Sunteți pe pagina 1din 5

Cuvnt nainte

Bio-tehnologiile constituie ansamblul de tehnici metode i procedee care utilizeaz sisteme


biologice, n vederea producerii de bunuri i servicii. Domeniile de aplicare a bio-tehnologiilor sunt
multiple, iar miza lor economic este considerabil: agricultur i industrie alimentar, industriile
farmaceutic i cosmetic, industria chimic i a proteciei mediului, sntate; toate acestea
integrnd i dezvoltnd noi mijloace i procedee generate de bio-tehnologii.
Evoluia rapid a cunotinelor n tiinele biologice i emergena noilor concepe sunt acelea
care au permis recunoscuta explozie a bio-tehnologiilor. Pentru a le cuprinde i nelege, sunt
absolut indispensabile solide cunotine de: biochimie, microbiologie, biologie celular i
molecular. De asemenea, producia de celule i, respectiv, molecule asociate acestora, la scar
industrial, implic existena unei bune cunoateri a problemelor de inginerie a proceselor i de
inginerie biochimic, ca i a principalelor tehnici de analiz instrumental i de msur, utilizate n
producia de scar mare.
Tehnologiile enzimatice, ca proceduri de aplicare a proceselor enzimatice n practica
productiv, fcnd parte din grupul bio-tehnologiilor de scar mare, sunt dintre acestea din urm
cele mai apropiate (asemntoare) de tehnologiile chimice catalitice clasice.

I. Elemente de biotehnologie
I. 1.Generaliti, clasificri i sistematizri asupra proceselor tehnologice bioindustriale
Dac am aborda schematic structura unui proces tehnologic bioindustrial, n general, prin
esenializare, atunci principalele componente ale unui asemenea model, prezentate n figura de mai
jos, vor fi urmtoarele:
sua microbian (celular) sau factorul (agentul) biologic, ca element fundamental al
bioprocesului;
mediul de cultur sau materiile prime ori, n general, substratul bioprocesului;
compuii biochimici sau produii biosintetizai pe parcursul desfurrii bioprocesului;
ansamblul dispozitivelor, aparatelor i utilajelor prin intermediul cruia se nfptuiete
bioprocesul (aparatura tehnologic);
totalitatea procedurilor i metodelor de operare i de lucru pentru asigurarea punerii n valoare
a factorului biologic i a realizrii bioprocesului n condiii optime, adic biotehnologia.

BIOTEHNOLOGIA

MATERIILE
PRIME

FACTORUL
BIOLOGIC

APARATURA
TEHNOLOGIC

PRODUSELE
FINITE

Figura: Structura schematic a unui proces tehnologic bioindustrial.


n legtur cu acest model schematic, este de menionat c: ntr-un bioproces tehnologic o
parte important a operaiilor i procedurilor componente ale ansamblului biotehnologiei sunt
nemijlocit legate de agentul (factorul) biologic, fr a avea ns, o influen direct asupra
produselor finite, astfel dect doar prin intermediul respectivului factor biologic.

