... 6
1.1.4.4 Distribuia geografic i pe altitudine ............................................................................ 7
1.1.4.5 Limitrile topografice i climatice ale habitatului.......................................................... 7
1.1.5 Utilizri.............................................................................................................................. 7
1.1.6 Genetica spaial ............................................................................................................... 8
1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra geneticii spaiale ................................................................ 8
1.1.6.2 Genetica spaial: pinul .................................................................................................. 8
1.1.7 Genetica spaial a Pinului silvestru n Romnia .............................................................. 8
1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetic.............................................................................. 9
CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZ A DIVERSITII
GENETICE .............................................................................................................................. 9
2.1. ISTORICUL DEZVOLTRII AMELIORRII PLANTELOR PE CRITERII
MOLECULARE ....................................................................................................................... 9
2.2 DEFINIIA MARKERILOR GENETICI I MOLECULARI................................... 10
2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI.............................................................................. 10
2.3.1 Markeri morfologici ........................................................................................................ 10
2.3.2 Markeri biochimici .......................................................................................................... 10
2.3.3 Markeri moleculari .......................................................................................................... 10
2.4 IMPORTANA MARKERILOR MOLECULARI ...................................................... 10
2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ........................................................ 10
2.5.1 Microsateliii (SSR)......................................................................................................... 11
2.5.1.1 Evoluia microsateliilor: mecanismele de mutaie i de variaie SSR......................... 11
2.5.1.2 Dezvoltarea markerilor microsatelii ............................................................................ 11
2.5.1.3 Dezvoltarea de microsatelii, transferaea inter-specific sau inter-genic ................... 11
2

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

2.6

PARAMETRI

Rezumatul tezei de doctorat

GENETICI

UTILIZAI

PENTRU

EVALUAREA

VARIABILITII GENETICE INTRAPOPULAIONALE. ......................................... 11


2.7

PARAMETRI

GENETICI

UTILIZAI

PENTRU

EVALUAREA

VARIABILITII GENETICE INTERPOPULAIONALE .......................................... 12


2.8 MOTIVAIA CERCETRII.....12
2.9 SCOPUL,

OBIECTIVELE

ACTIVITILE

DE

CERCETARE

TIINIFIC..12
CAPITOLUL 3 ACTIVITI DE CERCETARE PE TEREN ........................................ 13
3.1 PARTICULARITI I ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE .............................. 14
3.1.1 Populaii de Pinus silvestris din Romnia i Ungaria ..................................................... 14
CAPITOLUL 4 ACTIVITI DE CERCETARE N LABORATOR ............................. 15
4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI .......................................................... 15
4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI I PREPARAREA SOLUIEI DE AND ..................... 15
4.3

DETERMINAREA

SPECTROFOTOMETRIC

PURITII

CONCENTRAIEI DE ADN ............................................................................................... 15


4.3.1 Tehnica PCR ................................................................................................................... 15
4.3.1.1 Caracteristici................................................................................................................. 15
4.3.1.2 Utilizri......................................................................................................................... 16
4.4 TRANSFERAREA I OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13.......................... 16
4.5 SEPARAREA ELECTROFORETIC I ANALIZA CROMATOGRAFIC......... 16
4.6 TRANSFERAREA I OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCAI
FLUORESCENT .................................................................................................................... 16
4.7 PCR MULTIPLEX .......................................................................................................... 17
4.8 PACHETE INFORMATICE I METODE STATISTICE APLICATE N ANALIZA
I INTERPRETAREA DATELOR ...................................................................................... 17
CAPITOLUL 5 REZULTATE I DISCUII ..................................................................... 17
5.1 REZULTATE PRIVIND EXTRACIA ADN-ULUI I ESTIMAREA CANTITII
I CALITII ACESTUIA .................................................................................................. 17
5.2

REZULTATE

OBINUTE

LA

TRANSFERAREA

OPTIMIZAREA

MARKERILOR SSR M13, PREMARCAI FLOURESCENT I N MULTIPLEX .... 17


5.3 DIVERSITATEA GENETIC A PINULUI SILVESTRU DIN ROMNIA I
UNGARIA ............................................................................................................................... 18
5.3.1 Diversitatea genetic intra- i inter-populaional .......................................................... 18
5.3.2 Frecvenele alelice n populaiile din Romania i Ungaria ............................................. 18
3

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

5.4STRUCTURA GENETIC SPAIAL N POPULAII NATURALE DE PIN


SILVESTRU ........................................................................................................................... 19
5.4.1 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice. .................................................... 19
5.4.2 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice i a domeniilor teritoriale. ........... 22
5.4.3 Analiza distribuiei spaiale pe baza metodelor de coordonare ....................................... 23
5.4.4 Testul Mantel................................................................................................................... 23
5.4.5 Coeficientul de consangvinizare ..................................................................................... 25
6 CONCLUZII I RECOMANDRI ................................................................................... 25
BIBLIOGRAFIE SELECTIV ............................................................................................ 28

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

CAPITOLUL 1- IMPORTANA ECONOMIC


1.1 INTRODUCERE
1.1.1 Scurt istoric a pdurilor din Europa
La sfritul Evul Mediu i dup (secolul al cincisprezecelea-aptesprezecelea),
suprafeele mpdurite au sczut drastic datorit modificrii modelelor de utilizare a
terenurilor. Mai mult, o exploatare intensiv a pdurilor rmase naturale, a nceput i
ca urmare, aceste pduri au devenit mai accesibile datorit tierilor arbitrare
(KUSTER, 1998). n unele ri, producia de crbune pentru industria fierului,
construcii navale i extracia de sare a dus la despdurirea complet a unor suprafee
mari. La nceputul secolul al optsprezecelea n unele ri cerinele legale au intrat n
vigoare pentru a evita o criz de aprovizionare cu lemn i de a mbunti starea
pdurilor degradate (CARLOWITZ, 1713).
1.1.2 Pdurile din Romnia
Datorit varietii condiiilor climatice i de altitudine, Romnia este ara cu cea
mai mare variaie din Europa temperat, n ceea ce privete vegetaia n general,
fondul forestier n special. Condiiile variaz de la climat est-mediteranean (Marea
Neagr) pn la climat continental i de la altitudini joase cum ar fi esurile inundabile
i zonele de coast pn la muni nali, cu pduri i arbuti de-a lungul lizierei i mai
sus de ea n Carpaii Meridionali (OSZLANYI, 2004).
Compoziia pdurilor romneti cuprinde Fagus care acoper cea mai mare
suprafa 31,5%, pdurile de Quercus 18%, pduri de rinoase 29,9%., diverse tari
15,7% i diverse moi 4,9% (RNP, 2009) n pdurile de conifere Pinus 2,1%.
1.1.3 Managementul forestier n Romnia
n perioada comunist, Romnia a investit masiv n gestionarea pdurilor,
educnd unii dintre cei mai buni silviculturii i specialiti tehnici din Europa (WORLD
BANK, 2002).
n ultimul deceniu suprafaa mpdurit a fost regenerat cu circa 20000 ha
anual, regenerare natural, reprezentnd aproximativ 50% din total. Regenerarea
natural a pdurilor este o prioritate i se aplic n mai mult de 90% din suprafaa
pdurilor. Suprafeele exploatate prin tieri la ras i alte tieri care trebuie regenerate,

