INSAMANTARILE ARTIFICIALE

Biotehnologie de generaia I-a, ce permite multiplicarea descendenei unui mascul

valoros, dincolo de limitele biologice ale acestuia
Aplicat pe scar larg la bovine, ovine, suine i curcan i, ntr-o msur mai mic, la
celelalte specii (cabaline, canide, bubaline)
Ofer avantaje de ordin :
Economic
Zootehnic ameliorarea raselor
Medical
Indicaiile de ordin clinic :
Deficiena anatomic la unul dintre parteneri ce nu permite monta natural (angustia
vulvei sau a vaginului, diferena mare de greutate sau talie, etc.);
Masculul refuz monta deoarece actul montei i provoac durere;
Sunt cazuri n care masculul i femela nu se accept reciproc din pur antipatie, n timp
ce cu ali parteneri ar fi dispui s se monteze;
Caracterul dominant puternic al femelei ce atrage dup sine inhibarea masculului;
Lipsa de experien a unuia dintre parteneri poate face imposibil monta natural.
Momentul nepotrivit
Avantaje economice
Numr crescut de fertilizri per ejaculat
Reducerea numrului de masculi per ferm
Elimin costurile, riscurile si timpul legate de transportul femelei.
D.p.d.v. al proprietarului masculului, dac acesta are un an expozitional foarte bun,
inseminarea artificial permite recoltarea spermei si nsmntarea femelelor fr
ntreruperea activittilor curente.
Materialul seminal congelat permite reproducerea unui mascul de mare valoare o lung
perioad de timp dup moartea sa
Riscul transmiterii bolilor venerice este minimalizat
Cuprinde patru etape principale :
Recoltarea spermei
Examenul materialului seminal
Ex. Macroscopic
Ex. Microscopic
Ex. complementare
Diluarea si conservarea materialului seminal
Refrigerarea
Congelarea
In gheata carbonica
In azot lichid
Inocularea materialului seminal
Reuita I.A. depinde de trei puncte cruciale:
Calitatea spermei;
Alegerea momentului optim de I.A.;
1

 Alegerea metodei adecvate de inseminare.

A. Recoltarea spermei
Indiferent de metoda de recoltare utilizata, aceasta trebuie sa fie precedata de examenul
general al masculului, inclusiv al aparatului genital, cu efectuarea de teste specifice (ex.:
examen serologic pentru bruceloza).
Recoltarea se poate face in prezenta unei femele aflate in estru sau cu ajutorul
feromonilor artificiali (vier, caine)
Examenul reproducatorului mascul
Anamneza
regimul de mont;
comportamentul n timpul montei;
rezultatele montelor anterioare;
afeciuni recente, ndeosebi ale sferei genitale;
eventualele tratamente efectuate i rezultatul lor;
regimul de utilizare la munc, sport sau antrenament,
performanele individuale
Inspectia
Generala
Locala
Reflexele sexuale
Apropierea
Erectia
Saltul
Intromisiunea
Ejacularea
Palpatia
Ecografia testiculara si prostatica
Examene serologice pt bolile veneriene (bruceloza, herpesviroza etc.)
A. Recoltarea spermei
1. Vaginul artificial
Imita condiiile de temperatur, presiune i lubrifiere din vaginul femelei n estru
Alctuit din : carcas cu robinet, cma din latex + inele de cauciuc, pahar
colector + protecie
Folosit la taur, armsar, berbec, vier, cine
2. Electroejacularea
Stimularea centrilor nervoi ai ereciei i ejaculrii din mduva lombo-sacral, cu
ajutorul unui curent electric de joas tensiune
Se practic la taur (electrod endorectal bipolar), berbec (electrod endorectal
monopolar i electrod lombar monopolar) i motan
Avantaj : poate fi folosit la masculii cu impoten de copulaie (impotentia
coeundi)
Dezavantaje : ejaculatul este inferior d.p.d.v. cantitativ si calitativ celui obtinut cu
vaginul artificial ; uneori se poate produce ejacularea in furou
2