I. 2. Selecia microorganismelor productoare


Mecanismele biochimice prin care este reglat biosinteza celular a enzimelor se bazeaz
pe: inducie, inhibiie (feed-back i feed-back cooperativ) i represie (feed-back i catabolic).
Pe scurt, iat n ce const mecanismul induciei enzimatice. De pild, -galactozidaza de E.
coli, care este o enzim inductibil, n lipsa substratului (lactoza), este bio-sintetizat ntr-o
cantitate mic (1 3 molecule/celul), dar, dup apariia, n mediul de cultur, a unui -galactozid
(substrat sau analog al acestuia), masa de microorganisme bio-sintetizeaz cca. 3000 de molecule
enzimatice/celul.
Acest proces poate fi explicat pe baza mecanismului de funcionare al secvenelor genetice
implicate n biosinteza enzimei respective. Astfel, secvena semnal sau operator, care precede gena
structural a enzimei, este complexat, prin legarea, la respectivul situs operator, a unei proteine
represoare, codificat de o gen regulatoare; inhibndu-se, n acest mod, transcrierea genei
structurale fenomen denumit represie enzimatic toate acestea manifestndu-se n absena
inductorului. Atunci cnd acesta este prezent i se manifest, el se leag la proteina represor
inactivnd-o i decomplexnd operatorul, care, rmnnd liber, permite transcrierea genei
structurale i, deci, biosinteza enzimei.
n cazul inhibiiei, care opereaz la nivelul cilor anabolice ale metabolismului, rolul de
regulator-inhibitor l are produsul sau ansamblul produilor finali ai unui lan de reacii enzimatice,
care acioneaz prin proces feed-back simplu sau cooperant asupra biosintezei primei enzime din
lanul biochimic. Pentru asemenea secvene anabolice complexe, procedeul al doilea, mai sofisticat,
(cooperant) presupune c produsul final intervine tot printr-un proces feed-back, dar n rol de
corepresor, care transform represorul inactiv ntr-unul activ, inhibnd, astfel, transcrierea genei
structurale, ce codific enzima primei reacii biochimice din ciclu sau serie.
Revenind la exemplul anterior, dac n mediul de cultur al E. coli se introduce glucoza,
atunci biosinteza -galactozidazei este represat, chiar dac n mediu exist i un -galactozid
fenomen numit (de data aceasta) represie catabolic ; n acest caz metabolismul (catabolismul)
celular fiind optimizat prin utilizarea glucozei, glucidul cel mai uor de consumat.
Abordnd biosinteza enzimatic, din punctul de vedere al tehnicilor de inginerie molecular
enzimatic, pot fi catalogate dou categorii de enzime:
- proteine enzimatice controlate cromozomial, determinate de caracteristicile speciei fiind
dominante i
- proteine enzimatice controlate extra-cromozomial, de episomi i plasmide, implicate n ci
metabolice secundare, manifeste, de regul, atunci cnd creterea microorganismelor
ncetinete, n plus, fiind uor de pierdut (sau ctigat) prin mutaii genetice.
Aceste din urm enzime, de natur extra-cromozomial, au o importan practic special,
pentru c, prin intermediul lor, producia poate fi crescut substanial, pe calea ingineriei genetice.
Astfel, prin asemenea tehnici, se pot realiza mutaii la nivelul secvenei genei regulatoare
enzimatice sau a situs-ului operator de dinaintea genei structurale a enzimei respective, ceea ce
genereaz apariia aa-numiilor mutani constitutivi, care bio-sintetizeaz enzimele dorite, n
cantiti mari, indiferent dac n mediu se gsete sau nu vreun inductor ori represor (corepresor).
Aadar, organismul selecionat trebuie s furnizeze o bun producie de enzime, ntr-un
minimum de timp posibil. De asemenea, enzimele extracelulare sunt preferabile acelora
endocelulare, dac se iau n consideraie dificultile de extracie-purificare (cazul enzimelor din a
treia clas hidrolazele, majoritare ntre bio-catalizatorii industriali). Sua utilizat n producie, pe
lng faptul c trebuie s se dezvolte pe substraturi simple i ieftine, mai trebuie s nu produc
molecule antibiotice toxice i, n acelai timp, s creeze ct mai mici cantiti de subproduse de
interferen, ca: pigmeni, polizaharide i mai ales proteaze.

Principalele microorganisme utilizate n acest domeniu sunt: bacterii (Bacillus), fungi