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

reprezint puin sub 10% din suprafaa anual de mpdurit, care este de 10 - 16000 ha.
Activitile de mpdurire au fost reduse dup 1990.
1.1.4 Pinul Silvestru
Pinul este un component foarte important al vegetaiei, ocupnd cca. 143
milioane ha (37% din suprafaa mpdurit a globului, 70% din suprafaa mpdurit a
emisferei nordice (MIROV, 1967)). Este cel mai rspndit conifer din lume, dup
Juniperus communis.
1.1.4.1 Clasificarea tiinific a speciei Pinus sylvestris dup Ciocrlan
(CIOCRLAN, 2000)
Regnul: Plantae, ncrengtura: Pinophyta, Clasa: Pinopsida, Ordinul: Pinales,
Familia: Pinaceae, Sub-familia: Pinus, Genul: Pinus, Specia: P. sylvestris.
1.1.4.2 Varieti de Pinus sylvestris
Cea mai mare diversitate a genului l gsim n Mexic i California. Peste 100 de
varieti au fost descrise n literatura botanic, dar numai trei sau patru sunt acum
acceptate. Diferenele morfologice sunt minime, ns analiza genetic i a metaboliilor
secundari (compoziia rin) ne dezvluie diferene mai pronunate.
1.1.4.3 Biologia Pinului silvestru
Face parte din genul Pinus, un mare gen n cadrul familiei Pinaceae
(Abietineae) din care fac parte arbori i arbuti venic verzi. Nativ pentru Europa,
Asia, America de Nord, America Central, Africa de Nord i insulele din apropiere
(DALLIMORE, 1948).
Pinul silvestru este un conifer venic verde care poate crete n nlime pn la
25 m, n mod excepional 35-45m n parcele foarte productive i cu diametrul
trunchiului matur de pn la 1 m.
Prezint dou ace n teac. Este un arbore cu cretere monopoidal, ramurile
sunt dispuse n spiral i nu prezint nici un mugure lateral ntre spirale. Creterea
monopodial nu este la fel de marcant ca n cazul Picea abies, iar forma general
variaz de obicei de la coroane nguste spiralate cu ax bine definit pn la formaiuni
stufoase fr nici un ax principal definit. (CARLISLE, 1968).
Arborele este hermafrodit unele exemplare sunt predominant de un anumit sex,
masculin sau feminin.
6

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Pinii sunt specii de arbori cu ciclu de via foarte lung. Longevitate medie,
poate ajunge pn la 600 de ani. Cel mai btrn pin nc n via este considerat a fi
Pinus aristata ce are 2435 ani (BRUNSTEIN, 1992).
1.1.4.4. Distribuia geografic i pe altitudine
Pinul silvestru (Pinus sylvestris; familia Pinaceae) prezint cea mai mare
distribuie geografic, fiind nativ n cea mai mare parte a emisferei nordice, n Europa
i Asia.
Limita de nord a distribuiei pinului silvestru n Europa este la 7029'N n
Norvegia (CARLISLE, 1958) limita sudic este la 37N n sudul Spaniei. Limita
continental n partea de vest fiind la 7 W, n nord-vestul Portugaliei (CARLISLE,
1968) iar limita de est la aproximativ 138E, existnd civa arbori mai n est,
ajungnd pe coasta Pacificului (MALEV, 1955). Limita insular a Pinului silvestru
este n Scoia, la 538'W. O descriere mai detaliat a distribuiei P. sylvestris a fost
realizat de STEVEN n 1959.
1.1.4.5. Limitrile topografice i climatice ale habitatului.
Tolereaz o gam larg de condiii climatice, de la climatul arctic din nordul
Siberiei pn la climatul mediteranean din sudul Spaniei i de la poalele Alpilor
Liguriei, precum i climatul oceanic umed, de pe coasta de vest a Scoiei, pn la
climatul continental uscat din Europa Central i Asia. Limita de vest este determinat
de bariera creat de Oceanul Atlantic, iar limita de est de ctre Oceanul Pacific,
excepia fcnd nord-estul Rusiei, unde Munii Verhoiansk previn n mod eficient
migraia spre est. Limita de nord a pin scoian este probabil determinat de
temperatur, dei nu este clar pn la ce temperaturi acest arbore i desfoar ciclul
de via.
1.1.5 Utilizri
Uleiul volatil extras din pin a fost studiat nc din antichitate i este folosit n
special pentru beneficiile aduse n tratarea afeciunilor respiratorii, amelioreaz strile
de oboseal, este antiseptic i stimuleaz circulaia sanguin. Polenul de asemenea se
folosete n tratamente naturiste ca i energizant, n tratarea afeciunilor respiratorii,
este recomandat de asemenea pacienilor hipertensivi, n cazul afeciunilor renale sau
articulare. Acele, crengile i scoara tuturor speciilor de pin conin o rin lipicioas,
7

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

cu miros plcut ce conine substane, cum ar fi colofoniu, terebentin i uleiuri


eseniale, care sunt extrase i folosite cu succes n diferite afeciuni. Gudronul
medicinal este folosit, n special n medicina veterinar, pentru proprietile sale
antiseptice, dar i ca stimulent, diuretic i diaforetic. Pinul silvestru este o specie
lemnoas de mare importan comercial n Europa. Lemnul este uor de prelucrat, cu
proprieti mecanice bune i are multe utilizri. Pdurea boreal, din nordul Europei i
a Asiei, este zona cu cea mai extins pdure de conifere din lume iar pinul este o parte
important a ecosistemului su (BONAN et al., 1992). Pinul silvestru este foarte
rezistent la poluare urban, este predispus la boli parazitare i a fost folosit ca plant
pionier pe terenurile degradate, fiind utilizat n rempdurirea i controlul eroziunii,dar
i ornamental n parcuri i spaii verzi. (PUPLETT, 2011). Cheresteaua, de asemenea,
este larg ntrebuinat la fabricarea unei game largi de produse, de la brci la traverse
de cale ferat, mobilier i jucrii. n Statele Unite, din anii 1950 pn prin anii 1980,
pinul a fost foarte popular ca i pom de Crciun.
1.1.6 Genetica spaial
1.1.6.1 Privire de ansamblu asupra genetici spaiale
nelegerea proceselor care determin asemnrile i diferenele dintre
populaiile izolate spaial este impetuos necesar pentru biologia evoluionist. Att
speciile vegetale ct i cele animale au fost i sunt direct influenate de condiiile de
mediu, implicit de distribuia spaial i barierele geografice care intervin n transferul
genelor de la o populaie la alta.
1.1.6.2 Genetica spaial: pinul
Pinus sylvestris L. crete n condiii ecologice i geografice diferite, fapt ce a
dus, n procesul de evoluie, la formarea unui numr mare de forme, ecotipuri i
subspecii.
1.1.7 Genetica spaial a Pinului silvestru n Romnia
Pinul silvestru este ntlnit n Munii Harghitei i Ciucului, o specie de
importan ecologic (BOSCAIU et al., 1999; BNRESCU, 1973) A fost, de
asemenea, o specie predomin n aceast zon (BNRESCU, 1973). Structura
populaiei a suferit schimbri dramatice datorit glaciaiunii, introducerii speciei Picea
abies i datorit tierilor excesive. n prezent doar 0,2% din pdurile naturale de Pinus
8

