UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR A

BANATULUI DIN TIMIOARA

FACULTATEA DE TEHNOLOGIA PRODUSELOR
AGROALIMENTARE
PROGRAM DE STUDIU: S.B.P.A.

Lucrare de disertatie

Coordonator tiinific:
Prof. dr. ing. Adrian Cpri

Absolvent :
Ing. Achim Alina Ioana

Timioara
2013

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR A

BANATULUI DIN TIMIOARA
FACULTATEA DE TEHNOLOGIA PRODUSELOR
AGROALIMENTARE
PROGRAM DE STUDIU: S.B.P.A.

Lucrare de disertatie
nlocuirea metodelor chimice de
analiz a produselor alimentare cu
metode alternative nepoluante

Coordonator tiinific:
Prof. dr. ing. Adrian Cprit

Absolvent:
Ing. Achim Alina
Ioana

Timioara
2013

CUPRINS
FIA DE APRECIERE A LUCRRII DE DISERTAIE
REZUMAT LIMBA ROMAN
REZUMAT LIMBA ENGLEZ

1
2
3

PARTEA I

STUDIU BIBLIOGRAFIC
1. Introducere
2. Laptele
2.1. Principalele componente ale laptelui
2.2. Proprietile fizice si chimice
2.3. Proteinele
2.4. Cazeina
2.5. Lactoza
2.6. Microbiologia
3. Bioluminiscena

4
4
5
6
10
11
12
18
22
24

PARTEA II

PARTEA EXPERIMENTAL
26
4. Obiective
26
5. Metodologia
27
5.1. Protocolul de lucru
27
5.2. Determinri analitice
28
5.2.1. Determinarea lactozei
28
5.2.2. Determinarea proteinelor
29
5.2.3. Detrminarea clorurilor
29
5.2.4. Determinarea conductivitii electrice
30
5.2.5. Determinarea coeficientului de tensiune superficial
31
5.2.7. Determinarea vscozitaii dinamice
32
5.2.8. Determinarea ATP bioluminiscenei
33
6. Rezultate si discuii
35
6.1Cercetri asupra corelaiei dintre compozitia chimica si proprietaile biofizice ale
laptelui integral
35
6.1.1 Coninutul de protein corelat cu densitatea
38
6.1.2. Coninutul de protein corelat cu tensiunea superficial
39
6.1.3. Coninutul de protein corelat cu vscozitatea
40
6.1.4. Coninutul de lactoz corelat cu conductivitatea electric
40
6.2. Determinarea calitii microbiologice a laptelui prin metode clasice si prin
metode bazate pe biocheluminiscen
42
7. Concluzii
46
8. Bibliografie
47

Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar a Banatului Timioara

Facultatea de Tehnologia Produselor Agroalimentare
Specializarea: Sigurana i Biosecuritatea Produselor Agroalimentare
Studii Master
FIA DE APRECIERE
A LUCRRII DE DISERTAIE INTITULAT
nlocuirea metodelor chimice de analiz a produselor alimentare cu metode
alternative nepoluante
ELABORAT DE ING. ACHIM ALINA
Lucrarea abordeaz un domeniu de maxim interes pentru domeniul tehnologiei produselor
alimentare, legat de analiza produselor alimentare, ncadrndu-se n sfera preocuprilor de cercetare
tehnologic a disciplinelor din cadrul facultii.
Bazat pe studiul surselor bibliografice, aduse la zi i atent selectate, prima parte a lucrrii
sintetizeaz informaii interesante i utile privind elaborarea i utilizarea de noi metode mai simple,
rapide, exacte i ieftine pentru analiza unor produse alimentare, care s completeze sau s
nlocuiasc metodele actualmente n uz, metode chimice sau biochimice clasice, care sunt n general
laborioase, scumpe i de cele mai multe ori neconcludente pentru stabilirea biodisponibilitii
substanelor nutritive din produsele alimentare. Sunt sintetizate informaii privitor la importana i
proprietile fizico-chimice, nutriionale i microbiologice ale laptelui, unul din alimentele de foarte
mare importan nutriional i economic, care a constituit obiectul cercetrilor proprii efectuate.
Sunt prezentate apoi date despre metodele de analiz moderne, bazate pe biochemiluminiscen.
Partea a doua a lucrrii prezint rezultatele cercetrilor experimentale efectuate privind
elaborarea unor metode mai simple, mai rapide, mai exacte i mai ieftine dect cele bazate pe
analize biochimice n analiza laptelui, i anume metode bazate pe determinri biofizice i metode
bazate pe biochemiluminiscen. Se prezint aparatura, materialele i metodele folosite pentru
realizarea cercetrilor. Sunt discutate rezultatele obinute i sunt prezentate concluziile desprinse n
urma studiului efectuat. Au fost stabilite corelaiile ntre valorile parametrilor biofizici i biochimici
luai n studiu, evideniindu-se posibilitatea nlocuiri determinrilor biochimice cu cele biofizice. De
asemenea, au fost stabilite corelaiile ntre valorile caracteristicilor microbiologice obinute prin
metode clasice i metoda bazat pe ATP-bioluminiscen, punndu-se n eviden avantajele
folosirii metodei bazate pe ATP-bioluminiscen.
Prin modul de abordare i rezolvare a problemelor teoretice i practice din cadrul temei
lucrrii de disertaie, domnioara inginer Achim Alina face dovada competenelor profesionale
necesare unui viitor specialist n domeniu, dovedind c stpnete fondul de cunotine de baz
necesare, are capacitatea de a realiza o documentare ntr-o anumit tematic, poate realiza analize i
determinri experimentale i elabora concluzii adecvate i poate propune soluii tehnico-inginereti
corespunztoare.
Lucrarea de disertaie elaborat de domnioara inginer Achim Alina evideniaz deosebit
interes i seriozitate n rezolvarea temei propuse, ndeplinind cerinele impuse pentru a fi admis n
vederea susinerii publice.
Propun acordarea diplomei de absolvire a studiilor de master n profilul Tehnologia
Produselor Alimentare, specializarea Sigurana i Biosecuritatea Produselor Agroalimentare,
domnioarei inginer Achim Alina.
Timioara, 20 mai 2013

Prof. dr. ing. Adrian Cprita

Rezumat
Lucrarea intitulat nlocuirea metodelor chimice de analiz a produselor
alimentare cu metode alternative nepoluante este compus din 2 pri: studiu
bibliografic i partea experimental.
n urma studiului bibliografic se prezint date privind elaborarea i utilizarea de noi
metode mai simple, rapide, exacte i ieftine pentru analiza unor produse alimentare, care s
completeze sau s nlocuiasc metodele actualmente n uz, metode chimice sau biochimice
clasice, care sunt n general laborioase, scumpe i de cele mai multe ori neconcludente
pentru stabilirea biodisponibilitii substanelor nutritive din produsele alimentare. n
continuarea primei pri, sunt sintetizate informaii privitor la importana i proprietile
fizico-chimice, nutriionale i microbiologice ale laptelui, unul din alimentele de foarte mare
importan nutriional i economic, care a constituit obiectul cercetrilor proprii efectuate.
Sunt

prezentate

apoi

date

despre

metodele

de

analiz

moderne,

bazate

pe

biochemiluminiscen.
n partea a doua a lucrrii, partea experimental, sunt prezentate rezultatele
cercetrilor efectuate privind elaborarea unor metode mai simple, mai rapide, mai exacte i
mai ieftine dect cele bazate pe analize biochimice n analiza laptelui, i anume metode
bazate pe determinri biofizice i metode bazate pe biochemiluminiscen.
Sunt prezentate aparatura, materialele i metodele folosite pentru realizarea
cercetrilor. Lucrarea continu cu prezentarea i discutarea rezultatelor obinute privind
determinrile coninutul de protein i lactoz ale probelor de lapte luate n studiu, precum
i ale rezultatelor determinrilor unor caracteristici biofizice (densitate, tensiune
superficial, vscozitate). Au fost stabilite corelaiile ntre valorile parametrilor biofizici i
biochimici luai n studiu, evideniindu-se posibilitatea nlocuiri determinrilor biochimice
cu cele biofizice.
n continuare sunt prezentate rezultatele obinute privind determinarea calitii
microbiologice a probelor de lapte prin metode clasice i prin metode bazate pe
biochemiluminiscen.

Au fost stabilite

corelaiile

ntre

valorile

caracteristicilor

microbiologice obinute prin aceste metode, punndu-se n eviden avantajele folosirii

metodei bazate pe ATP-bioluminiscen.
Ultima parte a lucrrii este constituit din concluziile desprinse n urma cercetrilor
efectuate.
2

SUMMARY
The paper entitled "Replacing chemical methods for analysis of foods with alternative
clean" is composed of two parts: bibliographic study and the experimental.
The study presents bibliographic data on the development and use of new methods
simple, rapid, accurate and cost analysis of food products to supplement or replace the
methods currently in use conventional chemical or biochemical methods, which are
generally laborious , costly and often inadequate to establish the bioavailability of nutrients
from food. Following the first part, are synthesized information on the importance and the
physico-chemical, nutritional and microbiological characteristics of milk, one of the foods
high nutritional and economic importance, which was the subject of researches made. Are
then presented modern data analysis methods based on chemiluminescence bio.
In the second part of the paper, the experimental research results are presented on the
development of simpler methods, faster, more accurate and cheaper than those based on
biochemical analysis in milk analysis, and methods based on biophysical measurements and
methods based chemiluminescent bio. Are presented equipments, materials and methods
used for the research. The paper continues by presenting and discussing results of
determinations of protein and lactose content of milk samples studied, and the results of
measurements of biophysical characteristics (density, surface tension, viscosity).
Correlations have been established between biophysical and biochemical parameter values
in the study, highlighting the possibility of replacement of the biophysical biochemistry.
Below are the results for determining the microbiological quality of milk samples by
classical methods and methods based on chemiluminescence bio. Correlations have been
established between the values obtained by the microbiological method, putting into
evidence the advantages of using the method based on ATP bioluminescence.
The last part of the paper consists of conclusions drawn from research.

PARTEA I

STUDIU BIBLIOGRAFIC

1. INTRODUCERE
n ultimul timp se pune tot mai mult accent pe elaborarea i utilizarea de noi metode
mai simple, rapide, exacte i ieftine pentru analiza unor ingrediente alimentare, care s
completeze sau s nlocuiasc metodele actualmente n uz, metode chimice sau biochimice
clasice, care sunt n general laborioase, scumpe i de cele mai multe ori neconcludente
pentru stabilirea biodisponibilitii substanelor nutritive din produsele alimentare.
Unul din alimentele de baz, de maxim importan, att nutritiv, ct i economic,
este laptele.
Metodele chimice i biochimice (metode colorimetrice, titrimetrice, gravimetrice),
care se folosesc pentru analiza calitii laptelui necesit echipamente i reactivi costisitoare
i personal de laborator cu un anumit grad de pregtire. Ele necesit i un volum mare de
munc, fiecare etap fiind o potenial surs de erori. Aceste inconveniente fac ca nu
ntotdeauna productorii s poat nfiina laboratoare de analiz a calitii laptelui. Studiile
preliminare efectuate au demonstrat c metodele de analiz biochimic a laptelui
propuse de diveri autori sunt laborioase i imprecise.
Cercetrile actuale i propun s elaboreze metode mai simple, rapide, exacte i
ieftine n analiza laptelui procesat sau neprocesat, metode care s poat fi aplicate de marii
productori, de unitile de prelucrare, dar i n cadrul unor mici laboratoare nfiinate
pe lng fermele cu vaci de lapte. Astfel, se poate urmri calitatea laptelui nc din faza
4

incipient, i totodat se pot stabili eventuale stri patologice ale vacilor, cum ar fi
mastita.
Proprietile fizice ale laptelui sunt n strns corelaie cu compoziia chimic a
laptelui. Parametrii fizici sunt influenai att de concentraia diferitelor componente
anorganice i organice, ct i de proporiile n care se gsesc acestea unele fa de altele.
Determinarea principalilor indici biofizici ai laptelui se poate face prin metode
simple, rapide, ieftine i precise. Se poate determina variaia acestora n funcie de starea
fiziologic a vacilor lactante i de producia de lapte. De asemenea, parametrii biofizici pot
fi corelai cu cei biochimici, a cror determinare presupune metode mai scumpe i mai
laborioase.
n ultimii ani se pune un accent tot mai mare pe asigurarea securitii i siguranei
alimentare. Metoda obinuit folosit pentru aprecierea calitii microbiologice a laptelui
integral determin unitile formatoare de colonii, test care nu identific ns tipurile de
organisme prezente. Metoda folosit pentru aprecierea sntii ugerului const n
determinarea numrului de celule somatice (NCS). Ambele teste dau informaii generale
asupra calitii laptelui, fr a determina sursa de contaminare bacterian.
Un rol din ce n ce mai important l dein noile biotehnici care vin n sprijinul
microbiologilor, pentru obinerea unor rezultate de mare acuratee, sensibile i n special
rapide. Astfel de biotehnici sunt cele bazate pe bioluminiscen.

2. LAPTELE
Laptele conine aproape toate elementele nutritive necesare susinerii vieii. nc
din cele mai vechi timpuri, oamenii au folosit laptele de capr, oaie i vac drept
aliment. Astzi, termenul de lapte este sinonim cu laptele de vac.
n anul 1877, O. Hammarsten a identificat trei proteine n lapte: cazeina,
lactalbumina i lactoglobulina, elabornd i un procedeu de separare a acestora:
laptele smntnit este diluat i apoi acidifiat cu acid acetic; cazeina precipit, iar
proteinele din zer rmn n soluie, stabilindu-se astfel o caracteristic a cazeinei: este
insolubil n mediu slab acid. Mai trziu s-a stabilit c sistemul de proteine al laptelui
este mult mai complex. n anul 1936, Pedersen a folosit ultracentrifugarea pentru a
dovedi neomogenitatea cazeinei, iar n 1939 Mellander a folosit electroforeza pentru a
evidenia trei fraciuni ale cazeinei: -, - i -cazein (Nickerson,.1985).
Fraciunea cea mai important din profilul proteinic al laptelui este
reprezentat de cazein. Lactoglobulinele i lactalbuminele sunt constituenii majori ai
proteinelor din zer. Ali constitueni proteinici, cum ar fi enzimele, sunt prezeni n
cantiti mult mai mici (Belitz, 1987; Cpri, 2003).
Laptele brut este o emulsie apoas ce conine ap, proteine, glucide, grsimi,
minerale, enzime, hormoni i componeni celulari (Vintil, 1996). Laptele este un lichid
opac, alb sau alb-glbui, culoarea fiind influenat de absorbia luminii de ctre
globulele de grsime i miceliile de proteine. Coloraia galben sau galben-verzuie se
datoreaz carotenului din faza gras, respectiv riboflavinei din faza apoas. Gustul
este uor dulce, iar mirosul slab.
Lactoza, unele minerale, precum i vitaminele hidrosolubile sunt prezente n
lapte n stare dizolvat. Proteinele zerului exist n soluii macromoleculare; cazeina
5

este prezent ca i micelii de cazeinat de calciu-fosfat de calciu, cu diametre ntre 10200 nm. Grsimea i vitaminele liposolubile formeaz globule grase emulsionate, cu
diametrul ntre 1-20 , acoperite de o membran, un strat subire compus din lipide
i proteine. Aceast membran conine un numr mare de enzime i cantiti foarte
mici de elemente minerale (Cu). Membrana gras este puternic alterat n timpul
procesrii laptelui (agitare, pompare, nclzire, omogenizare). Ca material al
membranei pot fi ncorporate i proteine din zer i cazein. Laptele mai conine
bacterii i componeni celulari, prezeni sub form de suspensie, care pot fi
sedimentai. Globulele de grsime separate dup o depozitare prelungit sau dup
centrifugare, formeaz smntna. Omogenizarea laptelui mparte i emulsioneaz
globulele de grsime, astfel c separarea ulterioar a smntnii se face mai greu.
Laptele smntnit este o emulsie analog laptelui, care cu excepia
componenilor grai i ai membranei conine aceleai substane ca cele menionate mai
sus. Smntna este similar laptelui integral prin aceea c este o emulsie concentrat
de globule de grsime n lapte smntnit.
Concentraia constituenilor laptelui variaz considerabil n funcie de specia
productoare. Compoziia laptelui de vac este influenat de factori diveri, ca:
animalul, vrsta i rasa, tipul de hran, sezonul, stadiul lactaiei. Interesant este faptul
c, coninutul de grsime crete continuu n timpul mulsului, astfel c ultimii 100 ml de
lapte conin 12-15% grsime. De asemenea, coninutul de grsime din lapte depinde i
de tehnica de muls.