(Aspergillus), dar i actinomicete, care, toate, trebuie s fie ntr-o stare optim la inoculare (o bun
sporulare la Aspergilli de exemplu).
Aadar, mutanii selecionai trebuie s fie constitutivi, nesupui inhibiiei sau represiei ori,
chiar, s posede caracteristici de amplificare genetic (ADN extra-cromozomial).
Cum microorganismul productor al enzimei dorite trebuie s prezinte nite caracteristici
proprii acestei utilizri, aa cum este, pe lng lipsa din spectrul subproduselor a contaminailor
enzimei menionat , i nesporularea n timpul cultivrii, este, de asemenea, necesar ca
respectivul tip de organism s fie categorisit (caracterizat) din punct de vedere taxonomic, n
vederea reproductibilitii bio-tehnologiei, dar i a patentrii, eventuale, a bio-procesului. n acelai
scop, trebuie realizate cercetri n vederea, att a utilizrii cu maxim eficien a mediului de
cultur, ct i a mbuntirii stabilitii genetice a tulpinii, respectiv: meninerea independenei de
inductori, lipsa sensibilitii fa de represori sau constana amplificrii genetice (principiul biotehnologiei).
Metoda clasic de transformare a unui productor de enzim nedorit ntr-un mutant
generator al enzimei cutate este evideniat de urmtorul exemplu: izolarea unui mutant fr
transferaz dintr-o tulpin de A. niger generatoare de amiloglucozidaz. Aceasta din urm
catalizeaz (printre altele) hidroliza maltozei la glucoz, n timp ce transferaza faciliteaz apariia
izomaltozei sau panozei, scznd, astfel, randamentul produciei de glucoz. Procedeul tehnic
const din producerea mai multor culturi diferite de A. niger, care sunt pulverizate pe agar, iar
coloniile sunt izolate i incubate cu maltoz, dac ntr-unul dintre mediile de incubare se identific
prezena glucozei ntr-o concentraie crescut, fa de celelalte culturi, atunci colonia respectiv este
reprezentat de un mutant fr transferaz.
Dup ce proprietile tulpinii productoare de enzim au fost mbuntite, satisfcnd
necesitile produciei industriale (tehnologice), este esenial evitarea degradrii, prin conservarea
respectivului material de inoculare. Aceasta se realizeaz relativ uor, prin liofilizarea culturii sau,
n cazul microorganismelor nesporulante, prin pstrarea n azot lichid.
I. 3. Medii nutritive pentru cultivare
Pentru c majoritatea fermentaiilor efectuate n scopul obinerii de enzime trebuie realizate
pe medii nutritive cu, relativ, puine componente, n vederea evitrii complicaiilor costisitoare de la
etapa final de extracie-purificare, alegerea acestora trebuie s fie ghidat de urmtoarele
considerente:
- s fie accesibile n cantiti mari i la preuri de cost reduse, precum i
- s nu conin contaminani toxici i s aib o compoziie constant (reproductibil).
De asemenea, constatndu-se c anumite substane au o aciune pozitiv asupra produciei
enzimatice a microorganismelor (ageni tensio-activi, fosfatidil-inozitolul etc.), trebuie luat n
considerare, la proiectarea i optimizarea coninutului mediilor nutritive, i o cercetare n acest sens,
pentru depistarea naturii unor astfel de activatori, ca i a concentraiilor optime n care acetia
trebuie s fie introdui n mediile de fermentaie respective.
n general, mediile nutritive tehnologice pot fi de natur sintetic, dar i complexe, care sunt
mai puin costisitoare i, deseori, mai eficiente bio-tehnologic. Acestea trebuie s conin substratul
principal, respectiv, sursa de carbon-energie, precum i pe aceea de azot, dar i srurile minerale
necesare, mpreun cu factorii de cretere indispensabili.
Sursele de carbon-energie cele mai frecvent utilizate sunt, printre altele: fini de cereale,
fin de soia, amidon de cartofi, tre de gru sau orez, melase.
Sursele de azot organic sunt cel mai frecvent: finurile de pete, gelatina, caseina, fina de
soia, trea sau peptonele.

Factorii de cretere i oligoelementele sunt aduse de: extractul de drojdie, extractul de