 3. Metoda prezervativului (condomului)

Se practic uneori la armsar, de regul ca un expedient
Pe post de prezervativ, se poate utiliza o manup obstetrical pentru ETR
4. Metoda manual (masturbarea)
Se practic la vier i la cine
La vier elementul esenial este presiunea exercitat de operator cu degetele la
nivelul poriunii spiralate a penisului, analog papilelor cervicale ale scroafei
La cine presiunea trebuie exercitat la nivelul bulbilor glandului, iar penisul se
orienteaz posterior atunci cnd masculul pete peste mna operatorului
5. Masajul transrectal al veziculelor seminale i al ampulelor canalelor deferente
Este o metod practicat uneori la taur, n cazul impotenei de copulaie
Prezint dezavantajul c ejacularea se produce fr erecie, n furou, iar n cazul
masajului prea energic al gtului vezici urinare exist riscul amestecului spermei cu urina.
Avantajul principal const n simplitatea metodei, care nu necesita nici un fel de materiale
suplimentare
B. Examinarea materialului seminal
Este precedat de i corelat ntotdeauna cu examenul fizic general al reproductorului mascul.
1.Ex. macroscopic:
Volum se apreciaz imediat dup recoltare prin citire directa n paharul de recoltare
Culoare- se apreciaz subiectiv imediat dup recoltare i variaz n funcie de specie,
concentraia n spermatozoizi sau prezena substanelor strine n ejaculat (snge, puroi,
urin, etc).
pH apreciat cu ajutorul pH-metrelor sau cu hrtie indicatoare special; exist o
corelaie direct ntre calitatea spermei i pH-ul acesteia (cu ct proba de sperm este mai
bun cu att este mai acid)
Miros - sperma normal este inodor; prezena urinei, a puroiului, a sngelui sau a unor
medicamente n ejaculat modific mirosul acestuia
2. Ex. microscopic:
Concentraia materialului seminal
-tehnica hemocitometric: adaptat dup tehnica de numrare a globulelor roii.
- metoda electronic (SQA): mult mai rapid i mai exact. Combin un sistem optic cu
unul electronic pentru elaborarea rezultatelor. Pe baza densitii optice determin concentraia,
mobilitatea i procentul de spermatozoizi fr anomalii.
- sistemele computerizate de analiz a spermei (CASA): reprezint o combinaie de
sisteme optice, digitale i computerizate, iar softul este proiectat pentru a determina i analiza
concentraia, viabilitatea, morfologia i mobilitatea spermatozoizilor. Este foarte rapid i precis.
Azoospermia = absena spermatozoizilor n ejaculat
Oligozoospermia = un numr sczut de spermatozoizi n ejaculat (raportat la specie)
Mobilitatea spermatozoizilor
- Mobilitatea generala a spermei se apreciaza cat mai repede dupa recoltare prin examenul in
picatura suspendata (o picatura de sperma nediluata se depune pe o lama); miscarea in val (taur,
tap) se noteaza cu 5, iar lipsa de miscare cu 0
- Mobilitatea individuala se apreciaza prin examinarea unei picaturi de sperma proaspata diluata
depusa intre lama si lamela; se vor aprecia miscarea de inaintare, traiectoria liniara si viteza de

inaintare (velocitatea). Mobilitatea individuala se noteaza pe o scara de la 0-5, sperma normala

