Sunteți pe pagina 1din 11

Analiza postelectroforetica prin metoda Western Blot

Metoda Western blot este una din metodele de baza utilizate in laboratoarele de biologie
celulara si moleculara. Folosita corect, aceata metoda duce la rezultate usor de
interpretat, unice, lipsite de ambiguitate, care pot fi utilizate ca atare sau in completarea
altor metode de imunomarcare, in cercetare sau in diagnosticul de laborator.

1. Notiuni generale: definitia metodei, denumirea metodei


Definitie:

WB, cunoscuta si sub denumirea de imunoblot, este o tehnica analitica

pentru identificarea unei proteine specifice dintr-o proba de omogenat tisular sau celular,
ori din probe biologice lichide (ser sau LCR).
Tehnica WB aduce informatii concrete si utile care nu pot fi puse la dispozitie prin alte
metode de imunomarcare.
Daca proteina, desi prezenta in proba, este moficata calitativ sau cantitativ, se poate
observa prin prezenta unei benzi mai subtiri, mai groase, pozitionata mai sus sau mai
jos fata de banda proteinei martor sau chiar prin prezenta a doua benzi in loc de una.
Aceste modificari fata de o proba martor, cu o proteina normala, ne da urmatoarele
indicatii: fie proteina tinta este degradata, fie este cantitativ redusa sau in exces, fie este
glicozilata sau formeaza multimeri. De asemenea ne poate ghida catre o investigatie
genetica in cazul unei deletii partiale sau duplicatii in gena respectivei proteine.
De asemenea metoda WB permite compararea expresiei proteinei tinta in mai multe
probe, fie in acelasi tesut, fie in tesuturi diferite, in scop de cercetare sau diagnostic,
indicand modificari patologice sau ca raspuns la un anumit tratament.
W. Neal Burnette a denumit aceasta tehnica, in 1979, ca un joc de cuvinte derivat de la
tehnica Southern blot, o tehnica utilizata pentru detectarea ADN, pusa la punct de Edwin
Southern (1975). In mod similar, tehnica de detectare a ARN, a fost denumita Northern
blot, iar detectarea modificarilor post-translationale a proteinelor se numeste Eastern
blot. Metoda WB a fost pusa la punct in laboratorul prof. George Stark, la Stanford, de
catre Harry Towbin si col., in 1979, iar ulterior a suferit multe modificari si imbunatatiri.

2.Principiul metodei
Pentru identificarea proteinei tinta, proteinele din proba biologica trebuie intai separate
in functie de greutatea lor moleculara prin electroforeza in gel de poliacrilamida,
transferate apoi pe un suport solid, membrana de nitroceluloza sau PVDF, urmand
imunodetectia proteinei urmarite, cu anticorpi specifici.
Odata detectata, sceasta proteina va fi vizualizata printr-una din metodele ce pot fi
utilizate in acest sens, in functie de posibilitatile si experienta laboratorului:
chemiluminiscenta, chimica, imagistica.
WB este asadar o tehnica in 4 pasi:

Electroforeza in gel a probei care contine proteina de interes

Transferul electroforetic al proteinei tinta de pe gel pe membrana (Blotare)

Imunomarcarea proteinei de interes cu anticorpi specifici

Vizualizarea proteinei tinta

Fig.1 Principalele etape ale metodei Western blot: 1) Electroforeza SDS-PAGE; 2)


Transferul proteinelor de pe gel pe membrana (blotarea); 3) Imunomarcarea si
Vizualizarea proteinei de interes din probele biologice.

3. Pregatirea probelor biologice


a) Obtinerea lizatului tisular
Este esental ca probele de tesut sa fie pastrate in bune conditii, astfel incat proteinele sa
nu fie distruse. Inca de la recoltarea probelor biologice, acestea trebuie pastrate la rece,
pe gheata, in timpul transportului si manipularii, pentru a reduce la maxim proteoliza,
defosforilarea sau denaturarea proteinelor.
-

Tesutul se omogenizeaza astfel incat proteinele celulare sa fie eliberate si


solubilizate. Se utilizeaza o solutie tampon de liza, care contine obligatoriu
inhibitori de proteaze si/sau fosfataze, in care se omogenizeaza tesutul, cu
ajutorul unui omogenizator. Raport optim: 1-5 mg tesut/1 ml tampon de liza.

Centrifugare la 40C, 20 minute, la 12.000 rpm.