2.1. PRINCIPALELE COMPONENTE ALE LAPTELUI

Din punct de vedere chimic laptele este constituit din ap, substane azotoase,
grsime, lactoz, substane minerale, vitamine.
Unele dintre aceste componente au fost izolate, iar altele identificate prin teste
specifice.
Cteva substane ca lactoza, cazeinele, -lactoglobulina, -lactoglobulina, grsimea
i probabil alte fraciuni proteice sunt specifice laptelui, fiind sintetizate n glanda mamar.
Ceilali constitueni nu sunt specifici laptelui fiind ntlnii i n alte surse biologice (Mooc,
1973).
Apa este componenta cu ponderea cea mai mare (86 89,3%, cu o valoare medie de
87,5%) i reprezint mediul dispers n care se gsesc ncorporai ceilali constitueni.
Substanele azotoase sunt reprezentate n proporie de aproximativ 95% de
substanele proteice propriu-zise (cazein, albumin, imunoglobuline, proteoze-peptone,
proteine minore), substanele azotoase neproteice (aminoacizi liberi, creatinin etc.) fiind n
proporie mai redus ( 5%).
Substanele proteice din lapte reprezint n medie 3,4%.
Cazeina reprezint aproximativ 3% din componena laptelui i 78,5% din azotul total.
n laptele de vac, oaie, capr i bivoli, cazeina constituie componenta major a
substanelor proteice. De aceea, laptele acestor specii se numete "lapte de tip cazeinic". n
laptele de iap i n cel de femeie coninutul de albumin este foarte mare, reprezentnd
aproximativ 50% din totalul substanelor azotoase, fiind numit "lapte de tip albuminic"
(Stnescu, 1994).
Masa molecular, relativ mic (cteva zeci de mii de uniti) confer un coeficient de
digestibilitate ridicat (o mare valoare nutritiv), conferindu-i totodat o mare vulnerabilitate
6

la agresiunea microbian. Calitatea biologic deosebit a laptelui se datoreaz raportului

echilibrat al aminoacizilor i n mod particular al celor eseniali (metionin, treonin, lizin,
triptofan etc.). Avnd o reacie chimic amfoter, cazeina se poate combina att cu acizii ct
i cu bazele. Datorit gruprilor carboxilice mai numeroase, caracterul acid este mai
pronunat.
n lapte cazeina se gsete combinat cu fosfatul de calciu sub form de fosfocazeinat
de calciu, solubil n ap. Luate separat, att cazeina ct i fosfatul de calciu sunt insolubile.
Punctul izoelectric (pHi) al cazeinei este aproximativ 4,6. Scderea pH-ului la
aceast valoare (4,6-valoare critic) produce denaturarea brusc i ireversibil a cazeinei,
exteriorizat prin precipitare.
Aceast nsuire st la baza coagulrii laptelui prin fermentaie spontan, cnd pH-ul
sczut se realizeaz pe seama acidului lactic rezultat din fermentaia lactozei.
n tehnologia brnzeturilor, aceast particularitate a cazeinei poate fi exploatat n
sens pozitiv sau negativ (favoriznd unele fraude). Astfel, n tehnologia de fabricaie a
brnzei telemea eliminarea apei din coagul se realizeaz cu att mai bine cu ct zerul este
mai acid, cu ct pH-ul este mai apropiat de 4,6 (deoarece n aceste condiii acioneaz
funcia hidrofob). Dac pH-ul este mai ridicat, brnza nu numai c nu elimin apa, ci chiar
mai absoarbe ap din saramur (deoarece n aceste condiii acioneaz funcia hidrofil).
nlocuind zerul acid, n care este conservat brnza telemea, cu saramur preparat din ap
de robinet i sare (pH 7), brnza crete n greutate; deci prin aceast procedur se poate
realiza un profit. Aceasta are numeroase implicaii: micorarea valorii nutritive a produsului
prin creterea coninutului n ap, reducerea capacitii de conservare i a calitii
organoleptice, crearea condiiilor prielnice pentru dezvoltarea florei microbiene de rea
natur i posibilitatea declanrii de toxiinfecii alimentare.
La produsele lactate capacitatea hidrofil-hidrofob a cazeinei poate genera unele
defecte. Astfel acidifierea brusc i pronunat a iaurtului duce la separarea zerului de
coagul, iar la brnza proaspt de vaci contribuie la apariia unui gust acru i a unei
consistene aspre, sfrmicioase.
Cazeina este coagulat de chimozin (rennin), numai n prezena srurilor de calciu.
Albumina reprezint 9,2% din azotul total al laptelui.
n laptele normal albumina reprezint 0,3-0,5%, iar n cel colostral poate ajunge pn
la 4%.
Albumina este solubil n ap, nu precipit n prezena renninei dar coaguleaz la
temperatur ridicat (circa 80C).
Imunoglobulina reprezint 3,3% din azotul total din lapte. n laptele normal,
imunoglobulinele reprezint n medie 0,08-0,1%, iar n cel colostral ajunge pn la 12%.
Proteozo-peptonele reprezint 4% din azotul total din lapte. Acestea nu precipit la
pH = 4,6 dup o nclzire la 95C timp de 30 de minute, dar precipit cu o soluie de acid
tricloracetic 10%.
Proteinele minore includ proteina roie sau lactotransferina, lactolina, proteinele
membranei globulelor de grsime i enzimele din lapte a cror concentraie nu este
suficient pentru a fi evideniat prin electroforez.
Albumina, imunoglobulinele, proteozo-peptonele i proteinele minore reprezint
proteinele din lactoser.
Substanele azotoase neproteice reprezint 5% din azotul total din lapte i sunt
reprezentate de uree, acid uric, amoniac, creatin, creatinin etc. care au originea sanguin i
cresc n cazul inflamrii glandei mamare.
7

Grsimea este componenta laptelui cu cele mai mari variaii cantitative. n mod
obinuit cantitatea de grsime variaz ntre 2,8-4,0%. Procentul de grsime din lapte variaz
n funcie de ras, individ, vrst, stadiul lactaiei, modul de furajare, anotimp, stare de
sntate etc.
n lapte, grsimea se gsete sub form de globule sferice (cu un grad foarte mare de
dispersie i de emulsionare) cu diametrul cuprins ntre 1,6 i 10 microni (n medie 3
microni).
Globula de grsime conine, n partea central, o cantitate mare de gliceride bogate n
acid oleic, cu punct de topire sczut, iar n partea periferic gliceride cu punct de topire mai
ridicat. La exteriorul globulei de grsime se gsete o pelicul fin de natur lipoproteic.
Din punct de vedere chimic, grsimea este compus din lipide simple (n cea mai
mare parte gliceride, steridele gsindu-se doar n proporie de 0,01-0,17%) i din lipide
complexe (fosfatide, care reprezint cca. 1% din totalul grsimilor din lapte).
Cei mai importani acizi grai care intr n constituia gliceridelor din lapte sunt:
butiric, caproic, caprilic, caprinic, lauric, miristic, palmitic, stearic, arahidonic, behenic
(saturai) oleic i linoleic (nesaturai).
Fosfatidele reprezint aproximativ 98% din totalul lipidelor din lapte. Ele conin
lecitin, cefalin i sfingomielin etc.
Natura i proporia acizilor grai din compoziia grsimii din lapte i confer acesteia
caracteristici fizico-chimici specifice.
Lactoza este glucida unic i specific a laptelui. Coninutul n lactoz al laptelui
variaz ntre 2,84-7,66% (cu o medie de 4,75%).
Sub aciunea diferitelor microorganisme (bacterii, levuri etc) lactoza fermenteaz
rezultnd acidul lactic, propionic, alcool etc., proprietate utilizat n industria produselor
lactate.
Fermentaia (hidroliza enzimatic) lactozei se produce n dou faze:
n prima faz lactoza se transform n glucoz i galactoz;
n a doua faz glucoza i galactoza sunt descompuse pn la acid lactic, responsabil
de instalarea procesului de fermentaie propriu-zis (ncrirea).
Substanele minerale reprezint n medie 0,75%. Principalii componeni ai cenuii
laptelui sunt fosfatul de calciu i clorurile alcaline, n special clorura de potasiu. Srurile
acizilor organici (citric etc.) se gsesc sub form de carbonai (Stnescu, 1994). Laptele este
foarte bogat n calciu (125 mg%) i fosfor (90 mg%) ceea ce i confer un nalt potenial
mineralizant. Laptele conine ns cantiti insuficiente de fier (0,1 mg%), cupru (0,05 mg
%) i magneziu (0,005 mg%). Animalele i oamenii hrnii exclusiv cu lapte, o perioad mai
lung de timp, datorit cantitilor reduse de Fe, Cu i Mg; necesare (formrii hemoglobinei)
sunt predispui la anemie.
Prin metode spectrometrice, n lapte s-au identificat i alte elemente, cum ar fi: litiu,
stroniu, vanadiu, crom, cobalt etc.
Vitaminele. Laptele conine un numr mare de vitamine necesare omului. Din acestea
amintim: vitaminele A, cele din grupele D, E i K (vitamine liposolubile), tiamina (B1);
ribo- sau lactoflavina (B2), PP, acidul pantotenic, piridoxina (B6), B12, acidul folic, biotina
(H), acidul para-aminobenzoic, colina, inozitolul, acidul ascorbic (C) (vitamine
hridrosolubile).
n timpul pstrrii i prelucrrii tehnologice unele vitamine se pot distruge parial sau
total (de exemplu, vitamina C este distrus n proporie de 20% prin pasteurizare i n
totalitate prin deshidratare-transformare n lapte praf ).
Enzimele din lapte au origine mamar, microbian sau mixt.
8

Dintre enzimele de origine mamar amintim: lactoperoxidaza, fosfataza acid i

alcalin, amilaza, esteraza, lipaza, lactaza, xantin-oxidaza, aldehidraza etc., enzime care sunt
n general termolabile.
Dintre enzimele de origine microbian amintim reductaza direct, iar dintre cele
mixte (mamar i bacterian) catalaza.
Pigmenii
n lapte se gsesc numeroi pigmeni dintre care amintim: carotenul de culoare
galben-portocalie, lactocromul de culoare uor albstruie, vizibil n mod special n laptele
smntnit, riboflavina de culoare glbuie.
Gazele
n momentul obinerii laptele conine pn la 100 cm bioxid de carbon/litru, mai
puin azot, oxigen, amoniac i urme de hidrogen sulfurat. n contact cu mediu exterior,
cantitatea de bioxid de carbon scade, iar cea de oxigen i azot crete. Oxigenul dizolvat
oxideaz grsimile din lapte i micoreaz concentraia de vitamin C.
Elementele figurate
n mod normal n lapte se gsesc celule epiteliale, leucocite i celule microbiene.
Anticorpii
Femelele n lactaie elimin prin lapte aglutinine, precipitine, hemolizine,
bacteriolizine, anticorpi anafilactici etc.
Compoziia chimic a laptelui, n funcie de specie este prezentat n tabelul 1.
(Drug, 1999).
Tabelul 1. Compoziia chimic a laptelui n funcie de specie
Specia
Femeie
Vac
Oaie
Capr
Bivoli
Iap
Mgri

din care:
Sruri
Albumine i Lactoz mineApa S.U. Grsime Protein Cazein
(%)
rale
globuline
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
86,00 12,06
5,0
1,50
0,80
0,60
5,30
0,26
87,60 12,25
3,40
3,50
3,08
0,50
4,60
0,75
83,87 16,43
6,18
5,15
4,17
0,98
4,17
0,93
86,88 13,12
4,07
3,76
2,60
1,16
4,44
0,85
82,69 19,03
7,87
5,88
5,35
0,53
4,52
0,76
90,18 9,92
0,61
2,14
1,09
1,05
6,73
0,35
91,23 9,05
1,15
1,50
0,94
0,53
6,00
0,40

ntre componentele laptelui au fost stabilite relaii cantitative.