regasindu-se in intervalul 2,5-5.
Sistemele CASA permit obtinerea unor rezultate precise, rapide si complexe privind
mobilitatea spermatozoizilor.
o Astenozoospermia defineste o mobilitate foarte scazuta a spermatozoizilor.
o Morfologia spermatozoizilor Se apreciaz imediat dup recoltare prin examen
microscopic (100x cu imersie) i colorare (albastru de metilen, violet de geniana, tu de
China, opal-bleu, albastru-tripan-Giemsa, eozin-negrozin, Spermac etc). Ofer
posibilitatea de a pune n eviden spermatozoizii imaturi, cu anomalii (majore sau
minore) sau mori.
o Teratozoospermia = exces de forme teratologice ale spermatozoizilor dintr-un ejaculat.
ntr-un ejaculat normal procentul spermatozoizilor anormali, imaturi sau mori = max
20%.
Viabilitatea
Tehnici de colorare intravitale (eozina-negrozina, albastru tripan-Giemsa etc.) sau tehnici
de colorare fluorescenta, urmate de examinare microscopica simpla sau speciala
(microscop cu lumina polarizata, microscop cu contrast de faza sau cu lumina
fluorescenta)
Flux-citometrie: permite identificarea a trei populatii de spermatozoizi (vii, morti sau
muribunzi)
3. Ex. complementare:
Testul hipoosmotic permite aprecieri privind integritatea membranei spermatozoidului.
n mediul hipoosmotic, spermatozoizii normali prezint gonflri ale membranei din zona
piesei intermediare i/sau a celei din regiunea cozii.
Proba redox urmrete aprecierea metabolismului celulelor spermatice prin intermediul
unei substante colorate pe principiul masurarii capacitatii de reducere a (albastru de
metilen); cu cat decolorarea amestecului este mai rapida cu atat proba de sperma este mai
buna.
Coloraia Spermac
Permite identificarea statusului membranelor acrozomului:
- Spermatozoizi cu acrozom intact
- Spermatozoizi cu acrozom alterat/reacionat
- Spermatozoizi fr acrozom
Analiza structurii cromatinei spermatozoizilor (SCSA) pune n eviden modul n
care are loc fragmentarea ADN.
SCSA identific 5 populaii majore de spermatozoizi:
- Spermatozoizi maturi fr modificri nucleare
- Spermatozoizi maturi cu nivel moderat de fragmentare al ADN
- Spermatozoizi cu nivel ridicat de denaturare al ADN
- Spermatozoizi cu nivele moderate i ridicate ale fragmentrii ADN
- Spermatozoizi cu cromatin imatur
Spermatozoizii cu o capacitate de fertilizare redus prezint denaturri importante
la nivelul cromatinei comparativ cu cei cu o capacitate de fertilizare ridicat.
Ex. bacteriologic
4

- presupune recoltarea separat a fraciunilor ejaculatului i realizarea de nsmnri pe medii

pentru germeni aerobi, anaerobi, micoplasme i fungi; n mod normal, n sperm se gsesc
aproximativ 10.000 celule bacteriene/ml.
Ex. imunologic
- urmrete detectarea anticorpilor antispermatici care ar altera capacitatea fecundant a
spermatozoizilor. Ruperea barierei hemato-testiculare (n traumatisme, infecii) permite contactul
spermatozoizilor cu sngele circulant => sinteza de ctre propriul sistem imun a anticorpilor
antispermatici
C. Diluarea i conservarea materialului seminal
Diluarea materialului seminal se realizeaz n scopul fracionrii ejaculatului
permind astfel obinerea unui numr mai mare de doze de inseminare.
Mediile de diluie trebuie s conin:
- substane energetice (glucide);
-substane crioprotectoare (glicerina, lecitina din glbenuul de ou);
- substane tampon - menin constant pH-ul spermei n timpul dilurii i conservrii
(citrai, fosfai, tartrai, etc);
- substane care s activeze mobilitatea spermatozoizilor n cile genitale femele
(mucinaza);
- substane care s mpiedice dezvoltarea florei microbiene (antibiotice, sulfamide)
Diluantul trebuie s fie izoton i izoterm cu sperma, s aib acelai pH cu aceasta, s se
prepare uor, s fie economic, s-i menin proprietile un timp ndelungat.
Conservarea materialului seminal urmrete meninerea mobilitii i
capacitii fecundante a spermatozoizilor un timp ct mai ndelungat, n afara cilor
genitale femele.

Principiul care st la baza crioconservrii materialului seminal = reducerea

temperaturii spermei determin o scdere a activitii metabolice a spermatozoizilor
permind stocarea lor.
Conservarea materialului seminal se poate realiza prin:
-refrigerare (pstrare la 2-8 grade Celsius)
-congelare (pstrare n azot lichid la -196 grade Celsius).
Procedee de congelare a materialului seminal:
- congelarea n paiete (mari, mijlocii i mici);
- congelarea n fiole;
- congelarea n pilule n ghea carbonic la 79 grade Celsius abandonat la
ora actual
Etapele congelrii
Centrifugarea pt. A ndeprta excesul de fluid prostatic (are efect negativ asupra
mobilitii i viabilitii spermatozoizilor congelai-decongelai)
Diluarea roluri: protejeaz spermatozoizii de efectele negative ale temperaturilor joase
i obinerea unei concentraii finale prestabilite
Echilibrarea termic pt a evita ocul termic sperma este refrigerat (1-4 ore) nainte de
plonjarea n azotul lichid
Ambalarea se prefer paietele datorit unor avantaje ale acestora: volum mic, congelare
uniform, se pot marca datele importante pt identificarea animalului i data recoltrii
Congelarea propriu-zis
5