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

sylvestris mai populeaz aceeste regiuni. Reducerea drastic a dus la distribuia


fragmentat a populaiilor de Pinus sylvestris iar micropopulaiile izolate au suferit o
scdere a diversitii genetice, ca urmare a driftului genetic, fluxul genetic redus,
reducerea calitii habitatului.
1.1.8 Genetica pinului, diversitatea genetic
Au existat numeroase tentative de a subdiviza imensa zon de distribuie a
pinului n diverse subspecii, care sunt mai degrab neconvingtoare din cauza lipsei
discontinuiti clare n distribuie. n condiii naturale pinul scoian nu este infertil n
relaie cu alte specii de pin, de asemenea, au fost raportai hibrizi cu P. nigra, P.
densiflora i P. mugo. Spre deosebire de ali taxoni, speciile de pin prezint o robust
incompatibilitate de hibridare. Pinul este considerat specia cu cea mai mare
variabilitate genetic din toate speciile, dovedit prin msuri ale variabilitii genetice
cantitative (CORNELIUS, 1994) i diversitatea n studiile aloenzimelor (HAMRICK
et al., 1979).
CAPITOLUL 2 METODE MOLECULARE DE ANALIZ A DIVERSITII
GENETICE
2.1. ISTORICUL DEZVOLTRII AMELIORRII PLANTELOR PE CRITERII
MOLECULARE
n ziua de azi populaia global are o rat de cretere numeric mai mare ca
niciodat. Se presupune c pn n anul 2050, populaia mondial se va dubla i va
ajunge pn la 12 miliarde de indivizi. De fapt s-a estimat c pe plan mondial
producia de hran va trebui s se dubleze n urmtorii 45 de ani. Suprafeele agricole
ct i cele forestiere sunt limitate. Cel puin n ceea ce privete viitorul apropiat,
ameliorarea plantelor va avea un rol important. Selecia fenotipurilor superioare din
populaiile segregante nc st la baza ameliorrii convenionale. Ameliorarea pe
termen lung mizeaz programe bazate pe cicluri repetate de recombinare i selecie.
Este important exploatarea tuturor posibilitilor disponibile pentru a maximiza
ctigul genetic pe unitatea de timp i pentru a reduce scderea diversitii genetice
(LINDGREN and MULLIN, 1997; ROSVALL et al., 1998). n cazul n care
heritabilitatea juvenil este destul de mare, selecia fenotipic poate fi o metod
eficient de a reduce costurile de testare ulterioar a descendenilor n cmp i
9

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

creterea general a ctigului genetic (NAMKOONG, 1970; COTTERILL and


JAMES, 1981; WU, 1998).
2.2 DEFINIIA MARKERILOR GENETICI I MOLECULARI
Markerii moleculari pun n eviden diferenele dintre secvenele nucleotidice,
marcnd totodat prezena unei anumite gene n ADN-ul extras de la diferii indivizi.
Formarea sau dispariia unui marker molecular este determinat de modificarea unei
singure nucleotide dintr-o gen sau chiar de la nivelul ADN-ului repetitiv.
Markerii genetici evideniaz orice diferen genotipic sau fenotipic specific
unui individ, care se transmite n descenden, sunt de fapt alele mutante care pot fii
urmrite de-a lungul generaiilor.
2.3 TIPURI DE MARKERI GENETICI
2.3.1 Markerii morfologici
Markerii morfologici controleaz caractere morfologice uor de evideniat,
controlate genetic de ctre o singur gen.
2.3.2 Markerii biochimici
Controleaz nsuiri biochimice care sunt controlate de mai multe gene i se
bazeaz pe proprietatea proteinelor de a fi separate prin electroforez
2.2.3 Markerii moleculari
Markerii moleculari evideniaz polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear i
citoplasmatic.
2.4 IMPORTANA MARKERILOR MOLECULARI
Caracteristicile markerilor moleculari permit procesul de identificare, selecie i
clonare a genelor de interes, precum i observarea naturii informaionale a materialului
analizat.
2.5 UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI
Cele mai importante utilizri ale markerilor sunt:
Stabilirea variabilitii genetice i caracterizarea coleciilor de germoplasm;
Amprentarea genetic a varietilor, identificarea i accelerarea dezvoltrii
indivizilor care combin alelele favorabile, contribuind la performanele presupuse
ale hibrizilor
Estimarea distanelor genetice ntre populaii, i producerea de semine;
10

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Detecia QTL(qualitative trait loci ) i monogene;


Puritatea i stabilitatea seminelor i a materialului vegetal;
Identificarea de secvene utile, gene candidat etc.
2.5.1. Microsateliii (SSR)
Disponibilitatea unei largi game de tehnici de marcare molecular a condus la
studii comparative ntre ele, (POWELL et al., 1996). Dintre toate acestea, markerii
SSR au ctigat considerabil importan n genetica i ameliorarea plantelor ca urmare
avnd multe atribute de dorit, inclusiv disponibilitate, natura multialelic, motenire
codominant, reproductibilitate, abunden relativ, acoperire extins a genomul
(inclusiv la nivelul organelelor), locaie specific pe cromozom, posibilitatea
automatizrii i detalii n genotipizare (PARIDA et al., 2009a)
2.5.1.1 Evoluia microsateliilor: mecanismele de mutaie i de variaie SSR
Evoluia SSR, adic orice modificare, cretere sau descretere a numrului de
repetri, este asociat cu rata de mutaie. Geneza microsateliilor este un proces
evolutiv dinamic care s-a dovedit a fi extrem de complex (ELLEGREN, 2004).
2.5.1.2. Dezvoltarea markerilor microsatelii
n ciuda aplicabilitii largi a markerilor SSR n genetica plantelor, dezvoltarea
lor rmne o mare problem la majoritatea speciilor mai ales n cazul culturilor
minore. Acest lucru se datoreaz faptului c markerii SSR ar trebui s fie izolai de
novo la majoritatea speciilor.
2.5.1.3 Dezvoltarea de microsatelii, transferarea interspecific sau intergenic
Studiile de genetic comparativ au dovedit c att genele ct i ordinea lor n
genom sunt nalt conservate n cadrul speciilor nrudite. Datele obinute n urma
secvenierilor realizate la mai multe specii de plante au dovedit suficient similaritate
ntre genomurile a dou sau mai multe genuri/specii strns legate. Datorit acestui fapt
markerii SSR pot fi transferai la specii din acelai gen.
2.6

PARAMETRI

GENETICI

UTILIZAI

PENTRU

EVALUAREA

VARIABILITII GENETICE INTRAPOPULAIONALE.


Prin populaie se nelege un grup de indivizi al unei specii care coexist n
aceeai arie geografic. Pentru fiecare populaie n parte se calculeaz separat
parametrii variabilitii genetice intra-populaionale. Sunt calculate valori medii ale
11

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

acestor parametri pentru mai multe populaii, dup care acestea se compar ntre ele cu
ajutorul datelor obinute.
2.7

PARAMETRI

GENETICI

UTILIZAI

PENTRU

EVALUAREA

VARIABILITII GENETICE INTERPOPULAIONALE


Distana genetic Nei (1972)
Printr-o distan genetic se pot cuantifica deosebirile i asemnrile ntre
structura genetic a dou populaii, att la nivel genic ct i genomic. Metoda de
calculare a distanei genetice promovat de Nei presupune c diferenele genetice sunt
datorate att drift-ului genetic ct i mutaiei (NEI et al., 1972).
2.8 MOTIVAIA CERCETRII
n cadrul acestei lucrri a fost propus studierea, cu ajutorul tehnicilor de
biologie molecular (PCR, SSR) a unor populaii de Pin silvestru din Romnia i
Ungaria.
2.9 SCOPUL, OBIECTIVELE I ACTIVITILE DE CERCETARE TIINIFIC
Cercetrile prezentate au ca scop studierea diversitii genetice intra- i interpopulaionale i a structurii genetice spaiale a populaiilor de pinului silvestru (Pinus
sylvestris L.) n arealul studiat, cu ajutorul markerilor moleculari (nSSR). Aceste
elemente sunt de un interes major n procesul de adaptabilitate climatic, producie i
conservare a resurselor genetice forestiere a acestei specii. n acest proiect au fost
studiate 15 populaii provenite din Romnia i Ungaria de la diferite altitudini i
latitudini.
Cercetrile efectuate au urmrit n primul rnd evaluarea diversitii genetice n
vederea caracterizrii structurii genetice i a identificrii modelului de distribuie a
variaiei genetice n populaii naturale de pin silvestru din Romnia i Ungaria.
Analiza comparativ ntre populaiile naturale, precum i utilizarea unor metode
noi de cuantificare a fluxului de gene a avut ca scop estimarea unui posibil efect al
utilizrii de materiale forestiere de reproducere de origine necunoscut asupra
integritii genetice a surselor autohtone de pin silvestru.
Obiectivele urmrite i activitile desfurate n cadrul proiectului de cercetare:
1. Recoltarea materialului vegetal. Pentru aceasta etap a fost necesar
stabilirea populaiilor int n arealul luat n studiu, populaii rezervaii de semine,
12