Overman, examinnd laptele diferitelor specii, obine urmtoarea relaie ntre
grsime (G) i coninutul proteic (P) al laptelui :
P = 1,93 + 0,42 G
Legtura ntre coninutul n grsime i substana uscat negras (SUN) prezint
importan pentru stabilirea valorii laptelui destinat industriei brnzeturilor, a
conservelor de lapte etc. Dac exist o relaie constant ntre aceste dou componente,
este simplu s se stabileasc o formul care s permit determinarea SUN prin
dozarea analitic a grsimii. Jacobson i Jack gsesc relaii lineare care sunt ns
dependente de rasa vacilor:
SUN = 7,07 + 0,444 G
(dup Jack)
SUN = 6,60 + 0,554 G
(dup Jacobson pentru rasa Holstein)
SUN = 8,09 + 0,253 G
(dup Jacobson pentru rasa Jersey)
9

Valoarea caloric a laptelui este de obicei calculat cunoscnd coninutul

laptelui n grsime, proteine i lactoz i folosind valorile standard pentru cldurile de
combustie ale acestor substane (respectiv 9,11; 5,86 i 3,95 Kcal/g). Valoarea caloric a
laptelui determinat calorimetric nu este echivalentul exact al energiei sale n corpul
animal, deoarece n metabolismul animal componentele nu sunt oxidate complet. Prin
msurtori calorimetrice directe, Overman i Saumann au obinut o corelaie foarte
strns ntre coninutul n grsime (G) i energia caloric (Mooc, 1973):
E = 115,33 (2,51 + G )
2.2. PROPRIETI FIZICE I CHIMICE

Culoarea alb i opacitatea laptelui sunt cauzate de mprtierea i absorbia

luminii de ctre miceliile de cazein i globulele de grsime. Aceste proprieti au
importan practic pentru culoarea alb a laptelui condensat i pentru determinarea
efectului procesului de omogenizare (Lupea, 2000).
Densitatea specific a laptelui, cu valori ntre 1,029-1,039 (15C), descrete odat
cu creterea coninutului de grsime, dar crete n paralel cu creterea coninutului de
protein, lactoz i sruri. Laptele degresat are o densitate specific mai mare dect
laptele integral. Exist relaii care permit calcularea coninutului de substan uscat
din lapte, funcie de procentul de grsime i densitatea specific a acestuia (Lupea,
2000):
m 1,2f

266,5 s 1
s

m = 0,25s + 1,21f + 0,66

(relaia Fleischmann)
(relaia Richmond)

unde: m = coninutul procentual de substan uscat

f = coninutul procentual de grsimi al laptelui
s = densitatea specific a laptelui
Indicele de refracie al laptelui (n D) variaz ntre 1,3410 1,3480 i depinde ntr-un
mod complex de compoziia laptelui. Valoarea sa are importan pentru determinarea
solidelor totale din laptele concentrat, n producia de lapte condensat i lapte pudr.
Laptele se comport ca un lichid newtonian. Vscozitatea depinde de temperatur
(temperatura peste 65C crete vscozitatea datorit denaturrii proteinelor serice) i de pH.
Vscozitatea depinde de coninutul n protein i grsime, un rol major avnd gradul de
dispersie al cazeinei. Lactoza nu are o influen important asupra vscozitii.
pH-ul laptelui variaz ntre 6,56,75, aciditatea laptelui variaz ntre 6,57,5SH
(metoda SoxhletHenkel), punctul de congelare ntre 0,53 i 0,55C. Modificarea
punctului de congelare al laptelui este un test potrivit pentru a determina falsificarea
acestuia prin adaos de ap. pH-ul acid al laptelui, respectiv aciditatea sa este cauzat de
srurile acide, de gruprile acide din catenele laterale ale proteinelor i de cantiti mici de
dioxid de carbon. pH-ul laptelui se modific n urma tratamentului termic. Pasteurizarea
provoac o cretere uoar a pH-ului, datorit pierderii dioxidului de carbon i precipitrii
fosfatului de calciu. Sterilizarea pe de alt parte, cauzeaz o uoar acrire (datorit reaciei
Maillard). Concentrarea laptelui coboar de asemenea pH-ul.
10

Gradul de aciditate este tot mai important n industria produselor lactate i se

determin prin titrarea laptelui la pH = 8,3 cu soluie de hidroxid de sodiu n prezena
fenolftaleinei. Numrul de ml de soluie de hidroxid de sodiu 0,25 M consumai pentru 100
ml lapte, d numrul Soxhlet-Henkel (grade SH sau SH). Alte metode dau numrul de
grade Thrner (ml soluie NaOH 0,1M consumai pentru 100 ml lapte) i grade Dornic
(numrul de ml soluie NaOH 1,9 M consumai pentru 100 ml lapte .
Scderea aciditii laptelui proaspt sub 6,5-7,5SH este o indicaie asupra capacitii
de tamponare a srurilor i proteinelor din lapte. Scderea valorii indic diluarea, boli ale
ugerului sau neutralizare. Valori mai mari reflect acrirea produs de bacterii. Stabilitatea
termic a laptelui se pierde la 10SH, iar la 25-30SH se produce coagularea spontan.
Un alt parametru caracteristic pentru lapte respectiv preparatele din lapte, este
potenialul redox. Valorile sunt :
+ 20 + 30 V pentru lapte brut
+ 0,10 V pentru lapte pasteurizat
+ 0,10 V pentru brnza dulce
+ 0,05 V pentru lapte autoclavat
0,15 V pentru iaurt
0,30 V pentru brnza Emmental
Potenialul redox are o importan deosebit n producerea i stocarea
produselor din lapte (previne oxidarea i determin activitatea bacterian). Dup cum
se vede din datele prezentate mai sus, nclzirea laptelui reduce potenialul redox
datorit eliminrii oxigenului i formrii gruprilor reductoare sulfhidril.
2.3. PROTEINELE

Componentele azotate pot fi clasificate n funcie de comportarea lor fa de

ageni precipitani n: proteine i substane azotate neproteice. Proteinele reprezint
95% din totalul componentelor azotate din lapte i sunt reprezentate de cazeine i
proteinele din zer (lactalbumina, lactoglobuline i proteoz-peptone).
n tabelul 2 este redat compoziia medie i distribuia proteinelor din laptele de
vac.
Tabelul 2. Compoziia i distribuia proteinelor din laptele de vac -valori medii( Kenner, 1983)
Proteine
g/l
%
CAZEINE
s -Cazein
12,0
46
- cazein
9,0
35
K- cazein
3,5
13
- cazein
1,5
6
Total cazein
26,0
100
PROTEINE SOLUBILE
-lactoalbumin
1,5
25
Serumalbumin
0,3
5
- lactoglobulin
2,7
45
Imunoglobuline
0,7
12
Proteoz-peptone
0,8
13
11

Proteinele din lapte reprezint o surs important de proteine alimentare

depite numai de carne i produse din carne.
Proteinele din lapte au masa molecular cuprins ntre 15000200000 Da i au
structur macromolecular peptidic.
Cazeinele reprezint aproximativ 80% din totalul proteinelor din laptele crud de
vac. Din punct de vedere chimic, cazeinele sunt fosfoproteide care au ca grupare prostetic
fosforilserina sau fosforiltreonina (Baumy, 1998).
Grupul de fosfoproteide predominante n lapte (, , , K-cazeinele) sunt cunoscute
sub numele de cazein. Cazeinele s, , K au masa molecular n jur de 25.000 Da. Cazeina
K conine i o proporie mic de glucide.
Proteinele solubile sunt proteinele din lactoser i reprezint un amestec complex
format din componente nedializabile care rmn n zer dup precipitarea cazeinei la pH
izoelectric sau n prezen de enzime (rennin). Proteinele solubile reprezint cca. 20% din
proteinele totale ale laptelui de vac.
n funcie de solubilitatea lor, proteinele din lactoser se clasific n:

globuline (lactoglobulina i imunoglobuline);

albumine (lactalbumina i albumina seric);

proteoz-peptone
Prin nclzire la 100C, globulinele i albuminele sufer un proces de denaturare i
precipit, spre deosebire de proteoz-peptone care nu precipit. -Lactoglubulina are masa
molecular egal cu 18.000 Da. Este constituit din 162 aminoacizi organizai ntr-o
structur primar format din trei lanuri polipeptidice.
n structura sa, -lactoglobulina conine grupri sulfhidril care pot fi eliberate prin
denaturare, imprimnd gustul de fiert al laptelui. De asemenea, prin nclzire lactoglobulina formeaz cu K-cazeina un complex foarte stabil.
Imunoglobulinele din lactoser sunt asemntoare cu -globulinele din serul sanguin.
Sunt cele mai mari molecule din lapte, avnd o mas de 180.000 Da i nu sunt proteine
specifice secreiei din lapte, deoarece sunt sintetizate de limfocitele B elaborate de mduva
spinrii. Prezint proprieti imunologice asigurnd imunitate sugarului.
-Lactalbumina este sintetizat n glanda mamar, are o mas molecular relativ
mic (17000 Da) i un coninut ridicat de triptofan. Ea reprezint 1/5 din proteinele
lactoserului.
Serumalbumina este o fraciune albuminic care reprezint 3% din proteinele
lactoserului. Se pare c este identic cu albumina din serul sanguin. Nu este specific
laptelui i are proprieti imunologice.
Proteoz-peptonele sunt substane caracterizate de un coninut ridicat de glucide (pn
la 6%) i fosfor. n structura lor chimic intr 1% hexozamine, 3% hexoze, 0,7% fructoz i
2% acid sialic.
Proteoz-peptonele i K-cazeina sunt singurele componente din lapte care conin acid
sialic.
Valoarea biologic a proteinelor din lapte este determinat de aminoacizii
constitueni i n primul rnd, de aminoacizii eseniali furnizai din proteinele din alimentele
ingerate de animal (Georgescu, 2000).
2.4. CAZEINA

12

Cazeina este cea mai important dintre proteinele laptelui. Cantitatea de

cazein din laptele de vac este de aproximativ 2,7%, valoare care sufer variaii
relativ reduse n timpul perioadei de lactaie.
Cazeina este o fosfoproteid a crei grupare prostetic este esterul fosforic al serinei
sau treoninei (Cpri, 2000). Forma monoester ortofosforic este probabil singura care
exist n cazein. Compoziia cazeinei variaz de la o specie la alta: cazeina uman are un
coninut mai ridicat n sulf, cistin i glucide dect cazeina din laptele de vac, cazeina din
laptele de oaie conine puin acid sialic.
Cazeina are pHi 4,6 i alturi de catena proteic, n molecul sunt prezente resturi de
acid fosforic (0,85% P), ioni de calciu, potasiu, acizii citric, sialic i glucide (galactoz i
galactozamin). Cele patru fraciuni separate electroforetic, n prezena ureei, sau
cromatografic, pot fi separate n variante genetice individuale, care sunt dependente de
factori ereditari (tabelul 3).
Tabelul 3. Proteinele laptelui de vac (Belitz, 1987)
Fraciunea
Cazeinele
Cazeina-s1
Cazeina-
Cazeina 1
Cazeina 2
Cazeina-s2
Cazeina-
Cazeina-
Cazeina 3
Proteinele zerului
-Lactoglobulina
-Lactalbumina
Albumin seric
Imunoglobulina
IgG1
IgG2
IgA
IgM
FSC(s)
Proteoz-Peptone

Varianta
Genetic

Cota parte

A,B,C,D

75-85
39-46
3-7

A,A,A,B
A/A,A,B
A,B,C,D
A,B
A,A,A,B,C,
E,B2
A/A/A,B
A,B,C,D,Dr
A,B

Punctul
izoelectric
4,92-5,35
5,8-6,0

Masa
Molecularb
(kDa)

8-11
8,15

5,37

23,6
12-21
20,5
11,8
25,2
19

25-35

5,20-5,85

24

Coninut
de fosfor
(%)
0,9
1,1
0,1
1,4
0,2
0,6

11,6
15-22
7-12
2-5
0,7-1,3
1,9-3,3
1,2-3,3
0,2-0,7
0,2-0,7
0,1-0,7
0,2-0,3
2-6

5,35-5,41
4,2-4,5e
5,13

18,3
14,2
66,3

5,5-6,8
7,5-8,3
-

162
152
400c
950d
80
4-41

3,3-3,7

a-procente din proteinele totale ale laptelui smntnit; b-monomeri; c-dimer; d-pentamer; e- punctul izoelectric.

Fraciunile cazeinei
a). Grupul -cazeinei. Complexul -cazeinei reprezint o fraciune din cazeina
ntreag (care conine s-, K-, i -cazeine), solubil n uree 6,6 M, dar insolubil n uree
4,6 M. Acest complex este format din dou grupuri de fraciuni: unele ,,sensibile la calciu"
(cazeinele s-, i s similare), iar altele ,,insensibile la calciu" (cazeinele K-, -, m).
13

Fraciunile -cazeinei sensibile la calciu. Aceast fraciune a complexului -cazeinei

este dificil de definit. O serie de cercettori dau denumiri diferite compuilor din acest grup
cu proprieti similare. Astfel Waugh i Hippe1 obin la prepararea cazeinei-K o parte din cazeina ca sare insolubil pe care o numesc s -cazein. Mai trziu Long, Mc Meekin,
Schmidt i Payens obin fraciunile denumite de ei R-, 1-, respectiv cazeina 1,07 i 1,10
care se aseamn n multe privine cu s-cazeina lui Waugh i Hippel. Ulterior Waugh
separ s-cazeina pe coloana de dietilaminoetil celuloza (DEAE celuloza) n soluie tampon
care conine uree, n dou pri: s 1,2-cazeina (format din s1 i s2-cazein) i scazein.
n 1962 Thompson constat existena a trei forme genetice ale s-cazeinei
individuale (A, B, C) sau n perechi (AB, AC, BC). Ca diferen analitic se poate semnala
coninutul de azot 15,1 (A), 15,34 (B) si 15,40 (C) i mici deosebiri n ceea ce privete
coninutul de aminoacizi.
Lindqvist sugereaz c cele dou fraciuni notate de Waugh s1- i s- sunt probabil
echivalente cu dou din variantele lui Thompson s-A, s-B, sau s-C. Thompson i Kiddy
au izolat i caracterizat cele trei forme ale s cazeinei notndu-le cu s1-A, s-B i s1-C.
Grupul cazeinelor s - este cel mai mobil dintre constituenii importani ai cazeinei
ntregi i cel mai bogat n fosfor.
Cazeina s este preparat prin fracionarea cazeinei ntregi cu CaCl 2; ea precipit
singur la temperaturi sczute apoi este purificat prin cromatografie. Se poate de asemenea
obine prin fracionare cu uree. Dei s-au utilizat aceleai metode de determinare s-au
obinut dou valori pentru masa molecular: 16500 i 27000 Da. n legtur cu structura se
tie c arginina este singurul aminoacid N-terminal, iar la captul C-terminal este triptofan
i leucin. Cazeina s nu conine glucide iar cistina este absent sau n cantiti reduse.
Thompson propune urmtoarea definiie pentru grupul cazeinelor sensibile la calciu:
s -cazeinele sunt fraciuni din complexul -cazein, insolubile n CaCl 2 0,4 M la pH 7,0 i
temperatura 0,4C. Aceast fraciune include formele genetice ale s1-cazeinei i alte
cazeine s-similare.
s1-cazeinele reprezint cea mai important parte din totalul fraciunii s-cazeinei.
Ele sunt stabilizate de ctre cazeina-K mpotriva precipitrii cu calciu. Exist patru variante
genetice ale acestor cazeine A, B, C i D n laptele de vac. Ele nu conin glucide.
Monomerul de cazein s1 este obinut la pH 12 sau prin folosirea agenilor disociani
(uree, clorhidrat de guanidin) la o trie ionic sau concentraie scazut. Masa molecular a
acestuia este de 23700 200 Da. Compoziia n aminoacizi a fost dat de Gordon, Basch,
Thompson i Konig i Van Rooijen (tabelul 4).
Fraciunile -cazeinei insensibile la calciu (Cazeina K)
Cazeina-K este ca i precedentele o fosfoprotein cu caracter acid, ns ea difer mult
de acestea prin compoziie i proprieti. Dintre proprietile specifice ale acestei proteine se
menioneaz:
- o mare solubilitate chiar n prezen de calciu la o concentraie relativ ridicat (0,4
M);
- putere stabilizatoare fa de calciu, pentru celelalte cazeine pe care le menine ntrun complex solubil;
- este substrat specific pentru rennin.
Thompson sintetizeaz n modul urmtor caracteristicile cazeinei-K: o fraciune din
complexul cazeinei solubile n CaCl2 0,4 M la pH 7,0 i temperatura de 0-4C. Aceast
fosfoglicoprotein este capabil s stabilizeze s cazeinele mpotriva precipitrii cu calciu i
se prezint puternic agregat (S20 ~13, la pH 7 i /2=0,2).
14