germeni de porumb (corn-steep) sau din cornul secarei, uleiuri vegetale, fini din semine
oleaginoase (roturi) etc.
n mod obinuit, mediile utilizate pentru conservarea suei sau pentru producia de spori
sunt diferite de acelea ntrebuinate la realizarea inoculului sau necesare biosintezei propriu-zise a
enzimei. Prezent n mediul nutritiv de lucru trebuie s fie i inductorul biosintezei enzimatice, dar
fr ca acesta s fie nsoit i de eventuali represori. Compuii cu rol inductor sunt substane ca:
amidonul pentru amilaze, ureea pentru ureaz, xiloza pentru xiloz-izomeraz etc. Este de remarcat
c exist molecule care acioneaz ca inductori la concentraii mici i ca represori la doze crescute,
de exemplu, celobioza la celulaze.
S-a constatat, frecvent, c un efect inductor puternic l prezint analogi de substraturi, ca un
izopropil--D-tiogalactozid pentru -galactozidaz ori derivai ai substraturilor ce sunt lent
degradai, cum ar fi palmitatul de zaharoz pentru invertaz. Produii reaciilor enzimatice pot, n
aceeai msur, aciona ca inductori: maltodextroza pentru -amilaz sau maltoza pentru
pullulanaz. Exist citri de asemenea molecule inductoare, cum sunt: maltodextrinele pentru
amilaza de Bacillus stearothermophilus, izomaltoza pentru dextranaza de Penicullium sp.,
maltoza pentru pullulanaza de Klebsiella, kynurenina pentru triptofan-oxigenaza de
Pseudomonas, acidul alofanic pentru ureocarboxilaza de Saccharomyces cerevisiae etc.
n cazul inhibiiei, pentru unele enzime catabolice, produsele directe sau indirecte ale
activitii lor le inhib biosinteza, cel mai bun exemplu fiind proteazele de Bacillus, a cror
producie este blocat de aminoacizi. De asemenea, un produs final este frecvent inhibitor i n
cazul biosintezei altor tipuri de enzime: obinerea glutamat-dehidrogenazei de ctre Bacillus
licheniformis este inhibat de glutamat i hidrolizatele caseinei, iar producerea triptofan-sintazei
este inhibat, desigur, de triptofan.
Alegerea sursei de carbon-energie, ca i a aceleia de azot mineral sau organic, este
important n privina apariiei represiei catabolice. Astfel, concentraiile ridicate de zahr rapid
asimilabil, cum este glucoza, pot antrena represia biosintezei diverselor enzime. Exist, din nou,
diverse exemple n acest sens: glucoza, celobioza, glicerina, amidonul reprim celulaza de
Trichoderma viride; glucoza inhib biosinteza invertazei de Aspergillus nidulans; glucoza, dar
i arabinoza, pe aceea a pectin-transeliminazei de Penicilium expansum i, de asemenea,
producerea de poligalact-uronaz de ctre Aspergillus niger este inhibat, att de glucoz, ct i
de acidul galacturonic.
I. 4. Fermentaii industriale
Principalele dou tipuri de fermentaii pentru obinerea, pe cale bio-industrial a enzimelor,
din punctul de vedere al condiiilor de cretere i aerare ale productorului microbian sunt:
a) culturile de suprafa pentru fungi acum puin utilizate i
b) culturile submerse (scufundate) moderne.
n cazul primelor, substraturile solide sau semi-solide sunt inoculate cu spori, faza de
cretere i dezvoltare a miceliilor generate de acetia durnd 1 7 zile, perioad n care controlul
temperaturii i umiditii este important. La finalul creterii, masa filamentoas este omogenizat i
uscat, pn la 10 12% din cantitatea iniial; pulberea obinut fiind utilizat, frecvent, n mod
direct sau supus extraciilor n ap ori n soluii saline, utiliznd extractoare ce funcioneaz n
sistemul contra-curentului.
Fermentatoarele (vasele de reacie), cu volume de la 1 m 3 pn la 10 m3 i chiar 100 m3,
prevzute cu agitare, sistem de preluare a cldurii, aerare i sisteme de msur i control, sunt
principalele utilaje n care are loc biosinteza enzimelor sau a altor metabolii primari ori chiar
secundari de ctre culturile microbiene submerse. Perioada de desfurare a unor asemenea bioprocese este de 50 150 de ore pentru sistemele discontinue (batch) i de peste 200 ore n cazul