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

surse genetice, i recoltarea propriuzis a probelor biologice (ace i muguri) de la 20


de indivizi din fiecare populaie, aflai la minim 50 de metri distan.
2. Testarea i transferarea unor markeri SSR disponibili la alte specii de pin la
Pinus sylvestris prin studiul bibliografiei de specialitate n vederea alegerii markerilor
utilizabili, testarea markerilor candidai i optimizarea reaciei de amplificare.
3. Dezvoltarea sistemului multiplex bazat pe markerii alei i folosirea sondelor
marcate fluorescent n vederea automatizrii procesului genotipizare.
4. Caracterizarea locilor luai n studiu, utiliznd amorse nemarcai, marcai
fluorescent i n multiplex.
5. Evaluarea diversitii genetice intra- i inter-populaionale n populaii
naturale de pin autohton din zona luat n studiu, cu ajutorul markerilor nSSR;
6. Analiza structurii genetice spaiale, n populaii naturale reprezentative sub
raportul tipului de ecosistem forestier i al nivelului altitudinal;
7. Stabilirea coeficientului de consangvinizare a populaiilor studiate.
8. Formularea de recomandri pentru o conservare eficient a resurselor
genetice forestiere de pin i privind controlul transferului materialelor forestiere de
reproducere.
CAPITOLUL 3 ACTIVITI DE CERCETARE PE TEREN
n cadrul acestui studiu au fost luate n considerare 13 populaii naturale de pin
silvestru din Romnia i 2 populaii din Ungaria. Alegerea populaiilor a fost fcut n
aa fel nct s cuprind o arie de distribuie geografica a pinului ct mai vast, att n
interiorul arcului Carpatic ct i n exterior, conform Catalogului Rezervaiilor Surse
de Semine, catalog ntocmit la nivelul Regiei Naionale a Pdurilor, care cuprinde
ntreaga suprafa a rii.

13

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Tab 1
Locaiile alese pentru recoltare.
Sites for sampling
Nr.
No.
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
3.1
3.2

ara
Country

Judeul
County

Localitatea
Location

Latitudine
Latitude

Longitudi ne
Longitude

Altitu
dine
Altitu de

Nr. probe
No.
samples

Romania

Alba

Baia de Arie

462433

232000

514m

20

Romania

Alba

Pianu de Sus

455332

233009

426m

20

Romania

Harghita

Toplia

465440

252035

750m

20

Romania

Mure

Gurghiu

464628

245116

609m

20

Romania

Mure

Reghin

465302

243142

484m

20

Romania

Sibiu

Agnita

460053

244547

557m

20

Romania

Braov

Zrneti

453359

251931

747m

17

Romania

CaraSeverin

Anina

450560

215141

615m

20

Romania

Hunedoara

Pui

453124

230605

476m

19

Romania

Suceava

Poiana
Stampei

472059

215112

917m

20

Romania

Timioara

Ndragu

453900

211100

850m

19

Romania

Vlcea

Voineasa

452812

235201

1240m

16

Romania

Vrancea

Tulnici

455518

263857

702m

20

Ungaria

Gyr-MosonSopron

Fenyf

47520

174547

264m

20

Ungaria

Vas

Velemr

464404

162235

213m

18

3.1 PARTICULARITI I ASPECTE DIN ZONELE STUDIATE


3.1.1 Populaii de Pinus silvestris din Romnia i Ungaria
Recoltarea materialului vegetal s-a desfurat n doua etape.
Prima etapa s-a desfurat n aprilie-mai 2010.Aceasta etapa a fost coordonata
de colega mea drd. Ing. Valentina Floran. Populaiile incluse n aceasta etapa s-au
concentrat n judeele: Alba, Harghita, Mure i Sibiu.
A doua etap s-a desfurat n perioada 27 septembrie-20 octombrie 2010.
Recoltarea a fost efectuat n judeele: Braov, Cara-Severin, Hunedoara, Suceava,
Timioara, Vlcea i Vrancea. De asemenea am extins aria de studiu i n afara rii,

14

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

lund n considerare doua populaii de pe teritoriul Ungariei cu scopul desluirii


distribuiei spaiale a pinului n zon i nu numai pe teritoriul rii noastre.
CAPITOLUL 4 ACTIVITI DE CERCETARE N LABORATOR
4.1 PROTOCOLUL DE IZOLARE AL ADN-ULUI
1. Izolarea ADN-ului din probele recoltate n perioada aprilie-mai 2010 a fost
realizat n cadrul Departamentului de Biotehnologii a Universitii de tiine Agricole
i Medicin Veterinar, Cluj-Napoca. ADN-ul a fost extras dup protocolul publicat de
LODHI i colaboratorii n 1994 i modificat de RODICA POP i colaboratorii n 2003
2. Izolarea ADN-ului din probele recoltate n perioada septembrie-octombrie
2010 a fost realizat n laboratoarul centrului de cercetare Umea Plant Science Center
(UPSC) sub egida Swedish University of Agriculture (SLU Umea, Sweden). n acest
caz protocolul folosit a fost cel dezvoltat de DOYLE i DOYLE n 1987.
4.2 PURIFICAREA ADN-ULUI I PREPARAREA SOLUIEI DE ADN
Din punct de vedere practic, purificarea ADN-ului presupune: ndeprtarea din
lizat a tuturor componenilor, cu excepia ADN-ului isau fracionarea ADN-ului,
adic separarea diferitelor specii de ADN n categorii distincte. Au fost efectuate
diluii la concentraia de 50 ng/l.
4.3

DETERMINAREA

SPECTROFOTOMETRIC

PURITII

CONCENTRAIEI DE ADN
n cazul probelor luate n studiu a fost folosit Spectrofotometru Nanodrop
ND-1000 i Fluorometrul Qubit.
4.3.1 Tehnica PCR
Aceast metod a fost descoperit n anul 1988 de ctre Karl Mullis i
colaboratorii lui, pentru care a primit premiul Nobel pentru Chimie. Tehnica PCR
(Polymerase Chain Reaction), reacia de polimerizare n lan, are la baz o tehnologie
n vitro care imit capacitatea natural de replicare a ADN-ului i care const n
generarea rapid a unor copii multiple a unei secvene nucleotidice int (ADN sau
ARN) dintr-o gen de interes sau un patogen specific.
4.3.1.1 Caracteristici
Metoda este foarte sensibil la "contaminare" cu ADN strin; o cantitate ct de
mic de ADN provenit de la alt individ poate compromite rezultatul analizei genetice.
15