Cazeina-K conine n proporii aproximativ echimoleculare galactoza, galactozamina

i o glucid acid, acidul sialic.
Datorit acestui fapt coninutul n azot al cazeinei-K (14,3 %) este mai redus dect la
celelalte cazeine (15,65 %). Aceast fraciune conine cistina i o proporie important de
hidroxiaminoacizi (12,3 %). Exist deci n cazeina K o proporie important de grupri -OH
hidrofile, ceea ce explic marea sa solubilitate.
Tabelul 4. Compoziia n aminoacizi a cazeinelor s1B, B i KB
Aminoacizi
Lys
His
NH3
Arg
Trp
Asp
Thr
Ser
Glu
Pro
Gly
Ala
Cys
Val
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
PO4H3
Total resturi
aminoacizi

s1B
MM = 23700
14
5
(26)
6
3
15
5
14
39
17
9
9
11
5
11
17
10
8
9

B
MM = 24200
11
6
(29)
5
1
9
9
15
39
33-34
5
5
20
6
10
22
4
9
5

KB
MM = 18700
9
3
(16)
5
2
11
13
12-13
27
20
3
14
2
11
2
12
8
8
4
1

198

209-210

166-167

15

Figura 1. Schema structurii cazeinei-K din laptele de vac (dup Jolles si Alais).
Structura cazeinei-K este mai bine cunoscut dect cea a altor cazeine, datorit
studierii aciunii diferitelor enzime i a reactivilor specifici (hidroborura de litiu). n schema
structural prezentat de Joles i Alais (figura 1.), se arat c n coagularea enzimatic se
rupe o singur legtur. n ceea ce privete gruprile prostetice, acidul sialic se gsete n
poziie terminal, naintea galactozaminei i galactozei.
Exist mai multe variante genetice ale cazeinei -K pe care Thompson le-a notat n
ordinea mobilitii electroforetice descrescnde K-A, K-B, K-C etc. Fiecarea variant de
cazein-K este compus din cel puin apte fraciuni de lanuri peptidice foarte
asemntoare (sau chiar identice), ns cu coninut n glucide variabil.
Multe procedee de obinere a cazeinei-K folosesc solubilitatea acesteia n soluii
diluate de CaCl2.
Unele metode noi de fracionare a cazeinei native presupun solubilizarea cazeinei-K
n uree 6,6 M i acizi tari ca acid tricloracetic 12% sau H 2SO4. Purificarea se poate face cu
alcool sau prin cromatografie pe coloana de DEAE-celuloz. Diferite preparate de cazeinK difer ntre ele prin compoziia elementar i proprieti fizice, probabil datorit
variaiilor n puritate determinate de metoda de preparare.
Alte cazeine insensibile la calciu. n complexul insensibil la calciu al -cazeinei
diferii cercettori au gsit o serie de fraciuni denumite -, m- i 2-cazeina. Exist ns
indicaii c de fapt acestea sunt amestecuri variabile ale acelorai substane, sau diferite
forme ale acestora. Sub denumirea de -cazein i cazein-m a fost foarte sumar descris o
fraciune care se gsete n preparatele impure de cazein-K i care se sedimenteaz mai
greu dect aceasta din urm. Cazeina are un coninut ridicat de fosfor (1,2 %) spre
deosebire de cazein-K (0,2%).
b). Grupul -cazeinei. Cazeina prezint analogii cu s-cazeina: mas molecular
apropiat (18000 25000), absena din compoziia sa a glucidelor i a cistinei, existena
formelor genetice A, B, C. Spre deosebire de s-cazein, cazeina nu este sensibil la
calciu dect la temperaturi peste 20C; la temperatur joas ea rmne n so1uie n
condiiile n care s-cazeina precipit. -Cazeina conine mai puin fosfor, are un punct
izoelectric mai ridicat i o mobilitate electroforetic mai redus dect cazeina s.
Dup Thompson, -cazeina poate fi definit ca o fraciune din cazeina ntreag care
la pH 4,6 este solubil n uree 4,6 M dar insolubil n uree 3,3 M.
16

Componentele -cazeinei posed proprieti de asociere-disociere prin

ultracentrifugare care sunt dependente de temperatura. Astfel la 4C -cazeina este
monomer, la 8,5C s-a constatat o agregare n funcie de concentraie iar la 20C se
prezint ca polimer. Sunt cunoscute mai multe variante genetice A 1, A2, A3, B i C; varianta
iniial A a fost subdivizat n fraciunile A1, A2, A3.
Formele genetice ale -cazeinei se pot gsi individual (A, B, C) sau n perechi (AB,
AC, BC) fiind dependente de rasa animalului. n tabelul 5 sunt prezentate cteva proprieti
ale fraciunilor -cazeinei.
Tabelul 5. Cteva proprietti ale fraciunilor -cazeinei (dupa Thompson i colab.)
Fraciunea

Metoda de
preparare
Thompson
Pepper

A
B
C
cazeina
Hipp i colab
cazeina
Groves i colab
*-280 m lungime de und

N%

P%

15,18
15,33
15,45
15,47
15,35

0,59
0,57
0,50
0,64
0,48

Raport
P/N
0,0389
0,0372
0,0324
0,0414
0,0313

1 cm *
A1 %
4,6
4,7
4,5
-

Pentru prepararea -cazeinei exist mai multe metode dintre care se remarc
procedeele propuse de Aschaffenburg, Hipp i Warner. Purificarea se poate realiza prin
cromatografie pe DEAE-celuloz n prezen de uree. Se apreciaz ca metode foarte eficace
pentru izolarea formelor genetice, electroforeza pe gel de amidon sau gel de poliacrilamid.
c). Grupul -cazeinei. Aceast fraciune a cazeinei ntregi este solubil la pH 4,7 n
uree, 3,3 M dar insolubil n uree 1,7 M, dup adugare de (NH4)2SO4. Cazeina a fost
izolat pentru prima dat de Hipp apoi o serie de studii o gsesc eterogen; -cazeina lui
Hipp conine probabil -cazeina lui Cherbuliez. Aschaffenburg presupune existena unor
forme de -cazein variabile genetic.
d). Interaciunea ntre fraciunile cazeinei. Una dintre proprietile cele mai
remarcabile ale cazeinei s i K este capacitatea de a se asocia pentru a forma polimeri
(asocierea moleculelor identice) sau compleci (asocierea moleculelor diferite).
n prezen de ioni de calciu, aceti compleci se unesc formnd agregate eterogene
numite micelii.
n soluie la temperatura obinuit cazeinele izolate sunt polimerizate, ns ctre pH
12 se observ forme monomere. Diferite fraciuni amestecate se asociaz ntre ele. Se pare
c asocierea cea mai rapid i cea mai puternic se produce ntre cazeina s i K pentru a
forma un complex stoechiometric molecular probabil 3/1). Waugh propune un model
pentru structura complexului K-s cazein, care ar constitui nucleul miceliilor. El admite c
n acest complex sunt trei molecule s orientate paralel una fa de alta i aezate simetric n
jurul moleculei de cazein-K. O parte din molecula cazeinei K depete mnunchiul format
de moleculele s. Waugh i Hippel au atribuit acestei pri capacitatea de coloid protector a
cazeinei-K. Fraciunile B i K sunt mai strns asociate dect i K. Acest complex prezint
probabil importan pentru coeziunea intern a agregatelor.
Aceste asocieri rezult datorit legturilor de hidrogen i a interaciunilor gruprilor
nepolare numeroase n cazein. Se pare c rolul principal n acest caz revine forelor van der
Waals.
17

n prezen de ioni de calciu, intervin alte legturi care se stabilesc ntre complecii
primari i moleculele izolate. Calciul bivalent formeaz puni ntre perechile de grupri ale
acidului fosforic i ntre aminoacizii dicarboxilici. Unele studii au artat existena a dou
tipuri de legturi prin Ca2+; o legtur puternic leag complexul s-K cu n proporii
constante i o legtur slab unete miceliile primare n agregate de dimensiuni variabile.
n absena cazeinei-K i n prezena calciului nu se formeaz micelii cu alte fraciuni
cazeinice.
Cazeina-K joac rol de coloid protector avnd fa de celelalte fraciuni ,,putere
stabilizatoare"; ea mpiedic precipitarea cazeinei s, pn la un raport K/s = 1/10.
Fosforul nu influeneaz puterea stabilizatoare a cazeinei-K, ns dac fraciunea s este
defosforilat ea nu poate fi stabilizat de cazeina K. Absena acidului sialic determin o
reducere a capacitii de stabilizare ns nu anularea ei.
Calciul contribuie la formarea miceliilor cnd este prezent n proporii reduse, de
exemp1u ca n lapte (0,03 M). La o concentraie de 10 ori mai mare el provoac disocierea
complexului (Ca-s--K) i precipitarea cazeinelor sensibile la calciu. Disocierea este
favorizat la temperaturi sczute, deoarece stabilitatea diverilor compleci este redus ntre
0-5C.

2.5. LACTOZA
n lapte se disting mai multe grupe de glucide: neutre (lactoza i polioze care conin
lactoz i fucoz), azotate (glucozamina N-acetilat i galactozamina N-acetilat) i acide
(acizi sialici). n laptele de vac normal lactoza reprezint cea mai mare parte din glucide; n
colostru celelalte componente glucidice sunt n proporie mai mare.
Lactoza se gsete n lapte i glanda mamar n proporii mai mari, ns n cantiti
mai reduse a fost semnalat i n snge i urin n timpul sarcinii i lactaiei.
Componenta glucidic principal a laptelui este lactoza, -D-galactopiranoil (1,4)
D glucopiranoz, prezent n lapte n proporie de 4-6%. Laptele de vac conine 45 50g
lactoz la litru, glucoz i galactoz libere (aproximativ 0,1 g/l), N-acetil glucozamin, Nacetil galactozamin i acizi sialici (urme).
Lactoza este o diglucid de origine animal care se gsete n laptele mamiferelor i
n produsele obinute prin prelucrarea acestuia. n plus, lactoza izolat din zerul dulce se
folosete ca adaos n diferite produse alimentare, datorit proprietilor ei funcionale.
Astfel, ca structur, lactoza (fig. 2) este o diglucid reductoare (Cpri, 2000)
format din -D-galactopiranoz i -D-glucopiranoz legate 1,4 glicozidic (C 12H22O11).

18

Figura 2. Structura lactozei

n funcie de modul n care se realizeaz cristalizarea, lactoza se prezint sub mai
multe forme (Cpri, 2000):
- anomerul (monohidrat), care se obine prin cristalizarea lactozei dintr-o soluie
apoas concentrat pn la suprasaturare, la temperaturi sub 94C; -Lactoza monohidrat
cristalizeaz sub form prismatic, n cristale albe, avnd punct de topire de 202C i [] 20
= + 85 55. Nu este higroscopic, fiind utilizat ca agent de antiaglomerare la produsele
sub form de pulberi. Lactoza monohidrat se dizolv mai greu n unele produse lactate
(lapte concentrat, brnzeturi topite, ngheat), ceea ce conduce la defecte de textur ale
produsului (senzaie de nisip). Prin uscare lent, sub vid i la t < 60C s-au prin uscare
rapid la t > 100C, - lactoza monohidrat devine anhidr, avnd proprieti higroscopice;
- anomerul (anhidru), care se obine prin cristalizarea lactozei din soluii apoase la
t mai mari de 94C i care are punctul de topire 252C, cu [] 20 = + 35 55C.
Cristalele de -lactoz sunt mai solubile n ap dect cele de -lactoz;
- lactoza amorf, care se obine prin uscarea rapid a soluiei de lactoz, i care
conine cei doi anomeri. Lactoza amorf este foarte higroscopic, iar dac se atinge un grad
de hidratare la care moleculele capt o mobilitate suficient, atunci se formeaz -lactoza
monohidrat;
- lactoza instant, care se obine prin uscarea lactozei amorfe, dup o prealabil
umezire, cu formarea de agregate de lactoz ce se dizolv rapid ca urmare a unei capaciti
de dispersare mai mari (Banu, 1998).

Biosinteza
Kleiber i Reiss au stabilit c principalul precursor al lactozei este D-glucoza din
snge. Studiile efectuate cu izotopi radioactivi au artat c 80% din atomii marcai din
glucoz pot fi regsii n lactoz. Principala cale de formare a galactozei este de asemenea
din glucoza sngelui prin epimerizarea atomului C4 (Dumitru, 1980, Lehninger, 1987).
Una din schemele indicate de Folley pentru sinteza lactozei este urmtoarea
(Popescu, 1991):
Hexokinazand

a) Glucoza + ATP

daza

Glucoza 6 fosfat + ADP

Fosfoglicomutaza

b) Glucoza 6 fosfat

Glucoza1 fosfat
Uridiltransfera
za nd19
daza

c) Glucozo 1 fosfat + uridintrifosfat

d) Uridindifosfoglucoza

Uridindifosfoglucoza + pirofosfat

Uridinfosfogluco 4 - epimeraza

Galactoziltransferaz

e) Uridindifosfogalactoza + glucozo1-fosfat
f) Lactozo 1 fosfat

Uridindifosfogalactoza
Lactozo-1-fosfat +
uridindifosfat

Lactoz + fosfat

Prin hidroliza lactozei se elibereaz cte o molecul de D-glucoz i D-galactoz.

Lactoza este o hexobioz (galactozido - - 1,4 glucoz) care exist sub dou forme
izomere i , difereniate prin poziia hidroxilului de la C1al glucozei. (Ferretti, 2001).
n natur sau n produsele lactate ea poate fi ntlnit sub form -hidratat sau anhidr sau ca substan amorf, ca amestec de - i -lactoz.
Diferite alte forme pot fi produse n condiii speciale. Echilibrul existent ntre aceste
forme depinde de condiiile fizice.

Proprieti
Lactoza obinuit este -lactoza monohidratat (C12H22O11 H2O). Ea se prepar prin
concentrarea unei soluii apoase de lactoz la suprasaturare i cristalizare sub 93,5C; are o
rotaie specific n ap []D20 = 89,4 i un punct de topire la 201,6C (Ferretti, 2001).
Puterea de ndulcire
Lactoza are o putere de ndulcire de ase ori mai redus dect a zahrului obinuit. n
tabelul 6. este indicat puterea de ndulcire relativ a unor glucide.