sistemelor semi-continue (fed-batch) sau chiar continue, pentru acelea ce funcioneaz n acel
regim.
La fermentaiile n care bio-sistemele sunt inductibile sau afectate de represia catabolic,
biosinteza maximal (optim) se realizeaz, de regul, n timpul fazei staionare de cretere
microbian (pentru metaboliii secundari). Astfel, mai nti este obinut bio-masa microbian, dup
care, eventual, n alt bio-reactor, se realizeaz i biosinteza enzimelor dorite (de regul, n alte
condiii de mediu), cu ajutorul crora se obin i metaboliii dorii. Aadar, factorii de optimizat n
asemenea situaii sunt: cantitatea de inocul, temperatura, pH-ul, agitarea, aerarea cu presiunile
pariale ale oxigenului i bioxidului de carbon etc. n plus, adugarea de antispumani, n prima
faz, mpiedic diminuarea volumului de lucru al fermentatorului, iar introducerea n bio-reactor a
unor tensio-acivi adecvai, n aceea din urm, poate conduce la creterea nivelului excretrii de
coenzime extracelulare, favoriznd, astfel, i extractibilitatea lor, din etapa de extracie-purificare a
bio-tehnologiei.
Cteva exemple vor fi edificatoare:
Exist proteaze i pectinaze de Aspergillus care sunt nc produse prin culturi de
suprafa, pe medii semi-solide, deoarece cantiti mici de ap i un grad nalt de aerare favorizeaz
biosinteza acestor bio-catalizatori.
n cazul fermentaiilor submerse discontinue (procedeul batch), faza de cretere
microbian (iniial) dureaz, de obicei, 10 25 ore, producerea enzimei dorite putndu-se realiza,
fie pe toat durata fermentaiei (enzimele comune pentru bio-procese generale), ori doar n ultima
ei parte, n funcie de condiiile de mediu sau capacitatea productorului (enzimele specifice
pentru reacii biochimice singulare).
Deseori, este utilizat i procedeul fed-batch, n care fermentaia este continuat (spre 100
150 ore i chiar mai mult), prin adugarea de mediu nutritiv proaspt, asemntor sau diferit
(eventual, doar unele componente) de acela iniial, pn cnd se manifest pierderea capacitii de
producie a microorganismului. Asemenea culturi sunt tot submerse, dar considerate semi-continue,
agitate i aerate tot cu echipamentul convenional, pentru fermentaiile aseptice i care utilizeaz, n
cele mai bune condiii, componentele mediului nutritiv, prin obinerea unei productiviti mari la
producerea enzimelor. Adugarea n timpul fermentaiei (n cea de-a doua partea a ei) de cantiti
crescnde de zaharuri i/sau proteine, mpreun cu alte componente cu rol bio-stimulator al sintezei
enzimei dorite; cu debite dependente de presiunea parial a oxigenului, de pH-ul mediului,
temperatur i ali parametri bio-tehnologici din fermentator; facilitat, n bio-procesele moderne,
de controlul, cu ajutorul electrozilor i senzorilor enzimatici, al concentraiei diverilor constitueni
ai mediului de fermentaie; permite utilizarea optim a compuilor nutritivi, fr apariia represiei
catabolice (cel puin pentru un timp acceptabil) i n lipsa creterii presiunii osmotice.
Bio-procesele fermentative continue erau, pn de curnd, rar utilizate n biosinteza
enzimatic i a metaboliilor secundari, deoarece obligativitatea folosirii unei aparaturi de nalt
performan, deci cu mult mai costisitoare (la nivel bio-industrial), precum i indispensabilitatea
stabilizrii suei productoare fac mult mai scumpe aceste procedee dect procesele batch i chiar
fed-batch (probabil pn n deceniul trecut, atunci cnd lucrurile au putut s stea altfel datorit
exploziei domeniului bio-tehnologiilor). Tendina de a se ajunge, i n acest domeniu, la proceduri
continue de operare este dictat de avantajele substaniale ale acestor sisteme de lucru: cantitative
printr-o productivitate mult superioar, dar i calitative prin fluctuaii considerabil reduse n
privina calitii produselor.
Este cunoscut un exemplu, din literatura de specialitate a deceniilor trecute, care se refer la
producerea, la scar industrial, n sistem pseudo-continuu, a glucoz-izimerazei de Bacillus
coagulans, dintr-o tulpin productoare constitutiv, cu mutantul nesporulant. Procesul fermentativ
este condus la temperatura de 50C, n condiiile unei presiuni pariale a oxigenului sczute i a unei
concentraii reduse a glucozei; productivitatea maxim a microorganismului fiind meninut mai
mult de 200 de ore (dup care bio-sistemul trebuie probabil reinoculat, de unde i caracterul
pseudo-continuu).