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Amplificarea nespecific poate constitui o problem; aceasta este posibil


datorit faptului c polimeraza poate fi activ i la temperaturi joase
Amplificarea

este

posibil,

adesea,

utiliznd

amorse

care

au

fost

"fabricate"pentru alte specii iar lungimea maxim a segmentelor amplificate este de


aproximativ 5000 baze pentru PCR standard i maximum 35 kb pentru kiturile "Long
PCR".
4.3.1.2 Utilizri
Amplificarea unei anumite secvene de ADN cunoscute se realizeaz prin
tehnica PCR; produii de amplificare pot fi utilizai fie pentru secveniere, fie pentru
clonare sau pentru alte utilizri; marcarea PCR se poate utiliza i n contextul seleciei
asistate de markeri; markerii PCR sunt de tip codominant - se poate face genotipizarea
indivizilor pentru o anumit gen.
4.4 TRANSFERAREA I OPTIMIZAREA MARKERILOR SSR M13
Dup studiul articolelor de specialitate n grupul nostru au fost testate peste 300
de perechi de amorse SSR nemarcate fluorescent, transferate la Pinus sylvestris de la
alte specii ale genului Pinus. Au fost alese pentru acest studiu un numr de 9 amorse
SSR M13.
4.5 SEPARAREA ELECTROFORETIC I ANALIZA CROMATOGRAFIC
Lungimea ampliconilor a fost msurat cu ajutorul electroforezei capilare
Beckman coulter CEQ 8000 sequencer.
4.6 TRANSFERAREA I OPTIMIZAREA AMORSELOR SSR PREMARCATE
FLUORESCENT
Din colecia de amorse disponibil n grupul nostru (peste 300 de amorse testate
iniial de drd Sara Abrahamsson) am ales un numr de 94 de amorse care au fost
testate din nou n diferite condiii. Scopul final al acestui test a fost dezvoltarea unui
sistem de amplificare multiplex pentru a reduce costurile de rulare a electroforezei
capilare, i am decis c folosirea amorselor premarcate fluorescent va reduce
amplificarea nespecific, astfel cromatogramele putnd fi analizate. Au fost alese
pentru acest studiu un numr de 34 de perechi de amorse SSR.

16

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

4.7 PCR MULTIPLEX


Dup testarea iniial au fost alese 34 de perechi de amorse, n funcie de
similaritatea condiiilor de amplificare (temperatur i concentraie de MgCl2) i de
dimensiunea ampliconului (100pb-350pb). Pe baza dimensiunii ampliconilor au fost
concepute dou combinaii de amplificare multiplex a probelor cu ajutorul amorselor
premarcate fluorescent produse de Sigma. Fluorocromii folosii pentru marcarea
acestor amorse au fost: Cy5- semnalul emis este albastru, Cy5.5- semnalul emis este
verde, D2- semnalul emis este negru.
4.8 PACHETE INFORMATICE I METODE STATISTICE APLICATE N
ANALIZA I INTERPRETAREA DATELOR
Datele obinute n urma interpretrii cromatogramelor, au fost prelucrate
statistic, n vederea evidenierii diversitii genetice, la nivelul markerilor nucleari, n
populaiile luate n studiu. Pachetele informatice au cuprins diferite programe de
analiz genetic: FSTAT 2.9.3 (GOUDET, 1995), ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005),
COANCESTRY 1.0 (WANG, 2007), BAPS 5.3 (CORANDER, 2003), TESS
(DURAN et al., 2009) i AIS (MILLER, 2005), fiind determinai diferii parametrii.
CAPITOLUL 5 REZULTATE I DISCUII
5.1

REZULTATE

PRIVIND

EXTRACIA

ADN-ULUI

ESTIMAREA

CANTITII I CALITII ACESTUIA


n urma procesului de extracie ADN am obinut concentraii cuprinse ntre
1000 ng/l i 6000 ng/l ntr-un volum final de 50 l. Puritatea probelor a fost
estimat cu ajutorul spectrofotometrului. Raportul optim este 1,5-2,0 observat i n
cazul probelor noastre. Nu a fost observat o fragmentare a ADN-ului n probele
obinute.
5.2

REZULTATE

OBINUTE

LA TRANSFERAREA

OPTIMIZAREA

MARKERILOR SSR M13, PREMARCAI FLOURESCENT I N MULTIPLEX


Amplificrile nespecifice datorate atarii sondelor fluorescente M13 direct la
ADN-ul genomial i nu la amorsei specifici au fcut analizarea populaiilor imposibil.
Calitatea amplificrii a fost net superioar n cazul folosirii kitului de la Qiagen,
comparnd cu rezultatele obinute cu ajutorul reactivilor de la VWR n cazul amorselor
nemarcate fluorescent i a celor premarcate fluorescent.
17

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

n urma acestor experimente a fost observat o transferabilitate de 10% la Pinus


sylvestris n cazul markerilor dezvoltai la Pinus taeda.
Pe baza acestor rezultate au fost dezvoltate dou complexe multiplex:
(M1):PtTx 3013, PtTx 3016, PtTx 3020, PtTx 4011, PtTx 3049; (M2): Ctg 4363,
SPAC 12:5, Ctg 1376, PtTx 3107, PtTx 4001.
5.3 DIVERSITATEA GENETIC A PINULUI SILVESTRU DIN ROMNIA I
UNGARIA
Diferenele dintre indivizii unei populaii/specii pot fi puse n eviden cu
ajutorul markerilor moleculari. Secvenele de ADN amplificate au fost separate n
funcie de mrimea lor prin electroforez capilar. Vizualizarea s-a realizat cu ajutorul
senzorului de fluorescen deoarece au fost folosite amorse marcate fluorescent.
5.3.1 Diversitatea genetic intra- i inter-populaional
Pe baza rezultatelor obinute au fost calculai parametrii diversitii i
diferenierii genetice. Au fost analizat astfel 10 loci nucleari. Nu toi locii s-au dovedit
a fi polimorfici pentru toate populaiile analizate, putnd fi observat prezena alelelor
nule pentru care este necesar o analiz mai amnunit n viitor.
5.3.2 Frecvenele alelice n populaiile din Romania i Ungaria
La nivelul celor 10 loci analizai n cele 15 populaii (13 din Romania i 2 din
Ungaria), au fost identificate un numr de 170 de alele, media de alele pe locus de 17
(numrul total de alele/numrul de loci analizai). Numrul maxim de alele per locus
gsit a fost de 45 pentru locusul SPAC 12:5 iar numrul minim de 9 alele pentru
locusul PtTx 3020. Aceste frecvene au fost calculate cu ajutorul programelor FSTAT
2.9.3 (GOUDET, 1995) i ARLEQIUN (EXCOFFIER, 2005).
Diferenierea genetic ntre populaiile din Romnia i Ungaria, la nivelul
ADN-ului nuclear a nregistrat o valoare de Gst=0,053 ceea ce indic o difereniere a
populaiilor semnificativ. Nivelul diversitii genetice totale (HT) se situeaz n jurul
valorii de 62%. Valoarea cea mai ridicat a diversitii genetice a fost gsit n
populaia din Braov (71%) iar cea mai sczut n populaia din Sebe (54%) i Vlcea
(55%).
Pentru a testa dac populaiile au suferit o constrngere (fenomenul de
bottleneck) de-a lungul anilor, indicele Garza-Williamson a fost calculat nregistrnd
18