Tabelul 6. Puterea de ndulcire relativ a unor glucide

(concentraia n % pentru o putere de ndulcire echivalent)
Zaharoza

Glucoza

Fructoza

Lactoza

0,5
1,0
2,0
2,0
2,0
5,0
5,0
5,0
10,0
1,0
10,0
15,0

0,9
1,8
3,6
3,8
3,2
8,3
8,3
7,2
13,9
14,6
12,7
17,2

0,4
0,8
1,7

4,2
4,6
4,5
8,6

8,7
12,8

1,9
3,5
6,5
6,5
6,0
15,7
14,9
13,1
25,9

20,7
27,8

20

15,0
20,0

20,0
21,8

13,0
16,7

34,6
33,3

Din aceste date se poate observa c lactoza este mai dulce la concentraii mai
mari dect la valori mai mici ale concentraiei (n comparaie cu alte zaharuri) i c
are o putere de ndulcire superioar datelor prezentate n literatur. n lapte gustul
lactozei este mascat de cazein; din acest motiv zerul pare mai dulce dect laptele
pentru aceeai concentraie de lactoz.
-Lactoza este mai dulce dect -lactoza, ns forma nu are o putere de
ndulcire superioar amestecului la echilibru pentru soluii n care concentraia n
lactoz nu depete 7%. Deoarece n amestecul la echilibru forma reprezint
aproximativ 60%, exist o diferen mai mic ntre puterea de ndulcire a formei i
amestec dect ntre -lactoz i amestecul acestor forme izomere.
Hidroliza
Lactoza poate fi hidrolizat (fig. 3) de ctre enzima lactaza prezent n secreia
glandelor intestinale, n unele plante, drojdii i bacterii. Prezena lactazei naturale n lapte
este controversat. Exist cteva drojdii lactice (Torula cremoris; Saccharomyces fragilis)
care conin lactaz i pot hidroliza lactoza.
Prezena galactozei inhib hidroliza enzimatic a lactozei ns glucoza nu are acest
efect.
Creterea concentraiei de enzim i a temperaturii determin o intensificare a
procesului de hidroliz. Reacia nu este ns limitat la o simpl hidroliz cu producerea
glucozei i galactozei. Aronson arat c imediat se formeaz diferite oligoglucide.
Cantitatea de oligoglucide este proporional cu concentraia soluiei de lactoz. Roberts i
McFarren pun n eviden peste zece oligoglucide n timpul hidrolizei lactozei cu -Dgalactozidaz. Trei dintre acestea au fost identificate ca fiind: 3-0--D-galactopiranozil-D-glucoz,

6-0--D-galactopiranozil-D-glucoz i 6-0--D-galactopiranozil-D-galactoza.
Lactoza este destul de rezistent la hidroliza acid, ea nu poate fi scindat de
ctre acidul citric n aceleai condiii ca i zaharoza.
CH 2 O H
CH 2 O H
HO H
H

OH H H
H

OH

CH
H 2O H

CH 2 O H

O
H
H
OH +
HO
+
H
O
2
OH H
OH
lactaza
OH H H HO OH H OH
H
H
OH
H
OH
H
OH
H

lactoza

D-galactoz

D-glucoz

Figura 3. Hidroliza lactozei

Din lactoz, pe cale chimic, se pot obine lactuloz, lactosiluree, lactitol i acid
lactobionic.
Aceste produse pot fi utilizate n diferite domenii pentru proprietile lor speciale
(tabelul 7.). Dintre substanele menionate, foarte importante pentru nutriia uman sunt
lactuloza i lactitolul.
21

Lactuloza este gsit in cantiti mici n produsele lactate prelucrate termic (lapte
concentrat, lapte tratat HTST etc.), cantiti care nu sunt satisfctoare pentru dezvoltarea
bacteriilor bifidogene. Lactuloza se obine din lactoz, n care caz, glucoza din molecula
lactozei este izomerizat n fructoz, obinndu-se (-4--D-galacto-piranozil-D-fructoz.
Acest proces are loc la nclzirea lactozei n prezen de borat. Lactuloza, ca i ali compui
neglucidici i polimeri ai fructanului, nu este metabolizat dect n colon, metabolizarea
fiind fcut de microorganisme care includ i bifidobacteriile. Prin fermentarea lactulozei se
formeaz acid acetic i lactic, reducndu-se cantitatea de acid butiric i valeric precum i
producia de NH3 i de acizi biliari secundari.
Tabelul 7. Produse obinute din lactoz
Produsul
Lactuloz
Lactosiluree
Lactitol

Proprieti
Anticonstipant

Procedeul aplicat
pentru obinere
Izomerizare alcalin

Observaii

Factor de cretere pentru

bifidobacterii
Potenarea apetitului Condensarea lactozei Conduce la utilizarea
rumegtoarelor pentru cu ureea
eficient a ureei n hrana
uree
animalelor
Proprietile poliolilor Hidrogenarea lactozei Echivalent cu sorbitol
n prezena de Ni
2+
Sechestrarea
Ca , Oxidarea lactilolului n Utilizare n industria
2+
2+
Fe , Mg i acidulant mediu acid
alimentar ca acidulant

Lactitolul sau 4-0-(-D-galactopiranizol)-D-glucitolul este obinut prin hidrogenarea

unei soluii de lactoz cu concentraia 30-40%, la 1000C, n prezena catalizatorului NiRaney.
Dizaharidul hidrogenat are masa molecular mai mare ca a lactozei. Se poate obine
lactitol monohidrat i dihidrat (Lacty) care difer prin coninutul de ap. Lactitolul
monohidrat are punctul de topire la 120C, iar cldura de dizolvare este de -52,1 J/g.
Lactitolul dihidrat are punctul de topire la 720C i cldura de dizolvare este de 58,18 J/g.
Lactitolul are un grad de dulce de 0,3-0,4, solubilitatea n ap fiind de 55% din cea a
sorbitolului, la 200C.
Pe lng faptul c lactitolul se utilizeaz ca substan bifidogen, se poate folosi i ca
substan de ndulcire, ca substan pentru creterea vscozitii, ca substan care d
corpolen pentru guma de mestecat i pentru buturi rcoritoare pe baz de fructe.
Lactitolul nu cristalizeaz i are higroscopicitate redus i, din aceste motive, poate fi
utilizat n masa de ciocolat, care poate fi conat la temperaturi mai mari. n cazul
deserturilor congelate, prin adaos de lactitol scade punctul crioscopic al acestor produse.
Ca substan bifidogen, lactitolul este hidrolizat foarte lent in intestinul subire, cea
mai mare parte din lactitolul ingerat ajungnd in intestinul gros, unde este utilizat de
microflora intestinal pentru producia de acizi grai cu lan scurt, care scad pH-ul
colonului, dar pot fi absorbii de organism, fiind folosii ca surs de energie. Lactitolul
reduce colesterolul sanguin i modific metabolismul acizilor colici in intestin. Lactitolul
poate fi folosit i pentru tratamentul bolilor hepatice i n constipaie. Lactitolul are un grad
de cariogenitate foarte sczut.
22

Hidroliza lactozei din lapte n scop nutriional.

Se aplic lactozei din laptele destinat consumului ca atare i din cel destinat fabricrii
produselor lactate dietetice, cum ar fi iaurtul sau brnza proaspt de vaci. Gradul de
hidroliz poate fi stabilit la 25, 50, 75 sau 90%, pentru laptele destinat produselor lactate
dietetice de tipul iaurtului, i la peste 95%, n cazul laptelui destinat fabricrii brnzei
proaspete de vaci, respectiv pentru laptele de consum destinat persoanelor cu intoleran la
lactoz (deficien n lactaz de natur genetic).
Pentru hidroliza lactozei se poate folosi lactaza din Kluyveromyces fragilis sau lactis
sau chiar a drojdiei Kluyveromyces fragilis care produce lactaz, procedee prin care se
consum glucoza, dar nu i galactoza.
2.6. MICROBIOLOGIA

Laptele secretat n ugerul vacii este steril. Primele picaturi de lapte conin o cantitate
mai mare de bacterii, i aceast cantitate scade pe msur ce se mulge laptele. Ultimele
picturi de lapte par sa fie lipsite de bacterii, acest lucru indicnd c microorganismele din
laptele provin din surse externe. Diferitele surse de contaminare cu microorganisme sunt:
ugerul i pielea din jurul su, ustensilele i echipamentele de muls, hrana animalului, aerul
din grajd, persoana care mulge, apa.
Microorganismele din lapte pot fi microorganisme favorabile care schimb favorabil
gustul i aspectul laptelui, sau microorganisme nefavorabile (patogene), care cauzeaz boli.
Microorganismele patogene trebuiesc distruse n diferitele etape ale obinerii
produselor lactate destinate consumului.
Grupele de microorganisme din lapte
Microorganismele ntlnite n laptele de vac aparin urmtoarelor grupe:
1. Bacterii, care sunt microorganisme unicelulare de form sferic, cilindric sau
spiralat, care, n condiiile n care temperatura nu scade sub 4-6Celsius se nmulesc de
trei ori n fiecare minut; astfel dintr-o bacterie se pot forma n 7 ore dou milioane de
bacterii. Bacteriile din lapte sunt responsabile de fermentaia lactic, butiric, propionic,
unele sunt implicate n putrefacie iar altele, cele coliforme, provin din mediu.
Numrul de bacterii din lapte ofer o informaie precis asupra igienei mulsului i
condiiilor de pstrare a laptelui.
Datorit compoziiei sale, laptele este un mediu excelent pentru dezvoltarea
numeroaselor microorganisme, condiii mai favorabile avndu-le bacteriile lactice.
Bacteriile care sunt favorizate n industria laptelui se ncadreaz n dou grupe:
- bacterii lactice care sunt de neevitat in lapte: genul Streptococcus, Lactobacillus etc;
- bacterii propionice care provin din surse externe, se dezvolt lent n lapte i pot fi
utilizate industrial la maturarea brnzeturilor speciale;
2. Mucegaiuri, care sunt grupuri de microorganisme multicelulare heterogene
aerobe, care se reproduc fie prin spori fie prin fragmentaie. Ele se pot dezvolta pe o mare
varietate de substraturi, sunt de obicei microorganisme de descompunere, i sunt folosite
pentru producerea de antibiotice i pentru obinerea diferitelor varieti de brnzeturi.
3. Drojdii, care sunt organisme unicelulare ce se reproduc asexuat prin
nmugurire. Ele sunt folosite industrial pentru fermentarea carbohidrailor pn la
alcool i acid citric. De obicei nu sunt folosite n procesarea laptelui fiind considerate
organisme de descompunere. Dezvoltarea drojdiilor n lapte este inhibat de
23

multiplicarea bacterilor. Exemple de genuri de drojdii: Torulopsis, Kluyveromices,

Yarowia, Candida etc.
4. Virusuri, care sunt microorganisme de dimensiuni foarte mici alctuite dintr-un
cap sferic ce conine material genetic i o coad cilindric. Nu se pot reproduce singure i
de obicei atac celule bacteriene, n acest caz numindu-se bacteriofagi. Bacteriofagii care
atac bacteriile productoare de acid inhib producerea acidului n lapte.
Calitatea laptelui n funcie de numrul de germeni
Laptele crud destinat consumului uman direct i cel destinat fabricrii produselor
obinute din laptele crud, ale cror procese de fabricaie nu includ un tratament termic,
trebuie s corespund standardului de calitate care prevede ca numrul total de germeni
(bacterii) obinut la analiza din laborator s fie cel mult egal cu 1.000.000 / ml lapte. De
altfel, cele mai multe companii care achiziioneaz lapte crud n vederea procesrii pentru
consum (lapte la pung sau condensat, pentru fabricarea smntnii, iaurturilor, brnzeturilor
etc.) ofer preturi difereniate n funcie de coninutul n germeni, astfel:
- lapte de calitate A (extra) i B (bun) dac numrul de bacterii este < 100.000/ml;
- lapte de calitate C (satisfctoare) cu 100.000 -500.000 germeni /ml;
- lapte de calitate D (slab) cu 500.000 -1.000.000 germeni /ml;
- lapte de calitate E (nesatisfctoare) dac numrul de bacterii este mai mare de
1.000.000/ml;
Calitatea laptelui n funcie de numrul de celule somatice
Celulele somatice din lapte provin din ugerul vacii i dau informaii asupra faptului
c, fie apar semne clinice, fie c nu (boala este inaparent), vaca are ugerul bolnav boala
se numete mastita. Mastita este o boala infecioas care apare ca urmare a inflamaiei
esutului ugerului din cauza microbilor ajuni n uger. Celulele somatice sunt celule special
produse de corpul vacii, n lupta mpotriva infeciei cu bacterii. Celulele somatice sunt
reprezentate, ndeosebi, de globulele albe (leucocitele) i celulele epiteliale care cptuesc
alveolele secretorii. Laptele produs de ctre vacile cu mastit se cheam lapte mastitic.

3. BIOLUMINISCENA
Bioluminiscena reprezint lumina creat n organismele vii. Cel mai cunoscut
exemplu de bioluminiscen este licuriciul al crui abdomen devine luminos n sezonul
de mperechere n scopul comunicrii cu potenialii parteneri. Spre deosebire de alte
tipuri de emisii de radiaii, bioluminiscena se produce cu eliberare foarte redus de
cldur.
Reacia chimic a sistemului Luciferin/Luciferaz
Luciferinul este cel mai comun substrat n bioluminiscen. Sistemul
Luciferin/Luciferaz ntlnit i la licurici (Photinus pyralis) a fost introdus prima dat n
biologia molecular n anul 1986 de cercettori din UC San Diego (Ow, 1986).
Luciferaza, o protein cu masa molecular de 62000 daltoni este activ ca monomer,
neavnd nevoie de activare prin procesare. Procesul de bioluminiscen decurge n mai
multe etape (ecuaiile 1-3):
24

Luc + LH2 + ATP

Mg

Luc. LH2- AMP + O2

Luc.Oxyluciferin*

2+

Luc. LH2- AMP + PPi (1)

Luc.Oxyluciferin* + AMP + CO2 (2)

Luc.Oxyluciferin

light

(3)

Luc este luciferaza;

* semnific o stare electronic excitat.

n prima etap (ecuaia 1), luciferaza transform D-luciferin n complexul luciferiladenilat, legat de enzim. Luciferaza are o specificitate extraordinar pentru acest nucleotid
trifosfat. Adenilatul este adevratul substrat al proceselor oxidative urmtoare. De fapt, DLH2-AMP obinut prin sintez reacioneaz cu oxigenul n prezena luciferazei i produce
emisie de lumin la fel ca i n cazul utilizrii substraturilor naturale D-luciferin i Mg-ATP.
Dup cum se observ din ecuaiile 2 i 3, enzima luciferaza funcioneaz ca monooxigenaz, cu toate c nu este implicat un metal sau un cofactor. Se presupune c resturi de
aminoacizi ai luciferazei promoveaz legarea oxigenului molecular, care este apoi
transformat ntr-o molecul de oxiluciferin n stare electronic excitat i dioxid de carbon,
fiecare coninnd un atom de oxigen din oxigenul molecular. Prin pierderea rapid de
energie a moleculei de oxiluciferin n stare excitat rezult emisie de lumin prin
fluorescen.
Pe lng reaciile productoare de emisie de lumin, luciferaza catalizeaz i
formarea in vitro a adenilatului de dehidroluciferin (L-AMP) (ecuaia 4), ce nu poate
reaciona mai departe i inhib activitatea enzimei. Astfel, luciferaza prezint dou funcii
enzimatice distincte: ca sintetaz n formarea acil adenilatului i ca mono-oxigenaz.
25

Luc + L

ATP

Mg

2+

Luc.L - AMP + PPi (4)