 Decongelarea n baie de ap cald rata de decongelare se coreleaz cu cea de congelare,

n funcie de protocolul utilizat
Pt. paietele de 0,5 ml: 8 secunde la 70C
Decongelarea materialului seminal
Exista o corelatie intre ratele de racire si cele de decongelare se respecta instructiunile
furnizate de firma/persoana care a facut congelarea
Decongelarea n baie de ap cald
Pt. paietele de 0,5 ml: 8 secunde la 70C sau 30-60 secunde la 37C
In apa cu gheata timp de 3 minute
Decongelare in buzunar
D. Inocularea materialului seminal
Inocularea const n depunerea materialului seminal n cile genitale femele.
Principii care trebuie respectate la inocularea materialului seminal:
- inocularea s se realizeze n momentul optim pentru fiecare specie;
- depunerea materialului seminal s se fac la locul de elecie caracteristic fiecrei specii;
- instrumentarul folosit la inseminare s fie steril i nclzit la 38 C;
- s se evite traumatizarea mucoasei vestibulo-vaginale, cervicale sau uterine n timpul
inoculrii.
Pentru sperma refrigerat: - flaconul cu material seminal se las la temperatura
camerei 5 minute; se utilizeaz sperma care conine cel puin 60% spermatozoizi cu
micri vioaie de naintare.
Pentru sperma congelat: - se inoculeaz dup decongelare brusc n ap la 36 grade
Celsius; se admite inocularea spermei care conine minimum 35-40% spermatozoizi cu
micri vioaie de naintare.
Inocularea spermei la vaca: - se inoculeaza 1 - 2 doze de material seminal la interval de
12 ore ncepnd din momentul depistrii estrului pe baza semnelor clinice (mucus
caracteristic, execut saltul pe alte femele, creterea numrului de pai pedometre),
ecografice i dozarea progesteronului din lapte/ser
-depunerea materialului seminal se realizeaz n canalul cervical sau n cavitatea uterina;
- pentru depunerea spermei n cile genitale femele se poate utiliza metoda rectovaginal/bimanual (cel mai frecvent) sau metoda cu speculum vaginal.
Procedeul de inoculare prin metoda bimanuala:
1. Se contentioneaza femela.
2. Insamantatorul introduce mana bine lubrifiata in ampula rectala pe care o goleste de
fecale.
3. Se prinde cervixul in mana prin traversul rectului si se fixeaza.
4. Cu cealalta mana se introduce paieta cu seringa atasata in vaginul si se trece prin cervix.
5. Se apasa pistonul seringii, iar sperma este depusa direct in uter.
La ora actual, se inoculeaz o singur doz de material seminal la 12 ore de la depistarea
estrului prin metoda bimanual.
Inocularea spermei la iap: - depistarea momentului optim pentru I.A. se realizeaz
prin ultrasonografie (folicul peste 35-40 mm) sau prin palpare transrectal (evoluia n
dinamic a mrimii i formei foliculului ovarian); ambele metode se realizeaz n
dinamic
- inseminarea artificial ar trebui s se realizeze cu 12 ore naintea ovulatiei;
- materialul seminal se depune n cavitatea uterin.
6