Se recolteaza supernatantul. Se pastreaza timp timp de 2-3 luni la -20 0C sau


pentru mai mult timp la -800C.
b) Obtinerea lizatului celular

- Celulele se recolteaza din recipientul de cultura,


- se spala se centrifugheaza,
- depozitul de celule se resuspenda in tampon de liza cu inhibitori de proteaze. Toate
aceste operatii se fac pe gheata.
Denaturarea proteinelor se face pe de o parte prin fierbere (la 95-1000C, 5
minute), in prezenta de SDS (Sodium Dodecyl Sulfat).
Se pierde structura secundara si tertiara a proteinei, se faciliteaza accesul
anticorpilor la epitopi (secventa de aminoacizi recunoscuta de anticorp). SDS este
continut in reactivul Laemmli, in solutia tampon de electroforeza (de migrare) si uneori
se poate adauga si in solutia tampon de liza (in functie de reteta utilizata).

Fig. Pregatirea probelor biologice inainte de electroforeza: omogenizarea probei


biologice in tampon de extractie cu un omogenizator Potter; calcularea concentratiei
proteice; denaturarea termica a proteinelor.

2.2.4. Electroforeza in gel


Electroforeza SDS-PAGE, este procedeul prin care proteinele migreaza, in gel, intr-un
camp electric si se separa in functie de greutatea lor moleculara. Se utilizeaza o solutie
tampon de migrare care contine SDS si care se adauga in tancul de electroforeza.

Fig. 2 Suporturi cu geamuri montate pentru turnarea gelurilor.

Fig. 3 Electroforeza SDS-PAGE: tanc pentru electroforeza; suport cu electrozi pentru


geluri.

5. Transferul proteinelor (Blotarea)


Dupa ce proteinele s-au separat pe gel, urmeaza transferul lor pe un suport mai dur si
usor de manipulat, pentru analiza lor ulterioara. Metoda de blotare in camp electric
(Towbin et al., 1979) este utilizata in cele mai multe laboratoare, fiind fiind rapida si
eficienta. Campul electric este orientat perpendicular pe suprafata gelului si membranei.
Exista doua sisteme principale de transfer al proteinelor de pe gel pe membrana:

semi-uscat

umed

Gelul si membrana sunt asamblate intr-un sistem sandwich, intre hartii de filtru,
eventual bureti, care sa le protejeze si sa le mentina in contact strans. Important:
plasarea membranei sa se faca intre gel si electrodul pozitiv, astfel ca proteinele
incarcate negativ sa migreze dinspre gel spre membrana. In timpul montarii
sandwich-ului trebuie sa se indeparteze cu grija bulele de aer.

Solutia tampon utilizata in acest caz este solutia tampon de transfer,


(asemanatoare celei de la electroforeza), dar nu contine SDS. Contine metanol,
care ajuta proteinele sa se lege de membrana.

Membranele pentru transfer sunt membrana de nitroceluloza si membrana PVDF


(polyvinylidene difluoride).
- Transferul se face dinspre catod spre anod. Se mentine fie amperajul, fie voltajul
constant.
Transferul umed. Se utilizeaza un tanc plin cu solutie tampon de transfer, in care se
scufunda caseta/casetele cu sandwich-ul gel/membrana/hartie de filtru/bureti, puse intro anumita ordine si in conexiune cu pozitia fata de catod si anod.
In tanc se pune obligatoriu si un suport care contine gheata (in functie de tipul de suprt
se utilizeaza apa sau tampon inghetat), deoarece in timpul transferului se degaja
caldura.

Fig. 3 Ordinea componentelor sandwich-ului de transfer in cazul modului de


transfer umed

Fig. 4 Transferul umed: tanc de transfer cu capac, suport cu electrozi, suport


pentru sandwich-ul de transfer alcatuit din gel, membrana, hartie de filtru si bureti.

6. Imunomarcarea

Imunomarcarea proteinei de interes se face cu anticorpi specifici.


Se pot utiliza:
marcarea directa care utilizeaza un anticorp primar directionat contra proteinei

tinta, legat cu o substanta de marcaj.