De asemenea, n condiii specifice LH 2-AMP, format conform ecuaiei 1, poate fi

oxidat de luciferaz producnd cantiti reduse de L-AMP. Ulterior, luciferaza catalizeaz
transferul de AMP de pe L-AMP pe ATP producnd adenozin tetrafosfat. Aceste
transformri chimice indic c luciferaza poate funciona i ca ligaz. n plus, Coenzima A
poate inhiba aceast funcie de ligaz i poate modula cinetica de emisie de lumin, cu toate
c, coenzima nu reprezint un substrat necesar. Coenzima A simuleaz producerea de
lumin probabil prin promovarea eliberrii produsului oxiluciferin din luciferaz permind
enzimei s reacioneze din nou (Lee, 1970; DeLuca, 1974, 1976; Lemasters, 1977;
Branchini, 2002).
Luciferaza din licurici are cea mai mare eficien dintre toate reaciile de
bioluminiscen cunoscute avnd un randament de 0,88. Lungimea luminii emise este ntre
510 i 670 nm (galben pal la verde roiatic). Intensitatea i durata emisiei de lumin depind
de condiiile de reacie, puritatea reactanilor, etc. Pentru msurarea luminii se pot folosi
diferite aparate de la spectrofotometre la bioluminometre sau chiar camere video speciale. n
general, intensitatea emisiei de lumin poate fi msurat dup 20 secunde.
La pH-ul optim de 7,8, emisia de lumin are un maxim la 562 nm. Cu scderea pHului spre domenii mai acide, apare un al doilea maxim de emisie la 616 nm ce atinge un
maxim la pH 5,4, la care nu mai apare emisie msurabil la 562 nm. Aceast modificare n
spectrul de emisie dependent de pH se datoreaz protonrii speciilor reactive de
oxiluciferin.
Maximul n emisia de lumin este la aproximativ o secund i apoi scade rapid cu un
timp de njumtire de un minut. Arsenatul extinde timpul de njumtire substanial, dar
cu diminuarea sensibil a deteciei de ATP.
Ca majoritatea enzimelor, luciferaza din licurici respect cinetica Michaelis-Menten
i emisia maxim de lumin nu se obine pn ce nu se ating concentraiile substratul de
luciferin n exces i ale cofactorului. Cnd determinarea se efectueaz n aceste condiii,
emisia de lumin este direct proporional cu numrul de molecule enzimei luciferaza.
Valorile Km pentru luciferaza licuriciului cu D-luciferin i ATP la pH 7,8 sunt 1,7 10 -5 i
respectiv 3,4 10-4 (Lemasters, 1977). Aceste concentraii trebuie considerate atunci cnd se
efectueaz o determinare de luciferaz.
Temperatura optim pentru reacia luciferin/luciferaza este 28C. Reacia ncetinete
cu creterea temperaturii. Se evit agitarea energic, deoarece poate denatura enzima
luciferaza.

PARTEA II

26

PARTEA EXPERIMENTAL
4. OBIECTIVE

n prezent, pentru analiza calitii laptelui se folosesc metode chimice si biochimice,

care necesit echipamente i reactivi de laborator costisitoare (metode colorimetrice,
titrimetrice, gravimetrice) i personal de laborator cu un anumit grad de pregtire. Aceste
inconveniente fac ca nu ntotdeauna productorii s poat nfiina laboratoare de analiz a
calitii laptelui. Metodele chimice i biochimice de analiz sunt costisitoare (consum de
reactivi) i necesit un volum mare de munc, fiecare etap fiind o potenial surs de erori.
Studiile preliminare efectuate au demonstrat c metodele de analiz biochimic a
laptelui propuse de diveri autori sunt laborioase i imprecise.
Cercetrile i-au propus s elaboreze metode mai simple, rapide, exacte i ieftine n
analiza laptelui procesat sau neprocesat, metode care s poat fi aplicate de marii
productori, de unitile de prelucrare, dar i n cadrul unor mici laboratoare nfiinate
pe lng fermele cu vaci de lapte. Astfel, se poate urmri calitatea laptelui nc din faza
incipient, i totodat se pot stabili eventuale stri patologice ale vacilor, cum ar fi
mastita.
Proprietile fizice ale laptelui sunt n strns corelaie cu compoziia chimic a
laptelui. Parametrii fizici sunt influenai att de concentraia diferitelor componente
anorganice i organice, precum i de proporiile n care se gsesc acestea unele fa de
altele.
Cercetrile au avut ca scop determinarea principalilor indici biofizici ai laptelui:
densitate, vscozitate, tensiune superficial. S-a urmrit variaia acestora n funcie de starea
fiziologic a vacilor lactante i de producia de lapte. De asemenea, s-au stabilit corelaiile
care exist ntre diferiii parametrii biofizici, precum i ntre parametrii biofizici i cei
biochimici (protein, lactoz).
n ultimii ani se pune un accent tot mai mare pe asigurarea securitii i siguranei
alimentare. Metoda obinuit folosit pentru aprecierea calitii microbiologice a laptelui
integral determin unitile formatoare de colonii (UFC), test care nu identific ns tipurile
de organisme prezente. Metoda folosit pentru aprecierea sntii ugerului const n
determinarea numrului de celule somatice (NCS). Ambele teste dau informaii generale
asupra calitii laptelui, fr a determina sursa de contaminare bacterian.
Un rol important l dein noile biotehnici care vin n sprijinul microbiologilor, pentru
obinerea unor rezultate de mare acuratee, sensibile i n special rapide. O astfel de biotehnic este
ATP bioluminiscena.

5. METODOLOGIA
5.1. PROTOCOLUL DE LUCRU
27

Experimentul s-a efectuat pe un lot de vaci de lapte, rasa Blat Neagr

Romneasc, cu vrste cuprinse ntre 3 i 10 ani, n diferite stri fiziologice
(negestante, n gestaie timpurie, n gestaie avansat, ftate recent).
Starea fiziologic i producia de lapte a lotului experimental sunt prezentate n
tabelul 8.
Tabelul 8.
Proba
1

Starea fiziologic i producia de lapte a lotului experimental

Stare fiziologic
Ftat recent

Producia de lapte (l)

25,5

Negestant

26,5

3
4

Negestant
Negestant

19
18,5

Negestant

28

Negestant

32

Negestant

19

Negestant

16

Negestant

13,5

10

n gestaie timpurie

16

11

n gestaie timpurie

15

12

n gestaie timpurie

19

13

Gestant

10

14

Gestant

14,5

15

n gestaie avansat

10

16

n gestaie avansat

11

Furajarea s-a fcut cu borhot de la fabrica de zahr (12 kg), fn de lolium

multiflorum (3 kg), siloz de lolium multiflorum (30 kg) i amestec ferm (4-8 kg).
Suplimentarea mineral s-a realizat prin consum de 250 g /zi amestec alctuit din
NaCl, CaSO4 i uree.
Determinrile din probele de lapte s-au efectuat prin metodele standardizate:
densitatea s-a determinat cu lactodensimetrul (Mihaiu, 1998); vscozitatea dinamic s-a
determinat cu vscozimetrul Ostwald (Cpri, 2001); tensiunea superficial s-a determinat
prin metoda stalagmometric, cu stalagmometrul Traube (Cpri, a 2001); proteina s-a
determinat prin metoda Srensen (Neamu, 1998), lactoza s-a determinat prin metoda
refractometric, clorul s-a determinat prin metoda Mohr (Ghergariu, 2000), conductivitatea
electric s-a msurat cu conductometru Radelkis, numrul celulelor microbiene viabile s-a
determinat folosind numrtorul de colonii BIO-KOBE (Japonia), RLU s-a msurat cu
luminometrul Bioscan Monitor RHS 055.

28

5.2. DETERMINRI ANALITICE

5.2.1. DETERMINAREA LACTOZEI
1. Obinerea filtratului de lactoz prin acidifierea laptelui
ntr-un pahar Berzelius se pun 25 ml la care se adaug sub continu agitare, pictur
cu pictur, o soluie de acid acetic 2N pn ce pH-ul coboar la 4,6. n acest moment se
observ apariia precipitatului de cazein. Cazeina precipit la punctul izoelectric (pH i =
4,6). Deoarece la valori mai mici ale pH-ului (pH< PH izoelectric) cazeina se redizolv, este
foarte important etapa de acidulare a laptelui. Aceasta se realizeaz n bune condiii prin
msurarea continu a pH-ului cu ajutorul unui pH-metru digital.
Precipitatul obinut se filtreaz pe o hrtie de filtru. Filtratul obinut conine lactoz,
care se determin apoi la refractometru.
2. Determinarea lactozei cu refractometrul Abb
Tabelul 9. Corelaiile ntre indicii de refracie i concentraia de lactoz
Indice de
Lactoz
Indice de
Lactoz
Indice de
Lactoz
refracie
(%)
refracie
(%)
refracie
(%)
1,3380
3,37
1,3394
4,08
1,3408
4,75
1,3381
3,42
1,3395
4,13
1,3409
4,80
1,3382
3,47
1,3396
4,19
1,3410
4,85
1,3383
3,52
1,3397
4,24
1,3411
4,90
1,3384
3,57
1,3398
4,29
1,3412
4,95
1,3385
3,62
1,3399
4,34
1,3413
5,00
1,3386
3,68
1,3400
4,39
1,3414
5,05
1,3387
3,73
1,3401
4,44
1,3415
5,10
1,3388
3,78
1,3402
4,49
1,3416
5,15
1,3389
3,83
1,3403
4,52
1,3417
5,20
1,3390
3,88
1,3404
4,56
1,3418
5,25
1,3391
3,93
1,3405
4,60
1,3419
5,30
1,3392
3,98
1,3406
4,65
1,3393
4,03
1,3407
4,70
Pentru determinarea indicelui de refracie al laptelui, mediul de referin este
aerul, determinrile fcndu-se cu refractometrul Abb, la lungimea de und
corespunztoare liniei D a sodiului, cu o precizie de 4 zecimale.
Se determin indicele de refracie al probei. Valorile concentraiei n lactoz
corespunztoare indicilor de refracie sunt prezentate n tabelul 2.2 (Cpri, 2001).
5.2.2. DETERMINAREA PROTEINELOR
Principiul metodei const n neutralizarea aciditii libere a laptelui prin titrare cu
NaOH 0,143 N n prezen de fenolftalein. Gruprile aminice din protein reacioneaz cu
formaldehida formnd o baz Schiff. Totodat rmn libere gruprile carboxil, producnd o
nou acidifiere a laptelui, care se titreaz din nou cu NaOH 0,143 N.
29

CH

NH2 +

COOH
aminoacid

R'
H ( R ')

R
- H2O

aldehid (ceton)

CH

COOH
Baz Schiff

R'
H ( R ')

Se introduc ntr-un pahar Erlenmeyer 50 ml de lapte (msurai cu pipeta) i 2 ml

oxalat de potasiu 28% dup care fiola se agit. Se adaug cteva picturi de indicator
fenolftalein i apoi se titreaz cu soluie NaOH 0,143 N pn la apariia coloraiei slab roz,
persistent 30 secunde. Se adaug n prob 10 ml formaldehid 37% (neutralizat n
prealabil) i se agit. Se observ decolorarea soluiei de lapte. Dup 30 secunde repaus se
titreaz din nou pn la slab roz cu soluie de NaOH 0,143 N. Se noteaz volumul de
hidroxid folosit la cea de a doua titrare (dup adugare de formaldehid).
Calcul:
Protein % = V F/2
unde:

V = ml NaOH 0,143N folosit la cea de a doua titrare

F = factorul soluiei NaOH 0,143N
5.2.3. DETERMINAREA CLORURILOR

Ionii de clorur din filtratul obinut dup deproteinizarea i degresarea laptelui

se titreaz cu o soluie de AgNO 3 0,1N n prezena cromatului de potasiu 10% ca
indicator.
Se pun 20 ml de lapte ntr-un balon cotat de 200 ml i se aduce cantitativ cu
aproximativ 170 ml ap distilat. Se adaug 2 ml de soluie ferocianur de potasiu
15% i se omogenizeaz bine. Se adaug 2 ml soluie acetat de zinc 30%,
omogenizndu-se din nou. Se completeaz la semn cu ap distilat. Dup 15 minute de
repaus, se filtreaz prin filtru cutat; filtratul trebuie s fie limpede.
ntr-un pahar Erlenmeyer se introduc 100 ml filtrat, peste care se adaug cteva
picturi de indicator. Se titreaz cu AgNO3 0,1N pn la virajul culorii din galben
deschis la portocaliu persistent (nu trebuie s se ajung la rou-crmiziu).
Coninutul de cloruri exprimat n echivalent NaCl % se calculeaz cu formula:
NaCl % = 0,00585 V 10
n care:
0,00585 = cantitatea de NaCl, n g, care corespunde la 1 ml AgNO3 0,1N
V = volumul AgNO3 0,1N, n ml
10 = factorul de exprimare procentual (cantitatea de 100 ml filtrat
care se titreaz corespunde la 10 ml de lapte).
Nu se recomand a se determina clorurile din lapte nedeproteinizat, deoarece
proteinele fixeaz o anumit cantitate de AgNO3.
5.2.4. DETERMINAREA CONDUCTIVITII ELECTRICE
Conductivitatea a fost determinat cu un conductometru (fig. 4) de tip OK-102/1
(Radelkis).

30

Figura 4. Conductometru
Dup prealabila etalonare a aparatului (fr ap) i cu ap distilat, se msoar
conductivitatea unui etalon de KCl 0,1N i se citete Go.
Se nlocuiete coninutul vasului cu proba i se citete G p. Se calculeaz constanta
o
, n care o = valoarea standard a conductivitii pentru soluie de KCl 0,1N la
Go
temperatura determinrii, din tabel.

celulei: C =

Conductivitatea probei, la temperatura de 25C este:

p = G p C ft
unde: ft = factorul termic pentru corectarea conductivitii la 25C.

5.2.5. DETERMINAREA COEFICIENTULUI DE TENSIUNE

SUPERFICIAL
Metoda stalagmometric este dinamic i se bazeaz pe numrarea picturilor care se
desprind la curgerea unui volum determinat V, de lichid prin orificiul capilar al
stalagmometrului.
o

no

o n

unde: 0 = densitatea apei

0 = tensiunea superficial a apei
n0 = numrul de picturi n care se scurge apa
31

 = densitatea laptelui
= tensiunea superficial a laptelui
n = numrul de picturi n care se scurge laptele
Cunoscnd mrimile , 0 i 0 i determinnd n i n0 cu ajutorul stalagmometrului
Traube, se poate calcula coeficientul de tensiune superficial.
5.2.6. DETERMINAREA DENSITII RELATIVE
Densitatea relativ se determin cu lactodensimetrul, sau cu termolactodensimetrul.
ntr-un cilindru cu dimensiuni apropiate de acelea ale lactodensimetrului, curat i uscat, se
toarn laptele de analizat i apoi se introduce ncet lactodensimetrul, lsndu-l s pluteasc
liber, fr s ating pereii cilindrului. n timpul determinrii, laptele trebuie s aib
temperatura cuprins ntre 10 i 20C.
Diviziunea citit deasupra meniscului reprezint densitatea laptelui, exprimat n
grade lactodensimetrice, la temperatura la care s-a fcut citirea. Dac temperatura laptelui
este diferit de 20C, numrul de grade citit se corecteaz, conform datelor din tabelul de
corecie. Densitatea relativ se calculeaz cu formula:
Densitatea relativ la 20C = 1

C
1000

n care C reprezint numrul de grade lactodensimetrice corectat.