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

valori cuprinse ntre 0,26 n popluaia din Agnita i 0,37 n populaia din Suceava,
Romania. ). Toate populaiile studiate au prezentat o diversitate genetic substanial
ns i semene ale unei depresiuni demografice (bottleneck). Indicele FK este apropiat
de 0, evideniind faptul c toate populaiile sunt n echilibru Hardy-Weinberg, cu un
mic deficit de heterozigoi.
Indicele de difereniere FST
Acest indice a fost propus de WEIR i COCKERHAM (1984). Cu ct valoarea
acestuia este mai apropiat de 1, cu att populaiile respective sunt mai difereniate
genetic.
Cele mai mici diferenieri genetice (FST) au fost observate ntre populaiile
dintre Sebe i Velemr (-0.00119), cea mai mare difereniere a fost observat ntre
populaiile din Baia de Arie i Agnita (0.15761). ntre majoritatea populaiilor a fost
observat o difereniere semnificativ de peste 0,05.
5.4 STRUCTURA GENETIC SPAIAL N POPULAII NATURALE DE PIN
SILVESTRU
5.4.1 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice.
Pentru realizarea acestui obiectiv am folosit programul BAPS 5.3 (Bayesian
Analysis of Population Structure) (CORANDER, 2003) care funcioneaz pe baza
frecvenei alelelor markerilor moleculari i numrul de grupuri deviate din punct de
vedere genetic dintr-o populaie variabile alese aleatoriu. Acest program nu ia n
considerare barierele geografice.
Iniial am rulat programul considernd fiecare individ ca fcnd parte dintr-un
singur cluster, grupnd astfel indivizi. Au fost calculate 5, 10 i respective 15 clustere
de indivizi.
Distribuia indivizilor din clusterul 1 este n majoritatea populaiilor excepie
fcnd populaia din Vlcea. Cea mai mare pondere de indivizi din clusterul 1 fiind
regsit n populaia din Suceava. Indivizii aparinnd clusterului 2 sunt rspndii n
majoritatea populaiilor excepie fcnd populaiile din Agnita, Baia de Arie,
Hunedoara, Toplia i Timi. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup fiind
observat n cadrul populaiei din Fenyf. Indivizii aparinnd clusterului 3 sunt
distribuii n majoritatea populaiilor, singura excepie fiind populaia din Baia de
19

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Arie. Cea mai mare pondere de indivizi din acest grup poate fi observat n populaia
din Agnita. Distribuia indivizilor aparinnd clusterului 4 este observat n 60% din
populaii, lipsind din populaiile din Baia de Arie, Braov, Cara-Severin, Reghin,
Vlcea i Vrancea. Cea mai mare pondere a indivizilor din acest grup poate fi
observat n populaia din Hunedoara.
Observnd distribuia indivizilor aparinnd clusterului 5 putem spune ca
acetia sunt regsii n toate populaiile neexistnd excepie. Cea mai mare pondere a
acestor indivizi se regsete n populaia din Timi. Inexistena unei structuri clare n
distribuia indivizilor din clusterele mai sus menionate se datoreaz fluxului de gene
puternic. Acesta este datorat polenizrii libere existente la pin i nu se poate fi
observat o reducere a variabilitii n populaii. De asemenea recombinarea la nivelul
AND-ului nuclear a adus un aport semnificativ n diversitatea populaiilor, la nivelul
markerilor nucleari.
De departe cteva populaii se difereniaz datorit proporiilor de indivizi din
diferitele clustere. Populaia din Agnita, care prezint o proporie foarte ridicat a
indivizilor din clusterul 3 de indivizi (peste 75%) ns compenseaz prin prezena de
indivizi din alte 3 clustere. Populaia din Baia de Arie, datorit lipsei de variabilitate
prin prezena indivizilor din doar 2 clustere, ns aceste doua clustere sunt cele mai
rspndite, compensnd astfel. Populaia din Suceava, datorit proporiei mari de
indivizi din clusterul 1 (peste 60%) i variabilitatea mare n populaie datorit
prezenei indivizilor din toate clusterele ntr-o proporie mai mare sau mai mic. i nu
n ultimul rnd populaiile din Vlcea i Hunedoara cu o proporie mare de indivizi din
clusterul 3 (50% i respectiv 45%) i prezena indivizilor din alte dou clustere.
Gruparea indivizilor n 10 sau 15 clustere a dovedit o mare variabilitate n
populaii fiind observai indivizi cu genotipuri unice care formeaz clustere unice.
Utiliznd n analiz, n loc de indivizi unici, populaiile ca unitate structural
am obinut rezultate similare. Cernd gruparea populaiilor n maxim 5 clustere am
obinut un numr de 3 clustere.
Primul cluster, conine o singur populaie, populaia din Agnita, evideniind
diferene puternice ntre aceast populaie i restul. Aceste diferene se regsesc n
frecvena genelor (prezentate n subcapitolul anterior) i mai ales n prezena alelelor
20

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

private la nivelul acestei populaii. Al doilea cluster grupeaz majoritatea populaiilor


indicnd un flux genetic puternic, ntre populaii. Al treilea cluster grupeaz o singur
populaie, cea din Vlcea.
Aceast populaie se difereniaz de toate celelalte datorit provenienei
indivizilor din doar 3 grupuri, n proporii total diferite de celelalte populaii, datorit
frecvenelor alelelor foarte diferite de media populaiilor (prezentat n subcapitolul
anterior) i datorit prezenei unui numr mare de alele private la nivelul acestei
populaii. Aceste rezultate sunt susinute i de studiul realizat de ROBLEDOARNUNCIO i ROUSET n 2010 n care a fost dovedit o difereniere mai mare ntre
populaiile aflate pe versanii opui ai aceluiai lan muntos, fa de populaiile aflate
pe versani opui n dou lanuri muntoase diferite, situate n aceeai vale. n cazul
nostru populaiile din Agnita i Vlcea se afl n aceleai condiii, explicnd astfel
diferenierea i respective gruparea n clustere diferite.
Fornd gruparea populaiilor studiate n 2 clustere am observat gruparea
populaiei din Agnita cu celelalte populaii, identificnd astfel o similaritate genetic
mai ridicat a acestei populaii cu celelalte comparative cu populaia din Vlcea. Acest
lucru se datoreaz probabil numrului mai mare de clustere dispuse n aceast
populaie, comparnd-o cu populaia din Vlcea.
Datorit faptului c acest program nu ia n considerare datele geografice, care
influeneaz puternic distribuia spaial, am impus separarea populaiilor n dou
grupuri, un grup n partea de centru vest a Romniei, lund n considerare populaiile
din Transilvania i Banat, mpreun cu populaia din nord vestul Ungariei, Fenyf, i
un grup al populaiilor n afara Arcului Carpatic, populaiile din Vlcea, Vrancea,
Suceava mpreun cu populaia din vestul Ungariei, Velemr.
Analiznd populaiile din primul grup, impunnd 5 clustere, am obinut un
maxim de 3 clustere. Primul cluster coninnd populaia din Agnita, care am observat
din nou ca se difereniaz de restul populaiilor, un al doilea cluster coninnd
majoritatea populaiilor, inclusiv populaia din Ungaria, care nu se difereniaz la
nivelul markerilor nucleari de celelalte populaii, i un al treilea cluster care conine
populaia din Baia de Arie. Observnd frecvena indivizilor din analiza gruprii pe
indivizi, observm o lips de variabilitate comparativ cu celelalte populaii. n aceast
21