Marcarea indirecta, utilizeaza un anticorp primar anti-proteina tinta si un anticorp
secundar directionat contra anticorpului primar, acesta fiind legat cu substanta de
marcaj.
Pasii imunomarcarii:
Blocarea: previne

legarea

nespecifica

anticorpilor

pe

suprafata

membranei,prin incubarea cu o solutie proteica, neutra in raport cu protocolul


de imunomarcare. Se recomanda lapte degresat 5% in tampon TBS (solutie
tampon TRIS), ori BSA (bovine serum albumine) 3-5% in TBS. Pentru detectia

fosfoproteinelor se recomanda blocarea cu BSA, deoarece laptele contine


fosfoproteine (caseina) care pot interfera cu imunodetectia. Timpul de blocare:
30 minute Dupa blocare, membrana se spala cu TBST (TBS+Tween20, un
detergent), 5 min.

Incubarea cu anticorpi specifici: se incubeaza membrana cu solutia de


anticorpi specifici (marcati sau nu), timp de 2 ore la temperatura camerei sau
peste noapte la rece. Peste membrana se toarna solutie de anticorp de
detectie (diluati corespunzator in TBS. Optimizarea dilutiei anticorpilor sa se
faca de fiecare data cand se lucreaza cu un anticorp nou).

Pentru a intensifica semnalul, se utilizeaza anticorpi secundari cuplati cu


biotina.

Dupa incubarea cu anticorpul primar, membrana este spalata cu TBST.

Atat blocarea, spalarile, cat si incubarea cu anticorpi a membranei trebuie


facute cu suficient reactiv cat sa spele bine membrana, pe un agitator.
Membrana nu trebuie in nici un caz sa se usuce.

Se adauga anticorpul secundar (cuplat cu o enzima, peroxidaza, HRP


horseradish peroxidase sau fosfataza alcalina, AP) detectabila prin utilizarea
unui substrat care produce un semnal vizibil, sau un marker fluorescent.

Nota: in cazul sistemului ce utilizeaza anticorpi biotinilati, se adauga o enzima


cuplata la streptavidina, care permite cuplarea la biotina de pe anticorp.

Fig.4 Detectia proteinei de interes prin imunomarcare pe membrana: incubare cu


anticorpul primar specific; incubare cu anticorpul secundar cuplat cu o enzima;
vizualizarea substantei de marcaj cu ajutorul unui substrat enzimatic.

7. Vizualizarea proteinei de interes.


Cea mai utilizata enzima ca substanta de marcaj, legata de anticorpul primar, este HRP.
HRP este detectata cand vine in contact cu o solutie cu substrat pentru aceasta enzima,
un reactiv chimic cu care interactioneaza si produce un semnal vizibil, detectabil
colorimetric sau chemiluminiscent.
Substratul pentru HRP este DAB (diaminobenzidina), care produce o culoare maro.
Detectia dureaza de la cateva minute la cateva ore, pana apar benzile vizibile unde se
afla proteina tinta.
Alternative

moderne:

chemiluminiscenta,

ECL

(enhanced

chemiluminescence).

Substratul utilizat este luminolul, care este oxidat de HRP in prezenta H 2O2, producand
lumina. Aceasta este detectata prin expunera membranei unui film radiologic Timpul de
detectie este scurt, de la cateva secunde, la 30 minute (rareori mai mult). Filmul
developat, poate fi pastrat permanent, iar vizibilitatea este foarte buna.

Metoda WB aplicata in diagnosticul medical


Diagnosticul infectiilor virale
-

Confirmarea testelor HIV in cazuri neconcludente

Hepatita B

Confirmarea testelor FIV la feline, in medicina veterinara

Diagnosticul infectiilor bacteriene


-

Boala Lyme

Diagnosticul infectiilor parazitare


-

Protozoare (exemple: Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum)

Viermi (exemple: Trichinella spiralis, Fasciola hepatica, Capillaria sp.)

Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora


-

Encefalopatia spongiforma bovina (boala Creutzfeldt-Jakob)

Distrofii musculare

Unele forme de cancer

BIBLIOGRAFIE
Moore C - Introduction to Western Blotting, LIT CMr 2009 1 MorphoSys UK Ltd 2009
All rights reserved Published by MorphoSys UK Ltd Endeavour House, Langford
Business Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GE, UK
Bolt M and Mahoney P High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Anal Biochem. (1997) 247,
185-192
Burnette W N - Western Blotting: Electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic
detection with antibody and radioiodinated protein, Anal Biochem (1981) 112, 195-203
Hames B D and Rickwood D - Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 3
Rd Edition, The Practical Approach Series, Oxford University Press, 1998.
Towbin H et al Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A
(1979) 76, 4350-4354
Towbin H and Gordon J - Immunoblotting and dot immunobinding--current status and
outlook, J Immunol Methods (1984) 72, 313-340