Densimetrul (hidrometru, aerometru) este un instrument bazat pe legea lui Arhimede
(un corp cufundat ntr-un lichid este mpins n sus cu o for egal cu greutatea volumului de
fluid dezlocuit) i folosit pentru determinarea rapid a densitii lichidelor.
Densimetrele sunt construite dintr-un cilindru de sticl, continuat cu un tub cilindric
ngust, pe care se afl gradaiile corespunztoare. n partea inferioar este un compartiment
conic sau sferic, umplut cu alice de plumb sau mercur (figura 14). Lichidul cercetat se
introduce ntr-un cilindru curat i uscat, aezat pe o suprafa orizontal. Densimetrul se
cufund cu grij, lent, inut de captul superior al tijei. Citirea se face numai dup ce
densimetrul a ncetat s oscileze. Ochiul observatorului n timpul citirii trebuie s fie la
nivelul lichidului (figura 5).

32

Figura 5. Densimetre

5.2.7. DETERMINAREA VSCOZITII DINAMICE

Vscozitatea se poate determina experimental msurnd viteza de curgere a

lichidului printr-un tub capilar. Dac un volum de lichid V curge sub presiune p
n timpul t printr-un tub capilar de raz r i lungime l atunci vscozitatea
lichidului este dat de relaia lui Poiseuille.

r4 p t
8V l

r 4 p0 t 0
8V l

Determinarea coeficientului de vscozitate absolut este dificil n practic i de

aceea se accept coeficieni de vscozitate relativi ( rel). Vscozitatea relativ
reprezint raportul dintre vscozitatea lichidelor de determinat i vscozitatea unui
lichid de referin.
Din raportul relaiilor pentru lichidul de cercetat i pentru ap obinem
vscozitatea relativ (H2O distilat la 20C):
r

t p

t o po

Presiunea hidrostatic este proporional cu densitatea pentru aceeai coloan

de lichid (p = gh); relaia devine:
33

t o o

de unde: o t
o
o
unde: t = timpul de scurgere al lichidului determinat
= densitatea lichidului la temperatura dat
t0 = timpul de scurgere a apei distilate
0 = densitatea apei distilate la temperatura dat
0 = vscozitatea apei la densitate i temperatur dat
0 i 0 se iau din tabele.
Determinarea vscozitii relative a laptelui s-a efectuat cu ajutorul
vscozimetrului Ostwald.
5.2.8. DETERMINAREA ATP BIOLUMINISCENEI
Adenozin trifosfatul (ATP) se gsete n toate celulele, detecia acestuia este un
indicator al prezenei organismelor vii. Supravieuirea celulelor necesit un consum
continuu de energie pentru desfurarea activitilor metabolice. Hidroliza ATP furnizeaz
energiei celulei prin desfacerea legturii fosfat.
NH2
N
O
O
O
HO P ~ O P ~ O P O
OH OH OH

N
O

NH2

N
N

N
+H2O

O
HO P O
OH

N
O

OH OH

OH OH

ATP

AMP

N
N

O
O
HO
P
O
P OH
+
OH OH

PP

ATP poate fi detectat rapid prin emisia luminii prin utilizarea enzimei luciferaza i a
unui luminometru. Reacia de bioluminiscen necesit cofactor D-luciferina i Mg 2+ pentru
activitate. Se emite o lumin galben-verzuie (max. 562 nm) dup ~ 300 ms. Tehnica
detecteaz limita de 1 pg ATP, care echivaleaz cu aproximativ 1000 celule bacteriene (10 15
g ATP/celula). ATP bioluminiscena este o metod rapid, efectundu-se n aproximativ 30
secunde. Metoda este foarte util n monitorizarea igienei, deoarece msurarea majoritii
microorganismelor necesit 2-3 zile pentru realizarea proceselor de cultur. La probele de
lapte se analizeaz RLU (Relative Light Unit), NCS (numr de celule somatice) i UFC
(uniti formatoare de celule) i se stabilesc corelaiile dintre aceti parametri.
Determinarea ATP se efectueaz n 2 etape: extracia ATP celular i determinarea
enzimatic prin bioluminiscen. Msurarea ATP se realizeaz cu aparatul (figura 6.)
Bioscan Monitor RHS 055 al firmei Betz Dearborn.

34

Figura 6. Luminometru

ATP bioluminiscena
Tehnica de ATP bioluminiscen se bazeaz pe faptul c toate celulele vii (eucariote
i procariote) conin molecule de adenozin trifosfat (ATP). ATP-ul furnizeaz energia
necesar funciilor celulei. ATP este placa turnant a energeticii materiei vii i deine un rol
decisiv n reaciile metabolice, funcionnd ca acumulator sau generator de energie.
Reaciile biochimice la care particip ATP se bazeaz pe hidroliza unui rest de fosfat
terminal (desfacerea legturii fosfoanhidrid), cnd se elibereaz 7,3 kcal/mol.
NH2
N
O
O
O
HO P ~ O P ~ O P O
OH OH OH

N
O

N
N

OH OH

Metoda de determinare a ATP-ului folosete enzima luciferaza, enzima care este

responsabil de lumina emis de licurici. Luciferaza reacioneaz cu ATP i
produce lumin, iar cantitatea de lumin produs este proporional cu
cantitatea de ATP din prob. Reacia e producere a luminii dureaz doar cteva
secunde, iar cantitatea de lumin emis este msurat cu ajutorul unui
35

luminometru. Tehnica are o limit de detecie de 1 pg ATP, corespondent la

aproximativ 1000 celule bacteriene. Reacia este eficient producnd un singur
foton de lumin pentru fiecare molecul de luciferin oxidat i respectiv fiecare
molecul de ATP utilizat (Anand, 2004).

6. REZULTATE I DISCUII
6.1. Cercetri asupra corelaiei dintre compoziia chimic i proprietile
biofizice ale laptelui integral
Rezultatele analizelor biochimice de laborator sunt prezentate n tabelele 10, 11 i 12.
Rezultatele analizelor biofizice sunt prezentate n tabelele 13, 14 i 15.
Tabelul 10. Valorile unor parametri biochimici ai laptelui n experimentul I
Proba
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
XDS

Protein %
3,51
3,26
3,65
3,51
3,22
3,51
3,31
3,26
3,51
2,97
3,36
3,80
3,12
3,41
3,46
4,48
3,450.33

Experiment I
Lactoz %
5,35
5,40
5,85
5,80
5,80
5,35
5,60
5,35
5,40
5,25
5,90
5,35
5,35
5,85
4,44
4,95
5,430,378

Cazein %
2,65
2,63
2,65
2,60
2,33
2,48
2,68
2,47
2,59
2,18
2,70
3,00
2,44
2,76
2,77
3,62
2,650.319

36

Cl %
0,082
0,126
0,075
0,094
0,100
0,110
0,104
0,113
0,104
0,123
0,097
0,123
0,104
0,107
0,082
0,138
0,1050,017

Cl/lactoz
1,45
2,33
1,28
1,62
1,72
2,05
1,85
2,11
1,92
2,34
1,64
2,29
1,94
1,82
1,84
2,78
1,930,376

Tabelul 11. Valorile unor parametri biochimici ai laptelui n experimentul II

Proba
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
XDS

Protein %
3,56
3,32
3,37
3,37
3,37
3,95
3,51
3,17
3,51
2,83
3,42
3,90
3,12
3,32
3,37
4,49
3,470.38

Cazein %
2,60
2,44
2,57
2,51
2,74
3,20
2,80
2,42
2,80
2,23
2,66
2,98
2,48
2,64
2,66
3,52
2,700.317

Experiment II
Lactoz %
6,10
5,90
6,10
5,75
5,45
6,00
5,90
5,55
6,05
5,75
6,05
5,90
5,25
5,60
6,05
5,75
5,820,253

Cl %
0,095
0,163
0,092
0,102
0,131
0,127
0,134
0,172
0,127
0,153
0,115
0,124
0,121
0,127
0,089
0,163
0,1270,025

Cl/lactoz
1,55
2,76
1,50
1,77
2,40
2,11
2,27
3,09
2,09
2,66
1,90
2,10
2,30
2,26
1,47
2,83
2,190,484

Tabelul 12. Valorile unor parametri biochimici ai laptelui n experimentul III

Proba
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
XDS

Protein %
3,34
3,29
2,96
3,24
2,96
2,87
3,20
3,19
3,38
2,40
3,06
3,57
2,96
3,29
2,63
4,32
3,160.42

Cazein %
2,64
2,65
2,31
2,57
2,33
2,23
2,57
2,47
2,66
1,92
2,27
2,79
2,31
2,63
2,13
3,43
2,490.340

Experiment III
Lactoz %
6,75
6,10
6,90
6,15
5,75
5,90
6,05
6,15
5,90
5,45
6,15
6,05
6,10
6,10
5,90
6,00
6,080,341
37

Cl %
0,115
0,147
0,102
0,096
0,112
0,115
0,099
0,134
0,102
0,131
0,086
0,137
0,115
0,112
0,089
0,141
0,1140,018

Cl/lactoz
1,70
2,41
1,48
1,56
1,95
1,95
1,64
2,18
1,73
2,40
1,67
2,26
1,88
1,84
1,51
2,35
1,900,322

Tabelul 13. Valorile unor parametri biofizici ai laptelui n experimentul I

Proba

Experiment I
Densitate
relativ

Conductivitate
Vscozitate
Tensiune
electric
dinamic
superficial
mS/cm
(cP)
(dyn/cm)
6,61
4,48
1,0268
2,1070
56,42
6,63
4,76
1,0275
1,7873
55,90
6,56
4,53
1,0265
1,6265
57,55
6,64
4,95
1,0262
1,7397
56,38
6,60
5,47
1,0251
1,6455
56,89
6,66
5,64
1,0260
1,9237
56,37
6,60
5,28
1,0260
1,8309
57,52
6,60
6,10
1,0269
1,7198
57,57
6,63
5,44
1,0254
1,7173
55,26
6,65
5,80
1,0257
2,2639
59,32
6,55
5,36
1,0268
1,7188
56,99
6,64
5,11
1,0249
1,6946
56,88
6,74
5,47
1,0285
2,1105
56,51
6,67
5,28
1,0254
1,8298
56,34
6,63
4,95
1,0265
2,0606
54,76
6,63
4,95
1,0270
2,1065
57,38
6,620,044 5,2230,443 1,02630,0009 1,86760,0499 56,750,2623
pH

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
XDS

Tabelul 14. Valorile unor parametri biofizici ai laptelui n experimentul II

Proba
pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

6,45
6,35
6,40
6,37
6,31
6,56
6,34
6,51
6,55
6,55
6,42
6,55
6,24
6,48
6,49

Conductivitate
electric
mS/cm
4,51
4,84
4,33
4,84
5,99
6,17
5,50
6,36
4,84
5,76
5,53
4,84
4,70
5,25
4,70

Experiment II
Densitate
Vscozitate
relativ
dinamic
(cP)
1,0303
1,4690
1,0309
1,4926
1,0270
1,5693
1,0259
1,9237
1,0338
1,9582
1,0227
2,2127
1,0299
1,5536
1,0271
1,4871
1,0301
1,4713
1,0299
1,5532
1,0306
1,5324
1,0250
1,5032
1,0289
1,9976
1,0273
1,7171
1,0311
1,4945
38

Tensiune
superficial
(dyn/cm)
56,05
54,99
57,00
53,68
54,62
54,03
56,59
54,79
54,95
55,48
56,62
55,20
56,53
57,01
56,45

16
XDS

6,45
6,430,097

5,53
5,2300,620

1,0288
1,02870,0006

1,8231
1,67240,0097

57,10
55,690,2787

Tabelul 15. Valorile unor parametri biofizici ai laptelui n experimentul III

Proba
pH

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
XDS

Experiment III
Densitate
relativ

Conductivitate
Vscozitate
electric
dinamic
mS/cm
(cP)
6,49
4,85
1,0318
1,5537
6,51
5,61
1,0320
1,5078
6,48
4,85
1,0309
1,7865
6,38
5,02
1,0292
1,5732
6,42
5,39
1,0312
1,6491
6,60
5,34
1,0305
1,5540
6,33
5,02
1,0305
1,6466
6,55
5,39
1,0292
1,6200
6,62
5,12
1,0301
1,8097
6,58
5,66
1,0305
1,6466
6,45
4,85
1,0310
1,6233
6,58
5,48
1,0280
1,4795
6,40
4,94
1,0301
2,0447
6,51
5,02
1,0319
1,6249
6,51
4,85
1,0332
1,5322
6,70
5,66
1,0311
1,6941
6,500,097
5,190,307
1,03070,0003 1,64660,0348

Tensiune
superficial
(dyn/cm)
48,41
49,84
50,78
45,76
52,37
46,95
46,15
45,27
46,13
46,15
46,15
47,59
47,87
47,07
44,65
52,37
47,710,80

6.1.1. Coninutul de protein corelat cu densitatea

Densitatea laptelui este cuprins ntre 1,0249-1,0332. S-a observat c la scurt timp
dup muls densitatea este mai sczut. Diferena este datorat n principal modificrii strii
de agregare a particulelor de grsime, care la rcire se contracteaz (se solidific).
Un coninut mare n grsime scade densitatea relativ a laptelui, n timp ce un
coninut ridicat n protein, lactoz i sruri minerale crete valoarea greutii specifice.
Densitatea relativ a substanei uscate degresate, adic de protein, lactoz i sruri, la 15C,
este de 1,601. Aceste componente, la fel ca i grsimea, a crei densitate relativ la 15C
este aproximativ 0,9307, sufer variaii mici n raport cu densitatea relativ.
Imediat dup muls, densitatea relativ este mai sczut dect dup cteva ore. Astfel,
din datele obinute la experimentul I, la care determinrile s-au efectuat imediat dup muls,
se observ valori ale greutii specifice sub limitele valorilor normale pentru lapte. Diferena
este datorat n principal modificrii strii grsimii, respectiv a particulelor de grsime, care
la rcire se contract, adic se solidific. Totodat are loc probabil i o umflare a particulelor
coloidale de proteine, care ns nu este de mare importan pentru modificarea greutii
specifice. Experimentul III reprezint o excepie, laptele fiind analizat dup 12 ore de la
mulgere, cnd particulele de grsime i-au modificat starea de agregare.
S-a observat corelaia pozitiv a greutii specifice a laptelui cu coninutul de
protein.
39

Densitatea este pozitiv corelat cu proteina (figura 7), datorit miceliilor de cazein
cu dimensiunile de 10-100 nm i densitatea de 1,11 g/ml.

Figura 7. Coninutul de protein corelat cu densitatea

6.1.2. Coninutul de protein corelat cu tensiunea superficial
Tensiunea superficial a laptelui reprezint 0,7-0,8 din cea a apei, proteinele fiind
substane cu rol tensioactiv. S-a observat corelaia negativ (fig. 8) care exist ntre
tensiunea superficial i coninutul n protein al laptelui (r = -0,8204).