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

populaie fiind inclui indivizi din doar dou clustere. Acest lucru se poate datora
managementului forestier, datorit folosiri de puiei, provenii din aceeai surs de
semine, la nfiinarea acestei suprafee forestiere.
Fornd gruparea populaiilor n dou clustere observm alipirea populaiei din
Baia de Arie la clusterul coninnd restul populaiilor, rmnnd un alt cluster
coninnd populaia din Agnita. Acest lucru se datoreaz faptului ca populaia din Baia
de Arie conine indivizi din cele dou cele mai frecvente clustere de indivizi, de aici
i similaritatea ridicat, comparativ cu populaia din Agnita.
Analiza grupului de populaii din exteriorul Arcului Carpatic, impunnd
formarea de 5 clustere, am obinut un maxim de 3 clustere. Primul cluster coninnd
populaia din Suceava, aceasta datorndu-se variabilitii mari ntlnite la nivelul
acestei populaii. Acest lucru poate fi observat prin prezena n aceast populaie a
indivizilor din toate cele 5 clustere de indivizi, dar separarea se datoreaz i prezenei
unui numr mare de indivizi din primul cluster, mai mare comparativ cu populaia din
Vrancea, acest grup de indivizi neregsindu-se n populaia din Vlcea. Al doilea
cluster grupeaz populaiile din Vrancea i Velemr, datorit similaritii distribuiei
alelelor. Al treilea cluster conine populaia din Vlcea, despre diferenierea creia am
discutat deja.
Fornd formarea a numai 2 clustere, se observ gruparea populaiei din
Suceava n clusterul format anterior de populaiile din Vrancea i Velemr. Populaia
din Vlcea rmne n continuare n cluster diferit.
Populaia din Vlcea pare sa fie cea mai diferit populaie dintre cele luate n
studiu n cadrul acestei populaii au fost observate att frecvene alele alelelor mult
diferite fa de medie ct i prezena unui numr mare de alele private. Urmtoarea
populaie care se difereniaz de restul populaiilor este cea din Agnita i este urmat
de populaiile din Baia de Arie i Suceava.
5.4.2 Analiza distribuiei spaiale pe baza datelor genetice i a domeniilor
teritoriale.
Acest tip de algoritm se bazeaz pe teselaia liber, i se numete aa deoarece
poligoanele sunt independente de situl de prelevare a probelor. Ideea central este ca
indivizii vecini au o probabilitate mai mare sa fie similari. Analiza datelor prin aceast
22

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

metod necesit dou etape. Prima, definirea vecinilor, n cazul teselaiei, vecintatea
indivizilor se bazeaz pe vecintatea poligoanelor de care aparin. A doua, modelarea
probabilitii ca indivizii vecini sa fie i similari. Rezultatul analizei este reprezentarea
grafic a poligoanelor n diferite culori. Fiecare culoare reprezint aparinerea
populaiei sau a populaiilor, din acel poligon, unui cluster. Aceast metod este greoi
de interpretat i necesit experien, deoarece fiecare grafic este generat diferit n
funcie de schema de recoltare a probelor.
Se poate observa lipsa unei structuri, ntre populaiile luate n studiu. Clustere
unice au fost observate la nivelul populaiilor din Timi, Hunedoara, Sebe,Vlcea,
Agnita, Vrancea, Suceava i Baia de Arie. Aceste Rezultate susin rezultatele obinute
n urma analizei distribuiei spaiale cu ajutorul programului BAPS. Populaiile
menionate mai sus prezentnd diferenieri profunde la nivelul frecvenelor alelelor.
5.4.3 Analiza distribuiei spaiale pe baza metodelor de coordonare
Cea mai popular metod este PCA (principal components analysis). Metoda
transform un set de observaii a unor variabile posibil corelate n valori necorelate
numite componente principale care ulterior pot fi ordonate (JOMBART et al., 2009
review).
Analiza PCA a componentelor principale calculate pe baza frecvenei alelelor a
dovedit existena unei zone cu frecvente sczute, i anume populaiile din Baia de
Arie, Sebe, Hunedoara i Vlcea. n aria de studiu pot fi observate i dou zone unde
PCA a determinat o frecven foarte ridicat, prima zon fiind n centrul rii i
cuprinde populaiile din Agnita, Gurghiu, Reghin i Toplia, a doua zon cuprinde
populaia din Timi i Cara-Severin. Cu valori medii ale frecvenei alelelor s-au
prezentat populaiile din Braov, Fenyf, Velemr, Suceava i Vrancea. n cadrul
acestei analize observam formarea a 5 clustere, dou cu frecvene alelice ridicate, dou
cu frecvene alelice medii, i un cluster cu frecvena alelic sczut.
5.4.4. Testul Mantel
Testele Mantel (MANTEL, 1967) sunt folosite, de obicei, pentru a evalua
corelaia dintre asemnrile i diferenele ntre matrici (MANTEL 1967; SOKAL i
ROHLF 1995).

23

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Corelaia dintre distana genetic i distana geografic, a fost determinat prin


testul Mantel n programul AIS Allele n Space (MILLER, 2005).
Rezultatele testului Mantel indic o valoare negativ a coeficientului de
corelaie (r) ntre distana genetic i distana geografic de -0,0582 nesemnificativ
statistic, cum de altfel se atepta lund n calcul aezarea geografic i orografia
regiunii luate n studiu.
Analiza autocorelaiei spaiale a fost folosit n vederea evidenierii structurii
genetice spaiale.
Aceast analiz a urmrit analiza distribuiei spaiale a frecvenelor alelice
pentru fiecare populaie. n cazul de fa, coeficientul de autocorelaie a fost calculat
ca medie a tuturor locilor polimorfici, pentru 10 clase de distan a cte 100 km
fiecare. Calculele privind autocorelaia spaial au fost efectuate cu ajutorul
programului AIS (MILLER 2005).
Pentru populaiile din Romnia i Ungaria pe baza rezultatelor ADN-ului
nuclear valoarea distanei genetice calculat pentru fiecare clas de distan Ay a avut
valori cuprinse ntre 0.53 i 0.63. Pentru media distanei genetice s-a nregistrat o
valoare de Ay = 0.5870 ceea ce denot faptul c indivizii din fiecare clas de distan
sunt diferii din punct de vedere genetic.
Se observ ns lipsa autocorelaiei spaiale n cazul datelor analizate. Nu exist
o izolare a populaiilor, diferenele dintre populaii nu sunt datorate distanei, de
exemplu populaiile din Ungaria i cea din Suceava sau Vrancea sunt situate la o
distan foarte mare una de cealalt ns diferenele genetice nu sunt datorate distanei.
Aceste rezultate sunt similare cu rezultatele Testului Mantel, evideniind
aceeai idee i anume, lipsa unei corelaii ntre distana genetic dintre
indivizi/populaii i distana geografic. Diversitatea dintre indivizi, respectiv populaii
s-a datorat mai degrab orografiei, munilor.
Metoda interpolrii a fost folosit pentru vizualizarea modelerelor diversitii
genetice n conformitate cu terenul/relieful zonei analizate. Am utilizat aceast metod
pentru a ntrii, confirma rezultatele obinute cu ajutorul programului BAPS i
TESS. Cum a fost de ateptat nu exist o grupare clar a populaiilor, structura lipsind.

24

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

5.4.5 Coeficientul de consangvinizare


Dei nu exist o evideniere a unei structuri spaiale specifice iar analizele
efectuate au evideniat o depresiune populaional foarte evident n toate populaiile,
aceste lucruri nu sunt datorate consangvinizrii.
Folosind programul Coancestry (WANG, 2007), am obinut coeficientul de
nrudire dup RIRLAND, 1996. Acesta este, nesemnificativ pentru toate populaiile.
6 CONCLUZII I RECOMANDRI
Extracia ADN a dat rezultate satisfctoare cu ambele protocoale folosite.
Markerii SSR nucleari sunt markerii ideali pentru determinarea variabilitii i
diferenierii n populaii de pin silvestru. Dei disponibilitatea de markeri este limitat
la aceast specie, ei pot fi cu succes transferai de la alte specii ale aceluiai gen.
n cadrul acestui studiu s-a reuit transferarea de amorse SSR de la Pinus taeda
la Pinus sylvestris.
Amorsei SSR M13 prezint amplificare nespecific de aceea nu au putut fi
folosii n acest studiu.
S-a reuit dezvoltarea a doua protocoale multiplex la Pinus sylvestris.
n cazul stemelor multiplex, ampliconii cu dimensiuni mici au emis un semnal
fluorescent mult mai puternic dect cei cu dimensiuni mari, datorit timpului necesar
pentru elongaie diferit. Semnalul ampliconilor mici a fost suficient de puternic sa
induc o eroare senzorului laser, semnalul fluorocromului albastru fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului verde, semnalul fluorocromului verde fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului albastru iar semnalul fluorocromului negru fiind perturbat cu
semnalul fluorocromului albastru, datorit absorbanei similare.
Concentraia iniial recomandat de manualul de utilizare a kitului a fost
schimbat, concentraia amorselor cu ampliconi mici a fost sczut iar concentraia
amorselor cu ampliconi mari a fost crescut pentru a putea observa semnalul emis de
acetia. Balansarea concentraiilor amorse a fost realizat la fiecare plac n parte
ncetnd sa obinem cromatograme cu semnal ct mai curat. De asemenea a fost
observat un semnal mult mai slab al fluorocromului D2, de aceea nu au fost folosii.
Volumul final al amestecului de amplificare a fost redus i el la 10 l (2,5 l
Master mix, mix de amorse cu volum variabil, ap ultra pur n volum variabil, 0,1 l
25