La oaie: inocularea materialului seminal se realizeaz imediat ce femela este depistat n

clduri de ctre berbecul ncercator i se repet dup 12-18 ore;
- cu un speculum vaginal i seringa de inoculare se depun 0,1 ml sperm la nivelul
canalului cervical.
La scroafa:
- depistarea momentului optim pt inseminare se face cu vier ncerctor sau prin
identificarea apariiei imobilizrii la ngrijitor
- se folosesc catetere de cauciuc sau plastic care la extremitatea liber se termin cu o
formaiune ovalar (cateterul cu oliv)sau sunt spiralate asemntor poriunii libere a
penisului la vier (cateterul Melrose);
- vrful pipetei se angreneaz n cervix, iar materialul seminal se depune n corpul uterin.
La scroaf nu este nevoie de presiune extern, sticla cu sperm de inoculat este ridicat
deasupra corpului femelei i sperma se scurge direct.
La cea: - detectarea momentului optim pentru I.A. se realizeaz prin ex. citovaginal (celule
Schollen), prin dozarea progesteronului plasmatic (peste 8 ng/ml) sau LH si vaginoscopie; se mai
pot utiliza vaginoscopia si examenul ecografic al ovarelor
Progesteron

Culoarea testului ELISA

Momentul montei

01

Albastru nchis

Monta n 36 48 ore

13

Albastru mediu

Mont n 36 48 ore

36

Albastru deschis

Mont n 24 36 ore

6 12

Albastru foarte deschis

Mont n 9 24 ore

Alb

Mont n 12 ore ( < 24 ore)

(ng/ml)

> 12

Vaginoscopia permite examinarea mucoasei vaginale cu ajutorul unui endoscop rigid sau flexibil
sau al unui proctoscop pediatric. Endoscopul trebuie s aib un diametru de maxim 8 15 mm,
cel puin 10 20 cm lungime i o surs adecvat de lumin. Procedura este bine tolerat de
femel i nu necesit sedarea acesteia.
n timpul examinrii se urmresc culoarea mucoasei, prezena faldurilor i a secreiilor.
Sub influena estrogenilor, faldurile vaginale devin edemaiate, umede i de culoare roz. Pe
msur ce femela avanseaz de la proestru spre estru aceste falduri ncep s i piard din
aspectul edemaiat, devenind cutate (pliuri primare i secundare). Cnd ceaua este n deplin
estru faldurile vaginale prezint cute cu margini bine definite. La trecerea din estru spre diestru
faldurile vaginale se aplatizeaz, iar mucoasa vaginal capt un aspect vrgat rou cu alb.
Examenul citovaginal hormonal in anestru
Srac n celule,
Celule parabazale mici, rotunde, cu nucleu mare,
Bazofile
Celule intermediare mici
Celulele sunt repartizate n colonii.
Leucocitele polimorfonucleare sunt n numr redus,
Eritrocitele lipsesc
7

Examenul citovaginal hormonal - proestru timpuriu

Cretere a numrului de celule epiteliale vaginale.
Predomin celulele intermediare
Pot apare i celule parabazale i superficiale.
Eritrocitele sunt prezente n
numr mare
leucocitele lipsesc.
Coloraia este bazofil.
Examenul citovaginal hormonal - proestrus mijlociu:
Prezena, aproape n exclusivitate, a celulelor superficiale anucleate sau cu nucleu
picnotic.
Coloraia predominant este cea acidofil,
Numrul eritrocitelor este n descretere evident.
Examenul citovaginal hormonal - proestrus tarziu:
Prezena, aproape n exclusivitate, a celulelor superficiale anucleate sau cu nucleu
picnotic.
Coloraia predominant este cea acidofil,
Numrul eritrocitelor este n descretere evident.
Examenul citovaginal hormonal - estrus
frotiul vaginal este bogat n celule superficiale cheratinizate, anucleate, grupate n
ciorchine
Coloraia acidofil este maxim n aceast faz (50 - 90 % din frotiu).
Eritrocitele sunt rare sau chiar absente i este posibil ca modificrile mucusului vaginal
dup vrful de LH s accelereze liza acestora.
Fondul frotiului este curat lipsit de mucus i detritusuri celulare
Depunerea materialului seminal la cea se poate realiza intravaginal, intracervical sau intrauterin
(cateterul Osiris), apoi ceaua se va menine cu trenul posterior ridicat 15 min pentru a facilita
pasajul spermatozoizilor n uter, timp n care se va masa clitorisul (stimuleaz contraciile
vaginale i uterine antiperistaltice)