Figura 8. Coninutul de protein corelat cu tensiunea superficial

40

Tensiunea superficial scade n timp, cele mai mici valori s-au obinut la lapte
analizat dup 12 ore de la mulgere.
6.1.3. Coninutul de protein corelat vscozitatea
Vscozitatea dinamic este cuprins ntre 1,3492-2,2639 cP. S-a observat c
vscozitatea depinde direct proporional de coninutul n protein (fig. 9). Cazeina este
componenta ce contribuie n cea mai mare msur la modificarea vscozitii. Cazeina
formeaz mpreun cu albumina dispersii coloidale. Albumina este un stabilizator al
cazeinei, prin efectul su de coloid de protecie. Gradul de dispersie al proteinelor are un
efect major asupra vscozitii.

Figura 9. Coninutul de protein corelat cu vscozitatea

6.1.4. Coninutul de lactoz corelat cu conductivitatea electric
Prin fermentaia lactozei, cnd dintr-o molecul de lactoz se formeaz patru
molecule de acid lactic, are loc acidifierea laptelui i n consecin scderea pH-ului. S-a
observat o scdere a coninutului de lactoz dup 24 de ore de la recoltarea probelor.
Formarea acidului lactic i implicit creterea aciditii a fost evideniat i prin
msurtorile de pH. Fermentaia lactic a lactozei din lapte duce la scderea pH-ului i la
creterea conductivitii electrice, conform determinrilor efectuate. Recunoaterea laptelui
provenit de la vaci bolnave de mamit se face n mod normal prin determinarea indicelui de
Cl/lactoz, deoarece n cazul acestei boli crete cantitatea de Cl iar cantitatea de lactoz
scade. Indicele de Cl/lactoz reprezint raportul dintre coninutul de cloruri (exprimat n
echivalent clor, folosind n formula de calcul factorul de conversie pentru clor 0,00355) i
cel de lactoz, exprimat procentual. Laptele normal, de la vaci sntoase are valoarea
indicelui < 3.
41

Cu toate c laptele este izotonic cu sngele, cele dou lichide biologice difer n ceea
ce privete componena ionilor i proporia lor. Datorit presiunii osmotice constante a
laptelui, exist o corelaie negativ ntre conductivitate i lactoz. Deoarece conductivitatea
electric depinde de prezena electroliilor n stare ionic din lapte, iar presiunea osmotic
este un parametru aproape constant (aproximativ 300 kPa), am corelat variaia
conductivitii cu coninutul n lactoz. Conductivitatea este ridicat atunci cnd coninutul
de lactoz este sczut, deoarece n acest caz, pentru a menine presiunea osmotic constant,
crete coninutul de electrolii. Echilibrarea se datoreaz n principal ionilor de clor
(probabil din NaCl). Aceasta explic variaia conductivitii electrice. Conductivitatea
electric poate fi utilizat pentru aprecierea calitii laptelui n locul raportului de Cl/lactoz,
precum i pentru aprecierea prospeimii laptelui.
Corelaia (fig. 10) dintre conductivitatea electric i indicele Cl/lactoz (r = 0,8482)
este statistic semnificativ (P0.001). Ionii de clorur sunt invers proporionali cu coninutul
de lactoz. Concentraia ionilor influeneaz conductivitatea electric. Deoarece indicele
Cl/lactoz este un indice de apreciere a calitii laptelui i detecie a mastitei, concluzionm
c, conductivitatea electric poate fi folosit n acelai scop.

Figura 10. Indicele Cl/lactoz corelat cu conductivitatea electric

42

6.2. Determinarea calitii microbiologice a laptelui prin metode clasice i prin

metode bazate pe biochemiluminiscen
Analiza microbiologic prin metode clasice
n ultimii ani se pune un accent tot mai mare pe asigurarea securitii i siguranei
alimentare. Analiza microbiologic a laptelui este deosebit de important att din punct de
vedere economic ct i al siguranei i securitii alimentare. Metoda obinuit folosit
pentru aprecierea calitii microbiologice a laptelui integral determin unitile formatoare
de colonii (UFC), test care nu identific ns tipurile de organisme prezente. Metoda folosit
pentru aprecierea sntii ugerului const n determinarea numrului de celule somatice
(NCS). Ambele teste dau informaii
UFC se determin prin numrarea coloniilor ce cresc pe plci cu agar. Numrul
celulelor microbiene viabile se determin folosind numrtorul de colonii BIO-KOBE
(Japonia).
Analiza microbiologic prin biochemiluminiscen
Un rol important l dein noile biotehnici care vin n sprijinul microbiologilor, pentru
obinerea unor rezultate de mare acuratee, sensibile i n special rapide. O astfel de
biotehnic este ATP bioluminiscena.
Cea mai uzual metod de determinare a ATP bacterian este bazat pe utilizarea
enzimei Luciferaza i a substratului Luciferin. Reacia este endergonic: are loc consumul
moleculelor de ATP cu producerea unui foton, cuantificat cu luminometrul Bioscan Monitor
RHS 055.
Deoarece adenozin trifosfatul (ATP) se gsete n toate organismele vii (eucariote i
procariote) detectarea acestuia este un indicator al prezenei materiei vii. ATP poate fi
detectat rapid cu un luminometru care msoar emisia de lumin cnd se folosete sistemul
enzimatic luciferin/luciferaza. Reacia cu luciferaza extras din licurici (Photinus pyralis)
este cea mai eficient reacie bioluminiscent pentru determinarea ATP-ului. Reacia
necesit D-luciferin i Mg2+ ca i cofactori (fig. 11).
Fotometrul msoar lumina galben-verzuie (max. 562 nm) emis dup aproximativ
300 ms i care este exprimat n RLU (uniti relative de lumin).

HO

S
N
Luciferin

COOH

ATP

PP
2+

Mg
Luciferase

Luciferyl - AMP
O2

CO2
Oxyluciferin + AMP

Figura 11. Sistemul reaciilor luciferin/luciferaz

43

Experimentele s-au efectuat pe probe de lapte provenind de la 10 vaci de lapte.

Rezultatele analizelor microbiologice sunt prezentate n tabelul 216.
Tabelul 16. Analizele microbiologice
Prob
RLU
1. 22000
2. 18000
3. 39000
4. 11000
5. 37000
6
16000
7. 18000
8. 38000
9. 27000
10. 19000

log
RLU
4,3424
4,2552
4,591
4,0413
4,2552
4,2041
4,4149
4,5797
4,4313
4,2787

UFC/
ml
736000
220000
310000
97000
5400
3600
45000
1500
1100
500

log
UFC
5,8668
5,3424
5,4913
4,9867
3,7323
3,5563
4,6532
3,1760
3,0413
2,6989

NCS/
ml
50000
120000
105000
430000
195000
175000
525000
270000
65000
110000

log
NCS
4,6989
5,0791
5,0211
5,6334
5,2900
5,2430
5,7201
5,4313
4,8129
5,0413

NCS+UFC
786000
340000
415000
527000
200400
178600
570000
271500
66100
110500

log NCS+
UFC
5,8954
5,5314
5,6180
5,7218
5,3018
5,2518
5,7558
5,4337
4,8202
5,0433

ATP total (Figura 12) s-a calculat din ecuaia de calibrare a luminometrului:
ATP = 0,0033RLU - 0,0123

Figura 12. Corelaia dintre ATP i RLU

44

Corelaiile dintre valorile analizelor microbiologice

Corelaiile s-au realizat cu valorile logaritmice. Figurile 13, 14 i 15 prezint
corelaiile ntre valorile RLU obinute folosind bioluminiscena i valorile UFC, NCS i
NCS+UFC obinute prin metodele microbiologice clasice. S-a observat o bun corelaie
ntre RLU i NCS (r = 0,9250). Coeficientul de corelaie dintre RLU i UFC este r = 0,7088.
Metoda determin ATP total. Deoarece ATP din celulele eucariote este de trei ori mai mare
dect din cele bacteriene, procedeul este mai potrivit pentru evaluarea NCS. Corelaia cea
mai bun s-a observat ntre RLU i suma NCS+UFC, r = 0,9590.

Figura 13. Valorile RLU corelate cu valorile UFC

45

Figura 14. Valorile RLU corelate cu valorile NCS

Figura 15. Valorile RLU corelate cu suma NCS+UFC

Metoda de determinare a ATP-ului prin bioluminiscen este o metod foarte rapid,
deosebit de util n monitorizarea igienei laptelui, celelalte tehnici necesitnd 2-3 zile pentru
determinare. Aprecierea calitii laptelui i a strii de sntate a ugerului la vacile de lapte
(evidenierea mastitei) prin biochemiluminiscen are i avantajul de a se putea realiza direct
la productorul de lapte, fr a necesita prelevarea n condiii sterile, transportul la un
46

laborator de microbiologie i efectuarea unor analize de durat ce necesit personal

specializat.

7. CONCLUZII
Densitatea este mai sczut la scurt timp dup muls datorit n principal modificrii

strii de agregare a particulelor de grsime, care la rcire se contracteaz;

S-a observat o corelaie pozitiv a densitii a laptelui cu coninutul de protein;
Densitatea relativ a laptelui este n corelaie invers evident cu tensiunea superficial
i cu vscozitatea dinamic;
Analizele au evideniat influena coninutului n protein asupra tensiunii superficiale i
asupra vscozitii. Proteina are aciune tensioactiv. Valori crescute de protein
(cazein) n lapte se reflect n valori mai mici ale tensiunii superficiale;
Vscozitatea depinde direct proporional de coninutul n protein, cazeina fiind
componenta ce contribuie n cea mai mare msur la modificarea vscozitii;
Tensiunea superficial scade n timp, cele mai mici valori s-au obinut la laptele
analizat dup 12 ore de la mulgere;
Coninutul de lactoz scade pe msur ce avanseaz fermentaia, respectiv scade pH-ul;
Fermentaia lactic este asociat cu scderea pH-ului i cu creterea conductivitii
electrice;
Coninutul de lactoz este n corelaie negativ cu conductivitatea electric i cu
coninutul de Cl;
Determinarea raportului Cl/lactoz pentru aprecierea calitii laptelui i detecia
mastitei poate fi nlocuit cu valoarea conductivitii electrice, mai uor i mai rapid de
determinat, experimentele efectuate artnd o foarte bun corelaie ntre cei doi
parametri;
Determinarea ATP prin bioluminiscen este o metod rapid, efectundu-se n
aproximativ 30 secunde;
S-a observat o bun corelaie ntre valorile determinate prin bioluminiscen i cele
obinute prin metode clasice de determinare a caracteristicilor microbiologice a
laptelui;
Determinarea ATP total poate fi folosit ca indicator al calitii laptelui, valori mari ale
RLU indic fie mastit subclinic, sau contaminare bacterian;
Deoarece nivelul de ATP din celulele eucariote este de trei ori mai mare dect cel din
celulele bacteriene, procedeul este mai potrivit pentru evaluarea NCS;
La utilizarea metodei cu ATP n monitorizarea igienei din industria laptelui, acest
inconvenient dispare, deoarece att celulele ct i bacteriile trebuie s fie absente.
Determinarea caracteristicilor microbilogice prin bioluminiscen este o metod foarte
rapid, deosebit de util n monitorizarea igienei laptelui, n comparaie cu metodele
clasice, mai laborioase i de lung durat.

47

8. BIBLIOGRAFIE
1. Anand, S.K., Griffiths, M. W. (2004). Inside Microbiology: Advances in Biotechniques
Used

in

Quality

Assurance

of

Food

Products.

www.foodsafetymagazine.com/issues/0312/colmicro0312.htm
2. Banu, C.- Manualul Inginerului de Industrie Alimentar, Ed. Tehnic, Bucureti, 1998
3. Baumy, J. J.; Brule, G.; Study of calcium binding to phosphoserine residues of -casein
and its phosphopeptide; J. Dairy Res., 1998.
4. Belitz, H.-D.- Grosch, W.- Food Chemistry, Ed. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg,
1987
5. Branchini,

B.

(2002).

Firefly

bioluminescence.

http://modares.ac.ir/sci/saman_h/

Pages/Firefly.htm.
6. Cpri Rodica - Biochimie animal, Ed. Mirton, Timioara, 2000
7. Cpri Rodica Metode i teste de laborator, Ed. Waldpres, Timioara, 2002
8. Cpri Rodica Principii i tehnici biochimice, Ed. Gutenberg, Arad, 2001
9. Cpri, A. Chimie organic agroalimentar, Partea I, Editura Mirton, Timioara,
2003
10. DeLuca, M. (1976) Firefly luciferase. Adv. Enzymol. 44, 37-68.
11. DeLuca, M., McElroy, W.D. (1974). Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions.
Biochemistry, 13 (5), 921-925.
12. Drug, M.- Controlul Calitii Laptelui i Produselor Lactate, Ed. Mirton Timioara,
1999
13. Dumitru, I. F. - Biochimie, Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti, 1980
14. Ferretti, A., Chambers, J. V.- Indianapolis Center for Advanced Research, Indiana
Univ., 2001
15. Georgescu, G.- Laptele i Produsele Lactate, Ed. Ceres, Bucureti, 2000
16. Ghergariu, S., Al. Pop, L. Kadar, Marina Spnu Manual de laborator clinic
veterinar, Ed. All Educational, Bucureti, 2000
17. Kenner, C., Brueggemeyer, A., & Gunderson, L.P. (1993). Comprehensive neonatal
nursing (pp. 440-442). Philadelphia: W.B. Saunders Co
18. Lee, R.T., Denburg, J.L., McElroy, W.D. (1970). Substrate-binding properties of firefly
luciferase. Arch. Biochem. Biophys., 141, 38-52.
19. Lehninger, A. L. Biochimie, Vol. 1, Editura Tehnic Bucureti, 1987
48

20. Lemasters, J.J., Hackenbrock, C.R. (1977). Kinetics of product inhibition during firefly
luciferase luminescence. Biochemistry, 16 (3), 445-447.
21. Lupea, A. X., Ardelean, D., Pdure, M. - Chimia i Controlul Alimentelor de Origine
Animal, Ed. Politehnica, Timioara, 2000
22. Mihaiu, M. Laptele i controlul calitii sale, Ed. Risoprint Cluj-Napoca, 1998
23. Mooc, D.; Dimitriu, M.; Biochimia Produselor Alimentare, Ed. Didactic i
Pedagogic, Bucureti, 1971.
24. Neamu, G. Biochimie alimentar, Editura Ceres, Bucureti, 1997
25. Neamu, G. Lucrri practice de biochimie alimentar, Tipo Agronomia ClujNapoca, 1997
26. Nickerson, T. A. - Fundamentals of Dairy Chemistry, Ed. Webb and Johnson,
Westport, 1985
27. Ow, D.W., Wood, K.V., DeLuca, M., de Wet, J.R., Helinski, D.R., Howell, S.H. (1986).
Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic
plants. Science, 234, 856-859.
28. Popescu Aurora, Zamfirescu-Gheorghiu Marcela Tratat de Biochimie Medical,
Editura Medical, Bucureti, 1991
29. Stnescu, V. Tehnologia produselor animaliere, Tipo Agronomia Cluj-Napoca, 1980
30. Vintil Cornelia Industrializarea i valorificarea laptelui, produselor avicole i
apicole, 1996

49