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Q, 1 l ADN 50ngl) pentru a reduce costurile de analiz, innd cont ca pentru


migrarea n electroforeza capilar a fost nevoie de 1 l de produs PCR.
De asemenea volumul bufferului de ncrcare i volumul de standard intern din
kitul de analiza prin electroforeza capilar au fost reduse pentru reducerea costurilor.
Volumul de Formamida folosit i volumul de standard intern au fost reduse din acelai
considerent. Volumul pentru restul reactivilor a rmas neschimbat pentru buna
funcionare a electroforezei capilare.
Dup optimizarea sistemului multiplex la pinul silvestru, putem concluziona c
aceast metod a crescut eficiena procesului de genotipizare, a redus substanial
costurile i timpul de lucru necesar pentru genotipizarea unui numr mare de probe.
Toate probele prelevate din Romnia i Ungaria au fost analizate folosind
sistemul multiplex cu amorsei testai n multiplexul 1 i 2. A fost observat un
polimorfism crescut n ceea ce privete locusul amplificat de amorsa SPAC 12:5,
locusul amplificat de amorsa PtTx 3020, au prezentat un polimorfism sczut, iar restul
locilor amplificai au prezentat polimorfism mediu.
La locusul SPAC 12:5 au fost observate 45 de alele iar la locusul PtTx 3020 au
fost evideniate 9 alele.
Markerii nucleari sunt ideali n analiza variabilitii n populaii, spre deosebire
de markerii mitocondriali i cloroplastici care sunt folosii n special pentru a evidenia
structura genetica a populaiilor n timp i spaiu.
La nivelul markerilor nuclear nu a fost observat o structur spaial clar.
Acest lucru se datoreaz att transmiterii pe cale maternal ct i pe cale paternal a
acestor marker, ct i datorit proceselor de recombinare.
Gruparea anumitor populaii n clustere diferite se datoreaz alelelor private
evideniate la diferii loci.
Diferenierea genetic a populaiilor de pe teritoriul Romniei nu se datoreaz
distanei geografice dintre acestea ci mai degrab datorit orografiei, munilor. n acest
sens Munii Carpaii au funcionat ca o barier cu privire la diversitatea genetic dintre
populaiile de pin silvestru, respectiv n procesul de reproducere, (diseminare a
seminelor, polenului) i schimbului de gene ntre populaii.

26

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

n toate populaiile studiate pot fi observate, pe baza rezultatelor obinute,


evidene clare a unei depresiuni genetice anterioare. Declinul populaional i are
originea n era glaciar (acum 1000 de generaii, 20000 de ani) i continu i astzi.
Rezultatele obinute demonstreaz clar c populaiile de pin silvestru din Romnia i
Ungaria au fost timp ndelungat sub influena driftului genetic i a presiunii selective.
Aceast ipotez a fost verificat cu ajutorul analizei M-stat propus de GARZA i
WILLIAMSON n 2001.
Fluctuaiile observate n populaii, alelele unice, gruparea populaiilor n
clustere i diferenierea populaiilor pot fi folosite n conturarea strategiilor de
conservare.
Efecte profunde ale acestui proces de depresie explic valori aa de sczute la
nivelul acestui indice. Simulri realizate de GARZA i WILLIAMSON n 2001 au
artat c unei populaii, care a suferit un declin major i dimensiunea populaiei
rmne mic, i sunt necesare cteva sute de generaii pentru ca acest indice a creasc
la nivelul normal.
Posibilitatea ca o parte populaiile din Romnia sa fie la rndul lor relict glacial,
mpreun cu cele din Ungaria i Bulgaria. n plus fa de efectele migraiei post
glaciale, istoria i izolarea geografic a putut contribui la depresia populaional
observat din analizele efectuate.
Analizele statistice au dovedit ca nu exist consangvinizare ntre populaii.
Se recomand meninerea resurselor genetice n aceast distribuie prin
folosirea in repopulare a puieilor provenii din surse de semine situate n aceeai zon
geografic.
Recomandm de asemenea continuarea cercetrilor n ceea ce privete
populaiile de pin silvestru din Romnia, prin intermediul studiilor bazate pe urmrirea
caracterelor fenotipice. Acest lucru poate fi realizat prin nfiinarea de loturi
experimentale, n diferite regiuni ale rii, cu diferite proveniene de pin silvestru,
pentru evaluarea acestor caractere.

27

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

Rezumatul tezei de doctorat

Bibliografie selectiv
Selective references
1.

AL-RABABAH M.A., WILLIAMS C.G. 2004, An ancien bottleneck n the

Lost Pines of central Texas. Mol Ecol 13:10751084


2.

AUCKLAND L.D., BUI T., ZHOU Y., SHEPHERD M., WILLIAMS C.G.

2002. Conifer Microsatellite Handbook. College Station, TX, USA Texas A & M .
University
3.

DOYLE J.J.D. I DOYLE J.L., 1987, A rapid DNA isolation procedure for

small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin of the American


Mathematical Society 19: 1-15.
4.

GARZA J.C., WILLIAMSON E. 2001 Detection of reduction in population size

using data from microsatellite DNA. Molecular Ecology 10: 305-318


5.

MANTEL, N.A. 1967. The detection of disease clustering and a generalized

regression approach. Cancer Res. 27: 209 220


6.

MILLER M.P. 2005. Alleles In Space: Computer software for the joint analysis

of interindividual spatial and genetic information. J Hered 96: 722724.


7.

NAYDENOV

K.D.,

M.K.

NAYDENOV,

F.

TREMBLAY,

A.

ALEXANDROV, L.D. AUBIN-FOURNIER 2011. Patterns of genetic diversity that


result from bottlenecks n Scots Pine and the implications for local genetic
conservation and management practices n Bulgaria. New Forest 42:179193
8.

NEI M.,1972 Genetic distance between populations. The American Naturalist,

vol.106,pp. 291-296.
9.

OSZLANYI J., GRODZINSKA K., BADEA O., SHPARYK Y., 2004, Nature

conservation n Central and Eastern Europe with a special emphasis on the Carpathian
Mountains. Environ Pollut 130: 127-134.
10.

ROBLEDO-ARNUNCIO J.J., F. ROUSSET 2010 Isolation by distance n a

continuous population under stochastic demographic fluctuations. J Evol Biol


23(1):5371
11.

WANG J., 2007 Triadic IBD coefficients and applications to estimating parwise

relatedness. Genet. Res. 89:135-153

28

Drd. Ing. Laura tefana GANEA

12.

Rezumatul tezei de doctorat

WORLDBANK 2002. Romania-Forest Development Program. Report No.

PID8602. The World Bank,Washington, USA.

29

S-ar putea să vă placă și